Tokat ve çevresinde halk ilacı olarak kullanılan bazı bitki karışımlarının antiproliferatif ve immunosupresif etkilerinin araştırılması

(1)

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu

Sonuç Raporu

Proje No: 2010/39

Tokat ve Çevresinde Halk İlacı Olarak Kullanılan Bazı Bitki ve Bitki Karışımlarının Antiproliferatif ve İmmunosupresif Etkilerinin Araştırılması

Proje Yöneticisi Prof. Dr. Adem ÖNAL

Fen-Edebiyat Fakültesi

Prof. Dr. Şaban TEKİN (Fen-Edebiyat Fakültesi/Biyoloji Bölümü)

Yrd. Doç. Dr. Ayşe ŞAHİN (Çankırı Karatekin Üniversitesi /Fen Fakültesi/Kimya Bölümü) Arş. Gör. Dr. Ferda ESER (Fen-Edebiyat Fakültesi/Kimya Bölümü)

(2)

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu

Sonuç Raporu

Proje No: 2010/39

Proje Yöneticisi Prof. Dr. Adem ÖNAL

Fen-Edebiyat Fakültesi

Prof. Dr. Şaban TEKİN (Fen-Edebiyat Fakültesi/Biyoloji Bölümü)

Yrd. Doç. Dr. Ayşe ŞAHİN (Çankırı Karatekin Üniversitesi /Fen Fakültesi/Kimya Bölümü) Arş. Gör. Dr. Ferda ESER (Fen-Edebiyat Fakültesi/Kimya Bölümü)

(3)

(4)

ÖZET*

Proje kapsamında Malus floribunda (Rosaceae), Crataegus oxyacantha (Rosaceae), Alnus

glutinosa L. gaertn (Betulaceae), Hypericum perforatum L. (Clusiaceae), Glycyrrhiza glabra

(Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) bitkilerinin antiproliferatif aktiviteleri C6 (sıçan beyin tümörü) ve HeLa (insan rahim kanseri) hücrelerine karşı test edilmiştir.

Yapılan test sonuçlarına göre C6 (sıçan beyin tümörü) hücresine karşı 100-75 μg/ml konsantrasyonlarda yemişen (C. oxyacantha), asma yaprağı (V. vinifera), kızılağaç (A.

glutinosa L. gaertn), Japon elması (M.floribunda), nar çiçeği (H. sabdariffa) ve hatmi (A. pallida) bitki ekstreleri oldukça etkili bulunmuştur.

Diğer taraftan HeLa (insan rahim kanseri) hücresine karşı ise asma yaprağı (V. vinifera), kızılağaç (A. glutinosa L. gaertn), meyan kökü (G. glabra), nar çiçeği (H. sabdariffa) ve hatmi çiçeği (A. pallida) bitkilerinin 100-75 μg/ml konsantrasyonlarda yüksek antiproliferasyon gösterdiği tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Antiproliferatif aktivite, C6 ve HeLa kanser hücreleri, Malus floribunda,

Crataegus oxyacantha, Alnus glutinosa L. gaertn, Hypericum perforatum L., Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera L., Alcea pallida, Hibiscus sabdariffa

*Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje no : 2010/39).

(5)

ABSTRACT*

Investigation of Antiproliferative and Immunosupresive Effects of Some Plants and Plant Mixtures That Uses As Folk Medicine in Tokat and its Environs

In this study, were tested antiproliferative activities of Malus floribunda (Rosaceae),

Crataegus oxyacantha (Rosaceae), Alnus glutinosa L. gaertn (Betulaceae), Hypericum perforatum L. (Clusiaceae), Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) aganist C6 (rat brain tumours) and

HeLa (human uterus carcinoma) cancer cell lines.

According to test results, extracts of C. oxyacantha, V. vinifera, A. glutinosa L. gaertn, M.

floribunda, H. sabdariffa and A. pallida) were determined to be significantly effective aganist

C6 cancer cell line.

On the other hand, extracts of V. vinifera, A. glutinosa L. gaertn, G. glabra, H. sabdariffa and

A. pallida were determined to be high antiproliferative activity observe aganist HeLa cancer

cell line in 100-75 μg/ml concentration.

Keywords: Antiproliferative activity, C6 and HeLa cancer cell lines, Malus floribunda,

Crataegus oxyacantha, Alnus glutinosa L. gaertn, Hypericum perforatum L., Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera L., Alcea pallida, Hibiscus sabdariffa

* This research was supported by Scientific Research Projects Commission of Gaziosmanpaşa University (Project no : 2010/39).

(6)

ÖNSÖZ

Bitkilerin halk arasında tedavi amacıyla kullanılması insanlık tarihiyle başlar. Bitkisel kökenli ilaçlar, kimyasal dönemin açılması ve ilerlemesi ile eski değerini kaybetse de farmakolojik tedavi ajanlarının önemli bir kısmını oluşturmaya devam ettirmiştir.

Bitkilerle kanser ve kanser benzeri hastalıkların tedavisine yönelik çalışmalar M.Ö. 1550‟li yıllara dayanmaktadır. Alternatif tıbbın öneminin giderek arttığı günümüzde bitkisel kaynaklı ilaçların yapımı için çalışmalar da aynı oranda artmaktadır.

Bu proje kapsamında öncelikle Üniversitemiz Doğal Boyalar Uygulama ve Araştırma Merkezi‟nde geliştirilen ve halen üretilen „Fungop‟ adlı bir bitki kanser hücrelerine karşı antiproliferatif etkisi araştırıldı. Sağlık Bakanlığı izniyle ayak mantarı ilacı olarak etkin bir şekilde kullanılmakta olan fungop, mantar hücrelerinin gelişimini engellemesi nedeniyle bu karışımda bulunan aktif maddelerin sinerjik etkiyle anti kanserojenik aktivite gösterme ihtimalinin olup olmadığı da bu çalışma kapsamında incelenmiştir.

(7)

İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii İÇİNDEKİLER ... iv SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ... v ŞEKİLLER DİZİNİ ... vi 1. GİRİŞ ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3 3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 6

3.1. Kullanılan Araç ve Malzemeler ... 6

3.2. Bitkilerin Temin Edilmesi ... 6

3.3. Bitkilerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) İşlemi ... 6

3.4. Biyolojik Aktivite Testleri için Stok Çözeltlerin Hazırlanması ... 7

3.5. Hücre Kültürleri ... 7

3.6. Antiproliferatif Aktivte Testleri ... 7

3.7. İmmunosupressif aktivite testleri ... 7

4. BULGULAR ... 8

4.3. Antiproliferatif Aktivite Test Sonuçları ... 8

4.3.1. C6 Hücreleri ile Proliferasyon Deneyi Sonuçları ... 8

4.3.2. Hücreleri ile Proliferasyon Deneyi Sonuçları ... 10

5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 13

(8)

SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ μg : Mikro gram μl : Mikro litre mg : Miligram ml : Mililitre g : Gram nm : Nanometre

DMEM : Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium DMSO : Dimetil sülfoksit

DPBS : Dulbekko‟nun fosfat tampon tuzu EDTA : Etilendiamin tetra asetik asit

UV : Ultraviyole

M.Ö. : Milattan önce

CH2Cl2 : Metilen klorür

MeOH : Metanol

LDH : Low Density Hemoglobin

FBS : Fetal Bovine Serum

BrDU : Bromodeoxyuridine

(9)

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa Şekil 4. 1. C. oxyacantha, V. vinifera ve G. glabra bitkilerinin C6 hücresine karşı

antiproliferatif aktiviteleri ... 8 Şekil 4. 2. A. glutinosa, M. floribunda ve H. perforatum bitkilerinin C6 hücresine karşı

antiproliferatif aktiviteleri ... 9 Şekil 4. 3. H. sabdariffa ve A. pallida bitkilerinin C6 hücresine karşı antiproliferatif

aktiviteleri ... 9 Şekil 4. 4. Fungop ve bileşenlerinin C6 hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri ... 10 Şekil 4. 5. C. oxyacantha, V. vinifera ve G. glabra bitkilerinin HeLa hücresine karşı

antiproliferatif aktiviteleri ... 11 Şekil 4. 6. A. glutinosa, M. floribunda ve H. perforatum bitkilerinin HeLa hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri ... 11 Şekil 4. 7. H. sabdariffa ve A. pallida bitkilerinin HeLa hücresine karşı antiproliferatif

aktiviteleri ... 12 Şekil 4. 8. Fungop ve bileşenlerinin HeLa hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri ... 12

(10)

1. GİRİŞ

Bitkilerin halk arasında tedavi amacıyla kullanılması insanlık tarihiyle başlar. Bitkisel kökenli ilaçlar, kimyasal dönemin açılması ve ilerlemesi ile eski değerini kaybetse de farmakolojik tedavi ajanlarının en büyük bölümlerinden olmayı devam ettirmiştir. Sentetik ilaçların yan etkilerinin, doğal kaynaklılara göre fazla olması, insanları tekrar bitkilerle tedaviye yöneltmiştir (Yücel ve Tülükoğlu, 2000).

Bitkilerin kanser ve kanser benzeri hastalıkların tedavisine yönelik çalışmalar üzerine bilinen en eski kayıt M.Ö. 1550‟li yıllara ait olduğu düşünülen Ebers papirüs‟tür. Kırktan fazla bitkinin; tümör, siğil ve kötü huylu bazı hastalıkların tedavisinde kullanılabileceğini ortaya çıkaran Mısırlı grubun incelediği bitkilerin başında üzüm, hurma, sarımsak, arpa, incir vs. yer almaktadır.

Kanser, hücre ve dokuları etkileyen karmaşık bir hastalıktır (Klug ve Cummings, 2002). Kanser, kalp ve damar hastalıklarından sonra en fazla ölüme sebep olan hastalık türüdür. Dünya Sağlık Örgütü‟nün bir araştırmasına göre 2000 yılında dünyada 10 milyon kanser vakası tespit edilirken Türkiye‟de her yıl yaklaşık 100 binin üzerinde kanser olgusuna rastlanmaktadır (Anonim, 2004).

Alternatif tıbbın öneminin giderek arttığı günümüzde bitkisel kaynaklı ilaçların yapımı için çalışmalar da aynı oranda artmaktadır. Perdue JR. ve Hartwell “antikanser ilaçların bitkisel kaynakları” üzerine bir araştırma yapmışlar ve 1200 ham bitki ekstresini laboratuvar hayvanları üzerinde deneyerek kanser hücrelerindeki büyümeyi azalttığını ortaya koymuşlardır.

Bu proje kapsamında öncelikle Üniversitemiz Doğal Boyalar Uygulama ve Araştırma Merkezi‟nde geliştirilen ve halen üretilen „Fungop‟ adlı bir bitki karışımının (içerik şahsi koruma altında olduğu için bileşim gizli tutulmaktadır) kanser hücrelerine karşı antiproliferatif ve lenfositler üzerindeki immunosupresif (baskılayıcı) etkisi araştırdı. Bu bitkisel karışım halen ayak mantarı ilacı olarak etkin bir şekilde kullanılmakta ve Sağlık Bakanlığı izniyle satılmaktadır. Mantar tedavisinde oldukça etkili olan bu bitki karışımınında, mantar hücrelerinin gelişimini engellemesi nedeniyle bu karışımda bulunan aktif maddelerin

(11)

sinerjistik etkiyle antikanseronik veya immunosupresif aktivite gösterme ihtimalinin olup olmadığı da bu çalışma kapsamında incelenmiştir.

Proje kapsamı içerisinde ayrıca, fungop bitkisel karışımının yanı sıra antiproliferatif aktivitesi yoğun olarak çalışılmamış olan ve halk arasında yaygın bir şekilde çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan Malus floribunda (Rosaceae), Crataegus oxyacantha (Rosaceae), Alnus

(Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) gibi bitkilerin (Yalçın, 1999) değişik (Kök, Gövde, Çiçek, Yaprak, Tohum) kısımlarının antiproliferatif aktiviteleri belirlenmiştir.

(12)

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Meyve büyüklüklerinin farklı olduğu, kültüre alınmış 3 farklı Malus türünü (M. floribunda,

M. coronaria, M. domestica) inceleyen Harada ve arkadaşları, en küçük meyve boyutuna

sahip olan Japon elması (M. floribunda) bitkisinin hücre proliferasyonunu azalttığını ortaya koymuşlardır (Harada ve ark., 2005).

42 yaban elması (Malus spp.) meyvesinin suyunun antiproliferatif aktivitesini araştıran Yoshizawa ve grubu birçok ekstraktın HL-60 insan kan kanseri hücrelerinin proliferasyonuna karşı güçlü inhibisyon gösterdiklerini ortaya çıkarmışlardır (Yoshizawa et al., 2004).

Kardiyotonik, damar genişletici, kas gevşetici, antidepresan, antitrombotik ve antiinflammatuar gibi çeşitli farmakolojik özelliklere sahip olmasından dolayı yaygın olarak kullanılan bir ilaç sınıfı olan fosfodiesteraz inhibitörleri (PDEl) üzerine yapılan çalışmalar giderek artmaktadır. Bitkide bulunan farmakolojik olarak aktif bazı maddelerin PDEl aktivite gösterdikleri bilinmektedir. PDEl aktiviteye neden olan en önemli sekonder metabolitler ise alkaloidler, flavonoidler ve saponinlerdir. Rahimi ve grubu, bitkisel PDEl üzerine yapılan çalışmaları ve bunların olası terapik uygulamalarını derleme olarak sunmuşlardır (Rahimi ve ark., 2010). Flavonoid içeriğinden dolayı yemişen (Crataegus oxyacantha) bitkisinin PDEl aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Verma ve ark., 2007).

Walloon Bölgesi ormanlarındaki 16 yaygın Belçika ağaçlarından elde edilen 48 ekstraktın, insan LoVo kolon kanseri, PC3 prostat kanseri ve U373 beyin kanser hücrelerinin büyümesine karşı in vitro ortamda inhibisyonunu inceleyen Frédérich ve grubu, Alnus

glutinosa gövde kabuğu ekstraktının hücre büyümesine karşı potansiyel inhibitör aktivite

gösterdiğini ve yeni antikanser ajanı olarak ekonomik bir kaynak olabileceğini ortaya koymuşlardır (Frédérich et al., 2009).

Sarı kantaron (Hypericum perforatum) bitkisinin in vitro ve in vivo ortamda insan prostat kanser hücrelerinin büyümesine etkisini inceleyen Martarelli ve ark., bu bitkinin prostat kanseri tedavisinde kullanılabilecek etkili bir doğal bileşik olduğunu ortaya koymuşlardır (Martarelli ve ark., 2004).

(13)

Hypericum perforatum bitkisinin aktif bileşenlerinin aktiviteleri incelenerek hypericin ve pseudohypericin maddelerinin memeli hücrelerine karşı antiproliferatif aktivite gösterdiği

tespit edilmiştir (Patocka, 2003).

Antioksidan özellik gösteren meyan kökü (Glycyrrhiza glabra) bitkisinin metanolik ekstraktını, insan kolon kanser hücresindeki reaktif oksijen türlerinin sitotoksik etkilerine karşı etkisini inceleyen D‟Angelo ve grubu, reaktif oksijen türlerinin artmasına bağlı olarak ortaya çıkan bağırsak hastalıklarından korunmada meyan kökünün oldukça etkili rol oynadığını belirtmişlerdir (D‟Angelo ve ark., 2009).

18 β-glycyrrhetic asit bileşiğini standart olarak kullanarak, Glycyrrhiza glabra bitkisinin üç farklı ekstraktında (kloroform, metanol ve su), in vitro sitotoksik aktivite incelemeleri yapılmış ve kloroform ekstraktında daha yüksek yüzdede olan (%26.6 µg/g) 18 β-glycyrrhetic asit için doğal antikanser kaynağı olabileceği belirlenmiştir (Rathi et all., 2009).

2001‟de Calliste ve arkadaşları, aralarında asma (Vitis vinifera) bitkisinin de bulunduğu 7 bitkinin farklı polaritelerdeki çözeltilerinin B16 melanoma hücrelerine karşı antiproliferatif etkisini inceleyerek bitkinin (V. vinifera) apolar (kloroform ve hekzan) fraksiyonlarının oldukça etkili olduğunu ortaya koymuşlardır (Calliste ve ark., 2001).

Bazı meyve çekirdeklerinin kimyasal bileşenlerini, antioksidan kapasitelerini ve antiproliferatif aktivitelerini inceleyen Parry ve grubu, vitis vinifera‟nın da içinde bulunduğu üç ekstraktın HT-29 hücre proliferasyonunu önemli ölçüde azalttığını tespit etmişlerdir (Parry et al., 2006).

Sung ve Lee, 2010‟da yaptıkları bir çalışmada 10 farklı asmadan (V. vinifera) elde edilen üzüm çekirdeklerinin antioksidan ve antiproliferatif aktivitelerini incelemişlerdir. Antiproliferatif aktiviteleri, MCF-7, NCI-H460, HCT116 ve MKN45 kanser hücrelerine karşı inceleyen grup, flavonoid miktarı ve polifenolik bileşenleri fazla olan türlerin yüksek radikal giderme aktivitesine sahip olmasının yanı sıra diğer türlerden daha yüksek antiproliferatif aktiviteye sahip olduklarını belirlemişlerdir (Sung ve Lee, 2010).

(14)

Halk arasında başta ağız ve yutak mukozası olmak üzere mide-bağırsaklar, idrar yolları ve nefes yolları mukozalarındaki tahrişleri önleyen gülhatmi (Alcea pallida), bu iltihapların yayılmasını engellemekte kullanılır. Tahrişli (yırtıcı) öksürüğü, kuru bronşiti ve ishali önler. Mikropların yayılmasını önleyerek vücudun savunma sistemini güçlendirir, mikropları daha kısa sürede zararsız hale getirir (Anonim, 2009).

Böbrek ve idrar kesesi taşları için Tayland‟da geleneksel ilaç olarak kullanılan gülhatmi (Hibiscus sabdariffa) çiçeği aynı zamanda antibakteriyel, antifungal, antispazmodik, diüretik, müsil, yüksek kan basıncını önleyici ve bağışıklık düzenleyici madde olarak da kullanılmaktadır (Ali ve ark., 1991; Chen ve ark., 2003, Dafallah ve Al-Mustafa, 1996; Farombi ve Fakoya, 2005).

Cai ve grubu, 50 farklı familyaya ait 112 tıbbi bitkinin antikanser özelliği ile beraber antioksidan aktivitesi ve fenolik bileşiklerini incelemişlerdir. Bu çalışmada fungop bileşenini oluşturan C1 maddesinin çekirdekleri kullanılmış ve bu bitkinin doğal antioksidan kaynağı ve etkili bir kanser önleyici madde olarak değerlendirilebileceğini belirtmişlerdir (Cai ve ark., 2004).

(15)

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1. Kullanılan Araç ve Malzemeler

 Mekanik karıştırıcı  Döner buharlaştırıcı  Değişik cam malzemeler  Metanol

 Tripsin EDTA (%25) Sigma

 Penicilin streptomycin solüsyonu (Sigma)

 DPBS (Dulbecco‟nun fosfat tampon tuzu) (Sigma)  Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) (Sigma)

 Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium-High glucose (Sigma)  Cell proliferation ELISA, BrdU kit (Roche)

 HeLa (İnsan rahim kanseri hücresi)  C6 (Sıçan Beyin Tümör Hücresi)

3.2. Bitkilerin Temin Edilmesi

Proje kapsamında çalışılan bitkiler (Malus floribunda (Rosaceae), Crataegus oxyacantha (Rosaceae), Alnus glutinosa L. gaertn (Betulaceae), Hypericum perforatum L. (Clusiaceae),

Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae)) Tokat ve çevresinden daha önceden toplanarak kurutulmuş,

Doğal Boyalar Uygulama ve Araştırma Merkezi‟nde depolanmıştır.

3.3. Bitkilerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) İşlemi

Bitki değirmeninde toz haline getirilen bitki numuneleri üçer gün oda sıcaklığında CH2Cl2/MeOH (1:1) karışımında ekstrakte edildi. Bu şekilde, bitkide bulunan bütün

maddelerin çözücü ortamına geçmesi sağlandı. Çözücü, evaporatörde (döner buharlaştırıcı) uzaklaştırılarak bitki ekstreleri hazır hale getirildi.

(16)

3.4. Biyolojik Aktivite Testleri için Stok Çözeltlerin Hazırlanması

Tüm numuneler, antiproliferatif aktivite testleri için 20 mg/1ml DMSO olacak şekilde hazırlandı. Hazırlanan stoklardan 25 μl alınarak 475 μl besiyeri eklenerek son stok konsantrasyonu 1 mg/ml olarak seyreltildi.

3.5. Hücre Kültürleri

Fungop bitki karışımının ve çalışılacak diğer bitkilerin hücreler üzerindeki antiproliferatif etkisi kanser hücre hatları (C6 ve Hela hücreleri) kullanılarak Demirtaş ve grubunun, 2009‟da açıklandığı gibi test edilmiştir (Demirtaş ve ark., 2009). C6 ve Hela hücreleri DMEM + 5% FBS+%2 pen-strep ihtiva eden besiyerinde konfluent olana kadar kültüre edildi, besiyeri steril olarak boşaltıldı, hücreler 10 ml trypsin-EDTA ile 1-2 dakika inkübe edilerek ve flask çalkalanarak hücre süspansiyonu 50 ml falkon tüpüne aktarıldı. Üzerine 10 ml besiyeri eklendikten sonra yarı hızda santrifüj edilerek hücrelerin çökeltilmesi sağlandı. Hücre çökeltisi 2 mL besi yeri ile süspansiyon haline getirildikten sonra, hücre konsantrasyonu belirlendi. Daha sonra her kuyucuğa 30000 hücre/100 µl hücre olacak şekilde pipetlenmiştir. 3.6. Antiproliferatif Aktivte Testleri

Fungop bitki karışımının ve halk arasında yaygın olarak kullanılan tıbbi öneme sahip bitkilerin antiproliferatif aktiviteleri, tümör hücreleri (insan beyin tümör hücreleri (C6), insan rahim kanseri hücreleri (Hela)) üzerinde hücre proliferasyon deneyi ile test edilmiştir (Tekin ve ark., 2002, 2005; Demirtaş ve ark., 2009). Bu amaçla yukarıda bahsedildiği gibi kültüre edilmiş tümör hücreleri 24 saat süreyle bahsedilen bitki ekstraktlarının farklı konsantrasyonlarıyla (5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ve 100 µg/ml) muamele edilmiştir. Ekstraktların hücreler üzerine olan antiproliferatif etkisi BrDU Cell ELİSA (Roche) kiti kullanılarak test edilmiştir. hücre proliferasyon deneyi ve Tripan mavisi boya alımı (Tripan Blue Dye Exclusion) yöntemiyle test edildi.

3.7. İmmunosupressif aktivite testleri

Proje bütçesinin yetersiz olması ve kan donoru hayvan temin edilememesi nedeniyle bu aktivite testleri yapılamamıştır.

(17)

4. BULGULAR

4.3. Antiproliferatif Aktivite Test Sonuçları

4.3.1. C6 Hücreleri ile Proliferasyon Deneyi Sonuçları

(Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvaceae), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) bitki ektrelerinin 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ve 100 µg/ml konsantrasyonlarının C6 hücrelerinin proliferasyonuna etkileri test edilmiştir. Test sonuçlarına göre yemişen ve asma yaprağı bitkilerinin özellikle yüksek konsantrasyonda ( 100, 75 ve 50 µg/ml) doza bağlı olarak, C6 hücresine karşı, konrol kanser ilaçları 5-FU ve cisplatinden daha yüksek antiproliferatif aktivite gösterdiği gözlenmiştir (Şekil 1). Test edilen ekstrelerden Meyan kökü ekstresi C6 hücrelerinin proliferasyonunu doza bağlı olarak aktivite artışı gösterirken, standartlarla karşılaştırıldığında dikkate değer etki göstermediği tespit edilmiştir (Şekil 1).

Şekil 4. 1. Yemişen, asma yaprağı ve meyan kökü bitki ekstrelerinin C6 hücre proliferasyonuna etkisi

Çalışılan bitkilerden kızılağaç ve japon elmasının ekstrelerinin C6 hücreleri üzerinde doz bağımlı antiproliferatif aktivitesinin gösterdikleri belirlenmiştir. Özellikle kızılağaç ve japon elmasının ekstrelerinin antiproliferatif aktivitesinin 100 μg/ml konsantrasyonda %80‟in

(18)

üzerinde olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.2). Kantaron bitkisinin ise tüm konsantrasyonlarda doza bağlı olarak antiproliferatif aktivitesinde artış gözlenirken, standartlarla mukayese edildiğinde önemli bir etkiye rastlanmamıştır (Şekil 4.2).

Şekil 4. 2. Kızılağaç, japon elması ve kantaron bitkilerinin C6 hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri

Çalışmamızda nar çiçeği ve hatmi ekstrelerinin yüksek dozlarda (100 ve 75 µg/ml) C6 hücre proliferasyonu standart bileşiklerle mukayese edildiğinde oldukça dikkate değer etki gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 4.3).

Şekil 4. 3. Nar çiçeği ve hatmi bitkilerinin C6 hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri

(19)

Bu çalışmada Fungop ve bileşenlerinin (P1, D1,C1) antiproliferatif aktiviteleri incelendiğinde hem Fungop KARIŞIM numunesinin hem de Fungop bileşenlerinin test edilen tüm konsantrasyonlarda C6 hücresine karşı etkili olmadığı tespit edilmiştir (Şekil 4.4). Ayak mantarı tedavisinde etkili biçimde kullanılan bu karışımın antiproliferasyon dışında bir mekanizma ile (antimikrobiyal, antifungal. vs.) etkisini gösterdiği düşünülmektedir.

Şekil 4. 4. Fungop ve bileşenlerinin C6 hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri

4.3.2. Hücreleri ile Proliferasyon Deneyi Sonuçları

(Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) bitki ektrelerinin 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ve 100 µg/ml konsantrasyonlarının HeLa hücrelerinin proliferasyonuna etkileri test edilmiştir. Test sonuçlarına göre yemişen bitki eksrelerinin test edilen 20-50 μg/ml konsantrasyonlarda kontrol bileşiklerden 5FU ile aynı seviyelerde (>%50) antiproliferatif etki gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 4.5). Buna karşin asma yaprağı ekstresinin 100 ve 75 μg/ml konsantrasyonlarda HeLa hücresine karşı her iki standarttan da daha yüksek, meyan kökü bitkisinin ise yüksek dozlarda standartlara yakın seviyede antiproliferatif aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 4.5).

(20)

Şekil 4. 5. Yemişen, asma yaprağı ve meyan kökü bitkilerinin HeLa hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri

Kızılağaç yaprakları, HeLa hücresine karşı 100 ve 75 μg/ml konsantrasyonda 5-Florourasilden daha yüksek aktivite gösterirken, Cisplatin ile hemen hemen aynı aktiviteye sahiptir. Düşük konsantrasyonlarda kızılağacın aktivitesi giderek düşmektedir. Diğer yandan, japon elması da 100 μg/ml „de %60‟ın üzerinde inhibisyon gösterdiği gözlenmiştir (Şekil 4.6). Japon elmasında ve kantaronda doza bağlı olarak aktivitede artış gözlenmiştir. Fakat tüm ekstrelerin özellikle düşük dozlarda standartlara göre antipeoliferatif aktivitesinin çok düşük oladuğu gözlenmiştir (Şekil 4.6).

Şekil 4. 6. A. glutinosa, M. floribunda ve H. perforatum bitkilerininHeLa hücresine karşı antiproliferatif aktiviteleri

(21)

Nar çiçeği ve hatmi bitki ekstreleri HeLa hücresine karşı tüm konsantrasyonlarda cisplatinden daha düşük aktivite gösterirken, her iki bitki ekstresi de 100-20 μg/ml konsantrasyon aralığında 5-FU ile paralel aktivite göstermektedir (Şekil 4.7).

Şekil 4. 7.H. sabdariffa ve A. pallida bitkilerinin HeLa hücresine karşı antiproliferatif

aktiviteleri

Fungop karışımı ve karışımı oluşturan bileşenlerin (P1, C1, D1) tün konsantrasyonlarda HeLa hücresine karşı etkili olmadığı gözlenmiştir (Şekil 4.8). Ayak mantarı tedavisinde etkili biçimde kullanılan bu karışımın antiproliferasyon dışında bir mekanizma ile (antimikrobiyal, antifungal. vs.) etkisini gösterdiği tezini desteklediğini göstermektedir.

(22)

5. TARTIŞMA ve SONUÇ

(Fabaceae), Vitis vinifera L. (Vitaceae), Alcea pallida (Malvacea), Hibiscus sabdariffa (Malvaceae) gibi bitkilerin değişik (Kök, Gövde, Çiçek, Yaprak, Tohum) kısımlarının antiproliferatif aktiviteleri C6 (sıçan beyin tümörü) ve HeLa (insan rahim kanseri) hücrelerine karşı test edilmiştir.

Yapılan test sonuçlarına göre C6 (sıçan beyin tümörü) hücresine karşı 100-75 μg/ml konsantrasyonlarda yemişen (C. oxyacantha), asma yaprağı (V. vinifera), kızılağaç (A.

glutinosa L. gaertn), Japon elması (M. floribunda), nar çiçeği (H. sabdariffa) ve hatmi çiçeği (A. pallida) bitki ekstreleri oldukça etkili bulunmuştur.

Diğer taraftan HeLa (insan rahim kanseri) hücresine karşı ise asma yaprağı (V. vinifera), kızılağaç (A. glutinosa L. gaertn), meyan kökü (G. glabra), nar çiçeği (H. sabdariffa) ve hatmi çiçeği (A. pallida) bitkilerinin 100-75 μg/ml konsantrasyonlarda yüksek antiproliferasyon gösterdiği tespit edilmiştir.

Kızılağaç, asma yaprakları, nar çiçeği ve hatmi ekstreleri her iki kanser türüne karşı etkili olduğu göz önüne alındığında bu bitkilerin literatürdeki yerinin önemini arttırdığı söylenebilir. 2010‟da yapılan bir çalışmada, asma ağacının meyvesi olan üzüm çekirdeklerinin HCT116 (bağırsak kanseri) ve MKN45 (mide kanseri) hücrelerine karşı hücre büyümesinde inhibitör aktivite gösterdiği belirlenmiştir (Sung ve Lee, 2010). Kızılağacın gövdesinin ise potansiyel antikanser ajanı olabileceği Frédérich ve grubu tarafından tespit edilmiştir (Frédérich et al., 2009).

Akim ve grubu, ticari olarak satın alınan nar çiçeği (Hibiscus sabdariffa) sularının antioksidan ve antiproliferatif aktivitelerini incelemişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucunda, nar çiçeği suyunun saklama zamanlarına bağlı olarak değişen güçlü antioksidan ve 4 kanser hücresine (MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri, Caov-3 yumurtalık kanseri, HeLa rahim kanseri hücreleri) karşı yüksek antiproliferatif aktivite gösterdiklerini saptamışlardır (Akim et al., 2011).

(23)

Yemişen bitkisinin yer aldığı Crataegus cinsi Verma ve grubu tarafından derleme olarak yapılan bir çalışmada ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Bu çalışmaya göre, C. oxyacantha dahil birçok Crataegus türünün benzer farmakolojik aktivitelere sahip olduğu saptanmıştır (Verma et. al., 2007). Çiçeklerinden elde edilen ilacın anti-spazmodik, düşük tansiyon, kalp kuvvetlendirici, diüretik ve sinir yatıştırıcı özelliklere sahip olduğu bilinmektedir (Anonim, 2006). Kardiyovasküler hastalıklara etkisinin dışında bu türlerin antioksidan aktivite (Brchm et al., 1995) ve anti-inflammatuar özellik (Anonim, 2011) gösterdiği belirlenmiştir.

HeLa hücresine karşı etkili olan meyan kökünün (G. glabra), ülser, astım, anti-diüretik, anti-hepato toksik aktivitelerine sahip olduğu; ekzema ve sedef hastalığı ile uçuklarda etkili olduğu klinik olarak kanıtlanmıştır (Monograph, 2005).

Elde edilen sonuçlar, yukarıda verilen literatür araştırma sonuçlarıyla paralellik göstermektedir. Bunun yanı sıra, proje kapsamında antiproliferatif aktivite testleri gerçekleştirilen bitkilerin tamamına yakını çalışılan kanser hücreleri (C6 ve HeLa) bakımından orjinallik göstermektedir. Bu bağlamda, yüksek antiproliferatif aktivite gösteren bitkilerin literatürdeki önemi arttırılmış ve antikanser ajanı olarak kullanılabilirliği yönünde yeni bir yol göstermesi bakımından bilime katkısı oldukça fazla olduğu ortaya çıkartılmıştır.

(24)

Kaynaklar

Akim, A., Ling, LC., Rahmat, A., Zakaria, ZA., 2011. Antioxidant and anti-proliferative activities of roselle juice on Caov-3, MCF-7, MDA-MB-231 and HeLa cancer cell lines,

African Journal of Pharmacy and Pharmacolgy, Vol., 5 (7), 957-965.

Ali, MB., Salih, WM., Mohammed, AH. and Homeida, AM., 1991. Investigation of the antispasmodic potential of Hibiscus sabdariffa calyces, Journal Ethnopharmacol, 31, 57-249. Anonim, 2004. http://www.losev.org.tr (14.11.2004)

Anonim, 2006. Hawthhorne Berry info and Products-great fort he hearth.

http://www.bodybuilding.com/store/haw.html (25.08.2011). Anonim, 2009. http://www.draligus.com.tr (31.10.2009)

Anonim, 2011. Dr. Duke‟s phytochemical and ethnomedicinal database. http://www.ars-grin.gov/duke/index.html (25.08.2011).

Brchm, M. et al., 1995. Comperative antitumor activity of doxorubicin plus two radical scavenging plant extract preparations (Ginkgo biloba, Crataegus oxyacantha) and of doxorubicin alone. Conbrib Oncol. 48, 48-52.

Cai, Y., Luo, Q., Sun, M., and Corke, H., 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer, Life Sciences, 74, 2157-2184.

Calliste, CA., Trouillas, P., Allais, DP., Simon, A., Duroux, JL., 2001. Free radical scavenging activities measured by electron spin resonance spectroscopy and B16 cell antiproliferative behaviors of seven plants, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol., 49, 7, 3321-3327.

Chen, C.C., Hsu, J.D., Wang, S.F., Chiang, H.C., Yang, M.Y., Kao, E.S., Ho, Y.C. ve Wang, C.J., 2003. Hibiscus sabdariffa extract inhibits the development of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 5465-5472.

D‟Angelo, S., Morana, A., Salvatore, A., Zappia, V., Galletti, P.,2009. Protective effect of polyphenols from Glycyrrhiza glabra against oxidative stress in Caco-2 cells, Journal of

Medicinal Food, Vol. 12, 6, 1326-1333.

Dafallah, AA. and Al-Mustafa, Z., 1996. Investigation of the antiinflammatory activity of Acacia nilotica and Hibiscus sabdariffa, The American Journal of Chinese Medicine, 24, 263-269.

Farombi, EO. ve Fakoya, A., 2005. Free radical scavenging and antigenotoxic activities of natural phenolic compounds in dried flowers of sabdariffa L., Molecular Nutrition and Food

Research, 49, 1118-1120.

Frédérich, M., Marcowycz, A., Cieckiewics, E., Mégalizzi, V., Angenot, L., and Kiss, R., 2009. In vitro anticancer potential of three extracts from the Walloon Region forest, Planta

(25)

Frédérich, M., Marcowycz, A., Cieckiewicz, E., Mégalizzi, V., Angenot, L., Kiss, R., 2009. In vitro anticancer potential of tree extracts from the Walloon Region Forest, Planta. Med., 75(15),1634-1637.

Harada, T., Kurahashi, W., Yanai, M., Wakasa, Y., Satoh, T., 2005. Involvement of cell proliferation and cell enlargement in increasing the fruit size of Malus species, Scientica

Horticulturae, 105, 447-456.

Klug, WS., and Cummings, MR., 2002. Genetik, 6. Baskı, Palme Yayıncılık, Ankara, 24, 28, 635-651.

Martarelli, D., Martarelli, B., Pediconi, D., Nabissi, MI., Perfumi, M., and Pompei, P., 2004.

Hypericum perforatum methanolic extract inhibits growth of human prostatic carcinoma cell

line orthotopically implanted in nude mice, Cancer Letters, 210, 27-33.

Monograph., 2005. Glycyrrhiza glabra, Alternative Medicine Review, V 10, N 3, 230-237. Parry, J., Su, L., Moore, J., Cheng, Z., Luther, M., Rao, JN., Wang, JY., and Yu, LL., 2006. Chemical compositions, antioxidant capasities, and antiproliferative activities of selected fruit seed flours, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 3773-3778.

Patocka, J., 2003. The chemistry, pharmacology, and toxicolgy of the biologically active constituents of the herb Hypericum perforatum L., Journal of Applied Biomedicine, 1, 61-70. Rahimi, R., Ghiasi, S., Azimi, H., Fakhari, S., and Abdollahi, M., 2010. A review of the herbal phosphodiesterase inhibitors; Future perspective of new drugs, Cytokine, 49, 123-129. Rathi, SG., Suthar, M., Patel, P., Bhaskar, VH., Rajgor, NB.,2009. In vitro cyctotoxic screening of Glycyrrhiza glabra L. (Fabaceae): A natural anticancer drug, 1 (3), 239-243. Sung, J., and Lee, J., 2010.Antioxidant and antiproliferative activities of grape seeds from different cultivars, Food Sci. Biotechnol., 19 (2), 321-326.

Sung, J., Lee, J., 2010. Antioxidant and antiproliferative activities of grape seeds from different cultivars, Food Sci. Biotechnol., 19 (2), 321-326.

Verma, SK., Jain, V., Verma, D., and Khamesra, R., 2007. Crataegus oxyacantha : a cardioprotective herb, J. Herb Med Toxicol, 1, 65-71.

Verma,SK., Jain, V., Verma, D., and Khamesra, R., 2007. Crataegus Oxyacantha- A Cardioprotective Herb, Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 1(1), 65-71.

Yalçın, A., 1999. Şifalı Bitkiler Ansiklopedisi, Geçit Kitabevi, No : 9, İstanbul

Yoshizawa, Y., Sakurai, K., Kawaii, S., Soejima, J., and Murofushi, N., 2004. Antiproliferative and antioxidant properties of crabapple juices, Fd Sci. Technol. Res., 10 (3), 278-281.

Yücel, E., ve Tülükoğlu, A., 2000. Gediz (Kütahya) çevresinde halk ilacı olarak kullanılan bitkiler, Ekoloji Çevre Dergisi, 9 (36), 12-14.9

(26)