A~ U. Ve/o Fak. Derg. 30 (4) : 542-549, 1983
CA:-'1PYLOBACTERJEJUNI SUŞLARINI;\j DNA HİDROLIz VE ALKALIN
FOSFA-TAZ AKTİvıTELERİ
Serdar Diker* Ersİn İstanbulluoğlu**
DNA hydrolysis and alkaliDe phosphatase activities of Caınpylobacter jejuDi strains
Summary: In this study, two dijferent methods were used for both DNA hydrolysis and alkaline phosphatase activities of Campylobacter jejuni strains isolated from gallbladder of sheep and caltle. T wo tests used for DNA hydrolysis and alkaline phosphatase activities were deseribed by Hebert et al.Other two methodsfor detecting DNA hydrolysis and alkaline phosphatase activities developed by Pham and by Holmberg, respectively, were applied to
C.jejuni in our laboratory. Several biochemical tests like H ıS production, hip-pura! hydrolysis and growth on charcoal yeast extmct (CrE) agar were also studied for their usefulness for the examination of C.jejuni stmins.
qf the63 stmins tested, 53from sheep and
ı
o
from caltle, 22 (34.9 %)hydro(p:.ed DNA. Alkaline phosphatase activit)! was detected in 25 (39.6 %)
oj the strai/LS . In the other biochemical tests, most oj the isolates (80.9 %) hyd-rolyzed sodium hippurate and (84.
ı %l
grew on chanoal yeast extract agar. Of the63 C.jejuni strains studied, 49 (77.7 0;:)) produced HıS in an ordina~y media.DNA hydrolysis and alkaline phosphatase activı~y tests applied to C. je-Juni strains were found to be much suitable than the original ones. The results
also showed that these tests with afew additional ones could be usedfor hioryping of C.jejuni.
Özet: Bıı araştırmada, Campylobacter jejuni suşlarının DNA hidroliz ve alkaliııefosfataz aktivitelerini belirlemek için iki farklı yöııtem kullanıldı. Ayrı-ca bu türiin identijikasyonundaki kullanılabilirliklerini saptamak için çeşitli biyoki"?yasal testler yapıldı. K~yımlardan izole edilen 53 ve sığırlardan izole
* Arş. Gör., A. C.Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.
CAMPYLOBACTER JEJUNI SUŞLARININ DNA HiDROLiz.. sı:ı
edilen LOadet olmak ü<.eretoplam 63 suşu n22 si (% 34.9) DNAyı hidroli<.e etti ve 25 i (% 39.6) alkalin fosfata<. aktivitesi gösterdi. Laboratuvarımıda
C. jejuni i<.olatlarırtauygulanan iki.yöntem diğerlerinden daha kullanışlı bulundu.
Diğer b~yokimyasal testlerde, C. jeJuni suşlarının
%
80.9 u hippuratı hidrolı"<:eetti,
%
77.7 si H /) oluşturdu ve%
84.1 i CYE agarrla üredi. GirişCampylobaeter J~juni, son yıllarda gerek veteriner hekimlikte gerek-se insan hekimliğinde önemi gitikçe artan patojenik bir mikroorganiz-madır. Yeni izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesi ile ortaya çıkan bu patojen, özellikle insanlardaki gastroenterit olgularının büyük kısmının sorumlusu olarak kabul edilmektedir (3, 12, 15,
ı
7,20). Bunun yanı-sıra, enteritli hayvanlardan da izole edildiği çeşitli araştırmacılar ta-rafından bildirilmiştir. C. JeJuni sığır, koyun, köpek, kedi, at ve ke-miricilerde infeksiyonlara neden olabilmektedir (I ,2, 8, i3, 17, 23). Sağlıklı hayvanların da barsaklarında ve safra keselerinde bulunan bu mikroorganizmanın, gerek hayvansal gıda maddeleri ile ve gerekse direk olarak insanlara bulaştığı ve C. Jejuni nedenli insan infeksiyon-larının bu kaynaklardanköken aldığı gösterilmiştir (4, 5, 7, 18, 24). Bu mikroorganizmanın Türkiye'deki sağlıklı ve sürgünlü hayvan po-pulasyonlarında varlığı saptanmıştır (6).Yukarıda açıklanan nedenler ile üzerindeki ilgi gittikçe artan C. Jejuni'nin çeşitli kaynaklardan izole edilen suşlarının biyotiplendiril-mesigereği ortaya çıkmıştır. Biyotiplendirme için çeşitli yöntemler öneren araştırmacılardan Skirrow ve Benjarnin (21) C. J~juni'yi H ıS oluşturma özelliklerine göre iki biyotipe ayırmışlardır. Hebert vc ark. (I O) ise, C. Jejuni'yi hippurat hidrolizi, DNA hidrolizi ve CYE (Charcoal Yeast Extract) agarda üreme testlerinden oluşan bir tab-loda biyotiplendirmeye çalışmışlar ve mikroorganizmanın 8 biyoti-pini ayırmışlardır. Bu kaynaklar, ayrıca diğer bazı biyokimyasal test-lerin C. JeJuni'nin biyotiplendirilmesinde kullanılabileceğini bildirmiş-lerdir.
Bu araştırmada, DN"A hidroliz ve alkalin fosfataz testlerinin C.
Jejuni biyotiplendirilmesindc kullanılma olanakları incelenmiştir. Ay-rıca, C. Jejuni'nin DNA hidroliz ve alkalin fosfataz aktivitelerinin sap-tanması amacıyla Hebert ve ark. (ıo) tarafından kullamlandan farklı iki yöntem C. jejuni suşları na uygulanarak bunlann pnıtiklik açı-sından karşılaştırılmaları yapılmıştır.
SH S. DiKER - E. iSTANBULlUOGlU
~ateryaı ve ~etot
Kampilrıbakter suşlan: Bu ara~tırmada, 100 adet sığır safra kesesi n-den izole edilen i0, ve
ı
00 adet koyun safra kesesinden izole edilen 53 olmak üzere toplam 63 Campylobaeteıjejııııi suşu kullanıldı.İzolasyon: S;\fra keselerinin iç cidarından steril ekü\'yonlar ilc toplanan örnekler, iO mg jl vancomycin, 5 mg / i trimethoprim lacta-te, 2500 III
ii
polymyxin B ve%
7 defibrine koyun kanı içeren Blood Agar Base NO.2 (Oxoid) besiyerine ekiIdi (I g). Ekim yapılan besi. yerleri, Gas-Pak (Oxoid) ile birlikte katalizörsüz aııaerobik jara konu-larak 37 oC de 3 gün bekletildi . .Jarlar bu sürenin sonunda incelenmek üzere a<;:ıldı.jdentifika~)'on: Besiyeri üzerinde yaygın ~ekilde üreyen tipik kolo-niler Gram yöntemi ilc boyandılar ve karanlık saha mikroskopu ile hareket muayeneleri yapıldı.
c:.
jejllTli su~larının identifikasyonu için oksidaz, katalaz, hidrojen sülfür, nitrat ve sodyum selenit gibi biyo-kimyasal testler ile ayrıca, 25 cC, 42 oC de üreme,%
i glisin ,%
3.5 sodyum klorür ,30 I11cg/ ml nalidiksik asit ve 400 mcg / ml TTC (trip-henyl tetrazalium chlorid) 'c tolerans testleri kullanıldı. Ayrıca bu su~-ların hippuratı hidrolize etme ve CYE agarda üremc yetenekleri in-celendi.DNA hidroliz testi: C. jejuni suşlarının DNA'yl hidrolize etme ö-zelliklerini belirlemek için iki farklı yöntem kullanıldı.
J. Yöntem: Hebert \OT arkadaşları (ıo) tarafından geliştirilen metot
kullanıldı. 1\feti i yeşil iniii (Merck)
%
O.j'lik solusyoııu hazırlanarak,critilmiş J)~A ase Test Agar (Oxoid) içine
%
O. OOS oranında katıldı. Kanlı agarda üretilmiş 24 saatlik C.j~jııni kültüründen bir özde dolusu alınarak, bu besiyeri üzerinde i cm çapında bir alana ekiidi. Her bir petri kutusuna altı suştan ekim yapıldı. Kültürler mikroaerofilik ko~ullarda 35"C de 3 gün bekletildi. Bu sürenin sonunda, mavi - yeşil hesiyerinin renginin ekim yapılan su~ıarın çevresinde renksizlqmesi, pozitif sonuç, renk deği~ikliğinin olmaması negatif sonuç olarak değer-lendirildi. Her tcstte bir ,':;taph. a7lreussu~u pozitif kontrololarak kul-lanıldı.ll. YiJntem:Bu test için Pham ve arkadaşları (16) tarafından geliş-tirilen yöntem laboratuvarımızda C.jejuni suşiarına uygulandı. Taze C.jejııni kültüründen bir öze dolusu alınarak DNA ase Test Agar üze-rinde bir cm çaplı bir alana ekiidi. Besiyerleri mikroaerofilik
koşul-CAMPYLOBACTER JEJUNI SUŞLARININ DNA HIDROL1Z.. sı5
larda 3 gün inkübe edildi. Bu sürenin sonunda besiyeri üzerine i ~ HCl asit dökülerek bir dakika bekletildi. Bulanık bir renk alan be-"iyel'inde, suşların <;evresinde renksiz bir alanın oluşması pozitif: bu-lanık rengin değişmemesi negatif sonuçlar olarak değerlendirildi. Her testtc bir Staph. allrells suşu pozitif kontrololarak kullanıldı.
Alkalin fosfata:;: aktivitesi: C. jejllni suşlarının alkalin fosfataz akti-"itelerini helirlemek için iki f~ırklı yöntem kullanıldı.
I. Yöntem: Hebert ve ark. (IO) tarafından geliştirilen metot kullanıldı. Fosfataz substratını hazırlamak için i00 mg p-nitrophenyl phosphate disodiuın tetrahydrate (Sigma) 25 ml distile suda eritildi ve üzerine 0.00 i
ıvı
MgC 12 de O. i M glisin içeren karışımdan 25 mL.eklendi. Karışım 0.3 ml miktarında küçük şişelere konularak -20°C de saklandı. C.jejuni'nin 24 saatlik kültüründen bir öze dolusu alınarak, içinde 0.3 ml fizyolojik tuzlu su bulunan vidalı küçük birtüptc yoğun şekilde siispaıısc edildi. Bu süspansiyonun üzerine daha önce hazırlan-mış olan fosfataz su bstratı eklenerek :-{5oC de 6 saat bekletildi. Bu sü-renin sonunda tüpteki karışımın renginin sarı olması pozitif ,renksiz reaksiyon ise negatif sonuç olarak değerlendirildi.
ll.Yöntem: Bu test i<;in, Holmberg (II) tarafından kullanılan me-tot laboratuvarımızda C. jejllni suşbnna uygulandı. Zenginleştirilmiş agara filtrasyon ile sterilize edilmiş
%
i lik phenolphthalein (Oxoid)%
i oranında katıldı. C. Jejuni'nin kanlı agardaki 24 saatlik kültürün-den bu besiyerine ekim yapılarak 35 oC de 3 gün bekletildi. Bu sürenin sonunda besiyerleri amonyak buharına tutuldu. Kolonilerin pembe renk alması pozitif, renksiz kalması ise negatif sonuç olarak değerlen-dirildi. Her testte bir Staph. aureus suşu pozitif kontrololarak kullanıl-dı.Bulgular
İdentifikasyon amacı ile yapılan tolerans testleri ve biyokimyasal testlerin tümünde incelenen 63 suş C.j~jııniiçin tipik olan özellikleri gös-gösterdiler. 63 suşu n
~.<)
100'ü oksidaz, katalaz, nitrat ve wdyum selenit testlerinde ve TTC tolerans testlerinde pozitif bulundu. Bu suşların tamamı (% 100) 42°C'dc üredi, hiç biri 25°C de ve nalidiksik asit varlığında üremedi. C. jejuni olarak ayrılan 63 suşu n 51 i(%
80.9) hippuratı hidrolize etme, 49'u (% 77.7) H2S oluşturma, 53'ü (:~ 84.1)S. DiKER - E. iSlANBULLUOGlU
İncelenen 63 C.jejuni suşunun 22si «10 34. 9) D~A hidrolizine neden oldu. DNA hidrolizinin belirlenmesi için kullanılan her iki yöntemd(~ de sonuçlar paralellik g-österdi, Fakat, laboratuvarımızda
C.jejuni suşlarına uygulanan II. yöntemde sonuçların diğerine göre
da-ha kesin okunduğu belirlendi.
Laboratuvarda C.jejuni suşlarına adapte edilen II. yöntem ile çalışılan 63 suşun 25 i (% 39.6) alkalin fosfataz aktivitesi gösterdi.
ı.
yöntem ilc incelenen suşların 20 si (% 3i.7) pozitif: 12si (% 19.O) şüpheli bulundu.Tartışına ve Sonuç
Kampilobakter türlerinin identifikasyonu ve bu türlerin içindeki alt türlerin veya suşların belirlenmesi için çeşitli biyokimyasal test-lerden yararlanılmaktadır. C. j~julli suşları çeşitli biyokimyasal test sonuçlarına göre heterojen gruplar oluşturma özelliğine sahip mikro-organizmalardır. Suşlar arasındaki bu heterojenitenin, bunların izole edildiği kaynakla ve kültürün yaşı ile ilişkisi olduğunu gösteren belirli kanıtlar yoktur. Buna karşın C.jejuni dışında kalan diğer kampilobak-ter türleri, tür içinde, çeşitli biyokimyasal sistemlerde homojen' sonuç-lar vermektedirler.
Hebert ve arkadaşları (10) tarafından kullanılan DNA hidroliz testinin esası, mikroorganizmanın salgıladığı DNA az enziminin be-siyerindeki DNA'yl parçalaması sonucu, metil yeşilinin D~A komp-leksinden ayrılarak besiyerini renksizleştirmesine dayanır. Labora-tuvarımızda C.Jejuni suşlarına adapte edilen yöntemde ise, mikroor-' ganizmanın parçaladığı DNA, besiyeri üzerine dökülen HCl 'asit ile birleşmemekte ve reaksiyon alanı renksiz kalmaktadır. Her iki 'yöntem ile incelenen C.jejuni suşlarının
%
34.9 unun DNA hidrolizine neden olduğunu belirledik. Hebert ve arkadaşları (I O) araştırmamızdan elde ettiğimiz sonuçlara yakın olarak, C.jejuni suşlarının DNA'yl hidrolize etme oranlarını%)
46 olarak belirlemiştir. Smibert (22) ise, değişik bir besiyeri kullanarak bu oranı%
60 olarak saptamıştır Bu sonuçlar C.jeJuni suşlarının hcterojenik özelliğini yansıtmaktadırlar.' Hebert ve ark. (I O)'tarafından kullanılan yöntem ile bizim kullandığımız yöntem karşılaştınldığıııda C. jt'juııi'yc uyguladığımız yöntemin, sonuçların daha kesin okunması ve besiyerinin daha kolay hazırlanması gibi üs-tünlükleri olduğu kanısına varılmıştır. Ayrıca, Hebert ve ark. (10) da kendi yöntemlerinde' %4.4 oranıııda şüpheli reaksiyonht karşılaştı-ğını bildirmişlerdir.
CAMPYLOBACTER JEJUNI SUŞLARININ DNA HİDROLİz. . . 517
Adapte edilen yöntem ile incelenen C.jejuni su~larının
%
39. 6'S1 alkalin fosfataz aktivİtesi göstermi~tir. Hebert'in yöntemi ile incelenen su~larda ise%
31.7 oranında pozitif reaksiyonun yanı sıra%
19 ora-nında ~üphcli reaksiyon saptanmıştır. Smibcrt (22), üzerinde çalı~tığıC.jejuni su~larının
%
67'sinin alkalin fosfataz aktivitesi gösterdiğinibildirmiştir. Hebert ve ark. (10) ise, su~ların
%
38 'nin pozitif, ~.~ 34.6'nın şüpheli sonuçlar verdiğini belirlemi~lerdir. Ara~tırmacılar, önceden biyotiplendirme amacıyla kullanmayı planladıkları bu testin çok sayıda ~üpheli sonuç vermesi üzerine, testi biyotiplendirme şema-sından çıkardıklarını açıklamı~lardır. Laboratuvarımızda kullanılan yöntem ise oldukça kesin sonuçlar verdiği için, alkali n fosfataz testinin tekrar biyotiplendirme şemasına alınmasını sağlayacak niteliktedir.Skirrow ve Benjamin (21) tarafından C.jejımi suşlarının biyotip-lendirilmesinde kullanılan HıS testi ilc araştırmam1zda kullanılan HıS testlerinin yöntemleri farklı olduğundan, bu biyotiplendirme ~ekli ile bir karşılaştırma yapmak mümkün olmamı~tır. Çünkü aynı C.jejuni
susundan bu iki yöntem ile farklı sonuçlar alınabilmektedir.
Birçok ara~tırıcı tarafından Cjejuni'nin ayırıcı karakteri olarak ka-bul edilen hippurat hidrolizi yönünden incelenen su~ların
%
80.9 IIbu testtc pozitif bulundular (9, 14). Hebert ve ark. (10), insan-lardan izole edilen C.jejuni suşlarının
%
90, hayvanlardan izole edilen su~ların ise%
30 oranında hippuratı hidrolize ettiğini bildir-mi~tir. Bu sonuçlar, testin insan ve hayvan su~ları arasında kaqıla~tır-ma yapkaqıla~tır-mak amacıyla kullanılabilcceğini göstermektedir.Biyokimyasal testlerde oldukça farklı sonuçlar veren C.jejuni su~-larının, belirli biyotip sınırları içine sokulması, mikroorganizmanın olu~turduğu infeksiyonların epidemiyolojik yönlerinin daha iyi anla-şıırnasını ve infeksiyon ile daha iyi sava~ılmasını sağlayacaktır. Yur-dumuzda, C.jejuni ile ilgili sadece bir ara~tırına yapılmı~ olduğundan, ara~tırmamızııı sınırlı sayıdaki materyali ile elde edilen sonuçları!}, Türkiye geneline getirilmesi ve diğer ülkelerdeki çalışmaların sonuçları ile kar~ılaştırılması güçtür. Fakat, en azından, özellikle Kanada, İn-giltere ve Amerika Birleşik Devletleri gibi deği~ik coğrafi konuma sahip ülkelerde izole edilen C.jejuııi su~ları ile yurdumuzda izole edilen su~-lar arasında bazı farkların bulunduğu anla~ılmaktadır.
Daha fazla sayıda materyal ile ve Türkiye'nin deği~ik yörelerin-den alınan örneklerle izolasyon çalı~malarının yapılmasının ve izole edilen su~ların çeşitli biyotiplerinin saptanması için halen var olan
548 S. DiKER - E. İSTANBULLUOGLU
sistemlerin yanısıra yeni testlerin araştırılmasının bu İnfeksiyon soru-nun çözümü içİn gerekli olduğu kanısındayız.
Literatür
1- Al.Mashat, R.R. and Taylor, D.J. (1980): Compylobacler spp in CIlleric lesions in caIlle.
Vet. Rec., 107: 31-34.
2- Al-Mashat, R.R. and Taylor, D.J. (1980): Producıion of diarrhoea and dysentıy in ex-perinıenlal calves by feeding pure wllures ofCampylobacıer felus subsp. jejuni. Vet. Ree., 107:
459-464.
3- Blaser, M.J. and ReUer, L.B. (1981); Camp)'lobacıer enteritis. New England J.Med., 305 :493-495.
4- Blaser, M.J., Checko, Po, Bopp, C., Bruce, A. and Hughes, J.M. (1982): Campy-lobacler enleritis associated with foodborne trasmission. Amer. J. Epidemiol, 116: 886-894. 5- Bolton, F.J., Dawkins, H.C. and Robertson, L. (1982): Campylobacıer jejuni/ coli in
aballoirs and butchers shojlS.J.Infeet., 4: 243-245.
6- Diker, S. ve İstanbulluo~lu, E. (1983): Sağlıklı oe sürgünlü hayvaıılardaı! Campylobac-ler felus subsp. jejUlıi izolaS)'onu üzerinde çalışmalar. A. Ü. Vet. Fak. Derg., 30: 28-34.
7- Doyle, M.P. and Roman, D.J. (1932): Prn'alence and survivalofCampylobaclerjeju11i in ıınpasteurized milk. App!. Environ. Microbio!., 44: i 154-1 158.
8- Fox, J.G. (1982): Campylobacteriosis-a "new" disease in laboralory Glıimals. Lab. Anim. Sei., 32: 625-637.
9- Harvey, S.M. (1980): Hippıırate lıydrolysis by Campylobacıer feıus. J. Clin. Mierobio!., ii: 435--437.
10- Hebert, G.A., Hollis, D.G., Weaver, R.E., Lambert, M.A., Blaser, M.J. and Moss, C.W. (1982): 30 years of campylobacters: biochemical characleristics and a biotyping proposalfor Campylobarıer jejuni . .J.Clin. Microbio!., 15: 1065-1073.
11- Hohnbeı'g, O. (1973): Sıaphylococcııs epidermidis isolaled from bovine milk. Aeta Vet. Scand. Supp!. 45: 1-144.
12- Karmali, M.A., Penner, J.L., Fleming, P.C., Williams, A. and Henessy, J.N.
(1983): The serotype and biotype distribution of clinical isolates of Campylobacler jejUlıi and Campylobacter coli over a ıhree-)'earperiod ..J.Infect. Dis., 147: 243-246.
13- Laregina, M. and Lon>gro, J. (1982): Isolation ofCampylobacler fetııS sııbsp. jejtllıi from
hamslers wiıh proliferaıiı'e ileiıis. Lab. Anim. Sci., 32: 660-662.
14- Luechte!eld, N.W. and Wang, W-L.L. (1982): Hippurate hydrolysis by and ıriphenyl-telrazoliıım lolerance q[ Camp)'lobacler feıus. J.Clin. Microbiol" 15: 137-140.
15-- Norkrans, G. and Svedhem, A. (1982): Epidemi"logical aspecls of Campylobacıer jejuni enlerilis.J. Hyg., 89: 163--170.
iG- Pham, A.V. and Davis, G.H.G. (1979): A modified thermonııclease lesi for Sıaphylococ-clls auretlS itienlificalion. Aust. J.Med. Techno!., 10: 29-31.
CAMPYLOBACTER JEJUNI SUŞLARININ DNA HİDROLİZ... 549
17- Prescott, J.F. and Munroe, D.L. (1982): Campylobaeıer eııleritis iTl man and oomeslic animals ..l.Amer. Vet. Med. Ass., 181: 1524-1530.
18- Robinson, D.A. andJones, D.M. (1981): Milk bOTTleCtlmlrylobaelerinfeetion.Br. Med.J., 282:1374-1376.
19- Skirrow, M.B. (1977): Compylobaeler eııleriıis: a "new" disease.Br. Med. J.,2 :9-1
ı.
20- Skirrow, M.B. (ı982) :Camp)'lobaeter enleritis-the first jive years. J. Hyg., 89: 175-184. 21- Skirrow, M.B. and Ben.iaınin, J. (I 980): Dlffereıltiatioıı of eııteropathogenieeampylobae-ler ..l. Clin. PathoL., 33: iın.
22- Sınibert, R.M. (1974): CentLSil. Campylobaeıer. In R.E.Buehanan andNoE. Cibbons (Ed), Bergey's manııal of deleTllıinalive hacteriology, 8 ılı ed. The Williams and Wilkins Co., Bal-timon:.
23- Vandenberghe, J., Lauwers, S., Plehier, P. and Hoorens, J. (I 982) : Camp)'lobae-ler jejl/ni relaled with diarrhoea in dogs. Br. Vct ..l., 138: 356-361.
24- Weınpe, J.M., Genigeorgis, C.A., Farver, T.B. and Yusufu, H. I. (1983):
Pre-valeııee of Campylobaeter jejuni in Iwo clıieken proeessiııg plaııt. Appl. Environ. Microbio!., 45: 355-359.
