MİKROBİYOLOJİDE
BİYOTEKNOLOJİ
Biyoteknoloji;
Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan
manipulasyonlarla
yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler
elde etmektir
1920’li yıllar...
Mikrobik biyoteknoloji,
yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim sistemlerinin kolaylaştırılması, ……
Tarımsal biyoteknoloji,
gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan teknoloji
Hayvan biyoteknolojisi,
hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi)
başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar)
Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek, ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir.
4
Adli Biyoteknoloji:
Parmak izi yöntemi,
1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi
Tıbbi biyoteknoloji
hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde,
hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun
çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi,
Restriksiyon endonukleazlar:
Bakterilerde dışarıdan hücrelere giren,
bazı özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak, mutasyonlar meydana getirmesine mani olmak
ve böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla görevli enzimlerdir
Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler.
RE’lerin aktivitelerini gösterebilmeleri için bazı
optimal koşulların sağlanması gereklidir.
Ör: ısı, pH, buffer vs..Gen Klonlaması (moleküler klonlama)
Önemli bir ürünün (ya da proteinin) sentezini kodlayan genin
ait olduğu hücre genomundan özel yöntemlerle kesilerek çıkartılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA’sı ile birleştirilerek
alıcı bir hücreye transfer edilmesi,
8
Nukleik asitlerin
(DNA/RNA)invitro amplifikasyon yöntemleri
Çeşitli organ, doku ve sıvılardan izole edilen
genetik materyaller enzimatik olarak
çoğaltılır
bu genetik ürünler
ya homolog problar kullanılarak hibridizasyon
ya da elektroforezis ve boyama sonrası direkt
10
Polymerase Chain Reaction-PCR
Prensip:
Hedef genetik materyallerin (
DNA/RNA*)
spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile
enzimatik
olarak sayısal çoğaltılması
Hedef DNA sekansları
İki tür spesifik oligonukleotid primerleri
(15-30 bazlık, tek iplikcikli)
Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz)
Dört tür dNTP
Tampon çözelti, MgCl2
12
Hedef DNA sekansları
varlığı aranan, amplifiye edilmek istenen hedef DNA
kan, serumu, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli gibi inceleme örneklerinden ekstrakte edilerek ve
Primerler:
Replikasyonun başlama noktası
Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen, bir çift kısa sentetik oligonukleotid
14
Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat )
20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda)
Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl2’u bağlar konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı…
Enzim (Taq Polymerase)
Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı
polimeraz enzimi
Tampon çözelti, Magnezyum
Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl2 bulunmaktadır.
Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween 20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz enzimini stabilitesi için katılabilir.
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
2- Primerlerin bağlanması
3- Sentez/Uzama
Hedef sekans Yeni DNA Yeni DNA16
PCR’ın aşamaları
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar
Yüksek ısı: 94-96 °C
Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C
PCR’ın aşamaları
2- Primerlerin bağlanması
(Annealing/hibridizasyon)
Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede
kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır.
Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar
genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C)
18
I. basamak
II. basamak
http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html
Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir
PCR’ın aşamaları
3-Sentez
(
Polimerizasyon/Uzama/Extension)Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’
yönde uzatılması
Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede gerçekleştirilir
20
3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir.
Sonuçların değerlendirilmesi
Elektroforez
PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon) agarose ya da poliakrilamid jele bilinen işaret DNA lar (DNA marker)
ve
kontrol PCR ürünleri ile birlikte
yüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar.
22
Marker Pozitif kontrol Negatif kontrol Örnekler
M P N 1 2 3 4 5 6 M
M: Marker; P=Pozitif Kontrol; N= Negatif Kontrol; 1-7= İncelenen örnekler (2 numaralı örnek pozitif)
24
Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik
Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az
etkilenir
incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez
izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların
belirlenmesinde yararlı
Pahalı
? ? ?deneyimli personel
gelişmiş ekipmanlar
kontaminasyonlar
26
PCR’ ın kullanım alanları
Hastalıkların tanısı
Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı…
Toksijenik, virulens suşların saptanmasında
Antibiyotik direncinin saptanmasında
Moleküler tiplendirme çalışmalarında
Epidemiyolojik çalışmalar
Defektlerin saptanmasında
Adli tıp………
Farklı PCR çeşitleri:
Multiplex (Çoklu) PCR:
Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin), birden fazla primer çifti kullanarak
28
Farklı PCR çeşitleri:
Nested PCR:
ardarda iki PCR yapılır.
İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır.
İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün ürünler elde edilir.
30
Farklı PCR çeşitleri:
Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR):
İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) +
Moleküler tiplendirme yöntemleri
Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz
etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt
tipleri görülebilmektedir.
Korunma ve sağaltımda
Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme,
morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme...
Moleküler tiplendirme
Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması Protein saptanması
Nukleik asitlerin saptanması PCR a dayalı metodlar
34
Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin
başlıca kullanım amaçları
•Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi •Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi
•Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi
•Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi •Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması
•Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol yöntemlerinin değerlendirilmesi
Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için
sahip olması gereken kriterleri
• Tiplendirebilirlik •Ayrım gücü
•Tekrarlanabilirlik ve Stabilite
•Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu •Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması
36
Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler
Klon:
Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla organizmadır
Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar:
Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen izolatlardır
Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar):
Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan izolatlar
Salgın suşu:
Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar
Endemik suş:
Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen, tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen izolatlar
38
Yakın ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan izolatlar
Olası ilişkili izolatlar:
Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak yakın ilişkili değildir
İlişkisiz izolatlar:
Pulsed-Field Gel
Electrophoresis
40
Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde
altın standart
Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük
DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı
miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da
jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir.
Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye
zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı
bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir.
Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir,
Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir + pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur
Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı
agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar
blokları içerisinde yapılır.
Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan
çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile
kesilir,
42
Yöntemin ayrım gücü çok yüksek
Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem
44
Blotlama,
Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan proteinlerin veya nükleik asitlerin
bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi
Southern Blotlama
E.M. Southern adlı bilim adamı 1975
Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniği
1- DNA izolasyonu:
Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir.
2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim:
Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA segmentleri oluşur.
3- Elektroforez:
Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar
46
4- Membrana transfer
Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlara aktarılma aşaması
Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer
Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir. Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine,
jeldeki kalıntılara,
52
5- Denatürasyon ve Fikzasyon:
Membran üzerine transfer edilen DNA bantları 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir
= çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli hale gelir.
Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikze edilmesi (yapışması) sağlanır.
6- Hibridizasyon:
3 temel adımda gerçekleşir;
a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek için blotlanması tamamlanan membranın bloklanması
b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama
6- sonuçların gözle görülmesi
Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyama yöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir.
56 56
Northern Blotlama
J.Alwine ve G. Stark, 1979
Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi
RNA nın izolasyonu Elektroforez
Membrana aktarma Blotting
RNA nın saptanması
Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır
Dot/Slot Blotlama
DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi
Klinik materyalden DNA izolasyonu, İki ya da beş katlı seri dilüsyon,
Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma, Denatürasyon ve fikzasyon,
Hibridizasyon,
Otoradiografi ile görüntüleme.
Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir
58 58 58
In situ Hibridizasyon
Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi
Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar
5 temel adımda gerçekleşir;
•Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme) •Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi •Hibridizasyon
•Yıkama