biyoteknoloji-2015

MİKROBİYOLOJİDE

BİYOTEKNOLOJİ

Biyoteknoloji;

Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan

manipulasyonlarla

yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler

elde etmektir

1920’li yıllar...

Mikrobik biyoteknoloji,

yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim sistemlerinin kolaylaştırılması, ……

Tarımsal biyoteknoloji,

gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan teknoloji

Hayvan biyoteknolojisi,

hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi)

başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar)

Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek, ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir.

4

Adli Biyoteknoloji:

Parmak izi yöntemi,

1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi

Tıbbi biyoteknoloji

hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde,

hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun

çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi,

Restriksiyon endonukleazlar:

Bakterilerde dışarıdan hücrelere giren,

bazı özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak, mutasyonlar meydana getirmesine mani olmak

ve böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla görevli enzimlerdir

Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler.



RE’lerin aktivitelerini gösterebilmeleri için bazı

optimal koşulların sağlanması gereklidir.

Gen Klonlaması (moleküler klonlama)

Önemli bir ürünün (ya da proteinin) sentezini kodlayan genin

ait olduğu hücre genomundan özel yöntemlerle kesilerek çıkartılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA’sı ile birleştirilerek

alıcı bir hücreye transfer edilmesi,

8

Nukleik asitlerin

invitro amplifikasyon yöntemleri

Çeşitli organ, doku ve sıvılardan izole edilen

genetik materyaller enzimatik olarak

çoğaltılır

bu genetik ürünler

ya homolog problar kullanılarak hibridizasyon

ya da elektroforezis ve boyama sonrası direkt

10

Polymerase Chain Reaction-PCR

Prensip:

Hedef genetik materyallerin (

)

spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile

enzimatik

olarak sayısal çoğaltılması

Hedef DNA sekansları

İki tür spesifik oligonukleotid primerleri

(15-30 bazlık, tek iplikcikli)

Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz)

Dört tür dNTP

Tampon çözelti, MgCl₂

12

Hedef DNA sekansları

varlığı aranan, amplifiye edilmek istenen hedef DNA

kan, serumu, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli gibi inceleme örneklerinden ekstrakte edilerek ve

Primerler:

Replikasyonun başlama noktası

Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen, bir çift kısa sentetik oligonukleotid

14

Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat )

20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda)

Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl₂’u bağlar konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı…

Enzim (Taq Polymerase)

Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı

polimeraz enzimi

Tampon çözelti, Magnezyum

Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl₂ bulunmaktadır.

Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween 20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz enzimini stabilitesi için katılabilir.

PCR’ın aşamaları

1- Hedef DNA’nın denatürasyonu

2- Primerlerin bağlanması

3- Sentez/Uzama

16

PCR’ın aşamaları

1- Hedef DNA’nın denatürasyonu

Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar

Yüksek ısı: 94-96 °C

Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C

PCR’ın aşamaları

2- Primerlerin bağlanması

(Annealing/hibridizasyon)

Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede

kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır.

Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar

genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C)

18

I. basamak

II. basamak

http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html

Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir

PCR’ın aşamaları

3-Sentez

(

Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’

yönde uzatılması

Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede gerçekleştirilir

20

3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir.

Sonuçların değerlendirilmesi

Elektroforez

PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon) agarose ya da poliakrilamid jele bilinen işaret DNA lar (DNA marker)

ve

kontrol PCR ürünleri ile birlikte

yüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar.

22

Marker Pozitif kontrol Negatif kontrol Örnekler

M P N 1 2 3 4 5 6 M

M: Marker; P=Pozitif Kontrol; N= Negatif Kontrol; 1-7= İncelenen örnekler (2 numaralı örnek pozitif)

24

Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik

Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az

etkilenir

incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez

izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların

belirlenmesinde yararlı

Pahalı

deneyimli personel

gelişmiş ekipmanlar

kontaminasyonlar

26

PCR’ ın kullanım alanları

Hastalıkların tanısı

Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı…

Toksijenik, virulens suşların saptanmasında

Antibiyotik direncinin saptanmasında

Moleküler tiplendirme çalışmalarında

Epidemiyolojik çalışmalar

Defektlerin saptanmasında

Adli tıp………

Farklı PCR çeşitleri:

Multiplex (Çoklu) PCR:

Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin), birden fazla primer çifti kullanarak

28

Farklı PCR çeşitleri:

Nested PCR:

ardarda iki PCR yapılır.

İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır.

İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün ürünler elde edilir.

30

Farklı PCR çeşitleri:

Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR):

İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) +

Moleküler tiplendirme yöntemleri

Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz

etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt

tipleri görülebilmektedir.

Korunma ve sağaltımda

Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme,

morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme...

Moleküler tiplendirme

Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması Protein saptanması

Nukleik asitlerin saptanması PCR a dayalı metodlar

34

Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin

başlıca kullanım amaçları

•Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi •Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi

•Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi

•Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi •Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması

•Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol yöntemlerinin değerlendirilmesi

Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için

sahip olması gereken kriterleri

• Tiplendirebilirlik •Ayrım gücü

•Tekrarlanabilirlik ve Stabilite

•Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu •Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması

36

Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler

Klon:

Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla organizmadır

Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar:

Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen izolatlardır

Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar):

Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan izolatlar

Salgın suşu:

Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar

Endemik suş:

Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen, tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen izolatlar

38

Yakın ilişkili izolatlar:

Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan izolatlar

Olası ilişkili izolatlar:

Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak yakın ilişkili değildir

İlişkisiz izolatlar:

Pulsed-Field Gel

Electrophoresis

40

Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde

altın standart

Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük

DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı

miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da

jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir.

Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye

zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı

bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir.

Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir,

Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir + pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur

Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı

agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar

blokları içerisinde yapılır.

Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan

çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile

kesilir,

42

Yöntemin ayrım gücü çok yüksek

Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem

44

Blotlama,

Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan proteinlerin veya nükleik asitlerin

bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi

Southern Blotlama

E.M. Southern adlı bilim adamı 1975

Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniği

1- DNA izolasyonu:

Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir.

2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim:

Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA segmentleri oluşur.

3- Elektroforez:

Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar

46

4- Membrana transfer

Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlara aktarılma aşaması

Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer

Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir. Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine,

jeldeki kalıntılara,

52

5- Denatürasyon ve Fikzasyon:

Membran üzerine transfer edilen DNA bantları 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir

= çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli hale gelir.

Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikze edilmesi (yapışması) sağlanır.

6- Hibridizasyon:

3 temel adımda gerçekleşir;

a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek için blotlanması tamamlanan membranın bloklanması

b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama

6- sonuçların gözle görülmesi

Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyama yöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir.

56 56

Northern Blotlama

J.Alwine ve G. Stark, 1979

Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi

RNA nın izolasyonu Elektroforez

Membrana aktarma Blotting

RNA nın saptanması

Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır

Dot/Slot Blotlama

DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi

Klinik materyalden DNA izolasyonu, İki ya da beş katlı seri dilüsyon,

Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma, Denatürasyon ve fikzasyon,

Hibridizasyon,

Otoradiografi ile görüntüleme.

Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir

58 58 58

In situ Hibridizasyon

Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi

Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar

5 temel adımda gerçekleşir;

•Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme) •Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi •Hibridizasyon

•Yıkama