VERAPAMİL İLE UYARILMIŞ DORSAL KÖK GANGLİON HÜCRESİ REJENERASYONU

Tiirk Ndro§inirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 UIl/ii: Vernpamil ile LTyanlllll§ Dorsal Kdk Gallglioll Hiicresi RejellernsyolIl/

Verapamil

ile UyarI1ml~ Dorsal

Kok

Hiicresi

Rejenerasyonu

Ganglion

Verapamil

Induced

Dorsal

Root Ganglion

Cell

Regeneration

ACAHAN

U

A

Ankara Universitesi TIp Fakultesi Noro~iriirji Anabilimdah (AU, CS, AK), Ankara Wisconsin Universitesi TIp Fakultesi Noro~irurji Anabilimdah (BD, Madison, Wisconsin, ABD

Celi~ Tarihi: 01.11.2000 ~ Kabul Tarihi: 11.12.2000

Ozet: Gunumuzde travma, inme, dejeneratif hastahklar nedeniyle olu~an noronal kaYlplann azaltJlmasl yada yeniden kazandmaSlnl ama<;layan bir <;ok <;ah~ma yapJlmaktadlr. Hucrede bir <;ok olaym duzenlenmesinde yer alan ikincil mesajcl sistemi i<;inde yer alan kalsiyumun etkileride bu ara~tIrmalara konu olmu~tur. Bu ama<;la, bir kalsiyum kanal engelleyicisi olan Verapamil'in Santral Sinir Sistemi rejenerasyonu'na olan etkileri ara~tInlml~tIr. Dorsal kolonlan hasarlandlnlml~ ve siyatik sinirleri kesildikten soma C2 seviyesinde dorsal kolonu uzerine eklenmi~ olan sl<;anlarda periton i<;ine verilen 0.1 mg/kg dozundaki Verapamil'in etkileri, plasebo kullamlan ve sham gruplan ile kar~lla~tmlml~tlr. Sonu<;ta, bu dozda verilen Verapamil ile 75±16 hucrede rejenerasyon oldugu saptanml~ ve plasebo (33.5±9.7) ve sham (33±4.2) gruplan arasmda istatistiksel olarak fark bulunmu~tur (t-testi, p=0.004 ve p=0.002). Elde edilen bir diger sonu<; ise siyatik siniri kesilen taraftaki dorsal kok hiicre rejenerasyonunun kesilmeyen kar~l taraftaki rejenerasyon oranmdan fazla oldugudur. Sham grubunda 19.3±5.4, Plasebo grubunda 15.5±2.1 hucre rejenere oln1U~tur. Verapamil grubunda 20± 11.1 hucre saY11abilmi~tir. Bu bulgular l~lgmda bir kalsiyum kanal blokuru olan Verapamilin santral noronlann rejenerasyonunu artIrdlgl bulunmu~tur.

Anahtar KelimeIer: Dorsal kok gangliyonu, kalsiyum kanal antagonisti, sinir rejenerasyonu

Abstract: So far, lot of studies have been done to improve or regain the neuronal disfunction and loss, caused by neurodegenerative diseases, stroke and trauma. Calcium which is a member of seconder messenger system involved in regulation of cellular events, has been the subject of some experiments. For this purpose, the effects of Verapamil-HCl, which is a voltage gated calcium channel blocker, on Central Nerve System regeneration was studied. The effects of 0.1 mg/kg dose on rats, whose dorsal column injured and grafted with a sciatic nerve graft at C2 level, was compared with placebo and sham surgery groups. As a result, there was regeneration in 75±16 cells and statistical analyse revealed significant difference between placebo (33.5±9.7, p=0,004) and sham surgery (33±4.2, p=0,002) groups. The regeneration at sciatic nerve lesion side is greater than the other side which the sciatic nerve was not cut. In Sham surgery group 19.3±5.4, in plasebo group 15.5±2.1, and in Verapamil group 20±11.1 cells were regenerated. It was suggested that Verapamil improves the regeneration of nerves.

Key Words: calcium channel blocker, dorsal root ganglion, nerve regeneration

Tiirk Naro§iriirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 Un/ii: Verapami/ ile Uyanlmz§ Dorsa/ Kok Gang/ion Hiicresi Rejenerasyonll

Her yll milyonlarca insan travma, dejeneratif

hastahklar ya da stroke gibi nedenlerden dolaYI

ya§amml ya da noronal fonksiyonlarmdan bir

klsmml kaybetmektedir. Bu kaYlplann

azaltllabilmesi i~in bir ~ok ~al1;;malar

yapllmaktadu(1,2,4,12-14,17,18). Noronlann bu gibi

durumlardan sonra olu§an birincil ve ikincil

hasarlardan korunmasl ilk plandaki ama~ olarak

dii§iiniilmii§tiir. Bu ama~la bir ~ok deneysel ya da klinik ~ah§ma yapllml§tlr. Noronlarm olu§acak yeni

hasarlardan korunmasl ile ilgili bazl olumlu

geli§meler olsa da hasar somaSI kaybolan noronlann yerlerine yenilerinin konulmasl ile ilgili ~ok ba§anh

sonu~lar ahnamaml§tlr. Her ne kadar iimit verici

geli§meler olsa da heniiz yetersiz durumdadlr.

Noronal rejenerasyon ~ah§malarmda degi;;ik

modeller kullamlmaktadu. Sempatik gangliyon

hiicreleri, dorsal kok ganglion hiicreleri, retinal

gangliyon hiicreleri ula;;llabilir ornekler olarak

olduk~a onem kazanml;;tlr. Santral ozellikli hiicre

govdesinin santral sinir sistemi dl§mda bulunmasl deneysel ~ah;;malar i~in olduk~a yararh olmu§tur. Memelilerde smuh olan rejenerasyon ozeUiklerinin daha alt canhlarda kaybolmaml;; olmasl bu canhlarda yapllan ~ah;;malarda rejenerasyon yetenegi ile ilgili direkt bilgiler de saglanml;;tlr.

Kalsiyumun santral sinir sistemi noronlan

iizerindeki etkileri hem rejenerasyon ~ah§malannda hem de hiicre has an ya da oliimii ~ah§malannda ara§tlnlmaktadlr.

Normal durumlarda kalsiyumun hiicreye giri;;i

kanal reseptorleri araClhgl ile olmaktadu. Bunlar

arasmda voltaj duyarh kalsiyum kanal reseptorleri (VSCCR),N-metil D-aspartat reseptorleri (NMDAR),

noronal acetylcholine reseptorii (n AchR), tip 3

serotonin reseptorleri (5HT3R) kalsiyum ge~irgen

AMP A and kainate glutamate reseptorleri saYllabilir. VSCCR leride kendi i~inde L,N,P,Q ve T alt tipleri i~erir(7,10,11).

Hiicre i~indeki kalsiyum konsantrasyonu, hiicre

i~ine ahmml kontrol eden kanal reseptorlerine ek

olarak, bazl depolama (Endoplazmik retikulum ER)

ve tamponlama-ta;;lma sistemleri ile de gerekli

diizeylerde tutulur(9).

Kalsiyumun hiicreye giri§ yolu ve intraselluler

konsantrasyonu hiicreyi degi§ik §ekillerde

etkileyebilir. Kalsiyum hiicre ya§am oramm

artlrabildigi gibi hiicre oliimiine de neden olabilir.

Kalsiyumun hiicre i~indeki daglllml da hiicrede

degi§ik yamtlara neden olabilir. Aynca VSCCR leride hiicre oliimii, norit biiyiimesi, sinaps formasyonu, fenotipik farkhla;;ma gibi etkileri kontrol ederler(8).

MATERYAL VE METOD

Bu ~ah§mada aglrhklan 200-250 gram arasmda degi§en 12 adet di§i Spraque Dawley sl~an (Harlan Spraque Dawley, Indiana) Wisconsin Universitesi

TIP Fakiiltesi Hayvan Baklm Unitesi ile yapllan

protokole gore kullamlml§tlr. Hayvanlar

Ketamin-HCl ve Xylazin Firma adl-iilke kan§lml ile

uyutulduktan soma sol siyatik sinir hem hazulaYlcl

lezyon yapmak hemde gref olarak kullanmak amaCl ile eksize edilmi§tir. Bu insizyon kapatlldlktan soma iist servikal bolgede yapllan orta hat insizyonu ile,

C2 totallaminektomi yapllml;;, dura a91dlktan soma

orta hattm her iki yamnda Imm uzakhkta ve Imm

derinlikte bilateral dorsal kolon hasan

olu§turulmu;;tur ($ekil 1). Daha soma siyatik sinir

grefti bu lezyonlann iizerine gelecek ;;ekilde piaya

1010 monofilaman naylon siitiirle dikilmi§tir. Greftin

distal ucu oksipital kemik periostuna tespit edilip

insizyon kapatllml§tlr. Sham grubuna herhangi bir

ila~ ya da ila~ ta§IYlclSI verilmemi;;tir. Plasebo

grubuna ise Verapamil-HCl nin i~inde ~oziildiigii

Fosfat tamponlu salin (PBS) i~inde 1/1000 EtOH 0.5

ml verilmi§tir. Deney sonunda, 2. giinde, 4. giinde

ve 6. giinde 0.1 mg/kg dozunda Verapamil-HCI

~oze1tisi 0.5 ml intraperitoneal olarak 4 kez

verilmi§tir. 12. giinde servikal insizyon a~lhp graft

ucu bulunmu§ ve 3 ml Fluorogold (FG)(16)

(Fluorochrome, Denver,CO) (Excitation 350-395 nM

I

soma hayvanlar yiiksek doz Ketamin/Xylazin

kan§lml ile uyutulup intrakardiyak olarak 60 ml, 0.1

M PBS ve 300 m!. %4 Paraformaldehid ile perfiize

edilmi§tir. Sol taraf ve sag taraftan L5 Dorsal kok gangliyonlan (DKG) ~lkanlml§, %4 Paraformaldehid ve %20 Sukroz ile muamele edilmi;;tir. Bu DKG ler, daha soma SIVInitrojen ile OCT (Histoprep, Fisher Scientific) i~inde dondurulmu§ ve cryostat ile 14 mm.

kalmhgmda kesilmi;;tir. Bu ornekler floresans

mikroskop (Axioscope, Zeiss, Almanya) altmda

incelenmi§ ve fluorogold ile i;;aretlihiicreler saYllml§tlr ($ekiI2). Sonu~lar t-testi, normalite, equal variance, ve

Mann- Whitney Rank Sum Testi kullamlarak

degerlendirilmi§tir. Veriler ±SD olarak verilmi§tir.

SONUC;LAR

Tlirk Noro~irurji Dergisi 11: 27 - 31, 2001

Lezyon yeri

7sm.

Ul1lU: Verapamil ile Uyarzlml~ Dorsal Kok Gal1gliol1 HIicresi Rejel1erasyol111

rejenere olan hucre SaYls133±4.2olarak bulunmu~tur. Plasebo grubunda 33.5±9.7 hucre rejenere olmu~tur. Verapamil verilen grupta 75±16.0 i~aretlenen hucre

saYllml~hr. Gruplar kar~lla~hnldlgmda plasebo

grubu ve sham grubu arasmda istatistiksel bir anlam yok iken (p=O.928),verapamil ile aralannda belirgin fark saptanml~tlr.(p=O.002 ve p=O.004)

Siyatik sinirin kesilmedigi, kontrol kani1 tarafta sham grubunda 19.3±5.4 hucre saptanml~tlr. Plasebo

grubunda 15.5±2.1 hucre rejenere olmu~tur.

Verapamil grubunda 20±11.1 hucre saYllabilmi~tir.

Bu grup degerleri kendi aralannda

kar~lla~tlflldlgmda aralarmda istatistiksel anlamh

fark bulunamaml~tlr. ($ekiI3)

$ekil 1: Cerrahi uygulamanm §ematik gosterimi. Lezyon

yeri, deneysel DKG tarafmda siyatik sinir kesilmi§

ve kar§! tarafmdaki (Kontrol) DKG

gosterilmektedir.

L5 DKG

(Sol)-Kontrol DKG (Sag)

Siyatik sinir kesilen taraf ile kesilmeyen taraf

degerleri kar~lla~tlflldlgmda tUrn gruplarda

istatistiksel anlamh fark saptanml~tlr(sham,p=O.Oll, plasebo, p=O.007, verapamil, p=O.OOl).

TARTI$MA

Aslmda hucre hasan ve hucrenin hasara

yamtlan ile ilgili mekanizmalar <;okkarma~!k olsa

da rejenerasyon oncesinde ortaya <;lkan

degi~ikliklerde rejenerasyonun seyrini degi~tirecek

durumdadlr. Bu mekanizmalarm buyuk bir klsmmda

kalsiyuma bagh aktivasyonlar ve bunun sonunda

ortaya <;lkanolaylar rol oynar. Axotomi sonrasmda,

$ekiI2: Fluorogold ile i§aretlenmi§ rejenere olan DKG hiicreleri. (A) Sham grubunda kontrol taraftan alman ornek, (B) Sham

grubunda siyatik sinirin kesilmi§ oldugu taraftan alman ornek. (C) Plasebo grubunda kontrol taraf, (D) Plasebo grubunda sinir kesilen taraf, (E) Verapamil verilen grupta kontrol taraf, (F) Verapamil grubunda sinir kesilen taraf. X200

Turk Noro§irurji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 Cln/U: Verapamil ile Uyanlml§ Dorsal Kok Ganglion Hucresi Rejenerasyol1ll

Verapamil ile uyanlml~ hucre rejenerasyonu

100 80 60 iii >.,'" <fJ ~ 40 u ':i:r: 20 0

"0 >bI:!>bI:!"0"0>bI:!

'" '"'" <Jl_b <Jl<Jl<Jl_:z:z E 6 b E '6 ..a <lI _'"'" ..a

<lI '" ..<: 8-'" ..<:'" '" <Jl<Jl0.- _'" E: ><lI E: ~~ <lI>

$ekil 3: Sonu<;lann grafik gosterimi. (Sol: Sinir kesilen taraf), (Sag:Sinirin kesilmedigi kar§l taraf)

hasar yerinden kalsiyum akr~l ile hucre i<;inde

belirgin konsantrasyon degi~ikligi olu~ur.

Hasarlanml~ axon ucunda konsantrasyon Imm'den

daha azdu. Axonal hasar yerinin membran ile

kapatIlmasl sonucunda serbest kalsiyum

konsantrasyonu normal degerlere iner. Buyuk

yaplsal degi~ikliklerin oldugu bolge ile

aksoplazmamn degi~medigi smuda intraselluler

kalsiyum konsantrasyonu 300-500 mM

arasmdadu(21). Burasl yaplsal degi~iklikler ile

normal axoplazmanm slmndu. Hasarlanmaml~

noronlarda da benzer ~ekilde konsantrasyonlann

olu~turulmasl ile aym yaplsal degi~iklikler

uyanlabilmi~tir. Yaplsal olarak keskin slmrlarm

bulundugu bu yerde kalsiyum konsantrasyon

farklan bu kadar keskin degildir(21). Bu kalsiyum

seviye degi~iklikleri ultrastruktural degi~ikliklere

neden olabildigi gibi hucre olumune de neden

olabilir.

Axotomi sonrasmda axonal retraksiyon,

membran olu~umu ile kesik ucun kapahlmasl(20), kom~u axonal segmentin duzle~mesi, hasarlanml~

axonal segmentden lamellipod uzamml, axon

ucundaki konsantrasyonun 1.5 mm seviyesini a~maSl

sonucunda mikrotubullerin kaybolmasl, elektron

dense deposit birikimi, ve bu bolgeye hem en kom~u

bolgede mikrotubullerin krsalmasl ve paralel

dizilimlerin kaybolmasl gibi olaylar olmaktadlr(21). Bu olaylar rejenerasyon i<;ingerekli ilk a~amalardlr.

Bundan sonraki a~amalarda yeni buyume konisi

olu~umu, rejenere yapmm yolunu bulmasl ve uygun sinaps olu~umu vardlr. Hucrenin ilk a~amalan ge<;ip

ge<;emeyecegi h ucrenin ilk tra vma Yl a tla tma

yetenegine baghdu. Yani hucrenin oldurucu

kalsiyum seviy~lerinden kurtulabilmesi gereklidir.

Bu ama<;la deneyimizde bir L tipi VSCCR olan

Verapamil kullamlarak hucre i<;ine a~m kalsiyum

girmesi engelenmeye ve dolaYlsl ile sonraki

rejenerasyon a~amalanna ge<;mesi saglanml~hr.

Yapllan <;ah~malarda hucre olUmunun ilk

haftada olduk<;a hIZll oldugu ve tubulin gibi hucre iskelet elemanlarmm ta~mmasmm yava~ladlgl ve gen

expresyonu farkhla~masmm azaldlgl devreye

uydugu bildirilmi~tir. Bu nedenlede ilk haftada 0.,

2., 4., ve 6. gunlerde Verapamil verilmi~ ve bu

devrede hucre kalsiyum konsantrasyonu oldurucu

yuksek degerlerin altmda tutulmaya <;ah~llml~hr.

Gene bir kalsiyum kanal blokuru olan Flunarizinin, DKG lerde sinir buyume faktorunun (NGF) etkisinin

axotomi sonucunda soma uzerinden kalkmasl

sonucu ortaya <;lkan sinyalleri duzenleyerek,

kromatin kondansasyonunu engelledigi dolaYlsl ile

apoptozisi engelledigi gosterilmi~tir. A poptozise

giden yolda onemli olan PI3-kinaz enziminin

engellenmesinin buna neden oldugu

samlmaktadlr(19). Verapamilin de benzer ~ekilde

hucre sinyal iletim yollanna etki ederek, hucre

olumunu engelledigi, ya~ayabilirligi arhrdlgl ve

dolaYlsl ile rejenerasyona neden oldugu

du~unulmu~tur(19).

Bu deneyde kullamlan siyatik sinir graftlerin

i<;erdikleri destekleyici faktorlerden yararlanmak,

buyume i<;inengelleyici olan santral sinir sistemi glial ortammm rejenerasyonu destekleyen periferik sinir

schwann hucre ortamma degi~tirilmesi amaCl ile

kullamlml~ ve yararh oldugu gosterilmi~tir(3,5). Bu

metod DKG rejenerasyon deneylerinde slk<;a ye

ge<;erlibir yontem olarak kullamlml~hr.(15) Siyatik

sinirin kesilmesinin aym taraf DKG santral

axonlanmn rejenerasyonuna etki ettigi gosterilmi~ ye

bu tip lezyonlar "hazlrlaYlcl lezyonlar" olarak

tammlanml~tIr(6). Burada ama<; distal axonun

kesilmesi ile ortaya <;lkan somatik degi~ikliklerden

santral axonun yararlandullmasldu. Periferik

axonun kesilmesi ile ortaya <;lkankromatolizis, bazl yaplsal proteinlerin yaplm ye ta~mma hlZl artl~l gibi

hucresel degi~iklikler DKG hucresinin santral

axonunun kesilmesi ile elde edilememi~tir. Periferik

sinirlerin axotomi sonrasmdaki ortaya <;lkan

rejenerasyon, santal axonlarda yeterli olmamasmm

nedenleri arasmda bu farkhhklann olmasl ile

Tiirk Ndro~iriirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 UIl/U: Vernpamil ile LTyanlml~ Dorsal Kdk Gallglioll HOeresi Rejellernsyollll

Deney sonu<;lanmlzda hazIrlaYlCl lezyon

i<;ermeyen tarafta rejenerasyonun i<;eren taraf gore

daha az oldugu saptanml~tIr. Bu sonu<;ta

rejenerasyonu hazIrlaYlCl lezyonlann artIrdlgl

~eklindeki bulgularla uyumlu olmu~tur.

SONU<;

Santral sinir sistemi hiicrelerinin rejenere olmasl

iizerine bir <;ok<;ah~ma yapllmaktadlr. Burada ama<;

bu yetenegi klSlth olan SSS hiicrelerinin rejenere

olmasl sonucunda, travma, iskemi dejeneratif

hastahklar sonucunda ortaya <;lkan fonksiyon

kaYIplannm yeniden kazamlmasldlr. Giiniimiizde

bu <;ah~malar her ne kadar tam olarak yiiz giildiiriicii

olmasa da, giiniin birinde kaYlp noronal

fonksiyonlann tam olarak geri dondiiriilmesi

miimkiin olacaktIr.

YaZl~ma Adresi: Dr. Agahan UnlU

Tusso Bloklan N-1/ 14 Emek-Ankara 06510 agahan@ixir.com Tel: 312-3103333/ 2629 Fax: 312- 309 4340 KAYNAKLAR

1. Aguayo AI, Muller KI, Views on regeneration in the

nervous system. Journal of Neurobiol Vol 23, New

York: Wiley, 1992,467-604

2. Aguayo AI, Nicholls JG, Development and

regeneration of the nervous system: a discussion.

Philosophical transactions: Biological sciences. Vo!.

331, London; Royal Society, 1991, 253-350

3. Bahr M, Eschweiler GW, Wolburg H : Precrushed

sciatic nerve grafts enhance the survival and axonal regrowth of retinal ganglion cells in adult rats. Exp

Neurol 116(1): 13-22, 1992

4. Borgens RB, Blight AR, Murphy DJ : Axonal

regeneration in spinal cord injury: a perspective and

new technique. J Comp Neurol 250(2): 157-167, 1986

5. Campbell G, Lieberman AR, Anderson PN, Turmaine M: Regeneration of adult rat CNS axons into peripheral

nerve autografts: ultrastructural studies of the early

stages of axonal sprouting and regenerative axonal

growth. J Neurocytol 21(11): 755-787, 1992

6. Dahlin LB, Kanje M : Conditioning effect induced by chronic nerve compression. An experimental study of

the sciatic and tibial nerves of rats. Scand J Plast

Reconstr Surg Hand Surg 26(1): 37-41, 1992

7. Desmadryl G, Hilaire C, Vigues S, Diochot S, Valmier

J : Developmental regulation of T-, N- and L-type

calcium currents in mouse embryonic sensory

neurones. European Journal of Neuroscience 10(2):

545-552, 1998

8. Franklin JL, Johnson EM, Jr.: Suppression of

programmed neuronal death by sustained elevation

of cytoplasmic calcium. Trends Neurosci 15(12):

501-508, 1992

9. Ghosh A, Ginty DD, Bading H, Greenberg ME :

Calcium regulation of gene expression in neuronal

cells. J Neurobiol 25(3): 294-303, 1994

10. Ghosh A, Greenberg ME : Calcium signa ling in

neurons: molecular mechanisms and cellular

consequences. Science 268(5208): 239-247, 1995

11. Greenberg DA: Calcium channels and calcium channel

antagonists. Ann Neurol 21(4): 317-330, 1987

12. Inoue T, Kawaguchi S, Kurisu K : Spontaneous

regeneration of the pyramidal tract after transection

in young rats. Neuroscience Letters 247(2-3): 151-154,

1998

13. Olson L : Regeneration in the adult central nervous

system: experimental repair stra tegies. Nature

Medicine 3(12): 1329-1335, 1997

14. Ramon y Cajal S, May RM, Degeneration &

regeneration of the nervous system, London; New

York: Hafner Pub. Co., 1968,2 v. (769)

15. Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ : Axons from CNS neurons regenerate into PNS grafts. Nature 284(5753): 264-265, 1980

16. Schmued LC, Fallon JH : Fluoro-Gold: a new

fluorescent retrograde axonal tracer with numerous

unique properties. Brain Res 377(1): 147-154, 1986

17. Schwab ME, Brosamle C : Regeneration of lesioned

corticospinal tract fibers in the adult rat spinal cord under experimental conditions. Spinal Cord 35(7):469-473, 1997

18. Seil FJ,Neural regeneration. Progress in brain research;

v. 103, Amsterdam; New York: Elsevier, 1994,xvi, 413

19. Tong JX, Rich KM : Diphenylpiperazines enhance

regeneration after facial nerve injury. J Neurocytol

26(5): 339-347, 1997

20. Xie XY, Barrett IN : Membrane resealing in cultured rat septal neurons after neurite transection: evidence for enhancement by Ca (2+)-triggered protease acti vity

and cytoskeletal disassembly. J Neurosci 11(10):

3257-3267, 1991

21. Ziv NE, Spira ME: Spatiotemporal distribution of Ca2+

following axotomy and throughout the recovery

process of cultured Aplysia neurons. Eur J Neurosci 5(6): 657-668, 1993