176
M a k rolitlerin Nötrofil Granülositleri ‹çindeki
Staphylococcus aureus’un Hücre ‹çinde Öldürülmesi
Üzerine Etkisi
Tanju KADIR (*), Adile ÇEV‹KBAfi (**)
ÖZET
Bu çal›flmada eritromisin, azitromisin ve klaritromisin’in plazmada eriflebildikleri konsantrasyonlar›nda (0.25, 1, 2 ve 20μg/ml) sa¤l›kl› insan nötrofil granülositlerinin Staphylococcus aureus’a karfl› hücre içi öldürme aktivitesi incelenmifltir. nötrofillein hücre içi öldürme aktivitesi deneyde kullan›lan antibiyotik konsantrasyonlar› ile muamele edildikten 4 saat sonra ölçülmüfltür. hüocre içi öldürme, azitromisin ile tüm konsantrasyonlarda, eritromisin ve klaritromisin ile yaln›z 20μg/ml konsantrasyonda kontrola göre anlaml› olarak (p<0.05) artt›¤› saptanm›flt›r. Antibiyotiklerin, öldürme endeksini 20μg/ml konsantrasyonda artt›rmas› anlaml› olarak (p<0.05) bulunmufltur.
Anahtar Kelimeler: Eritromisin, azitromisin, klaritromisin, nötrofil, hücre içi öldürme
SUMMARY
The Effect of Macrolides on Intracellular Killing of Staphylococcus aureus In Neutrophil Granulocytes In this study the in vitro effect of erithromycin, azithromycin and clarithromycin on the intracellular killing of S.aureus in human neutrophil granulocytes was invistigated Each drug was tested in concentrations of 0.25, 1, 2, and 20μg/ml and intracellular killing was measured for up to 4 h of incubation. Azithromycin increased significantlly (p<0.05) the intracellular killing in all concentrations, however erithromycin and clarithromycin increased the intracellular killing only in concentration of 20μg/ml. All 3 antibiotics increased the killing significantlly (p<0.05) in concentration of 20μg/ml relative to the control without antibotics.
Key words: erithromycin, azithromycin, clarithromycin, neutrophil, intracellular killing.
G‹R‹fi
Mikroorganizmalar›n fagositik hücreler taraf›ndan fagositozu ya da hücre içinde öldürülmesi önemli bir konak savunma mekanizmas› olmas›na ra¤men, baz› mikroorganizmalar›n hücre içinde canl› kald›-› bildirilmifltir (1). Tekrarlayan infeksiyonlar ya da ilac›n hücre içi penetrasyonunun zay›f olmas›, antibiyotik ile tedavinin baflar›s›z olma-s›na ve Staphylococcus aureus gibi mikroorganizma-n›n hücre içinde canl› kalabilmesine neden olmakta-d›r (2,3). makrolitlerin yüksek hücre içi penetrasyo-nu (4,5) gözönüne al›narak, çal›flmam›zda bu antibi-yotiklerin plazmada eriflebildikleri farkl› konsantras-yonlar›n›n (0.25, 1, 2 20μg/ml)nötrofil içinde
fagosi-te edilmifl olan S. aureus’un hücre içinde öldürülme-si üzerine etkiöldürülme-si in vitro araflt›r›lm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Antibiyotikler: Eritromisin (Abbot), azitromisin (Pfizer) ve klaritromisin (Abbot) diztile su içinde çö-zülerek %40 serum içeren RPMI 1640 ortam› içinde 0.25 1, 2 ve 20μg/ml konsantrasyonlarda olacak fle-kilde haz›rlanm›flt›r.
Di¤er Maddeler : L-glutamin içermeyen RPMI 1640 ortam› ve Ficoll-Hypaque Sigma’dan al›nm›fl-t›r. serum örnekleri ise sa¤l›kl› gönüllülerden toplan-m›flt›r.
S.aureus Suflunun Haz›rlanmas› : Klinikten izole edilen S. aureus kökeninden buyyon besiyerine pasaj al›nm›fl 18 saat 37°C de inkübe edilmifltir. S.aureus 3000 rpm de 10 dakika çevrilerek 2 kez fosfat
(*) Marmara Üniversitesi, Diflhekimli¤i Fakültesi, Mikrobiyoloji Bilim Dal›, Niflantafl›-‹stanbul
(**) Marmara Üniversitesi, Eczac›l›k Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Haydarpafla-‹stanbul
177 tamponlu tuzlu su ile y›kanm›fl ve %40 serum içeren
RPMI ortam› içinde bakteri say›s› ml’de 5x106kob
(koloni oluflturan birim) olacak flekilde suland›r›l-m›flt›r.
Nötrofil Granülositlerin Elde Edilmesi : Çal›flma-m›zda 30-40 yafl grubu sa¤l›kl› deneklerden kan al›n-m›fl ve Ficoll-hypaque satrifüj yöntemine uygun olark nötrofil granülasitleri elde edilmifltir (7). Hüc-re say›s› 1 x 107hücre/ml olacak flekilde %40 serum
içeren RPMI ortam› içinde süspanse edilmifltir. Hücre ‹çi Öldürme Aktivitesi : Nötrofil içinde S.aureus’un öldürülmesi, hücre içinde canl› bakteri say›s›nda azalman›n saptanmas› ile ölçülmüfltür (8). K›saca, nötrofiller (5x106hücre/ml) ile S.aureus 1:1
(nötrofil:bakteri) oran›nda 5ml %40 serum içeren RPMI ortam› içinde kar›flt›r›lm›fl ve 37°C de 20 da-kika inkübe edilmifltir. Fagositoz olay› 35 ml so¤uk %40 serum içeren RPMI ortam› ilave edilmesi ile durdurulmufl ve 2 kez 2000 rpm de 5 dakika santri-füj edilerek hücre d›fl›nda kalan stafilokoklar uzak-laflt›r›lm›flt›r. ‹çinde S.aureus bulunduran nötrofiller deneyde kulland›¤›m›z antibiyotiklerin plazma kon-santrasonlar› ile %40 serum içeren so¤uk RPMI or-tam› içnde tekrar süspansiyon haline getirilerek 37°C de %5 CO2’li otamda inkübe edilmifltir. ‹nkübasyon süresince farkl› zamanlardaki kar›fl›mdan 50μL ha-cim al›nm›fl, so¤uk NaOH (pH=11) çözeltisi ilave edilerek kar›flt›r›lm›fl ve bu ifllem sonucunda nötrofil-ler parçalanm›flt›r. Daha sonra fizyolojik tuzlu su içinde on - kat suland›r›lm›fl, Jeloz besiyeri üzerine 0.1 ml hacim konmufl ve yavrulu tüp ile yay›lm›flt›r. Petriler 37°C de 18 saat inkübe edilmifl, üreyen ko-loniler say›lm›flt›r (kob/ml).
Sonuçlar›n de¤erlendirilmesi ve ‹statistiksel Analiz-leri : Hücre içinde canl› kalma endeksi (SI), t zaman-da hücre içi canl› bakeri say›s› ile 0 zamanzaman-da hücre içi canl› bakeri say›s› karfl›laflt›r›lm›fl ve afla¤›daki formüle göre yüzde olarak belirlenmifltir (8). SIt= [(kob/ml) t/ (kob/ml)0] X 100
Antibiyotik öldürme endeksi (KI) ise afla¤›daki for-müle göre hesaplanm›flt›r.
KIt; antibiyotik = [(SIt; kontrol - SIt; antibiyotik) / SIt; kontrol] X 100
‹statiksel hesaplamalarda t testi kullan›lm›flt›r. BULGULAR
Venöz kanda elde edilen nötrofillerin canl›l›¤› %95 olarak bulunmufltur. Hücre içinde öldürme aktivitesi-nin saptanmas›nda kullan›lan S.aureus’un %90’n› nötrofiller taraf›ndan fagosite olmufltur.
Deneyde kulland›¤›m›z antibiyotiklerin farkl› plaz-ma konsantrasyonlar›nda (0.25,1, 2 ve 20μg/ml)
mu-fiekil. 0,0.25,1,2 ve μg/ml antibiyotik konsantrasyonlar›nda hücre içinde fagosite olmufl S. aureus’un hücre içi öldürülmesi.
T. Kadir, A. Çevikbafl, Makrolitlerin Nötrofil Granülositleri ‹çindeki Staphylococcus aureus’un Hücre ‹çinde Öldürülmesi Üzerine Etkisi
178
amele edilen nötrofillerin hücre içi öldürme aktivite-si azitromiaktivite-sin’in tüm konsantrasyonlar›nda, eritromi-sin ile klaritromieritromi-sin’in yaln›z 20μg/ml konsantrasyo-nunda anlaml› (p< 0.05) olarak artm›flt›r (fiekil ). Eritromisin ve klaritromisin’in di¤re kosantrasyonla-r›nda kontrol nötrofillere göre gözlenen farkl›l›klar istatistiksel aç›dan anlams›z olarak bulunmufltur. Makrolidlerin öldürme indeksi ise (KI); azitromisin %40± 2, eritromisin %27 ±3 ve klaritromisin’in %24±2 oldu¤u saptanm›flt›r. her 3 antibiyoti¤in öl-dürme endeksi anlaml› (p<0.05) olarak bulunmufltur. TARTIfiMA
Çal›flmam›zda eritromisin, azitromisin ve klaritromi-sin’in nötrofil taraf›ndan fagosite edilmifl S.aure-us’un hücre içinde öldürülmesi üzerine etkisi araflt›-r›lm›flt›r. Bu konu ile ilgili yapm›fl oldu¤umuz litera-tür taramalar›nda birçok araflt›rman›n yap›ld›¤›n›, ancak elde edilen sonuçlar› birbirine ters düflen fark-l› sonuçlar oldu¤u gözlenmifltir. Örne¤in, Milatoviç (9) in vitro koflullarda insan nötrofillerinin hücre içi-ne fagosite edilen stafilokoklar› 3 saat içinde öldür-dü¤ünü, bu olay›n makrolitler taraf›ndan etkilenme-di¤ini bilirmifltir. Anderson ve ark. (10) yapm›fl ol-duklar› in vitro çal›flmada, hücre içine fagosite edilen S.aureus’un hücre içinde öldürülmesinin makrolitler taraf›ndan engellendi¤ini göstermifllerdir. Ayn› sonu-cu Labro ve ark.(11) çal›flmalar› ile bildirmifllerdir. Di¤er çal›flmalarda (12-14) S.aureus’un hücre içinde öldürülmesinin makrolitler ve kinolonlar taraf›ndan artt›r›ld›¤› gösterilmifltir. Bu denli çeliflkili sonuçla-r›n ortaya ç›kmas›nda birçok yorum yap›lm›fl ise de, klinik çal›flmalarda hücre içine penetrasyonu yüksek olan antibiyotiklerin in vivo hücre içi patojenlere karfl› daha etkili olud¤u klinik çal›flmalarda bildiril-mifltir (15-18).
Çal›flmam›zda S.aureus’un nötrofiller içinde öldürül-mesi azitromisin ile tüm konsantrasyonlarda, eritro-misin ve klaritroeritro-misin ile yaln›z 20μg/ml konsantras-yonda belirgin bir flekilde artm›flt›r. her 3 antibiyoti-¤in öldürme endeksindeki art›fl anlaml› bulunmufltur. azitromisin ve di¤er makrolidlerin nötrofiller içinde öldürme aktivitesi üzerine etki mekanizmalar› kesin olarak bilinmemektedir. Hücre içinde antibiyoti¤in birikmesi, S.aureus’u direkt olarak öldürebilece¤i
yada bakteriyi nötrofillerin bakterisit etkisine karfl› daha duyarl› hale getirebilece¤i bildirilmiflti (13). Azitromisin’in denenen plazma konsantrasyonlar›n-da nörofillerin hücre içi öldürme aktivitesini artt›r-mas›n› azitromisin’in nötrofil içine penetrasyonunun di¤er makrolidlere oranla daha yüksek olud¤undan (19) kaynaklanabilece¤ini düflünmekteyiz.
Sonuç olarak; çal›flmam›zda kulland›¤›m›z makro-lidlerin nötrofillerin hücre içi öldürme aktivitesini artt›rd›¤›n›, özelikle azitromisin’in daha etkili oldu-¤unu görmekteyiz. Bugüne kadar yap›lan çal›flmalar-da farkl› bakteri kökenlerinin ve ad› geçen çal›flma-larda araflt›r›c›lar›n kulland›klar› yöntemlerin farkl› olmas›ndan kaynaklanm›fl olabilir. Bu nedenle anti-biyotiklerin nötrofilfonksiyonlar› üzerine etkilerini araflt›ran yöntemler sstandardize edilmeli, elde edile bulgular in vivo çal›flmalarla da kan›tlanmal›d›r (20,21).
TEfiEKÜR
Sa¤l›k - 1998/44 no’lu projemizi maddi yönden des-tekleyen Marmara Üniversitesi Rektörlü¤ü Araflt›r-ma Fonu’na teflekkür etmeyi bir boç biliriz.
KAYNAKLAR
1. Moulder J W : comparative biology of intracellular pa-rasitism, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 49:298 (1985). 2. Tulkens PM: Intracellular distribution and activity of antibiotics., Eur J Clin Microbiol Infect Dis 10: 100 (1991).
3. Yancey RJ, Sanches MS, Ford CW : Activity of anti-biotics against Staphylococcus aureus with polymorpho-nuclear neutrophils, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 10:107 (1991).
4. Prokesch Rc, Hand W L : Antibiotic entry into human polymorphonuclear leukocytes, Antimicrob Chemother 21:373 (1982).
5. Foulds G, Shepard RM, johnson RB : The pharmaco-kinetics of azithromycin in human serum and tissues, An-timicrob Agent Chemother 25(A): 73 (1990).
6. Carbon C : Clinical relevence of intracellular and ex-tracellular concentrations of macrolides, Infection 23:10 (1995).
7. Boyum A : Isolation of mononuclear cells and granu-locytes from human blood, Scand J Clin Lab 21(97): 77 (1968).
8. Nielsen SL, Black FT, Storgaard M, Obel N : Evalu-ation of method for measurment of intracellular killing of Staphylococcus aureus in human neutrophil granulocytes, Türk Mikrobiyol Cem Derg 30: 176-179
179
APMIS 103:460 (1995).
9. Milatovic D : Intraphagocytic activity of erithromycin, roxithromycin and azithromycin, Eur J Clin Microbiol In-fect Dis 9:33 (1990).
10. Anderson R, Joon G, van Rensberg CEJ : An invit-ro investigation of the intracellular bioavailability of amo-xicillin, clindamycin, and erythromycin for Staphylococ-cus aureus, J Infect Dis 153:593 (1986).
11. Labro MT, el Benna J, Babin-Chevaye C : Compa-rison of the in vitro effect of several macrolides on the oxi-dative burst of human neutrophils, J Antimicrob Chemot-her 24:561 (1989).
12. Schwab JC, Mandel GL : The importance of penetra-tion of antimicrobial agents into cells, Infect Dis Clin North Am 3:461 (1989).
13. Nielsen SL, Obel N, Storgaard M, Anderson PL : The effect of quinolones on the intracellular killing of Staphylococcus aureus in neutrophil granulocytes, J Anti-microb Chemother 39: 617 (1997).
14. Sato K, akaki T, Tomioka H : Antimicrobial activiti-es of benzoxazinorifamycin KRM-48, clarithromycin and evofloxacin against intracellular Mycobacterium avium complex phagocytosed by murine peritoneal macrophages, J Antimicrob Chemother 41:77 (1998).
15. Steingrinisson O, Olofsson JH, Thorarrinson H, Ryan RW, Johnson RB- Tilton RC : Azithromycin in the
treatment of sexually transmitted disease, J Antimicrob Chemother 25 (A): 109 (1990).
16. Mallory S : Azithromycin in comparison with cepha-lexin in the treatment of skin and structure infections, Am J Med 91 (2B): 91 (1991).
17. Laurent K : Efficacy, safety and tolerability of azit-hromycin versus roxitazit-hromycin in the treatment of acute lower respratory tract infections, J Antimicrob Chemother 37 : 115 (1996).
18. Mantero L : A Comparative study of the efficacy sa-fety and tolerability of azithromycin and cefaclor in the treatment of children with acute skin and/or soft tissue in-fections, J Antimicrob Chemother 37 © : 125 (1996). 19. Gladue RP, Bright GM, Isaacson RE, Newborg MF : ‹n vitro and in vivo uptake of azihromycin (CP-62, 993) by phagocytic cells: possible mechanism of delivery and release at sites of infection, Antimicrob Agents Chemother 33:277 (1989).
20. Derici K- Soyo¤lu-Güre r Ü, Çevikbafl A, Johansson C : Ketokonazol ile inkübe edilmifl insan marofajlar›n›n Candida albicans’a karfl› hücre içi öldürme aktivitesinin in vitro araflt›r›lmas›, Türk Mikrobiyol Cem Derg 28:91 (1998).
21. Çevikbafl A, Johansson C : ‹mmunosupresif hastalar-da fungal infeksiyonlar ve kemoterapide yeni yaklafl›mlar, Marmara.Üniv. Ecz Derg 9 : 187 (1993).
T. Kadir, A. Çevikbafl, Makrolitlerin Nötrofil Granülositleri ‹çindeki Staphylococcus aureus’un Hücre ‹çinde Öldürülmesi Üzerine Etkisi
