VĠġNE ÇEKĠRDEĞĠ ĠÇĠNDEN ÜRETĠLEN PROTEĠN KONSANTRESĠNĠN BAZI KĠMYASAL VE
FONKSĠYONEL ÖZELLĠKLERĠ Mehtap Gedik
Yüksek Lisans Tezi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
DanıĢman:
Prof. Dr. Metin YILDIRIM 2011
MÜHENDİSLİK ve DOĞA BİLİMLERİ FAKÜLTESİ GIDA MÜHENDİLİĞİ ANABİLİM DALI
Y. LİSANS TEZİ
Vişne Çekirdeği İçinden Üretilen Protein Konsantresinin Bazı Kimyasal ve
Fonksiyonel Özellikleri
Mehtap Gedik
TOKAT 2011
i
Yüksek Lisans Tezi
Vişne Çekirdeği İçinden Üretilen Protein Konsantresinin Bazı Kimyasal ve Fonksiyonel Özellikleri
Mehtap Gedik
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi
Gıda Mühendisliği Bölümü Danışman: Prof. Dr. Metin YILDIRIM
Meyve işleme tesislerinde ortaya çıkan en önemli yan ürünler kabuk ve çekirdektir. Kayısı ve vişne gibi meyvelerin çekirdekleri insan tüketimine uygun kayda değer miktarlarda protein ve yağ sağlayabilirler. Bu nedenle çalışmanın amacı vişne çekirdeği içinden protein konsantresi üretmek ve elde edilen konsantrenin kimyasal ve fonksiyonel niteliklerini incelemektir.
Vişne çekirdeği içi proteinleri pH 10,0’da ekstrakte edilip pH 4,5’te çöktürülerek protein konsantresi hazırlanmıştır. Protein konsantresinin kurumadde, yağ, toplam karbonhidrat, protein ve kül içeriği; su ve yağ tutma kapasitesi, köpük kapasitesi ve stabilitesi, emülsiyon aktivite indeksi ve emülsiyon stabilite indeksi, minimum jel oluşturan konsantrasyonu, protein çözünürlüğü ve proteinlerin molekül ağırlıkları belirlenmiştir.
Protein konsantresi %95,97±0,16 kuru madde, %3,31±0,17 kül, %2,94±0,36 karbonhidrat, %1,93±0,16% yağ ve %80,48±2,38 protein içermiştir. Su tutma kapasitesi, yağ tutma kapasitesi ve minimum jel oluşturan konsantrasyonu sırasıyla %242±0,09, %173±0,17 ve %8 olarak bulunmuştur. Maksimum çözünürlük pH 12,0 (%92,96±1,66) ve minimum çözünürlük ise pH 5,0’te (%12,41±1,23) gözlenmiştir. Emülsiyon aktivite indeksi 38,91±2,50 m2/g, emülsiyon stabilite indeksi ise 37,49±2,41 dakika olarak belirlenmiştir. Protein konsantresinin köpük kapasitesi %35,00±3,54 ve köpük stabilitesi ise %71,80±7,25 (30 dakika sonra) olarak belirlenmiştir. Protein konsantresinin emülsifiye etme ve köpürme özellikleri sodyum kazeinattan daha düşük bulunmuştur. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yağsız vişne çekirdeği içi unundaki protein fraksiyonlarının hemen hemen tamamının protein konsantresinde tutulduğunu göstermiştir. Üretilen protein konsantresinin fonksiyonel ve kimyasal özellikleri dikkate alındığında protein konsantresinin bazı gıda formülasyonlarında kullanım alanı bulabileceği anlaşılmıştır.
2011, 49 sayfa
ii
Some Chemical and Functional Properties of Protein Concentrate Produced from Sour Cherry Kernels
Mehtap Gedik Gaziosmanpaşa University
Faculty of Engineering and Natural Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Metin YILDIRIM
Fruit skins and seeds are the most important by-products produced by fruit processing plants. The seeds from such fruits as sour cherry and apricot can supply significant amounts of edible proteins and oils. Therefore, the aims of this research were to produce protein concentrate from sour cherry seed kernels, and to investigate its functional and chemical properties.
Protein concentrate was prepared from the defatted powder of sour cherry seed kernels by extracting at pH 10.0, and precipitating at pH 4.5. Dry matter, fat, total carbohydrate, protein, and ash contents; water and oil absorption capacity, emulsifying activity and stability indices, foaming capacity and stability, least gelling concentration, protein solubility and molecular weight of the resulting concentrate were determined.
Protein concentrate contained 95.97±0.16% dry matter, 3.31±0.17% ash, 2.94±0.36% carbohydrate, 1.93±0.16% fat, and 80.48±2.38% protein. Water holding capacity, oil holding capacity and least gelling concentration of protein concentrate were 242±0.09%, 173±0.17%, and 8%, respectively. Protein concentrate showed minimum and maximum solubility at pH 5.0 (12.41±1.23%) and 12.0 (92.96±1.66%), respectively. Emulsifying activity and stability indices, foaming capacity and stability of protein concentrate were 38.91±2.50 m2/g, 37.49±2.41 min, 35.00±3.54% and 71.8±7.25%, (after 30 minutes), respectively. Emulsifying and foaming properties of protein concentrate were lower than those of sodium caseinate. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis showed that almost all of the protein fractions in the defatted powder were transferred to the protein concentrate. The protein concentrate may find applications in some food formulations with regards to its functional and chemical properties.
2011, 49 pages
iii
Tezimin konusunun belirlenmesinde ve tezin başından sonuna kadar yazılmasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Metin YILDIRIM’a ve her zaman yanımda olup desteklerini hiç esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Laboratuar çalışmalarımda yardımını esirgemeyen değerli arkadaşım Melih GÜZEL’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
iv Sayfa ÖZET……….……….………... ABSTRACT……….……….……….………..… TEŞEKKÜR………..………...… İÇİNDEKİLER……….………..……….……… ŞEKİLLER DİZİNİ………….……….………..… ÇİZELGELER DİZİNİ………...………..…. i ii iii iv vi vii 1. GİRİŞ……….……… 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ………..……….. 4
2.1. Vişne Meyve ve Çekirdeklerinin Özellikleri……….. 4
2.1.1. Vişne Meyvesi……… 4
2.1.2. Vişne Çekirdeği………..……… 5
2.2. Proteinlerin Fonksiyonel Özellikleri………..…... 6
3. MATERYAL VE YÖNTEM………..………..…... 17
3.1. Materyal………..………... 17
3.2. Yöntem………...……….……… 17
3.2.1. Vişne Çekirdeği İçinden Yağın Uzaklaştırılması………...……… 17
3.2.2. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin (VÇİPK) Hazırlanması…... 17
3.2.3. Vişne Çekirdeği İçinin Fiziksel ve Kimyasal Niteliklerinin Belirlenmesi……... 18
3.2.3.1. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Kurumadde Analizleri….…………...… 18
3.2.3.2. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Yağ Analizleri………. 18
3.2.3.3. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Toplam Karbonhidrat Analizleri.……… 19
3.2.3.4. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Protein Analizleri………...…… 19
3.2.3.5. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Kül Analizi……… 20
3.2.3.6. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Renk Değerlerinin Ölçümü ..……....….. 21
3.2.3.7. Yağsız Vişne Çekirdeği İçi ve Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin SDS-PAGE’ de İncelenmesi……… 21
3.2.4. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özelliklerinin Belirlenmesi……….………..….……… 22
3.2.4.1. Protein Çözünürlüğünün Belirlenmesi………..……... 21
3.2.4.2. Su ve Yağ Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi………....……….…… 22
3.2.4.3. Köpük Kapasitesi ve Stabilitesinin Belirlenmesi ………...………... 23
3.2.4.4. Emülsiyon Akitivite İndeksi (EAİ) ve Emülsiyon Stabilite İndeksinin (ESİ) Belirlenmesi ………..……….. 24
3.2.4.5. Minimum Jel Oluşturan Konsantrasyonun (MJOK) Belirlenmesi ….…….... 25
3.2.5. İstatistiksel Değerlendirme………. 24
4. BULGULAR ve TARTIŞMA……….. 26
4.1. Protein Konsantresinin Hazırlanması………... 26
4.1.1. Örneklerin Öğütülmesi ve Yağ Ekstraksiyonu………... 26
4.1.2. Ekstraskiyon pH’sının Belirlenmesi………...……… 27
4.1.3. Protein Konsantresinin Hazırlanması ve Bileşimi………... 29
4.1.4. Vişne Çekirdeği ve İçi Ürünlerinin Renk Değerleri…………...……… 31
4.2. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özellikleri………. 32
4.2.1. Protein Çözünürlüğü ………...………... 32
v
4.2.6. Protein Konsantrelerinin Minimum Jel Oluşturan Konsantrasyonları ……….…. 39
4.2.7. Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)…..………. 40
5. SONUÇ………..……… 43
6. KAYNAKLAR……….. 45
vi
Şekil Sayfa
Şekil 4.1. Yağsız vişne çekirdeği içi örneklerinden proteinlerin ekstraksiyonuna pH’nın etkisi………...…………... 28 Şekil 4.2. Vişne çekirdeği içi protein konsantresinin (%5’lik) farklı pH
değerlerindeki çözünürlükleri ……….…. 34 Şekil 4.3. Protein örneklerinin köpük stabilitesinde zamanla gözlenen değişim…….. 38 Şekil 4.4. Vişne çekirdeği içi ürünlerinin SDS-PAGE elektroforezi……… 41
vii
Çizelge 2.1. Montmorency vişne çeşidinin bileşimi………... 4 Çizelge 4.1. Vişne çekirdeği içinin yağ ekstraksiyon öncesi ve sonrası bileşimi……... 27 Çizelge 4.2. Vişne çekirdeği içi protein konsantresinin bazı kimyasal nitelikleri……… 30 Çizelge 4.3. Yağsız vişne çekirdeği içi proteinlerinin, protein konsantresinde tutulma
oranları (verim)………... 31
Çizelge 4.4.
Çizelge 4.5 Vişne çekirdeği içi ürünlerinin renk değerleri………... Vişne çekirdeği içi protein konsantresinin farklı 1,0-12,0 pH aralığındaki protein çözünürlüğü………...
32 33 Çizelge 4.6. Protein konsantresinin su ve yağ tutma kapasiteleri………... 35 Çizelge 4.7. Protein konsantresinin ve Na-kazeinatın köpük kapasiteleri ve
stabiliteleri………... 37
Çizelge 4.8. Protein konsantresinin emülsiyon aktivite ve emülsiyon stabilite indeksi… 39 Çizelge 4.9. Vişne çekirdeği içi protein konsantresinin minimum jel oluşturan
konsantrasyonları……….. 40
Gıda işlemenin değişik aşamalarında çeşitli katı veya sıvı atıklar açığa çıkmaktadır. Meyve işleme tesislerinde en fazla karşılaşılan atık kabuk, posa ve çekirdektir. Çevre kirliliği, gıda yetersizliği gibi kaygılar, atıkların ekonomik ve güvenli bir şekilde geri dönüşümünü sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesi ihtiyacını da beraberinde getirmektedir (Kamel ve Kakuda, 1992). Günümüzde bu atıklar hayvan yemi olarak kullanma, fermantasyon yoluyla tek hücre proteinine dönüştürme, biyo-yakıt üretme gibi değişik uygulamalar ile değerlendirilmeye çalışılmaktadır (Kamel ve Kakuda, 1992; Duman ve ark., 2011).
Vişne, gülgiller (Rosaceae) familyasının bir üyesi olan vişne ağacından (Prunus cerasus L.) elde edilen ekşi tada sahip bir meyvedir (Anonim, 2011a). Sofralıktan daha çok meyve suyu, şurup, reçel, marmelat, komposto, likör gibi ürünlere işlenerek değerlendirilmektedir. Bu nedenle de önemli miktarlarda çekirdek atığı açığa çıkmaktadır. Kiraz daha çok sofralık olarak kullanıldığından önemli ölçüde toplu miktarlarda kiraz çekirdeği atığı açığa çıkmamaktadır (Iezzoni, 2008). Bu yüzden tüketim sonucunda ortaya çıkan kiraz çekirdeğinin değerlendirilmesinde toplama işlemi önemli bir engel oluşturmaktadır (Kamel ve Kakuda, 1992).
Anayurdu Anadolu ve Balkanlar olan vişne ağaçları, 5-7 metreye kadar boylanabilir. Dört yaşındayken meyve vermeye başlayan ve 40-50 yıl yaşayan vişne ağacının ekonomik ömrü 15-20 yıl ile sınırlıdır. Yuvarlak taçlı ve kiraza göre daha çalımsı görünüşlüdür. Gövdesi kırmızımtırak gri benekli, donuk ya da parlak renklidir. İlkbaharda erken açan çiçekleri beyaz renklidir. Temmuz ayı ortalarında olgunlaşmaya başlayan meyveleri, kirazdan biraz basıkçadır. Olgun vişneler, bol sulu ve siyaha yakın kırmızı renklidir (Anonim, 2011b).
Vişne yetiştiriciliği Türkiye‘nin bütün bölgelerine yayılmış olmakla beraber, ticari yetiştiricilik uygun iklim koşullarına sahip sınırlı alanlar içerisinde yapılmaktadır. Afyon, Kütahya, Ankara, Isparta, Tokat ve Amasya vişne üretilen başlıca illerimizdir
(Anonim, 2011c). 2008 yılı verilerine göre ülkemiz, yıllık 417 694 tonluk vişne üretimi ile dünyada birinci sırada yer almaktadır (Anonim, 2011d).
Vişne, kayısı gibi ―Purunus‖ cinsinde yer alan meyvelere ait çekirdeklerin, insan beslenmesinde kullanılabilir protein ve yağ kaynağı olabilecekleri belirtilmiştir. Vişne/kiraz meyvesinin %6,3‘lük kısmını çekirdek, çekirdeğin de %26,6‘lık kısmını çekirdek içi oluşturmaktadır. Vişne/kiraz çekirdeğinin %6,2 protein, %18,1 karbonhidrat, %14,5 yağ, %60 lif ve %1,2 mineral madde içerdiği saptanmıştır. Yüksek oranda protein (yağsız kısmında %31,7, %N x 5,3) ve yağ (%41,9) içermesi nedeniyle çekirdek içinin insan beslenmesinde kullanılacak protein ve yağ ekstraksiyonu için avantajlı olacağı belirtilmiştir. Aminoasit analizi, vişne/kiraz çekirdeği proteininin metionin aminoasidi açısından fakir olduğunu göstermiştir (Kamel ve Kakuda, 1992).
Bir gıdanın tüketici açısından önem taşıyan fonksiyonel özellikleri, gıdanın besleyici değerinin dışında kalan diğer niteliklerinin tümüdür. Tüketici tercihlerini etkileyen bu nitelikler sırasıyla tekstür, tat-koku, renk ve görünüştür. Fonksiyonel özellikler sadece son ürünün kalitesini belirlemek açısından değil ayrıca işlenmiş et ürününün dilimlenmesi, bisküvi hamurunun makinelerle taşınabilmesi gibi üretim aşamalarının kolaylaştırılması ve yeni gıda maddelerinin geliştirilmesi açısından da önemlidir (Singh ve ark., 2008; Ogunwolu ve ark., 2009). Bu nedenlerle proteinler, tat-koku maddelerini taşıma, köpük, emülsiyon, jel ve hamur oluşturma gibi özellikleri ile gıdanın fonksiyonel niteliklerini etkileyen ve/veya belirleyen önemli bileşenlerdir.
Proteinlerin fonksiyonel özellikleri, proteinlerin kompozisyonu ve üç boyutlu yapısı gibi iç faktörlerden, gıda ya da model sistemin kompozisyonu gibi çevresel faktörlerden ve izolasyon metodu ile koşullarından etkilenmektedir (Kinsella, 1981; Fernandez-Quintela ve ark., 1997; Bilgi ve Çelik, 2004). Bu nedenlerle elde edildikleri kaynağa bağlı olarak proteinlerin fonksiyonel nitelikleri de farklılık gösterebilmektedir.
Gıda üretiminde kullanılan proteinler kabaca hayvansal kaynaklı (jelatin, kazein vb) ve bitkisel kaynaklı (soya, yer fıstığı vb) proteinler olmak üzere iki grupta toplanabilir. Birçok bitkisel kaynaklı protein, insan beslenmesinde düşük maliyetli protein kaynağı
olarak ilgi çekmektedir (Ogunwolu ve ark., 2009). Gelecekte protein kaynaklarında yetersizlik olacağı kaygısıyla 1950‘li yıllardan itibaren yeni alternatif protein kaynakları bulmak amacıyla yoğun çalışmalar yapılmıştır. Bu amaçla maya, küf, bakteri ve mikroalg gibi canlılardan protein üretme yolları araştırılmıştır (Becker, 2007).
Vişne meyvelerinin çeşitli ürünlere işlenmesinden sonra atık olarak görülen çekirdeklerin çok az bir kısmı hayvan yemi rasyonlarında kullanılmaktadır. Vişne çekirdeklerinin hayvan yemi olarak kullanımının yanı sıra, biyo-yakıt üretimi ve gıda sanayi gibi alanlarda da kullanım olanakları mevcuttur. Yapılan kaynak taramalarında, vişne çekirdeğinin bileşiminin belirlendiği birkaç çalışma dışında, vişne çekirdeğinden proteinlerin izole edilmesi ve izole edilen proteince zengin ürünlerin (konsantre veya izolat) fonksiyonel niteliklerinin belirlenmesini konu alan herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle gerçekleştirilen bu çalışmada vişne çekirdeği içinden ekstrakte edilen proteinlerin bazı kimyasal ve fonksiyonel özellikleri belirlenerek, diğer bitkisel ve hayvansal kaynaklı proteinler ile karşılaştırılmış ve gıda endüstrisinde kullanım olanakları incelenmiştir.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Vişne çekirdeği ve çekirdek içinin bileşimini konu alan sınırlı sayıda kaynak bulunmaktadır. Vişne çekirdeğinden proteinlerin izole edilmesi ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi ile ilgili ise herhangi bir literatüre rastlanmamıştır. Bu nedenle konu ile doğrudan ilgili ulaşılabilen kaynaklar sınırlı kalmıştır.
2.1. Vişne Meyve ve Çekirdeklerinin Özellikleri
2.1.1. Vişne Meyvesi
Vişne, Çizelge 2.1‘de görüldüğü gibi besin maddeleri açısından oldukça zengin bir meyvedir (Iezzoni, 2008). Sanayide kullanılan birkaç çeşit dışında üretilen kirazın hemen hepsi taze olarak tüketilmektedir ve bu nedenle ortaya çıkan çekirdeğin değerlendirilmesinde toplama işlemi önemli bir engel oluşturmaktadır (Kamel ve Kakuda, 1992). Vişne ise meyve suyu randımanının (%70-75) ve toplam asitliğin (%3, sitrik asit cinsinden) yüksek olması nedeniyle, meyve suyu olarak işlenmeye çok uygundur (Anonim, 2011a). Ayrıca vişne dondurularak, kurutularak, konserve ve reçele dönüştürülerek de değerlendirilebilmektedir (Iezzoni, 2008; Anonim, 2011a).
Çizelge 2.1. Montmorency vişne çeşidinin bileşimi (100 g meyvede)
Bileşen Değer Protein (%) 1,11 Yağ (%) 0,10 Toplam karbonhidrat (%) 10,00 Şeker (%) 8,20 Früktoz (%) 3,10 Glukoz (%) 5,10 Diyet lifi (%) 1,10 Çözünür lif (%) 0,66 Çözünmez lif (%) 0,43 Kalsiyum (mg) 13,00 Demir (mg) 0,50 Fosfor (mg) 16,00 Potasyum (mg) 132,00 Sodyum (mg) 18,00 C vitamini (mg) 2,48 A vitamini (IU) 538,00
Vişnenin önemli düzeyde polifenolik maddeler (antosiyaninler ve diğer flavonoidler) ile melatonin alkaloidini içermesi onun sağlık açısından önemli bir meyve olduğuna işaret etmektedir (Kirakosyan ve ark., 2009). Vişnede bulunan antosiyaninlerin antioksidan ve iltihap önleyici olduğu (Wang ve ark. 1999), insan ve hayvan hücrelerinde tümör gelişimini durdurduğu gözlenmiştir (Kang ve ark., 2003). Ayrıca vişne sahip olduğu antioksidanlar sayesinde, damarlarda plak oluşumunu engelleyerek kalp hastalıklarına karşı da koruyucu etki sağlamaktadır (Wang ve ark., 1999; Jayaprakasam ve ark., 2005). Vişne çekirdeği içinin de fenolik maddelerce zengin olduğu belirlenmiştir. Vişne çekirdeği içinin yağı hekzan ile uzaklaştırıldıktan sonra geriye kalan ekstraktın %2-4 siyanid, %1-3 polifenol, %1-4 flavonoids, %1-2 proantosiyanidin ve antosiyanidin, %1 trans resveratrol ve %1 kateşin gibi biyoaktif bileşikler içerdiği bildirilmiştir. Bu ekstraktın farelerin beslenmesinde 14 gün süreyle kullanılması (10-30 mg/kg gün), farelerden uzaklaştırılan kalplerin yeniden işlev (kan akışı, basınç oluşturma) yapmasını önemli ölçüde iyileştirdiği saptanmıştır (Bak ve ark., 2006).
Vişne/kiraz meyvesinin %6,31,3‘lük kısmını çekirdeğin; çekirdeğin de %26,69,7‘lik kısmını çekirdek içinin oluşturduğu belirlenmiştir (Kamel ve Kakuda, 1992).
2.1.2. Vişne Çekirdeği
Çeşitli kaynaklarda vişne çekirdeğinin insan beslenmesinde kullanılabileceğine dair bilgiler bulunmaktadır. Cruess (1958) makarna hamurunda ve yağ üretiminde kayısı, şeftali ve vişne/kiraz çekirdek içlerinden yararlanıldığını belirtmiştir (Lazos, 1991). Bu konuda Amerika Birleşik Devletleri‘nde bulunan Beatrice Foods şirketi tarafından 1974 yılında patent alınmıştır. Patent vişne/kiraz çekirdeğinin öğütülerek insan tüketimine uygun bir un haline getirilmesine yöneliktir. Ayrıca patentte ekmek yapımında buğday ununun %30‘unun yerine vişne/kiraz çekirdeği unu kullanılabileceği ve bu şekilde elde edilen ekmeğin hoşa giden hafif bir badem lezzetine sahip olduğu da belirtilmiştir (Baudhuin, 1974). Lazos (1991) yaptığı incelemeler sonucunda vişne/kiraz çekirdeği içinin besin maddeleri açısından zengin olduğunu, fırıncılık ve şekerleme ürünlerinde protein kaynağı şeklinde kullanılabileceğini belirtmiştir. Aynı araştırmacı vişne/kiraz
çekirdeği içinden elde edilen yağın yemeklik yağ olarak ve kozmetik ürünlerinde badem yağının yerine kullanılabileceğini bildirmiştir. Benzer şekilde Kamel ve Kakuda (1992) da vişne/kiraz, kayısı gibi ―Purunus‖ cinsinde yer alan meyvelere ait çekirdek içlerinin, insan beslenmesinde kullanılabilir protein ve yağ kaynağı olabileceklerini bildirmiştir.
Weckel ve Lee (1960) tarafından vişne/kiraz çekirdeğinin bileşimini belirlemeye yönelik yapılan çalışmada çekirdeğin kurumaddesinde %7,6 (%N x 6,25) protein ve %10,4 yağ bulunduğu saptanmıştır (Kamel ve Kakuda, 1992).
İran‘da yetiştirilen vişne meyvelerine ait çekirdek içlerinin bileşiminin incelendiği bir çalışmada, kurutulmuş vişne çekirdek içlerinin %20,5-33,2 arasında değişen düzeylerde yağ içerdikleri tespit edilmiştir (Farrohi ve Mehran, 1975).
Vişne/kiraz çekirdeği bileşimini belirlemeye yönelik olarak gerçekleştirilen bir başka çalışmada, çekirdeğin kurmaddesinde %6,2 (%N x 5,3) protein, %18,1 karbonhidrat, %14,5 yağ, %60 lif ve %1,2 mineral madde içerdiği saptanmıştır (Kamel ve Kakuda, 1992).
Kurutulmuş vişne/kiraz çekirdeği içinin bileşimini inceleyen Kamel ve Kakuda (1992), kurutulmuş çekirdek içinin %41 yağ bulundurduğunu, yağsız kısımdaki protein oranının ise %31,7 (%N x 5,3) olduğunu belirlemişlerdir. Yağsız çekirdek içinin elzem aminoasitlerden metionince fakir olduğu da saptanmıştır.
Süperkritik akışkan yöntemiyle vişne/kiraz çekirdeğinden yağ ekstraksiyonu üzerinde çalışan Bernardo-Gil ve ark. (2001), kurutulmuş vişne/kiraz çekirdeğinin %89,1 kurumadde, %8,5 yağ, % 10,3 protein, %57,2 lif ve %0,9 kül içerdiğini belirlemişlerdir.
2.2. Proteinlerin Fonksiyonel Özellikleri
Proteinlerin fonksiyonel özellikleri gıda işleme ve ürün formülasyonlarında önem taşımaktadır. Fonksiyonel özelliklerden bazıları su tutma, yağ bağlama, emülsiyon,
köpük ve jel oluşturmadır. Bu fonksiyonel özellikler moleküler yapı ve ağırlık gibi iç faktörlerden, proteinlerin izolasyon metodu, pH, iyonik güç ve diğer bileşenlerin bulunması gibi birçok dış faktörden etkilenmektedir. Fonksiyonel özelliklerden hangisinin daha önemli olduğu protein konsantresinin veya izolatının kullanılacağı gıda maddesine bağlı olarak değişim gösterir. Örneğin yüksek su ve yağ tutma kapasitesi sosis, ekmek ve keklerde arzu edilirken yüksek emülsifiye etme ve köpük oluşturma özellikleri salata sosları, sosisler, çorbalar, şekerlemeler, donmuş tatlı ve kekler için tercih edilen özelliklerdir (Kinsella, 1979; Ahmedna ve ark., 1999).
Proteinlerin farklı koşullardaki çözünürlüğü, emülsiyon oluşturma, köpürme ve jelleşme gibi diğer fonksiyonel özelliklerini önemli düzeyde etkilemesi nedeniyle proteinlerin önemli fonksiyonel niteliklerinden birisidir (Kinsella, 1982). Proteinler izoelektrik noktalarında en düşük çözünürlüğü gösterirler. Çünkü bu noktada protein-protein interaksiyonu maksimum seviyede gerçekleşir. İyonların konsantrasyonu ve çeşidi proteinlerin su tutma kapasitesini, şişmesini ve çözünürlülüğünü önemli derecede etkilemektedir (Cheftel ve ark., 1985; Saldamlı ve Temiz, 1998).
Proteinlerin su ile etkileşimi, gıdaların lezzet ve yapısını belirlemesi nedeniyle gıda sistemlerinde çok önemlidir. Gıda proteinlerinin su tutma kapasitesini belirleyen proteine özgü faktörler aminoasit bileşimi, üç boyutlu yapı ve yüzey hidrofobisite/polaritesidir. Ayrıca gıda işleme metotları da proteinlerin üç boyutlu yapısı ve hidrofobisitesi üzerinde önemli etkiye sahiptir (Barbut, 1999). Su tutma kapasitesi çorba, hamur ve fırıncılık ürünleri gibi viskozitesi yüksek gıda maddeleri için kritik bir fonksiyonel özelliktir. Bu ürünlerde proteinlerin çözünmeden suyu tutmaları ve bu sırada viskoziteyi arttırıp kıvam ve yapı kazandırmaları gerekmektedir (Seena ve Sridhar, 2005).
Proteinlerin yağ ile etkileşimi, gıdaların lezzet ve yapısını belirlemesi nedeniyle gıda sistemlerinde çok önemlidir (Barbut, 1999). Gıda emülsiyonları termodinamik açıdan stabil olmayan su-yağ karışımlarıdır. Emülsiyonun oluşması ve stabilitesi mayonez gibi gıda sistemlerinde çok önemlidir. Proteinler yüklü-yüksüz, polar-apolar aminoasitler içerebilmektedir. Bu aminoasitler proteinlere, hidrofilik ve hidrofobik özellikleri bir
arada içeren yüzey aktif madde niteliği kazandırmaktadır. Bu sayede proteinler gıda sistemlerinde hem yağ hem de su fazı ile etkileşime girebilmektedir. Proteinlerin stabilize ettiği emülsiyonları pH, iyonik kuvvet, sıcaklık, düşük molekül ağırlığına sahip yüzey aktif maddelerin varlığı, şekerler, yağ fazı ve protein tipi gibi faktörler de etkilemektedir. Bunun yanı sıra emülsiyon özelliğini proteinin çözünebilirliliği de oldukça etkileyebilmektedir. Ancak doğrusal bir ilişkiden söz etmek olası değildir (Saldamlı ve Temiz, 1998). Çözünmez ve yüksek düzeyde apolar nitelik gösteren proteinlerin büyük miktarda yağ bağlayabildikleri görülmektedir. Küçük partikül boyutlu, düşük yoğunluklu protein tozları yüksek yoğunluklu protein tozlarından daha fazla yağ tutarlar. Bitkisel protein konsantrelerinin karbonhidrat bileşenlerinin yağ bağlamada önemli derecede bir payı bulunmamaktadır (Cheftel ve ark., 1985).
Köpük, emülsiyona benzer bir şekilde oluşur. Köpükte su molekülleri apolar faz olan hava küreciklerinin etrafını sarmaktadır. Teorik olarak proteinlerin hem polar hem de apolar grupları bir arada içermesi onları iyi bir köpük oluşturucu konumuna getirmektedir. Bu nitelikleri sayesinde proteinler su-hava ara yüzeyinde yer alarak hava küreciklerinin birleşmesine engel olurlar. Proteinlerin köpürme özellikleri marshmallow, kekler, çırpılmış kremalar gibi gıda maddeleri için önem taşımaktadır (Kinsella, 1979). Bir molekülün iyi bir köpürme ajanı olabilmesi için temel gereksinimler şu şekildedir: (i) köpürme süresince hava/su ara yüzeyinde hızlı bir şekilde adsorblanmalı, (ii) hızlı yapısal değişikliğe uğrama ve ara yüzeyde yeniden düzenlenme yeteneğine sahip olmalı, (iii) moleküller arası interaksiyonlar yoluyla kohezif bir viskoelastik film oluşturabilmeli (Makri ve ark., 2005). Moleküler arası kohezyon ve elastikiyet stabil köpük oluşumu için önemli iken ikincil ve üçüncül yapılı esnek moleküller köpüklerin etkili bir şekilde oluşumu için gerekli olmaktadır (Kinsella, 1981; Damodaran, 1990).
Protein jelleri, protein zincirlerinin kısmi etkileşimi sonucunda suyun hapsedildiği üç boyutlu ağ yapısıdır. Proteinlerin jel oluşturma yetenekleri salam, sosis gibi et ürünlerinde önem taşımaktadır (Kinsella, 1979). Jel, sıvı-katı arasında yer alan bir fazdır. Proteinlerin jel oluşturması yalnızca katı-viskoelastik jel oluşumunda değil, aynı zamanda su tutma, kalınlaştırma, partiküllerin bağlanması, köpük stabilizasyonu gibi
proseslerde de kullanılmaktadır. Belirli koşullar altında sıcaklık, enzim veya iki değerli katyonlarla ağ yapı oluşumu sağlanabilir. Isıl işlem etkisi ile oluşan jelleşmede protein çözeltisi (sol haldeki protein) önce ‖projel‖ haline dönüşür. Projel viskoz bir sıvı olup bazı proteinlerde polimerizasyon görülür. Projel oluşumu tersinmez olup ardından ikinci basamak olan ağ yapının oluşması gelir ve protein jelasyona uğrar. Ağ yapı oluşmasındaki interaksiyonlar öncelikle hidrojen bağları, hidrofobik ve elektrostatik etkileşimleri içermektedir (Saldamlı ve Temiz, 1998).
Vişne çekirdeği içi proteinlerinin fonksiyonel özellikleri ile ilgili herhangi bir çalışmaya ulaşılamadığı için bu kısımda diğer kaynaklardan sağlanan protein ürünlerinin üzerinde yapılan araştırmalardan bazılarının özetleri sunulmuştur.
Bezelyeden (Pisum sativum L. Var. Trapper) protein izolatı üretimi sonucunda yağsız bezelye unundaki proteinlerin %65‘i protein izolatında tutulmuştur. Elde edilen bezelye protein izolatlarının özellikleri: %4,2 su, %90 protein, %4,4 yağ, %2,8 kül, L*: 62,8, a*: 5,0, b*: 22,1 şeklinde tespit edilmiştir. Elde edilen bezelye protein izolatlarının fonksiyonel özellikleri ise şu şekilde bulunmuştur: Emülsifikasyon %38, yağ tutma kapasitesi %122, su tutma kapasitesi %112, köpürme %143. Protein izolatının farklı pH değerlerindeki çözünürlük profili ise pH 3,0‘te %56, pH 4,5‘te %2, pH 7,0‘de %87, pH 10,0‘da %100 olarak gerçekleşmiştir (Sumner ve ark., 1980).
Yağsız şeftali çekirdeği ununun yağ tutma ve emülsiyon oluşturma özelliklerinin iyi, ancak su tutma ve köpürme özelliklerinin düşük olduğu belirlenmiştir. Protein çözünürlülüğünün alkali ve asidik pH değerlerinde yüksek, pH 4,3‘te ise minimum düzeyde bulunduğu saptanmıştır (Rahma ve Abd El Aal, 1988).
Fernandez-Quintela ve ark. (1997) tarafından yapılan çalışmada bezelye, bakla ve soya fasulyesinden protein izolatları hazırlanmıştır. Baklagiller 10 saat su içerisinde bekletildikten sonra kabukları elle soyulmuştur. Daha sonra örnekler 25ºC‘de hava akımlı etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuştur. Kabukları uzaklaştırılan ve öğütülen baklagillerin yağı uzaklaştırılmıştır. Bu şekilde elde edilen unlar 1:5 (w/v) oranında suyla karıştırılarak süspansiyon haline getirildikten sonra pH‘sı 1 N NaOH ile 9,0‘a
ayarlanmıştır. Bu şartlar altında 20 dakika oda sıcaklığında protein ekstraksiyonu gerçekleştirilen örneklerin çözünmeyen kısımları santrifüj ile uzaklaştırılmıştır. Elde edilen sıvı fazın pH‘sı 1 N HCl ile 4,0‘e ayarlanarak 20 dakika oda sıcaklığında proteinlerin izoelektrik çöktürmesi gerçekleştirilmiş ve proteinler santrifüj edilerek ayrılmıştır. Ayrılan kısım dondurarak kurutulmuştur. Protein izolatlarının fonksiyonel özellikleri şu şekilde belirlenmiştir: Bezelye protein izolatının su tutma kapasitesi 1,7 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,2 g yağ/g, köpürme kapasitesi %15, köpük stabilitesi %94 ve minimum jel oluşturan konsantrasyonu %18; bakla protein izolatının su tutma kapasitesi 1,8 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,6 g yağ/g, köpürme kapasitesi %15, köpük stabilitesi %77 ve minimum jel oluşturan konsantrasyonu %14; soya fasulyesi protein izolatının su tutma kapasitesi 1,3 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,1 g yağ/g, köpürme kapasitesi %22, köpük stabilitesi %93 ve minimum jel oluşturan konsantrasyonu %16 olarak bulunmuştur. Baklagil protein izolatlarının izoelektrik noktası pH 4,0 olarak bulunmuştur. Baklagil protein izolatlarının protein çözünürlüklerinin pH 4-6 arasında minimuma indiği, alkali pH değerlerinde ise önemli ölçüde arttığı bulunmuştur.
Nohut unlarından pH 12,0‘de (izolat A) ve pH 10,5‘de kararmayı engellemek için Na2SO3 varlığında (izolat B) ekstrakte edilen proteinler izoelektrik çöktürme (pH 4,3) ile geri kazanılmıştır. İzolat A elde edilirken prespitat su ile yıkanarak donuk kurutulmuştur. İzolat B‘de ise prespitat pH‘sı 4,3 olan su, etanol ve aseton ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutulmuştur. İzolatB‘nin hazırlanmasında pH değerinin düşük olması ve sodyum sülfitin proteinlerle reaksiyona girebilecek okside polifenollerin oluşumunu engellemesi rengin daha beyaz olmasına yol açmıştır. İzoelektrik çöktürme ile özellikle albüminler geri kazanılamadığından örneklerdeki proteinlerin toplam geri kazanım oranları %65,9 (izolat A) ve %62,1 (izolat B) şeklinde gerçekleşmiştir. İzolat A ve izolat B‘nin kimyasal bileşimleri sırası ile %3,3 ve %5,5 su, %2,9 ve %4,3 kül, %78 ve %88,1 protein, %3,5 ve %1,1 yağ, %11,8 ve %3,3 karbonhidrat, <% 0,1 ve <%0,1 polifenol olarak bulunmuştur. İzolat B‘de etanol ve aseton yıkaması nedeniyle lipit ve karbonhidrat düzeyleri düşük bulunmuştur. Buna bağlı olarak da izolat B‘nin protein içeriği (%88,1) daha yüksek çıkmıştır. Hekzan ile ekstraksiyon nedeniyle yağsız unda (%1,5 yağ) ve protein izolatlarında bir miktar polar karakterli yağ kalmıştır. İzolat A ve B‘nin fonksiyonel özellikleri ise sırasıyla %26,6 ve %46,3 çözünürlük (pH 7,0‘de),
%343,7 ve %199,5 su tutma kapasitesi, %409,4 ve %125,7 yağ tutma kapasitesi şeklinde bulunmuştur (Sanchez-Vioque ve ark., 1999).
Sze-Tao ve ark. (2000) tarafından badem içi üzerinde yapılan çalışmada, öğütülmüş bademin yağı aseton ile uzaklaştırılmış ve yağsız örnek -20°C‘ de muhafaza edilmiştir. Yağsızlaştırılmış örnekler pH‘sı 8,1 olan tris-HCl tamponunda 1:10 oranında çözülmüştür. Daha sonra 12 000 g‘de 20 dakika süreyle 4°C‘de santrifüj edilmiştir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı kısmı saf suya karşı diyaliz edildikten sonra donuk kurutulmuş ve -20°C‘de muhafaza edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan protein izolatının pH 5,0‘de %1‘lik konsantrasyonda köpük kapasitesi %120, 30. dakikadaki köpük stabilitesi %98 (makaledeki veriler kullanılarak hesaplanmıştır), yağ tutma kapasitesi 2,926 g yağ/g, emülsiyon aktivite indeksi pH 5,0‘de %0,1‘lik konsantrasyonda 44,78 m2/g olarak belirlenmiştir.
Yağsız Amaranth unundaki proteinlerin ekstraksiyonu pH 10,0‘da gerçekleştirilmiştir. Santrifüj sonrası sıvı kısım alındıktan sonra katı kısım tekrar ekstraksiyona tabi tutulmuştur. Fakat çok az bir proteinin geri kazanılması ve sıvı fazın çok yükselmesinden dolayı ikinci ekstraksiyon işlemi uygun bulunmamıştır. Ekstraksiyon sıvısındaki proteinler pH 4,6‘da çöktürülerek geri alınmış ve sonra donuk kurutulmuştur. Bu proseste son ürünün protein içeriği %32 olarak gerçekleşmiştir. Ekstraksiyon sıvısının diyaliz edilmesi sonucunda ise protein içeriği % 67 olan bir ürün elde edilmiştir. İzoelektrik çöktürme ve diyaliz işlemleri uygulanarak elde edilen protein konsantrelerinin kimyasal bileşimleri sırasıyla %0,5 ve %0,7 yağ, %56 ve %24,4 polisakkarit, %0,3 ve %0,4 kül, %7 ve %7,5 su olarak bulunmuştur. İzoelektrik çöktürme ile hazırlanan örnekler başlıca globülin fraksiyonlarını içerirken albümin fraksiyonlarını içermemektedir. Ayrıca yüksek miktarda polisakkarit içermektedir. Fakat diyaliz metodu ile tüm protein fraksiyonları geri kazanılmıştır (Fidantsi ve Doxastakis, 2001).
Moure ve ark. (2001), yaptıkları çalışmada kuşburnu (Rosa rubiginosa) çekirdeklerinden iki farklı ekstraksiyon tekniği ile protein izolatı hazırlamışlardır. Su ile yapılan ekstraksiyonda partikül boyutunun < 0,5 mm olması durumunda, protein %83,5,
çözünür şeker %7,85, su tutma kapasitesi 2,37 g/g, yağ tutma kapasitesi 11,06 g/g, minimum jel oluşturan konsantrasyon %8, köpük kapasitesi %56, emülsiyon aktivite ve stabilite indeksi (%0,1‘lik konsantrasyonda) sırasıyla %53,4 ve %58,4 bulunmuştur.
Webb ve ark. (2002), buğday protein izolatı (%88,4 protein), sodyum kazeinat (%92,3 protein), soya protein izolatı (%84,8 protein), peynir altı suyu protein izolatı (%93,4 protein) ile hazırladıkları %3‘lük protein dispersiyonlarının fonksiyonel özelliklerini incelemişlerdir. Hazırlanan protein dispersiyonlarının pH değerleri sırasıyla 6,21, 6,68, 6,72 ve 6,00 olarak ölçülmüştür. Örneklerin bu pH değerlerindeki çözünürlükleri ise sırasıyla %79,67, %86,67, %60,67 ve %96,33 olarak gerçekleşmiştir. Örneklerin diğer fonksiyonel özellikleri ise sırasıyla %600,3, %6 877,3, %91 ve %1 662 overrun (%3‘lük konsantrasyonda), 155,0, 82,0, 115,9, 57,0 m2/g emülsiyon aktivite indeksi (%3‘lük konsantrasyonda), 294, 25, 52 ve 28 saat emülsiyon stabilite indeksi (%3‘lük konsantrasyonda) olarak bulunmuştur.
Mucuna fasulyesinden (Mucuna pruriens) hazırlanan protein konsantresinin protein içeriği %78,3 olarak bulunmuştur. Protein konsantrelerinin minimum çözünürlüğü %19,4 değeri ile pH 4,0‘te, maksimum çözünürlülüğü ise %96 ile pH 12,0‘de gerçekleşmiştir. Köpük kapasitesinin konsantrasyona bağlı olduğu; %10 (w/v)‘luk konsantrasyonda %94 ve %2 (w/v)‘lik konsantrasyonda ise %58‘lik bir değer aldığı gözlenmiştir. Protein konsantresinin minimum jel oluşturan konsantrasyon (MJOK) değeri %8 (w/v) ile pH 4,0‘te tespit edilmiştir. En yüksek MJOK değeri % 16 (w/v) ile pH 2,0‘de sağlanmıştır. Örneklerin pH 7,0 ve 8,0‘deki MJOK değerleri ise % 12 (w/v) olarak saptanmıştır (Adebowale ve Lawal, 2003).
Arpa protein konsantrelerinin hazırlanması ile ilgili bir çalışmada; iki farklı arpa örneğinden (Bülbül, Tokak), proteinlerin pH 11,2‘de ekstraksiyonu ve pH 5,4‘te izoelektrik çökmesi sağlanmıştır. Daha sonra çöken proteinler santrifüj (3 300 x g, 15 dakika) edilmiştir. Protein çökeltisi donuk kurutularak arpa protein konsantresi üretilmiştir. Bülbül ve Tokak protein konsantrelerinin protein içerikleri sırasıyla % 75,9 ve % 77,2 bulunmuştur (Bilgi ve Çelik, 2004).
Baklagiller üzerinde yapılan bir çalışmada, öğütülmüş örneklerden yağın uzaklaştırılmasında petrol eter (1:3 oranında) kullanılmıştır. Örneklerdeki proteinler pH 9,5‘da ekstrakte edilmiş ve pH 4,5‘te izoelektrik çöktürme yoluyla geri kazanılmıştır. Albüminlerin izoelektrik noktası daha yüksek (pI 6,5) olduğundan sıvı faz ile birlikte uzaklaştırılmıştır. Yapılan bu çalışmada izoelektrik çöktürme ile hazırlanan izolatlar yalnızca globülinleri içerdiğinden geri kazanım oranı ultrafiltrasyon tekniğine göre daha düşük gerçekleşmiştir (Makri ve ark., 2005).
Keten tohumu üzerinde yapılan bir araştırmada, öğütülen tohumlar 50ºC‘de kurutma işlemine tabi tutulmuştur. Daha sonra yağ içeriği %2‘den daha az olana kadar hekzan ile ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Protein konsantresi üretiminde kullanılan yağsız unun protein içeriği %36 olarak bulunmuştur. Örneklerdeki proteinler alkali (pH 9-11) koşullarda ekstrakte edildikten sonra pH 4,2-4,8 aralığında izoelektrik çöktürmeye tabi tutulmuştur. Ekstraksiyonun pH 11‘de ve çöktürmenin ise pH 4,8‘de yapılması ile hazırlanan protein konsantresinde geri kazanım oranı %26,5 bulunmuştur. Bu şekilde hazırlanan konsantrenin kimyasal bileşimi %2,56 yağ, %6,62 kül, %2,44 çözünmez lif, %15,79 çözünür lif, %6,59 şeker ve %66,03 protein olarak saptanmıştır. Konsantrenin su ve yağ tutma kapasitesi sırasıyla 2,7 g/g (%253,5) ve 1,18 g/g (%150,25) olarak bulunmuştur. Köpük kapasitesi pH 6,0‘da minimum (%12) değeri alırken aynı pH‘daki köpük stabilitesi %83,3 ile en yüksek değere ulaşmıştır (Martinez-Flores ve ark., 2005).
Subagio (2006) yaptığı çalışmada, sümbül fasulyesinden (Lablab purpureus L.) hazırladığı protein izolatının kimyasal bileşimini %89,8 kurumaddede protein, %2,15 yağ, %2,97 kül ve %4,60 nişasta olarak bulmuştur. Protein izolatı hazırlanmasının son aşamasında, çökeltinin %70‘lik etanol ile yıkama işlemine tabi tutulması, elde edilen protein izolatının diğer bileşenlerden (lipitlerin ve şekerlerin) arındırılmasında etkili olduğu belirlenmiştir. Protein izolatı üretiminde toplam protein geri kazanım oranı %37-40 arasında gerçekleşmiştir. Düşük geri kazanım değerinin, proteinin diğer bileşenlerle kompleks oluşturmasından ve ayrıca izoelektrik prespitasyon aşamasında, ekstrakte olmuş proteinlerin %50‘sinin geri kazanılmamış olmasından kaynaklanabileceği bildirilmiştir. Ekstrakte olmuş proteinlerin %50‘sinin izoelektrik prespitasyonla kaybolmasının sebebi, ekstraksiyon aşamasındaki bekletme uygulaması sırasında
proteinlerin hidrolize uğramasıdır. İzolatın renk değerleri L*: 90,32, a*: 1,76, b*: 3,36 olarak bulunmuştur. İzolatın beyazlığını bozan tohumdaki pigmentler hazırlama sürecinde elemine edilebilir veya Maillard reaksiyonuna yol açarak kahverengi renge neden olan şekerler uzaklaştırılabilir. Protein izolatının fonksiyonel özellikleri şu şekilde bulunmuştur: Köpük stabilitesi 2,3 dakika, yağ tutma kapasitesi %254, su tutma kapasitesi %321, emülsiyon aktivite ve stabilite indeksi (%0,1‘lik konsantrasyonda) sırasıyla 534 m2
/g ve 2,7 saat.
Kaur ve Singh (2007), damıtık suda farklı yağsız nohut unlarından (%5 w/v) alkali şartlarda ekstrakte ettikleri proteinleri, pH 4,5‘de çöktürerek nohut protein izolatları elde etmişlerdir. Bu yöntemde verimi arttırmak için ekstraksiyon 2 kez tekrarlanmış ve elde edilen çökeltiler yıkanarak kurutulmuştur. Hekzan ile yapılan ekstraksiyonda lipitlerin tamamı uzaklaştırılmadığı için nohut unlarında %0,53-1,21 oranlarında yağ bulunmuştur. Protein izolatlarının kimyasal bileşiminde %1,04-0,82 kül, %0,49-0,98 yağ ve %89,9-94,36 aralığında protein bulunduğu saptanmıştır. Renk değerleri L*: 58,63-61,33, a*: 1,88-2,21, b*: 22,46-24,95 olarak bulunmuştur. Nohut protein izolatlarının su tutma kapasiteleri 2,34-3,5 g/g, yağ tutma kapasiteleri 2,08-3,96 g/g, minimum jel oluşturan konsantrasyon değerleri %14-18, köpük oluşturma kapasiteleri (%3‘lük konsantrasyonda) %30,4-44,3 ve köpük stabiliteleri (120. dakikadaki) %94,7 olarak saptanmıştır.
Cheng ve ark. (2009) Çin çileği çekirdeğinden protein izolatı üretmek ve izolatın fonksiyonel özelliklerini belirlemek amacıyla gerçekleştirdikleri çalışmada, çekirdek içini öğütüp hekzan kullanarak Soxhlet düzeneğinde 9 saat süreyle yağını uzaklaştırmışlardır. Oda sıcaklığında kuruması sağlandıktan sonra tekrar öğütülüp 80 mesh‘lik (0,178 mm gözenek boyutlu) elekten geçirilmiştir. Daha sonra yağsız un siyah polietilen poşetle paketlenmiş ve 4°C‘de muhafaza edilmiştir. Yağsız Çin çileği çekirdeği ununun %5 (w/v)‘lik çözeltisi hazırlanmış ve 1 N NaOH ile çözeltinin pH değeri 10,0‘a ayarlanmıştır. 30oC‘de 1 saat süreyle karıştırıldıktan sonra 5 000 x g‘de 20 dakika boyunca santrifüj edilmiştir. Kalıntı kısmına aynı işlemler uygulanarak ekstraksiyon iki kez daha tekrarlanmıştır. Üç ekstraksiyon sonunda elde edilen çözeltiler karıştırılıp pH değeri 1N HCl ile 4,0‘e ayarlanmıştır. 5 000 x g‘de 20 dakika süreyle
santrifüj edilmiş ve çökelti kısmı donuk kurutulmuştur. Elde edilen protein izolatının bileşimi ve fonksiyonel özellikleri belirlenmiştir. İzolatın kurumaddesinde %91,6 protein, %0,8 yağ ve %1,25 kül bulunduğu saptanmıştır. Minimum (%4,3) ve maksimum (%94,0) azot çözünürlülüğü sırasıyla pH 4,0 ve 12,0‘de gözlenmiştir. Protein izolatının pH 6,0‘daki köpük kapasitesi (%2‘lik konsantrasyonda) %47,4, köpük stabilitesi (%2‘lik konsantrasyonda) %56,0, emülsiyon kapasitesi (%2‘lik konsantrasyonda) %48,7 ve emülsiyon stabilitesi (%2‘lik konsantrasyonda) %84,0 olarak bulunmuştur. Minumum jel oluşturan protein izolatı konsantrasyonu pH 6,0‘da %12 (w/v) olarak belirlenmiştir. İzolatın su tutma kapasitesi 2,2±0,1 g/g, yağ tutma kapasitesi ise 1,8±0,2 g/g şeklinde saptanmıştır.
Yerfıstığı protein konsantresi üretiminde değişik yöntemlerin incelendiği bir çalışmada izoelektrik presipitasyon tekniği kullanılarak elde edilen protein konsantresinin fonksiyonel özellikleri şu şekilde bulunmuştur: Minimum protein çözünürlüğü (1/100) yaklaşık %10 ile pH 4,5-5,0 aralığında saptanmıştır. Yağ ve su tutma kapasiteleri sırasıyla 2,0 mL yağ/g ve 1,15 g su/g, pH 6,0‘daki emülsiyon stabilite indeksi (%0,5‘lik konsantrasyonda) 19,18 dakika ve pH 7,4‘deki köpük kapasitesi (%1‘lik konsantrasyonda) %50 olarak belirlenmiştir (Wu ve ark., 2009).
Kaju fıstığından üretilen protein konsantresinin fonksiyonel niteliklerini inceleyen Ogunwolu ve ark. (2009), su tutma kapasitesini 1,74 mL su/g, yağ tutma kapasitesini 3,32 mL yağ/g, köpük kapasitesini (%0,1‘lik konsantrasyonda) %40, köpük stabilitesini (%0,1‘lik konsantrasyonda) %55, minimum jel oluşturan konsantrasyonu %10 ve minimum protein çözünürlüğünü (%1‘lik konsantrasyonda) pH 4,0‘te %10 olarak belirlemişlerdir.
Kanola ile aynı familyada yer alan Lesquerella fendleri bitkisi tohumlarından elde edilen ısıl işlem uygulanmamış yağsız unun fonksiyonel özellikleri Hojilla-Evangelista ve Evangelista (2009) tarafından incelenmiştir. Minimum protein çözünürlülüğü (%1‘lik konsantrasyonda) pH 5,5-7,0 aralığında %25 olarak belirlenmiştir. pH 7,0‘deki emülsiyon aktivite indeksi (0,1‘lik konsantrasyonda) 93,4 m2/g, emülsiyon stabilite
indeksi (0,1‘lik konsantrasyonda) 25,1 dakika ve su tutma kapasitesi 8,05 g su/g olarak belirlenmiştir.
Sharma ve ark. (2010) kayısı çekirdeğinden ürettikleri protein konsantresinin ortalama %68,8 protein, %9,1 su, %6,4 yağ, %0,8 kül, %2,2 lif ve %12,7 toplam karbonhidrat içerdiğini tespit etmişlerdir. Kayısı çekirdeği protein konsantresinin su tutma kapasitesi 1,4 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,4 g yağ/g ve köpük kapasitesi %21 olarak belirlenmiştir.
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
Araştırma 2010-2011 yılları arasında Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümünde yürütülmüştür. Araştırmada kullanılan vişne çekirdek içleri Tokat‘ın Niksar ilçesinde bulunan ticari bir işletmeden temin edilmiştir. Örnekler kullanılıncaya kadar plastik torbalarda 4ºC‘de muhafaza edilmiştir.
3.2. Yöntem
3.2.1. Vişne Çekirdeği İçinden Yağın Uzaklaştırılması
Vişne çekirdek içleri kahve değirmeni (Bosch MKM 600, Munich, Almanya) aracılığı ile parçalanarak un haline getirilmiştir. Öğütülen örnekler, hekzan ilavesinden (1:6 oranında) sonra oda sıcaklığında (22-24ºC) bir saat manyetik karıştırıcı ile karıştırılmıştır. Süre sonunda karışım kaba filtre kağıdından süzülerek hekzan ayrılmıştır. Bu işlem en az dört kez tekrarlanarak yağın uzaklaşması sağlanmıştır. Hekzanın tamamen uzaklaşması için bir gece çeker ocak içerisinde bekletilen örnekler sızdırmaz şekilde kapanabilen cam kavanozlara aktarılmış ve kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir.
3.2.2. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin (VÇİPK) Hazırlanması
Yağı alınmış vişne çekirdeği içi örneklerinden proteinlerin izole edilmesinde, katı/sıvı oranı 1:20 şeklinde kullanılmıştır. Saf su içerisinde dispers edilen yağsız unun pH değeri dijital pH metre (inoLab WTW pH 720, Weilheim, Almanya) yardımıyla 2 N NaOH kullanılarak 10,0‘a ayarlanmıştır. Daha sonra karışım 150 dakika süreyle manyetik karıştırıcıda (Heidolph MR 3001, Schwabach, Almanya) karıştırılmıştır. Bu
süre içerisinde karışımın pH değeri her 30 dakikada bir kontrol edilerek sabit tutulmuştur. Karışım kaba filtre kağıdından geçirilerek çökelti uzaklaştırılmıştır. Elde edilen sıvı kısmın pH‘sı 2 N HCl ile 4,5‘e ayarlandıktan sonra 15 dakika dinlendirilmiştir. Karışım kaba filtre kağıdından geçirilerek çökelti kısmı toplanmış ve bir miktar saf su ile dispers edilerek pH değeri 7,0‘ye ayarlanmıştır. Bu şekilde elde edilen ekstrakt 50ºC‘lik hava akımlı etüvde (Memmert 100-800, Schwabach, Almanya) 12-18 saat süreyle kurutulmuş ve kullanılıncaya kadar -18ºC‘de depolanmıştır.
3.2.3. Vişne Çekirdeği İçinin Fiziksel ve Kimyasal Nitelikleri
3.2.3.1. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Kurumadde Analizleri
Öğütülmüş yağlı vişne çekirdeği içi, yağsız vişne çekirdeği içi ve protein konsantresinin kurumadde oranları gravimetrik yöntemle belirlenmiştir (AOAC, 1997). Darası alınmış paslanmaz çelik kaplara (G2) yaklaşık ikişer gram örnek (G1) tartılarak 105±2ºC‘lik hava akımlı etüvde (Memmert 100-800, Schwabach, Almanya) 4 saat bekletilmiştir. Bu süre sonunda kaplar desikatöre alınıp 1 saat süre ile soğuması sağlandıktan sonra ağırlıkları (G3) belirlenmiştir. Bu işleme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) kurumadde miktarları aşağıdaki formüle kullanılarak hesaplanmıştır.
% Kurumadde = [(G3 - G2) / G1] x 100
3.2.3.2. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Yağ Analizleri
Öğütülmüş yağlı vişne çekirdeği içi, yağsız vişne çekirdeği içi ve protein konsantresinin yağ miktarının belirlenmesi için 1-2 gram örnek (G3) darası alınmış kartuşlar içerisine tartılarak ağız kısımları yapıştırılmıştır. Kartuş içeriği ile birlikte 105±2 ºC‘lik etüvde kurutulduktan sonra toplam ağırlık (G2) kaydedilmiştir. Kurutulan örnekler, yağ ekstraksiyon cihazının (Ankom XT10 Extractor, NJ, Amerika Birleşik Devletleri) haznesine konularak dietil eter ile 95ºC‘de 60-90 dakika süre ile ekstraksiyona
bırakılmıştır. Ekstraksiyonu tamamlanan örnekler tekrar etüve alınarak 105±2ºC‘de kalıntı çözücüden arındırılmıştır. Etüvden alınan örnekler desikatörde soğutulduktan sonra tartılıp (G1) aşağıdaki formül ile yüzde (%) yağ miktarları hesaplanmıştır.
% Yağ = [(G2-G1) / G3] x 100
3.2.3.3. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Toplam Karbonhidrat Analizleri
Örneklerin toplam karbonhidrat içerikleri, fenol sülfürik asit metoduna göre belirlenmiştir. Örneklerden 75 mg alınıp üzerine 5 mL HCl (2,5 N‘lik) ilave edildikten sonra vortex (Velp Scientifica ZX3, Usmate, İtalya) ile 10 saniye karıştırılmıştır. Karıştırılan örnekler 95ºC‘lik su banyosunda 3 saat süreyle (Memmert WB 22, Schutzart, Almanya) hidrolizasyona bırakılmıştır. Su banyosundan alınan örnekler 5 dakika içerisinde 1ºC‘ye soğutulmuştur. Soğutulan örnekler üzerine 750 μL NaOH (%40 w/w) eklenip vortex ile 5 defa onar saniye süreyle karıştırılmış ve hacimleri saf su ile 250 mL‘ye tamamlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan örneklerden bir tüp içerisine 600 μL alınmış ve üzerine 600 μL fenol (%5 w/w) ilave edildikten sonra vortex ile 30 saniye karıştırılmıştır. Karışım üzerine 3,0 mL konsantre sülfürik asit (H2SO4) eklenerek tekrar 30 saniye karıştırılmıştır. Karıştırılan örnekler 80ºC‘de 30 dakika ısıtılmış ve musluk suyuyla soğutulduktan sonra spektrofotometre (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201, CA, Amerika Birleşik Devletleri) ile 490 nm‘deki absorbans değerleri okunmuştur. Standart kurvenin çizilmesinde farklı konsantrasyonlarda glikoz içeren çözeltiler (0-100 μg/mL) kullanılmıştır (Geater ve Fehr, 2000).
3.2.3.4. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Protein Analizleri
Azot içeriklerinin belirlenmesinde Mikro Kjeldahl yöntemi kullanılmıştır (AOAC, 1997). Kjeldahl tüplerine 50-200 mg örnek tartılmış ve üzerine 2 g K2SO4, 150 μL %5‘lik CuSO4 ve 5 mL konsantre H2SO4 ilave edildikten sonra yaş yakma işlemine maruz bırakılmıştır. Örnekler Kjeldahl yakma ünitesinde (Gerhardt KB8, Königswinter,
Almanya) yaklaşık 2-4 saat süreyle 400ºC‘de berraklaşıncaya kadar yakılmıştır. Yakılan örnekler soğuduktan sonra üzerine 20 mL saf su ilave edilip destilasyon ünitesine yerleştirilmiştir. Destilasyon ünitesinde örnek üzerine 15-20 mL %40‘lık (w/w) NaOH ilave edilmiş ve destilatın 25 mL %4‘lük borik asit çözeltisi içerisinde toplanması sağlanmıştır. Destilasyon sonrası borik asit içerisinde toplanan destilat 0,0200 N HCl ile titre edilerek aşağıda verilen formül yardımıyla %azot değerleri bulunmuştur. Azot oranlarının 6,25 faktörü ile çarpılması ile de örneklerin protein içerikleri hesaplanmıştır.
V1: Titrasyonda örnek için harcanan HCl miktarı (mL) V0: Şahit için harcanan HCl miktarı (mL)
N: Titrasyonda kullanılan HCl‘in normalitesi
3.2.3.5. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Kül Analizi
Kül miktarının belirlenmesi AOAC (1997)‘de belirtilen şekilde örneklerin kül fırınında (Protherm PLF 115 M, Ankara, Türkiye) yakılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Darası alınmış porselen kroze içerisine (G2) 1-3 gram örnek (G1) tartılmış ve krozeler, suyu uzaklaştırmak için çeker ocağın içinde, elektrikli ısıtıcı üzerinde 30 dakika ön yakma işlemine maruz bırakılmıştır. Sonra örnekler kül fırınına alınarak sıcaklık kademeli bir şekilde 550±15ºC‘ye çıkartılmıştır. Bu sıcaklıkta beyaz renkte kül elde edilinceye kadar (yaklaşık 8 saat) yakılmıştır. Yakılan örnekler desikatöre alınarak soğutulmuş ve sonra tartılarak ağırlıkları (G3) kaydedilmiştir. Yüzde kül oranları aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır.
% Kül = [(G3-G2) / G1] x 100 (V1-V0) x 0,014 x N
% Azot = x 100 Örnek miktarı (g)
3.2.3.6. Vişne Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Renk Değerlerinin Ölçümü
Örneklerin L* (açıklık-koyuluk), a* (kırmızı-yeşil) ve b* (sarı-mavi) değerleri (Hunter sistemi) kolorimetre (Minolta, CR-300, NJ, Amerika Birleşik Devletleri) kullanılarak ölçülmüştür. Renk ölçüm cihazının kalibrasyonu standart beyaz plaka konularak yapılmıştır (L*: 96,97, a*: 0,16, b*: 1,86). Cam petri içerisine 1 cm kalınlığında örnek yayılmış ve üç farklı noktadan yapılan ölçümlerin ortalaması kullanılmıştır (Singh ve ark., 2005).
3.2.3.7. Yağsız Vişne Çekirdeği İçi ve Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin SDS-PAGE’ de İncelenmesi
Örneklerdeki proteinlerin moleküler ağırlık profilleri Laemmli (1970) metoduna göre SDS-PAGE kullanılarak belirlenmiştir. Örnekler 2 mL örnek tamponunda (3,8 mL saf su, 1 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu, 0,80 mL gliserol, 1,6 mL %10‘luk (w/v) SDS, 0,8 mL 2-β-merkaptaetanol, 0,4 mL %0,05 (w/v) bromfenol mavisi) 2 saat süre ile karıştırılarak çözündürülmüştür. Daha sonra örnekler 95ºC‘lik su banyosunda 5 dakika süreyle ısıtılmıştır. Örnek tamponundaki protein konsantrasyonu 5 mg protein/mL olacak şekilde ayarlanmıştır. Katı parçacık içeren örneklerden santrifüj edildikten sonra 10 µL (0,05 mg protein) alınıp jele yüklenmiştir. Ayırma ve yığın jelinin akrilamid konsantrasyonu sırasıyla %12 (11,73 mL su, 8,75 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 tamponu, 0,35 mL %10‘luk (w/v) SDS, 14 mL %30‘luk akrilamid/Bis (30 g akrilamid + 0,8 g bis/100 mL), 175 µL %10‘luk amonyum persülfat ve 17,5 µL TEMED) ve %4 (6,1 mL su, 2,5 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu, 100 µL %10‘luk (w/v) SDS, 1,3 mL %30‘luk akrilamid/Bis, 50 µL %10‘luk amonyum persülfat ve 10 µL TEMED) olacak şekilde 1 mm kalınlığında dökülmüştür. Elektroforez için pH 8,3, 5X elektrot tamponu (37,5 g tris, 180 g glisin, 12,5 g SDS saf su içerisinde çözündürülüp hacim 2,5 L‘ye tamamlanmıştır) hazırlanarak kullanım esnasında 1:4 oranında saf su ile seyreltilmiştir. Elektroforezde örnekler 25 mA (yığma jeli) ve 35 mA (ayırma jeli) sabit akımında (Consort 1200V-500 mA E815, Turnhout, Belçika) yaklaşık 5 saat süreyle yürütülmüştür. Elektroforez jelindeki proteinler Commassie brilliant blue G250 (%0,1
Commassie brilliant blue G250, %40 metanol, %10 asetik asit, %50 su) ile boyanmış ve %10‘luk asetik asit ile boya uzaklaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Moleküler ağırlık standardı olarak (Sigma katalog numarası S8445, MO, Amerika Birleşik Devletleri) miyosin (200 000 Da) beta galaktozidaz (116 000 Da), fosforilaz b (97 000 Da), bovin serum albümini (66 000 Da), glutamik dehidrogenaz (55 000 Da), ovalbumin (45 000 Da), gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (36 000 Da), karbonik anhidraz (29 000 Da), tripsinojen (24 000 Da), tripsin inhibitörü (20 000 Da), α-laktalbumin (14 200 Da) ve aprotinin (6 500 Da) kullanılmıştır.
3.2.4. Vişne Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özelliklerinin Belirlenmesi
3.2.4.1. Protein Çözünürlüğünün Belirlenmesi
Örneklerdeki proteinlerin çözünürlük profilleri Beuchat ve ark. (1975) tarafından belirtilen yönteme göre saptanmıştır. %5 (w/v)‘lik protein dispersiyonları hazırlanarak pH değerleri 1-12 aralığında olacak şekilde ayarlanmıştır (1 N NaOH veya 1 N HCl kullanılarak). pH değerleri kontrol edilerek oda sıcaklığında 90 dakika süreyle karıştırıldıktan sonra 4 000 x g‘de 30 dakika süreyle santrifüj edilmiştir. Sıvı fazın protein içeriği mikro Kjeldahl yöntemi (AOAC, 1997) ile belirlenerek çözünürlük aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır.
SP
Protein Çözünürlüğü (%) = ——— X 100 TP
SP: Sıvı fazdaki çözünür protein oranı (g/100 mL) TP: Başlangıç protein oranı (g/100 mL)
3.2.4.2. Su ve Yağ Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi
Protein örneklerinin su ve yağ tutma kapasiteleri Naczk ve ark. (1985) tarafından bildirilen yönteme göre saptanmıştır. Su tutma kapasitesi için 0,5 g örnek üzerine 4 mL
saf su ilave edilmiştir (pH 6,7). Hazırlanan karışımlar toplam 70 dakika süre ile her 10 dakikada bir 30 saniye baget yardımıyla karıştırılmıştır. Bu işlem sonunda örnekler 25ºC ve 2 000 x g‘de 15 dakika süreyle santrifüj edilmiştir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı fazı uzaklaştırıldıktan sonra tüplerin ağız kısmı zeminle 45‘lik açı oluşturacak şekilde yerleştirilerek 10 dakika boyunca sıvı fazın süzülmesi sağlanmıştır. Sıvı fazdan arındırılmış olan katı kısım tartılarak ağırlık artışı belirlenmiştir. Sonuçlar g su/g örnek veya örnek ağırlığındaki artış yüzde olarak ifade edilmiştir.
Yağ tutma kapasitesinin belirlenmesinde ise 0,5 g örnek üzerine 3 mL ticari ayçiçeği yağı (Ona) ilave edilmiştir. Hazırlanan karışım toplam 30 dakika süre ile her 5 dakikada bir 30 saniye baget kullanılarak karıştırılmıştır. Karıştırılan örnekler 25ºC‘de 1 600 x g‘de 25 dakika süreyle santrifüj edilmiştir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı fazı uzaklaştırıldıktan sonra tüpler ters çevrilerek 5 dakika boyunca sıvı fazın süzülmesi sağlanmıştır. Sıvı fazdan arındırılmış olan katı kısım tartılarak ağırlık artışı belirlenmiştir. Referans olarak sodyum kazeinat (Na-kazeinat) kullanılmıştır. Sonuçlar g yağ/g örnek veya örnek ağırlığındaki artış yüzde olarak ifade edilmiştir.
3.2.4.3. Köpük Kapasitesi ve Stabilitesinin Belirlenmesi
Örneklerin oluşturduğu köpüklerin kapasitesi ve stabilitesi çırpma yöntemiyle belirlenmiştir. 0,5 g örnek üzerine saf su ilave edilerek hacmi 40 mL‘ye tamamlanmıştır (%1,25 w/v). Hazırlanan dispersiyon (pH 7,0) homojenizatör (Ultra Turrax, T18 basic, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Almanya) ile 20 000 devir/dakika‘da 2 dakika süreyle karıştırılarak köpük oluşumu sağlanmıştır. Örnekler bekletilmeden 100 mL‘lik silindire alınıp toplam hacim ve sıvı fazın hacmi kaydedilmiştir. Örneklerin köpük kapasiteleri aşağıdaki formülle hesaplanmıştır (Moure ve ark., 2001).
V1: Homejenizasyon sonrası toplam hacim V2: Homojenizasyon öncesi toplam hacim
V1 – V2 Köpük Kapasitesi (%) = x 100
Örneklerin köpük stabilitesi ise 0, 10, 30, 60, 90 ve 120 dakika zaman aralıklarında köpük hacmindeki değişim ölçülerek aşağıdaki eşitlik ile hesaplanmıştır (Moure ve ark., 2001).
Vt: t zamanındaki köpük hacmi
Vk: Homojenizasyon sonrası 0. dakikadaki köpük hacmi
3.2.4.4. Emülsiyon Aktivite İndeksi (EAİ) ve Emülsiyon Stabilite İndeksinin (ESİ) Belirlenmesi
Örneklerin EAİ ve ESİ değerleri Pearce ve Kinsella (1978) tarafından belirtilen metoda göre saptanmıştır. %0,1 (w/v)‘lik 20 mL protein dispersiyonu (pH 7,0) ve 6,6 mL ayçiçeği yağı (Ona) emülsiyon oluşturmak amacıyla homojenizatör (Ultra Turrax, T18 basic, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Almanya) ile 20 000 devir/dakikada 1 dakika süreyle homojenize edilmiştir. Emülsiyonun alt kısmından (sıvı faz) alınan 50 μL örnek 5 mL‘ye %0,1‘lik (w/v) sodyum dedosil sülfat (SDS) ile seyreltilmiştir (1:100 dilisyon). Karışımın 500 nm‘deki absorbansı okunmuş (0. dakikadaki) ve bu absorbans değeri kullanılarak aşağıdaki formül yardımıyla EAİ değeri hesaplanmıştır.
A0: 0. dakikadaki absorbans N: Seyreltme faktörü (100)
c: Protein dispersiyonun protein konsantrasyonu (0,001 g/ml) φ: Yağın hacimsel fraksiyonu (6,6/26,6 = 0,248)
Örneklerin ESİ değerleri, emülsiyonun 10 dakika bekletilmesinden sonra alt kısmından (sıvı faz) alınan 50 μL örneğin 5 mL‘ye %0,1‘lik (w/v) SDS ile seyreltilmesi ve
Vt Köpük Stabilitesi (%) = x 100 Vk 2 x 2,303 x A0 x N EAİ (m2/g) = c x φ x 10000
absorbansının 500 nm‘de okunması (10. dakikadaki) sonucunda elde edilen verilerden aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır.
ESİ: Dakika
A0 : 0. dakikadaki absorbans
A10: Homojenizasyon işleminden 10 dakika sonra okunan absorbans t: Emülsiyonun bekleme süresi (10 dakika)
3.2.4.5. Minimum Jel Oluşturan Konsantrasyonun (MJOK) Belirlenmesi
Örneklerin jelleşme özellikleri Coffmann ve Garcia (1977) tarafından belirtilen yönteme göre ölçülmüştür. Sonuçlar minimum jel oluşturan konsantrasyon olarak ifade edilmiştir. 2-14 g/100 mL konsantrasyon aralığında tüplere hazırlanan örnek dispersiyonları (pH 7,0) 1 saat süre ile kaynar su banyosunda bekletilmiştir. Örnekler su banyosundan alınıp bekletilmeden 4ºC‘ye soğutulmuş ve 2 saat süre ile bu sıcaklıkta bekletilmiştir. Daha sonra örnek tüpleri ters çevrilerek jelleşme düzeyi gözlenmiştir. Jelleşme gösteren tüpler + olarak işaretlenmiştir. Her bir örnek için üç tüp hazırlanmış ve sonuçlar aşağıda belirtildiği şekilde değerlendirilmiştir.
+ + + veya + + - jelleşme var - - - veya - - + jelleşme yok
3.2.5. İstatistiksel Değerlendirme
Üç tekerrürlü (n=3) olarak elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları alınarak standart sapmaları ile birlikte verilmiştir. Elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirilmesi ve karşılaştırılması Minitab programında (Minitab release 12.1, Minitab Inc., 1998) one-way ANOVA ve Tukey analizleri kullanılarak yapılmıştır.
A0 x t ESİ =
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. Protein Konsantresinin Hazırlanması
4.1.1. Örneklerin Öğütülmesi ve Yağ Ekstraksiyonu
Proteinlerin maksimum düzeyde ekstraksiyonunu sağlamak için vişne çekirdek içleri kahve değirmeniyle 1 mm‘den küçük parçalar halinde öğütülerek yüzey alanı arttırılmıştır. Öğütülen örneklerdeki enzimatik aktiviteyi durdurmak için hemen hekzan ilavesiyle yağ ekstraksiyonu aşamasına geçilmiştir. Hekzan gıda sanayinde yaygın olarak kullanılan bir çözgendir. Ancak hekzan kullanımı arzu edilmeyen durumların ortaya çıkmasına da neden olabilmektedir. Kullanım sırasında atmosfere yayılan hekzan, diğer kirleticiler ile reaksiyona girerek ozon gibi okside edici maddelerin üretimine sebep olabilmektedir. Buna ilave olarak, serbest yağ asitleri, mumlar (waks) ve sabunlaşmayan maddeler tamamıyla uzaklaştırılamamaktadır (Hanmoungjai ve ark., 2002).
Yağca zengin materyallerden proteinlerin izolasyonu aşamasında, protein-yağ etkileşimleri sonucunda emülsiyon oluşabilmekte ve bu nedenle proteinlerin izolasyonu imkansız hale gelebilmektedir (Cheftel ve ark., 1985). Bu duruma yol açmamak amacıyla yağın uzaklaştırılması gerekmektedir. Öğütülen vişne çekirdek içleri hekzan ilavesinden (1:6 oranında) sonra oda sıcaklığında (22-24ºC) bir saat manyetik karıştırıcı ile karıştırılmıştır. Süre sonunda karışım kaba filtre kağıdından süzülerek hekzan ayrılmıştır. Bu işlem en az dört kez tekrarlanarak yağın uzaklaşması sağlanmıştır.
Ekstraksiyon sonucunda çekirdek içinin yağ oranı %34,75‘den %9,00‘a düşürülmüştür (Çizelge 4.1). Yağı uzaklaştırılan örneğin hala yüksek sayılabilecek düzeyde yağ içermesi ekstraksiyonda kullanılan hekzanın fosfolipidler, yağ asitleri gibi polar lipitleri tamamen çözememesinden (Makri ve ark., 2005) ve ekstraksiyonun oda sıcaklığında gerçekleştirilmesi nedeniyle örneklerdeki yağın tamamının uzaklaştırılamamasından kaynaklanabilir. Bu sorun polar çözgenlerin (etanol, izopraponol gibi) kullanıldığı ikinci bir ekstraksiyonla veya daha yüksek sıcaklıkların kullanımıyla giderilebilir (Cheftel ve
ark., 1985). Protein geri kazanımını önemli ölçüde etkileyen başlangıç materyallerinin yağ içerikleri, baklada %2,02 (Fernandez-Quintela ve ark., 1997), sümbül fasulyesinde %1,1 (Subagio, 2006) ve yağsız nohut unlarında %0,53-1,21 (Kaur ve Singh, 2007) şeklinde daha düşük düzeylerde bulunmuştur.
Çizelge 4.1. Vişne çekirdeği içinin yağ ekstraksiyon öncesi ve sonrası bileşimi. Değerler üç tekerrürün ortalaması olup standart sapması ile birlikte verilmiştir
Bileşen (%) Yağlı Vişne Çekirdeği
İçi
Yağsız Vişne Çekirdeği İçi Kurumadde 95,35±0,04 93,06±0,35 Protein 32,21±0,83 42,07±0,09 Yağ 34,75±0,68 9,00±0,28 Toplam karbonhidrat 10,16±0,73 16,28±1,63 4.1.2. Ekstraksiyon pH’sının Belirlenmesi
Proteinlerin izolasyonunda alkali koşullarda ekstraksiyon ve sonrasında izoelektrik presipitasyon (Bilgi ve Çelik, 2004), ultrafiltrasyon, ters osmoz (Sumner ve ark., 1980), organik çözgenlerle ve nötral tuzlarla ekstraksiyon gibi değişik teknikler kullanılmaktadır. Alkali koşullarda ekstraksiyon ve izoelektrik prespitasyon tekniğinde kullanılan kimyasalların ucuzluğu ve gerekli cihazların basitliği nedeniyle membran tekniklerinden daha avantajlı olduğu bildirilmektedir (Sanchez-Vioque ve ark., 1999).
Araştırmada vişne çekirdeği içi proteinlerinin ekstraksiyonu için en uygun pH değerini belirlemek amacıyla yağı uzaklaştırılmış örnekler %5 (w/v) oranında saf su içerisinde çözündürülüp pH değerleri 1,0–12,0 aralığına getirilmiştir. Sonra örnekler 150 dakika süre ile oda sıcaklığında çalkalama işlemine tabi tutulmuşlar ve santrifüj edilerek toplam proteinin ne kadarının sıvı fazda bulunduğu belirlenmiştir. Elde edilen veriler ekstrakte edilen % proteine karşılık pH grafiği formatında Şekil 4.1‘de sunulmuştur.
Yağsız vişne çekirdeği içi unlarından proteinlerin ekstraksiyonu 1,0 (75,34,6), 2,0 (78,94,8), 9,0 (67,82,6), 10,0 (74,12,5), 11,0 (70,50,6) ve 12,0 (76,90,7) pH‘da yüksek düzeylerde gerçekleşmiş ve bu pH değerlerinde elde edilen ekstraksiyon oranları arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık gözlenmemiştir (p>0,05). Asidik ve
