TOKAT VE ORDU ĐLLERĐNDEKĐ BAL ARILARINDA (Apis mellifera L.) DEFORME KANAT VĐRÜSÜ (DWV) VE
TULUMSU YAVRU ÇÜRÜKLÜĞÜ VĐRÜSÜ (SBV) VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI
Buket ARICI Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Şaban TEKĐN
2009 Her hakkı saklıdır
T.C.
GAZĐOSMANPAŞA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI
YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
TOKAT VE ORDU ĐLLERĐNDEKĐ BAL ARILARINDA (Apis mellifera L.) DEFORME KANAT VĐRÜSÜ (DWV) VE TULUMSU YAVRU ÇÜRÜKLÜĞÜ
VĐRÜSÜ (SBV) VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI
Buket ARICI
TOKAT 2009
Doç. Dr. Şaban TEKĐN danışmanlığında, Buket ARICI tarafından hazırlanan bu çalışma 11/09/2009 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Doç. Dr. Şaban TEKĐN Đmza:
Üye : Doç. Dr. Đsa GÖKÇE Đmza: Üye : Yrd. Doç.Dr. Yaşar GÜLMEZ Đmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Enstitü Müdürü Prof. Dr. Metin YILDIRIM
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
ÖZET Yüksek Lisans Tezi
TOKAT VE ORDU ĐLLERĐNDEKĐ BAL ARILARINDA (Apis mellifera L.) DEFORME KANAT VĐRÜSÜ (DWV) VE TULUMSU YAVRU ÇÜRÜKLÜĞÜ VĐRÜSÜ (SBV)
VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI Buket ARICI
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Şaban TEKĐN
ÖZET
Bal arıları hem ekonomik anlamda arıcılık açısından hem de ekolojik olarak bitkilerin tozlaşması gerçekleştiren ve dolayısıyla insan ve hayvanlar için çok kritik öneme sahip olan faydalı böceklerdendir. Bal arısı virüsleri arılarda ciddi hasarlar vererek hem koloni kayıplarına ve ürün kayıplarına hem de bitkilerin tozlaşma veriminin düşmesine sebep olmaktadırlar. Bilinen 18 arı virüsü bulunmaktadır. Deforme kanat virüsü (DWV) ve Sacbrood virüsü (SBV) de bunlardan biridir ve özellikle bir arı paraziti olan Varroa destructor ile arılara bulaşmaktadır. Ülkemizde arı virüsleri ile ilgili çalışma yok denecek kadar azdır. Bu nedenle ülkemiz arılarındaki arı virüslerinin durumu bilinmemektedir. Bu çalışmada Ordu bölgesinden toplanan bal arılarında DWV virüsü varlığı test edilirken, Tokat bölgesinden toplanan bal arılarında da SBV virüsü varlığı one step Reverse Transcriptase-Polimerase Zincir Reaksiyonu ile test edilmiştir. Bu çalışmada Ordu bölgesinden toplanan arılarda DWV varlığı bulunmuştur. Ayrıca Tokat bölgesinden toplanan bal arılarında da SBV varlığı şüphesi bulunmaktadır. Bu çalışma ülkemiz balarılarında en azından DWV virüsü varlığını göstermiştir. Dolayısıyla Varroa akarı ile bulaşan bu virüsle mücadele için Varroa mücadelesinin daha etkin olarak yapılması gerektiği düşünülmektedir.
2009, 40 sayfa
ABSTRACT Master Thesis
DETECTION OF DEFORMED WING VIRUS (DWV) AND SACBROOD VIRUS (SBV) IN HONEYBEES ( Apis mellifera L.) IN TOKAT AND ORDU PROVINCES
Buket ARICI
Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Doç. Dr. Şaban TEKĐN
ABSTRACT
Honeybees are very important for both economically and ecologically. They play crutial role during polination of flovering plants and provide food for animals and humans. They also produce economically important honey and realated products. Honeybee viruses cause severe damage on honeybees and economic losses. To date, 18 honeybee viruses, such as Deforme wing virüs (DWV) and Sacbrood virüs (SBV) were identified. These two viruses are transmitted to honeybees by Varroa destuctor. Some of the honeybee viruses are thought to be associated with honeybee colony losses. There are very limited studies on honeybee viruses in Turkey. Therefore the situation of honeybee viruses in honeybee colonies is unknown in Turkey. In the present study, presence of DWV and SBV were tested on honeybees collected from Ordu and Tokat provinces by using one step reverse transcriptase –polymerase chain reaction (RT-PCR). As a result, DWV and SBV were detected in honeybees from Tokat and Ordu provinces respectively. This study proved the presence of honeybee viruses in Turkey. Results suggest that Varroa control strategies has to be performed very extensively to prevent transmission of these viruses to other colonies and possible honeybee colony losses.
2009, 40 pages
ÖNSÖZ
Çalışmalarım boyunca yardım ve katkıları ile beni yönlendiren saygıdeğer hocam Doç. Dr. Şaban TEKĐN’e, yine çalışmamda katkılarından faydalandığım Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ ve Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI hocalarıma, yüksek lisans süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.
ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa ÖZET………..i ABSTRACT……….. ii ÖNSÖZ……… ... iii SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ………... .. vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ………viii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ……….ix 1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ………1 1.1. Varroa……….….………..3
1.2. Balarısı Kolonisi, Koloni Bireyleri ve Görevleri………...5
1.2.1. Koloni Bireyleri ve Görevleri ………...………5
.1.2.1.1 Ana Arı ve Görevleri………...5
1.2.1.2 Đşçi Arı ve Görevleri……….6
1.2.1.3 Erkek Arı ve Görevleri ……….7
1.3. Deforme Kanat Virüsü (DWV) Enfeksiyonlarında Varroa’nın Rolü………....8
1.4 Balarısı Virüsleri………...9
1.4.1 Kanat Deforme Edici Virüs ( Deforme Wing Virus DWV)………...10
1.4.1.1. Balarılarında (Apis mellifera) Deforme Kanat Virüsünün Moleküler ve Biyolojik Karekterizasyonu………10
1.4.2. Sacbrood Virus (SBV)………..…………...……….14
2. MATERYAL VE YÖNTEM……. ...……17
2.1. Materyal………. ... 17
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler………... 17
2.1.2. Cihazlar………... ... 17
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı……….. ... 18
2.1.3.1. 0,5 M EDTA Solüsyonu……… ... 18
2.1.3.2. 50X Tris Acetate EDTA (TAE) Tamponu….. ... 18
2.1.3.3. 1X TE Tamponu……... ... 18
2.2.3.5. Etidium Bromür………….………..………..…19
2.2.3.6. 6X Bromophenol Blue………..….19
2.1.4. Primerlerin Hazırlanışı………. ………...19
2.2.Yöntem………..………...20
2.2.1. RNA Ekstrasyonu………...20
2.2.1.1. Ergin Bal Arılarında Total RNA Ekstrasyonu…………...20
2.2.2. Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)……...22
2.2.2.1. RT-PCR için Thermal Cycler’ın Program Ayarı………23
2.2.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu……….……..………..23
2.2.3.1. PCR için Thermal cycler’ın Program Ayarı………...24
2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi………....25
2.2.5. Jelden DNA Saflaştırılması……….…...25
2.2.6. PCR Ürünlerinden DNA Saflaştırılması………26
2.2.7. DNA Dizi Analizi………. 27
3. BULGULAR VE TARTIŞMA………...…..28
3.1. Tokat Bölgesi Bal Arılarında SBV Varlığı………...………28
3.2. Ordu Bölgesi Bal Arılarında DWV Varlığı ve Genetik Analizi………...29
4. SONUÇ………...32
5. KAYNAKÇA……….33
6. ÖZGEÇMĐŞ………...………40 .
SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ Simgeler Açıklama oC Santigrat Derece g Gram L Litre M Molar % Yüzde o Derece s Saniye Kısaltmalar Açıklama
ABPV Akut Arı Felç Virüsü
Ark. Arkadaşları
Bç Baz Çifti
BFB Bromofenol Blue
BQCV Siyah Kraliçe Virüsü CPV Kronik Arı Felç Virüsü DNA Deoksiribonükleik Asit dNTP Deoksiribonükleosid Trifosfat SBV Çürümüş Kuluçka Virüsü DMSO Dimetilsülfoksit
DTT Ditiotrietol
EDTA Etilendiamintetraasetik Asit ELISA Enzim Bağlı Đmmün Assay HCL Hidrojen Klorür
KBV Kaşmir Arı Virüsü
Kb Kilobaz KGV Kakugo Virüs mA Miliamper Mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre mM Milimolar MW Moleküler Ağırlık nmol Nanomol
Np Nükleokapsid Protein Rcf Göreceli Yerçekimi Kuvveti PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RNA Ribonükleik Asit
Rpm Rotation Per Minute
RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu
TAE Tris-Asetat EDTA
TE Tris-EDTA
UV Ultraviyole
µl Mikrolitre
µM Mikromolar
Pmol Pikomol
SPV Yavaş Felç Virüsü
VDL-1 Varroa destructor 1 Virüsü
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ
Şekil Sayfa
Şekil 1.1. Arılar üzerindeki Varroa’nın görünümü ………..……..4 Şekil 1.2 Balarısı koloni bireyleri………....7 Şekil 2.1. Montage gel extraction kiti saflaştırma aşamalarının şematik görünümü……...25 Şekil 3.1 Tokat bölgesi balarılarında SBV spesifik primerler kullanılarak yapılan RT-PCR
ürünlerinin agoroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanılarak görüntülenmesi...29 Şekil 3.2.Ordu bölgesi balarılarında DWV spesifik primerleri kullanılarak yapılan RT-PCR
ürünlerinin agoroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanılarak görüntülenmesi...30
Şekil 3.3 Ordu bölgesindeki balarılarında tespit edilen DWV virüsünün, daha önce tespit edilmiş DWV virüsleriyle olan dizi benzerliği……….……...31
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ
Sayfa Çizelge 2.1 Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR reaksiyon koşulları..…………...……24 Çizelge 2.2 Promega kitine göre PCR reaksiyon koşulları………25
1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ
Balarıları gerek doğrudan ürünleri gerekse dolaylı olarak bitkisel tarıma olan katkıları ile insanlar için vazgeçilmez böceklerdir. Üretmiş oldukları bal, polen, propolis, arı sütü ve arı zehiri gibi ürünler insan beslenmesinde ve birçok hastalığın tedavisinde ilaç veya ilaç hammaddesi olarak kullanılmaktadır (Kaftanoğlu ve ark., 1992). Đnsanlarla olan uzun birliktelikleri yüzünden en iyi çalışılan sosyal böceklerdendir.
Ekonomik anlamda düşünüldüğünde arıların polinasyondan dolayı sağlamış olduğu fayda arı ürünlerinden dolayı sağlamış oldukları faydanın yaklaşık on katı kadardır (Genç ve Dodoloğlu, 2002). Gerek bitkisel üretime olan katkısı gerek çok değerli ürünleri üretmesi gerekse dar gelirli, arazisi olmayan insanlara kolay bir istihdam alanı olması nedeniyle arıcılığın Türkiye gibi ülkeler için önemi her geçen gün artmaktadır.
Arılar sadece polinasyondan dolayı bitkisel üretime katkıları ve üretmiş oldukları ürünler ile değil aynı zamanda yabani bitkilerin devamlılığını sağlayarak doğal floranın korunmasına da katkıda bulunmaktadırlar. Ekolojik dengenin korunmasında ve kültür bitkilerinin polinasyonunda arıların rolünün büyük olmasında onların biyolojik yapıları, yaşam şekilleri, davranış ve üreme özellikleri önemli rol oynar. Đnsan beslenmesinde kullanılan bitkilerin büyük bir çoğunluğunun polinasyonunda, kalite ve kantitesinin artmasında arıların rolü oldukça büyüktür (Akyol ve Camcı, 1999).
Entansif tarımın uygulanması ile, kimyasal kullanımı artmış ve ekolojik dengenin korunmasında büyük rol oynayan birçok yabani böceğin yok olmasına sebep olmuştur. Yabani böcek populasyonlarının azalması balarılarının önemini artırmıştır ( Akyol ve Korkmaz, 2005). Kültür dışı böcek popülasyonundaki azalış; insan eliyle kolaylıkla çoğaltılabilen ve nakledilebilen, her an temin edilebilen, bitkiye, bölgeye ve zamana bağlı olarak çalışan, uçuş etkinliği fazla olan, diğer böceklerin aktif olmadığı dönemde çalışabilen balarılarının ekonomik ve ekolojik açıdan önemini her geçen gün artırmakta, balarılarının tarımsal üretimindeki önemini gözler önüne sermektedir (Kumova, 2003).
Tüm canlılarda olduğu gibi arılarda da birçok hastalık ve parazit, onların yaşamlarını tehdit etmektedir. Arıların biyolojileri, yaşam şekilleri, üreme özellikleri ve insanlar
tarafından yanlış uygulamalar ve gezginci arıcılık programları arı hastalık ve parazitlerinin arılar ve arılıklarda hızla yayılmasına sebep olmaktadır.
Arı hastalık ve zararlıları; koloni popülasyon gelişimini engelleyen, verimliliği azaltan, arı ve insan sağlığına doğrudan etki eden, gerekli önlemler alınmadığında ürün ve koloni kayıplarına yol açabilmektedir. Bunların başında dünya arıcılığını son derece ciddi ekonomik sorunlarla karşı karşıya bırakan, 1904 yılında Apis cerena arısında, 1960 yılında Apis mellifera balarısında görülen Varroa paraziti gelmektedir ( Delfinado, 1963). Bütün dünyaya Apis mellifera üzerinden, ticari arıcılık; ana arı, oğul, göçer arıcılık ve arı taşınması yolu ile ülke içi ve ülkeler arası yayılma göstermiştir (Morse ve Laigo,1969). Varroa parazitinin arı kolonilerine hızla yayılarak zarar yapması (Morse ve Gonclaves, 1979), arıcılık dünyasını şaşırtmış ve sarsmıştır.
Parazit Türkiye’ye 1976 yılında Bulgaristan üzerinden Trakya bölgesine, oradan da ayçiçeği balı üretmek için bölgeye giden Anadolu’daki arıcıların arılıklarına bulaşmış ve Anadolu’ya taşınmıştır. 1977 -78 yıllarında Ege bölgesinde görülen parazit daha sonra çam balı üretmek amacıyla ülkenin tüm bölgelerinden Ege Bölgesine özellikle Muğla iline gelen arıcıların arılıklarına bulaşmış ve onlarında kendi bölgelerine dönmeleri ile 4-5 yıl gibi çok kısa bir süre içerisinde tüm ülkeye dağılmıştır. Parazit ülkemizde ilk yıllarda çok büyük tahribat yaparak yaklaşık 600 bin koloninin sönmesine ve 7000 -7500 ton ürün kaybına sebep olmuştur . Parazitin ülkeye girdiği ve tahribat yapmaya başladığı dönemde ülkenin koloni varlığının yaklaşık %50’sinin ilkel kovanlardan oluşması, bu kovanlarda parazitin varlığının anlaşılmasının ve mücadelesinin zor olması nedeniyle tahribat oranı yüksek olmuştur ( Akyol ve Korkmaz, 2005).
1.1.Varroa
Ülkemizdeki arılarda ilk kez 1976 yılında görülen Varroa 4-5 yıl gibi kısa bir sürede tüm ülkeye yayılarak binlerce koloninin sönmesine neden olmuştur. Bu arı akarı bugün arıcılığımızın en önemli sorunlarından birisidir (Şekil 1.1).
Varroa uzun zaman dikkati çekecek klinik bir semptom göstermez. Kısa zamanda çoğalarak kolonilerde ciddi zararlara yol açar. Arının hemolenfini emerek çoğalır ve beslenir. Parazitin üremesi petek gözleri içerisinde olur. Ana arı petek gözlerine ilkbaharda
yumurta bırakmaya başladıktan sonra dişi akarlar da faaliyete geçer. Bunlar gelişmekte olan 5-6 günlük larvalı petek gözleri içine gözler kapatılmadan 1-2 gün önce girerler. Larvalar üzerinde bir hafta kadar hemolenf emerek beslenir. Bunların yalnız dişileri arıların hemolenfini emerler. Erkek akarlar, çiftleştikten sonra kapalı petek gözleri içerisinde öldükleri için, ergin arılar üzerinde pek görülmezler. Dişi akarlar kışı petek gözleri arasında geçirirler. 8 ay kadar yasayabilirler. Yazın ise ömürleri en çok 2-3 aydır.
Varroa ile bulaşık kolonilerde hastalığın gelişmesinde genellikle 3 dönem görülür. Birinci dönemde kolonide herhangi bir hastalık belirtisi görülmez. Bu dönem 1-3 yıl sürer ve parazitler az sayıda olmaları nedeniyle kolonide Varroa'ya pek rastlanmaz. Dolayısıyla bu dönemde koloninin ilaçlanarak hastalığın durdurulması büyük önem taşır. Đkinci dönem ise yaklaşık 1 yıl sürer, kolonideki parazit sayısı biraz artmıştır. Koloniler zayıflamış ve verimleri fark edilir bir şekilde düşmüştür. Üçüncü dönemde ise şiddetli bir bulaşma vardır. Gerek kovanda gerekse arılar üzerinde çok sayıda Varroa bulunur.
Şekil 1.1 Arılar üzerindeki Varroa’nın görünümü 1.2 Balarısı Kolonisi, Koloni Bireyleri ve Görevleri
Balarıları, koloni adı verilen topluluklar halinde yaşayan sosyal böceklerdir. Koloni hayatında yardımlaşma ve iş bölüşümü esas olup kolonideki her bireyin kendine özgü görevleri vardır. Kolonide bireyler arası iletişim, bireyler tarafından vücut dışına salgılanan ve diğer bireylere mesaj veren feromon adı verilen kimyasal maddeler vasıtasıyla gerçekleşir. Bir arı kolonisinde ana arı, işçi arı ve erkek arı olmak üzere üç farklı birey vardır. Ana arı ve işçi arılar dişi bireyler olup döllü yumurtalardan gelişirlerken erkek arılar dölsüz yumurtalardan gelişirler. Arı kolonilerinde kışın sadece dişi bireyler mevcut olup erkek arılar ilkbaharda yeni sezonla birlikte görülürler.
1.2.1 Koloni Bireyleri ve Görevleri
1.2.1.1 Ana Arı ve Görevleri
Normal koşullar altında her arı ailesinde sadece bir adet ana arı bulunur. Görevi, yumurtlayarak yeni nesillerin meydana gelmesini ve koloninin sürekliliğini sağlamaktır. Ana arının vücut yapısı ince ve uzun, rengi diğer bireylere göre daha açık ve parlaktır.
Özellikle kolonide yavru yetiştirme aktivitesinin yüksek olduğu dönemlerde karın çok uzundur.
Ana arı, genellikle kendisini çevreleyen, temizliği ve beslenmesiyle ilgilenen bir grup işçi arı arasında görülür. Yaşamı süresince sadece çiftleşme amacıyla ya da koloninin oğul vermesi durumunda kovan dışına çıkar. Kendi kendine beslenemez. Beslenmesi, bakıcı işçi arıların ağzına arı sütü vermeleri şeklinde olur. Tek görevi yumurtlamaktır. Ana arı işçi arıya göre daha uzun ve daha az çentiği bulunan iğneye sahiptir. Bu nedenle iğnesini batırıp çıkararak defalarca kullanabilir. Ana arı, iğnesini rakip ana arılara karşı kullanır.
Ana arı; ana arı hücresi, ana arı memesi veya ana arı yüksüğü denilen özel bir göz içerisinde gelişir ve gelişme süresi 16 gündür. Ana arı salgıladığı feromonla işçi arıları etrafına çeker, kolonide birliği ve düzeni sağlar. Feromon kokusunu algılayan işçi arılar kolonideki işleri düzenle yürütürler. Aynı zamanda bu feromonlar işçi arıların yumurtalıklarının gelişmesini ve kolonide yeni bir ana arı yetiştirmelerini önler. Herhangi bir nedenle ana arısız kalan ve ana arı yetiştirme olanağı bulunmayan bir kolonide işçi arılardan bazılarının yumurtalıkları gelişerek yalancı ana arı meydana gelir. Yalancı ana arılar sadece dölsüz yumurta yumurtlayabileceklerinden koloni zamanla erkek arılarla dolar ve söner. Ana arıların ortalama yaşam süreleri 3-5 yıl olmakla beraber 7 yıla kadar yaşayabilirler.
1.2.1.2 Đşçi Arı ve Görevleri
Đşçi arılar, döllenmiş yumurtalardan meydana gelirler. Koloninin gücüne ve mevsime bağlı olarak kolonideki işçi arı sayısı kış aylarında 10.000-20.000 arasında değişirken, ilkbaharda sayıları giderek artar ve yaz aylarında 60.000-80.000 adet olabilir. Kolonilerin gücü, sahip oldukları işçi arı varlığı ile belirlenir.
Normal koşullar altında yumurtlama hariç kolonideki bütün işler olağanüstü bir işbirliği içinde işçi arılar tarafından yapılır. Đşçi arıların kolonideki başlıca görevleri; kovan temizliği, arı sütü ve balmumu salgılama, petek örme, yavru bakımı, kovanın havalandırılması, ana arının bakım ve beslenmesi, kovan bekçiliği, kovana nektar, polen, propolis, su taşıma ve balın olgunlaşmasını sağlama gibi görevlerdir.
Ömürleri kısa olan işçi arılar, ağır bir çalışma temposu ve yıpranma nedeniyle ilkbaharla sonbahar arasındaki dönemde 35-40 gün yaşarken, kışlayan işçi arılar daha uzun süre
yaşarlar. Kuluçka süresini tamamlayıp petek gözünden çıkan işçi arıların görevi hemen başlar. Ancak farklı görevler farklı yaşlarda yapılır. Đşçi arının yaşı, görevin yerine getirilmesinde belirleyici olan en önemli faktördür.
1.2.1.3 Erkek Arı ve Görevleri
Döllenmemiş yumurtalardan gelişen erkek arılar koloninin iri ve tombul bireyleridir. Çevre koşullarına ve koloninin gücüne bağlı olarak kolonilerde Nisan-Mayıs aylarından itibaren erkek arıları görmek mümkündür. En çok oğul mevsiminde görülen erkek arıların boyu, ana arının boyu kadar uzun değildir, fakat işçi arılardan ve ana arıdan daha geniş ve iridir. Erkek arılar çok kısa bir dile sahiptir. Bu nedenle çiçeklerden nektar alamazlar ve iğneleri olmadığı için kendilerini de koruyamazlar.
Kolonideki erkek arı miktarı, sezona ve kolonideki koşullara bağlı olup oğul mevsiminde 500-2.000 arasındadır. Koloniler, ilkbahar ve yaz başlarında erkek arı yetiştirmeye başlarlar. Geç sonbaharda ve kış aylarında normal koşullarda kolonilerde erkek arı bulunmaz. Ömürleri ortalama 30 gündür. Erkek arıların başlıca görevi ana arılarla çiftleşmektir. Đşçi arılar, ergin erkek arıları koloniden atmak veya erkek arı yumurta ve larvalarını tahrip etmek suretiyle kovandaki erkek arı sayısını düzenlerler. Erkek arı yumurtalarının ancak % 50-56'sının ergin arı olarak gelişmesine fırsat verilir.
1.3 Deforme Kanat Virüsü (DWV) Enfeksiyonlarında Varroa’nın Rolü
Varroa akarı (Varroa destructor, Anderson ve Trueman) balarılarının Apis mellifera en önemli zararlısı olarak kabul edilmektedir (Crane, 1978). Varroa dişileri, hücreler kapanmadan 20-40 saat önce son aşama işçilerinin veya erkek arı larvasının kuluçka hücrelerine girerek üremeye başlar (Boot ve ark., 1992). Akarlar pupa öncesi, pupa ve erişkinlerin hemolenfleri üzerinde beslenir. Arı hücresi kapatıldıktan 60 saat sonra, erişkin dişi akar ilk yumurtasını bırakır ve 10 dölün üzerinde üreyebilir (Sammataro ve ark., 2000). Erişkin dişi akar ve dölü, tek beslenme alanından, pupanın hemolenfi üzerinde beslenir (Kanbar and Engels, 2003). Varroa’nın üremesi kuluçka hücrelerinde gerçekleşir ve arı dışarı çıktıktan sonra sadece erişkin dişiler sağ kalabilir. Bazı olgunlaşmamış dişiler, yumurtalar (nadiren) ve erkekler geride bırakılır ve arı ortaya çıktığında işçi arı tarafından yok edilir. Varroa akarları erişkin balarıları ve gelişmekte olan pupaların hemolenfini emerler ve böylelikle onların ömürlerini kısaltırlar. Varroa akarlarının arı kolonilerinde hızla yayılması pek çok sebebe dayalı olabilir, bunlar enfestasyonlu arıların sürüklenmesi, arı oğullarının hareketi ve zayıflamış kolonilerin soyulması olabilir (de Jong, 1997). Buna ek olarak, yer değiştirilerek yapılan arıcılık ve enfestasyonlu arı stoklarınının ithal edilmesi Varroa akarlarının geniş coğrafi alanlara hızla yayılmasına olanak sağlamıştır (Sammataro ve ark., 2000).
Varroa akarlarının, oldukça karmaşık ve yüksek derecede değişken semptomlara sahip parazitik akar sendromu adı verilen salgınlara yol açtıkları düşünülmüştür (Shimanuki and Knox, 1997). Bu değişkenliğe rağmen, Varroa enfestasyonlu tüm kolonilerin alışılagelmedik şekilde, sıklıkla bir veya daha fazla arı virüsü ile enfekte olmuş hastalıklı kuluçkaları bulunmaktadır. Akarların arı kolonilerini nasıl öldürdükleri açık olmasa da, genel varsayım Varroa akarlarının arılardaki virüs enfeksiyonları üzerinde anlamlı etkisi olduğunu ve akarların vektör veya virüsleri aktifleştirici (Bowen-Walker ve ark., 1999 ve Brodsgaard ve ark., 2000) rol oynama olasılığı bulunduğu yönündedir. Bu varsayımı destekleyen pek çok delil bulunmaktadır. Birincisi, arıcılık dünyasında şiddetli viral hastalıkların ortaya çıkışı, 1970’lerde bal arısı zararlısı olarak Varroa akarlarının ortaya çıkışı ile eş zamanlı olmuştur. Varroa akarları 1987’de ABD’yi istila ettiğinde, viral enfeksiyonların insidansı hızla yükselmiş ve bunun akabinde arı kolonilerinde yaygın kayıplar gözlenmiştir (Hung ve ark., 1996). Đkinci olarak, son araştırmalar normalde bazı
virüslerin balarılarına nispeten zararsız olduğunu öne sürmektedir. Varroa akarının ortaya çıkmadığı Đngiltere’de acute bee paralysis virüsü (ABPV) hiçbir zaman mortaliteye yol açmamıştır (Allen ve ark., 1986). Bununla birlikte, virüsler Varroa ile enfekte olmuş kolonilerde ölümcül enfeksiyonlara yol açabilirler (Hung ve ark., 1995; Hung ve ark., 1996 ve Bowen-Walker ve ark., 1999). Üçüncü olarak, Varroa enfestasyonlarında arı virüslerinin artan düzeyleri, Varroa akarlarının viral replikasyonu aktif hale getirdiği görüşünü öne çıkarmıştır. Örneğin, farklı düzeylerde Varroa gözlenen kolonilerdeki arı virüslerinin prevalansının karşılaştırılması ile (Ball ve Allen, 1988) ABPV titrelerinin Varroa akarlı arı numunelerinde anlamlı olarak daha yüksek olduğunu göstermiştir. Dördüncü olarak, Varroa’da arı virüslerinin saptanması, Varroa akarlarının virüsleri aktif şekilde bal arılarına aktardığını öne sürmektedir (Hung ve Hachiro, 1999; Hung ve ark., 2000; Ongus ve ark., 2004; Tentcheva ve ark., 2004; Shen, 2003 ve Shen ve ark., 2005). Bu bulgular, beraber hareket eden virüs ve akarların bal arısı kolonileri üzerinde sinerjistik negatif etki gösterdiği ve bunun da bal arısı mortalitesi ve koloninin çökmesinin altında yatan sebep olduğuna dair varsayımlara yol açmıştır (de Jong ve ark., 1982; Allen ve ark., 1986, Glinsky and Jarosz, 1992; Korpela ve ark., 1992 ve Brodsgaard ve ark., 2000).
1.4. Balarısı Virüsleri
Varroa akarları ile birlikte balarısı patojenezindeki virüslerin rolü artarak ilgi odağı haline gelmiştir. Bugüne kadar, balarılarında 18 virüs belirlenmiştir (Allen and Ball, 1996). DWV ve SBV memeli picorna virüslerine benzerdir ve capsid proteinlerinin genomun 5’ bölgesine kodlandığı Iflavirus’a aittir. KBV Dicistroviridae familyasından Cripavirus cinsinin bir üyesidir (Liljas ve ark., 2002). Replikaz proteini genomun 5’ bölgesinde ve kapsid proteinleri 3’-proksimal ORF’de kodlanmış Cripavirus genomlarının iki önemli açık okuma çerçevesi (ORF’ler) bulunmaktadır (de Miranda ve ark., 2004 and Shen ve ark., 2005). DWV'nin hem bal arılarını (A. mellifera) hem de varroa akarlarını (V. destructor) enfekte ettiği bilinmektedir (Ongus ve ark., 2004). KBV ve SBV akarlarda saptanabilir ve varroa akarlarını da enfekte edebilir (Shen ve ark., 2005).
Virüslerin dünya literatürüne göre 2008 yılı isimlendirmeleri aşağıdaki gibidir.
1-Deforme Wing Virus (DWV) 2-Acute Bee Paralysis Virus (ABPV) 3-Sacbrood Virus(SBV)
4-Varroadestructor-1 Virus (VDV-1) 5-Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) 6-Black Queen Cell Virus (BQCV) 7-Kashmir Bee Virus (KBV)
1.4.1. Kanat Deforme Edici Virüs (Deforme Wing Virus DWV)
DWV (deforme kanat virüsü) şimdiye kadar tanımlanmış bal arılarını enfekte eden yaklaşık 18 virüsten muhtemelen en yaygın olanıdır (Allen ve Ball, 1996; Bailey ve Ball, 1991; Ball, 1983; Lanzi ve ark., 2006). Genellikle, virüs kenede Varroa destructor ile bir arada ektoparazit olarak görülür, Varroa destructor arılar arasında DWV taşınımında oldukça etkili bir vektördür, ve virüs kendi içinde replike olabilir (Bowen-Walker ve ark., 1999; Ongus ve ark., 2004; Shen ve ark., 2005; Tentcheva ve ark., 2006).
1.4.1.1. Bal Arılarında (Apis mellifera) Deforme Kanat Virüsünün Moleküler ve Biyolojik Karekterizasyonu
Balarılarında DWV (deforme kanat virüsü) karakteristik kanat deformasyonu ile kısalmış karın kısmı, felç ve yetişkin arılarda hızlı ölümün ortaya çıkması ile yakından ilişkilidir. Virüs hasta böceklerden saflaştırılmıştır, ve genomu klonlanmış ve sekanslanmıştır (Lanzi ve ark., 2006).
DWV 10,144 nükleotitden oluşan bir pozitif, tek iplik, poliadenilat ve monosistronik RNA genomu içerir. Tek parçalı genom bir büyük, viral polipeptid öncüyü kodlayan aralıksız açık okuma çerçevesinden oluşur, bu öncü molekül translasyon sonrasında proteazlar tarafından aktif proteinlere işlenir. Polipeptidin N-terminal ucu bir lider protein ile başlar (L protein), bunu yapısal protein VP2, varsayılan VP4, VP1 ve VP3 izler. Polipeptidin
C-terminal ucu yapısal olmayan proteinleri içerir; RNA helikazın korunmuş motifleri, varsayılan protein, C proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp) ortaya çıkan aminoasit sekansı içinde öngörülmüştür (Bere´nyi ve ark., 2007).
DWV henüz belirlenmemiş olan picorna benzeri böcek Iflavirüs genusuna aittir ve serolojik olarak Mısır arı virüsünden ayrıdır. Balarısı hatlarının dünya çapında olan dağılımı ve sıklığına rağmen, şimdiye kadar bu virüslerin genetik çeşitliliğine odaklanan yanlızca birkaç çalışma vardır (Bere´nyi ve ark., 2007).
DWV nin yanı sıra diğer 5 bal arısı virüsünü genomunun sekansları da GEN BANKASI veritabanında mevcuttur; sacbrood virüsü (SBV), arı akut felci virüsü (ABPV), siyah kraliçe hücre virüsü (BQCV), Kakugo virüsü (KGV) ve Kaşmir arı virüsü(KBV). Bal arılarında viral enfeksiyonları teşhis etmede PCR a dayalı bal arıları virüslerinin nükleik asidinin belirlenmesi hızlı, hassas, spesifik ve güvenilir bir methoddur (Benjeddou ve ark., 2001; Chen ve ark., 2005; Genersch, 2005; Tentcheva ve ark., 2004; Yue ve Genersch, 2005). Amplikonların direk sekanslanması ve sekansların filogenetik analizleri, farklı virüs hatları arasındaki genetik ilişkinin anlaşılmasını sağlamıştır. SBV ve ABPV nin filogenetik analizleri hatların gruplandırılmasının coğrafik orijinlerine uygun olduğunu açığa çıkarmıştır (Bere´nyi ve ark., 2007).
DWV (deforme kanat virüsü), Varroa destructor ekzoparazitinin istilasından dolayı balarısı kolonilerinin (Apis mellifera) çöküşü ile ilişkili asıl virüslerden birisidir (Anderson ve Truman, 2002; Bailey ve Ball, 1991; Ball ve Allen, 1988). Virüs ilk olarak 1980 lerin başında Japonyadan semptomatik balarısı örneklerinden izole edilmiştir ve şimdilerde tüm dünyada Varroa kenelerinin bulunduğu her yere dağılmış durumdadır (Allen ve Ball, 1996; Bailey ve Ball, 1991). Yetişkin arı populasyonları ile ilgili yapılan bir araştırmada, Fransız arı kovanlarında %90 ın üzerinde ve kene örneklerinde %100 oranında DWV tespit edilmiştir. Bu oran özellikle de ilkbaharda pupal örnekler analiz edildiğinde biraz azalmıştır (Tentcheva ve ark., 2004).
DWV virüsü serolojik olarak cüce arıda da (A. Florae) tespit edilmiştir ve Asya bal arılarında (A. Cerana) (Allen ve Ball,1996) ve RT-PCR yöntemiyle yaban arılarında da tespit edilmiştir (Genersch ve ark., 2006). Bu ilk olarak 1977 de Mısırdan enfekte olmuş yetişkin bireylerden elde edilen arı virüsü ile serolojik olarak ilişkilidir (Bailey ve
Ball, 1991; Bailey ve Ball, 1994; Ball ve Bailey, 1997; Bailey ve Woods, 1979). Deforme kanat virüsü hastalığının tipik semptomları; işlevini kaybetmiş ve buruşmuş kanatlar, şişmiş karın, felç ve birkaç işçi ve erkek arıda ortaya çıkan kısalmış yaşam aralığıdır (Kovac ve Crailsheim, 1988). Hastalıklı kolonilerde, deforme olmuş arıların Varroa kenesi ile istila edilmemiş hücrelerden ortaya çıktığının ve bu sendromların kenelerin yokluğunda da devam ettiği anlaşılana kadar, uzun bir zamandır bu semptomların kenenin beslenme aktivitesinden kaynaklandığına inanılıyordu (Daly ve Stone, 1988; Koch ve Ritter, 1991; Weinberg ve Madel, 1985; Marcangeli ve Fernandez , 1992; Nordstro”m, 2003; Ball ve Bailey, 1997). Semptomlar, azalan virüs titresi ve aynı kolonideki asemptomatik arıların varlığının azlığı kadar, büyük miktarda DWV nin varlığı ile de tam olarak ilişkilidir (Bowen-Walker ve ark., 1999; Chen ve ark., 2004; Chen ve ark., 2005; Nordstro”m, 2000; Tentcheva ve ark., 2004; Tentcheva ve ark., 2006). Kene ve virüslerin kombinasyonu arılarda immun-baskıya ve diğer elverişli-uygun patojenlere karşı artan hassaslığa neden olur , bu patojenler koloni performansında aşamalı bir azalmaya ve sık sık diğer patojenleri de içeren bir kompleks hastalık profiline yol açarlar (Yang ve Foster, 2005; Ball ve Allen, 1988; Nordstro”m ve ark., 1999; Shimanuki ve ark., 1994; Tentcheva ve ark., 2004). Semptomatik yetişkin arılar tipik olarak koloni çöküşünün son aşamasında yani genellikle kontrolden çıkmış Varroa kenesi istilasının ikinci veya üçüncü yılının yaz-sonbahar sonunda görülürler. Bazen, bir koloni erken ilkbaharda semptomatik arılara sahip olabilir ve yaz boyunca iyileşebilir, ancak semptomlar yılın sonunda tekrar ortaya çıkar.
Enfeksiyonun bir alternatif yolu yavru arılarla larval temasa geçiştir, çünkü virüs hipofaranjal salgılarda (kral jölesi), kuş yiyeceğinde, yumurtalarda ve kene ile parazitize olmamış larval kısımlarda ve enfekte olmuş kolonilerde istila edilmemiş pupalarda ortaya çıkabilir (Chen ve ark., 2004; Chen ve ark., 2005; Yue ve Genersch, 2005). Kenelerdeki yüksek virüs seviyesi genellikle pupadaki yüksek virüs seviyesine tekabül etmektedir, ve virüsün kene içerisinde de replike olabileceğinin kanıtları vardır (Bowen-Walker ve ark., 1999;Nordstro¨m, 2000; Ongus ve ark., 2004; Yue ve Genersch, 2005).
DWV normalde yavaş gelişen zayıf ve önemsiz bir virüstür ve yetişkinlik için pupal aşama aracılığıyla gelişim için kuluçkaya izin verir (Bailey ve Ball, 1991; Ball ve Bailey, 1997). DWV’yi Varroa kene istilalarıyla ilişkili asıl virüs yapan düşük virulansıdır, çünkü; CPV (kronik arı felci virüsü), ABPV, KBV, BQCV (siyah kraliçe hücre virüsü), SBV ve SPV (yavaş felç virüsü) gibi daha virülent virüsler pupa üzerindeki gelişimlerini tamamlamak
ve virüsü yeni konaklara aktarmak için Varroa kenesi ile yavruyu çok hızlı bir şekilde öldürürler (Martin, 2001; Sumpter ve Martin, 2004).
DWV tek zincir-pozitif RNA genomu ve üç yapısal proteinden oluşan bir 30 nm lik ikozahedral bir partikül üretir ve özellikleri çok sayıda böcek virüsü ile ortaktır (Bailey ve Ball, 1991). Başlangıçta pikorna benzeri böcek virüsleri olarak sınıflandırılan bu virüsler yapısal ve yapısal olmayan poliproteinlerin ayrılmasıyla şimdi büyük ölçüde iki gruba düşmüştür; Cripavirüs, Dicistroviridae familyası, ve yapısal proteinlerin yapısal olmayanlarla N-terminal de yer aldığı bir açık okuma çerçevesinden oluşan tipik olarak bir pikorna virüs genom organizsayonu ile Iflavirüs cinsi (Mayo, 2002; Moore ve Eley, 1991; Moore ve ark., 1985). Đki cinste de viral RNA poliadenilatdır ve açık okuma çerçevesi replikasyon ve translasyon kontrol elementlerini içeren transle edilmeyen bölgelerin (NTR) yanında yer almaktadır (Isawa ve ark., 1998; Wang ve ark., 2004; Wilson ve ark., 2000). Bal arısı virüsleri arasında, SBV, KV (Kakugo virüs) ve VDV-1 (Varroa destructor virüsü 1) Iflavirüsleri iken ; BQCV, ABPV ve KBV Cripavirüsleridir (Govan ve ark., 2000; Leat ve ark., 2000; Ongus ve ark.,2004). DWV son zamanlarda tanımlanan KV ve VDV-1 ile çok yakından ilişkilidir.
1.4.2. Sacbrood Virus (SBV)
Sacbrood virüsü tulumsu yavru çürüklüğü virüsü olarak da bilinmekte olup, hastalık öncelikle ve özellikle larva ve kuluçka dönemindeki arıları etkiler. Ancak bazen yetişkin arıları da etkilediği görülmüştür (Ball ve Bailey, 1999).
Sacbrood virüsü (SBV) balarısının (Apis mellifera) larvasını enfekte ederek, pupa evresine geçmesine engel olarak ölüme yol açmaktadır. Coğrafi orijini ne olursa olsun, enfekte bal arıları ve kuluçkalarından alınan numunelerdeki SBV nükleik asidinin doğrudan saptaması için RT-PCR miktar tayininin hızlı, özgül ve duyarlı bir tanı aracı olduğu kanıtlanmıştır. Amplifikasyon ürünleri dizilmiş ve filogenetik analiz ile SBV’nin birbirinden ayrı en az üç tane genotipinin bulunduğu öne sürülmüştür (Grabensteiner ve ark., 2000). Sacbrood balarısının kuluçkasını etkileyen bir durumdur ve larva ölümü ile sonuçlanabilir. Sacbrood virüslü larva pupa evresine geçemez ve sacbrood virüsünde (SBV) zengin miktarda bulunan deri değiştirme sıvısı dökülmemiş deri altında birikir ve duruma adını veren bir
kese oluşturur. Enfekte olmuş larva inci beyazı renginden beyaz ila soluk sarıya renk değiştirir ve bundan kısa süre sonra kuruyarak koyu kahverengi gondol şeklinde bir pul halini alır (Bailey, 1975). SBV ayrıca erişkin arıyı da etkileyebilir, ancak bu durumda hastalığa dair açık belirtiler gözlenmez (Anderson ve Gibbs, 1989; Bailey, 1969). Bununla birlikte, bu tür arıların ömürleri kısalır (Bailey, 1969; Bailey ve Fernando, 1972; Wang ve Moller, 1970).
Sacbrood sıklıkla, koloninin en hızlı şekilde büyüdüğü ve hastalığa yakalanmaya yatkın larva ve genç erişkinlerin geniş sayıda gözlendiği ilkbahar mevsiminde ortaya çıkar (Bailey, 1969). Sacbrood dünya çapında görülür ve bazı bölgelerde en yaygın balarısı hastalığı kabul edilir (Ball and Bailey 1999). Sacbrood ilk defa 1913 yılında tanımlanmış ve 1917 yılında virüs enfeksiyonuna atfedilmiş olsa da (White, 1917) enfeksiyona sebep olan ajan SBV 1964’e kadar karakterize edilememiştir (Bailey ve ark., 1964) .
SBV, genellikle picornavirus benzeri olarak adlandırılan pek çok böcek virüsünden biridir. Varsayılan bu benzerlik büyük ölçüde biyofiziksel özelliklere ve RNA genomunun varlığına (Moore ve ark., 1985) dayandırılmıştır; SBV partiküllerinin çapı 28 mm, zarfsız, yuvarlaktır ve görünüş açısından özelliği yoktur (Bailey, 1968; Brcak ve Kralik, 1965). Genomik RNA baz kompoziyonu açısından rhinovirüsleri (G 1 C 5 %37 ila 39), andırmaktadır ve virüs asite karşı kararsızdır (Bailey, 1976; Lee ve Furgala, 1965; Newman ve ark., 1973). SBV’de üç yapısal protein (25, 28 ve 31.5 kDa) olduğu bildirilmiştir (Bailey, 1976; Bailey ve ark., 1982). Küçük VP4-benzeri protein saptanmamıştır (Ghosh ve ark., 1999) SBV, tüm dizisi çıkarılmış ilk balarısı virüsüdür; genomik RNA (8,832 nükleotid [nt]) tipik memeli (yaklaşık olarak 7,500 nt) picornavirüslerinden daha uzundur ve 2,858 amino asitten meydana gelen poliproteini kodlayan tek geniş açık okuma çerçevesi (nt 179 ila 8752) içerir (Grabensteiner ve ark., 2000). SBV’nin genomik organizasyonu açık şekilde Picornaviridae’nin tipik üyelerini andırmaktadır, yapısal genler 59 sonunda ve yapısal olmayan genler 39 sonunda benzer sırayla dizilmiştir. Dizilişin karşılaştırması sonucunda, SBV’nin benzer boyut gen sıralamasına sahip bir genoma sahip bir virüs olan ipek böceğinin enfeksiyöz flacherie virüsü ile uzaktan ilişkili olduğu öne sürülmüştür (Ghosh ve ark., 1999).
Virüslerin balarısı patojenezindeki rolü üzerine yoğunlaşan ilgi büyümektedir, son zamanlarda elde edilen deliller virüs kaynaklı hastalığın alevlenebileceğini ve parazitik
akar Varroa destructor ile aktive olan persistan enfeksiyonların ve akar enfestasyonunun insidansının da ayrıca artmakta olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bugün itibariyle bu enfeksiyonların bal üretimi üzerindeki doğrudan etkilerini aşan yankıları sebebiyle virüs enfeksiyonlarının sonuçları daha anlamlı bir hal almaya başlamıştır (Grabensteiner ve ark., 2000).
Bugüne kadar, bal arısı virüslerinin laboratuvar tanısı virüs partiküllerinin elektron mikroskopi ve immunodifüzyon miktar tayinleri, radyoimmuno miktar tayini ve enzime bağlı immunosorbent miktar tayini (ELISA) ile tanımasına dayalı olarak konulmaktaydı. Bu miktar tayinlerinin çoğu düşük duyarlılık ve özgüllük göstermektedir veya nonspesifik reaksiyonlar vermektedir (Anderson, 1984); ayrıca bu tür geleneksel yöntemlerle virüs tipleri arasındaki ayrımı yapmak zor veya imkansızdır. Bal arısı hücre çizgisi bulunmadığından ve virüslerin in vitro izole edilmesi ve çoğaltılması mümkün olmadığından tanı ve ileri çalışmalar da karmaşık bir hal almaktadır (Grabensteiner ve ark., 2000).
Özellikle son yıllarda artan arı ölümleri arı hastalıklarına olan ilgiyi arttırmıştır. Ülkemizde özellikle bal arısı virüsleri ile ilgili çok fazla çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma ile balarılarında SBV (Tokat) ve DWV (Ordu) varlığı araştırılmıştır.
2. MATERYAL ve YÖNTEM
2.1. Materyal
Tokat ve Ordu illerindeki 2007-2009 yılları arasında yapılan arazi çalışmaları sonucunda arılıklardan toplanan ergin bal arıları ( kraliçe arı, işçi arı ve erkek arı ) örnekleri, deforme kanat virüsü ( deformed wing virus : DWV ) ve tulumsu yavru çürüklüğü virüsü (sacbrood virus : SBV) varlığı RT-PCR yöntemi kullanılarak test edilene kadar -80 0C’de muhafaza edilmiştir.
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler
Agaroz, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), Etanol, Glasiyal asetik asit (Merck), Sodyum asetat, HCI (Carlo Erba), Tris, EDTA, Gliserol, Xylene cyanol, Đsopropanol (Amresco), Sıvı azot, Moleküler ağırlık standartı (Vivantis), DWV-F2, DWV-R2 (IDT), SBV-F1, SBV-R1 (Đontek) primer seti, Viral RNA izolasyon kiti (Qiagen, Roche), RT-PCR kiti (Đnvitrogen, Roche), Jel Ekstraksiyon kiti (Qiagen, Montage), Erlen, Beher, Cam Şişeler (100 ml, 500 ml, 1000 ml’ lik), Mezür, Bistüri, Forcep, Enjektör, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), Mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı.
2.1.2. Cihazlar
Thermal cycler (Peqlab), Santrifüjler (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Yatay elektroforez (Scie-plas), Güç kaynağı (Consort), Hassas terazi (Acculab), pH metre (Hanna), Otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), Manyetik karıştırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4, -20 ve -80 oC’deki buzdolapları (Uğur, Arçelik, U410 premium), Fotoğraf makinesi (Sony) ve Saf su cihazları (Mes mp minipure, Millipore) kullanıldı.
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı
2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solüsyonu
16.81 g EDTA 90 ml H20 içerisinde manyetik karıştırıcı yardımı ile partiküller tamamen
çözününceye kadar karıştırıldı. pH:8.0’e ayarlandıktan sonra hacim 100 ml.’ye tamamlandı. Otoklavda 121 oC’de 20 dk. steril edildikten sonra, +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.2. 50X Tris Acetate EDTA (TAE) Tamponu
242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA (pH:8) manyetik karıştırıcı yardımı ile partüküller çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH’ı Glasiyal asetik asitle 8.5’e ayarlandı ve toplam hacim distile su ile 1 L’ye tamamlandı. Steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.3. 1X TE Tamponu
1.2 g 10 mM Tris HCI ile 0.37 g 1 mM EDTA, 900 ml distile su içerinde manyetik karıştırıcı yardımı ile çözüldü. pH:8’e ayarlandıktan sonra hacim 1000 ml’ye tamamlandı. Hazırlanan tampon steril edildikten sonra +4 oC’deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu
41 g Sodyum asetat, 90 ml distile su içerisinde çözüldü. pH:5.0’a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml’ye tamamlanır. Otoklavda steril edilerek +4 oC’de muhafaza edildi.
2.1.3.5. Etidium Bromür
10 mg Etidium bromür, 10 ml distile su içerinde hazırlandı ve 4 oC’de muhafaza edildi.
2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue
15 ml Gliserol, 0.25 g Bromophenol blue ile 0.25 g Xylene cyanol; 100 ml distile su içerisinde çözününceye kadar karıştırılarak hazırlandı.
2.1.4. Primerlerin Hazırlanışı
DWV-F2 (5'-TTT GCA AGA TGC TGT ATG TGG-3'), DWV-R2 (5'-GTC GTG CAG CTC GAT AGG AT-3') primerleri (IDT) ve SBV-F1 (5'-GCT GAG GTA GGA TCT TTGC GT-3'), SBV-R1 (5'-TCA TCA TCT TCA CCA TCC GA-3') primerleri (IONTEK) (konsantrasyon ve miktarlarına göre) TE tamponu veya RNase free ddH2O kullanılarak
hazırlandı. Şöyle ki;
• DWV-F2: 63,6 nmol ile DWV-R2: 80,3 nmol miktarında olan oligolar ise pmol’e çevrildikten sonra 10 µM konsantrasyonunda hazırlandı.
• SBV-F1: 58.2 nmol ile SBV-R1: 70.1 nmol miktarlarında olan oligolar ise pmol’e çevrildikten sonra 10 µM konsantrasyonunda hazırlandı.
2.2. Yöntem
2.2.1. RNA Ekstrasyonu
Ergin bal arıları total RNA ektrasyonu için Qiagen’nin ‘QIAamp Viral RNA isolasyon’ kiti ve Roche’un ‘High Pure Viral RNA’ kiti kullanılmıştır. Viral RNA ekstrasyonu kit üreticilerinin prosedürüne göre yapılmıştır.
2.2.1.1. Ergin Bal Arılarında Total RNA Ekstrasyonu
Ergin bal arılarının total RNA ekstrasyonu Qiagen ve Roche olmak üzere her iki kitlede denenmiştir.
• Qiagen kitine göre total RNA ekstrasyonu:
-80 0C’den çıkarılan ergin bal arıları kuru buz içerisine alınır. Steril bir bistüri yardımı ile ortadan ikiye kesilen ergin bal arılarının bütün dokuları forcep yardımıyla mikrosantrifüj tüplerine alınır. Dokular, 500 µl RNase free ddH2O ile sulandırıldıktan sonra 20’lik
iğneden geçirilerek homojenize edilir. Oluşan homojenat 14 000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilerek, süpernatant kısmı alınır ve Qiagen kiti kullanılarak aşağıdaki şekilde total RNA izole edilir:
1. Carrier RNA içerisine 310 µl AWE Buffer (%0.04 sodyum azid) eklenerek solüsyon hazır hale getirildi.
2. 56 µl carrier RNA, 5600 µl AWL Buffer (guanidin tiosiyanat) içerisine karıştırıldı (10 numune için).
3. 560 µl hazırlanan karışımdan, 560 µl de etanolden alınarak her biri eppendorf tüplerine eklendi.
4. Hazırlanan karışımın üzerine ise dokunun süpernatant kısmından 280µl ilave edilerek vortekslendi.
5. Filtreli kolonlara, 630 µl hazırlanan karışımdan ilave edildi.
6. 8000 rpm’de 1 dk santifüj edilip, collection kısımları atıldı ve yerine yenisi yerleştirildi. Karışım bitene kadar bu işleme devam edildi.
7. Sonrasında her bir tüpe, 500 µl AW1 Buffer’ı (guanidin hidroklorid) eklendi.
8. 14 000 rpm’de 3 dk. santrifüj edilip, collection tüpleri atılarak yeni tüpler yerleştirildi.
10. 14 000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilip, collection tüpleri atılarak yeni tüpler yerleştirildi.
11. Sonrasında 1 dk. kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleştirildi.
12. Filtreli kısma 60 µl Elution Buffer ilave edilip 14 000 rpm’de 1 dk. santrifüj edildi.
13. Son basamakta ise, filtreli kolonlar atılarak eppendorf tüplerinde kalan ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -20 0C’ye kaldırıldı.
Bu yöntem sonucunda Tokat ilinde iki arılıktan 173 kadar ergin bal arısı dokularından RNA izole edilerek DWV ve SBV varlığı RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir.
2.2.2. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
RNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen örneklerin Roche kiti kullanılarak RT-PCR’ı yapıldı.
• C. therm. Polymerase One-Step kitine göre RT-PCR;
1. Basamak: dNTP mix 2 µl DMSO 2,5 µl DTT 2,5 µl RNase Inhibitor 0,5 µl Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Template RNA 1-5 µl
RNase free su 25 µl’ye tamamlandı.
2. Basamak:
5X RT-PCR buffer 10 µl C.therm. polymerase mixture 2 µl
Đki basamak sonucunda numunelerin toplam hacmi 50 µl’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı.
• Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR;
Water, PCR Grade (vial 3) 27 µl
5xReaction Buffer (vial2) 10 µl
Upstream primer 4 µl Downstream primer 4 µl Transcriptor Enzym mix. (vial 1) 1 µl
Template RNA 4 µl
Bu işlemler sonucunda numunelerin toplam hacmi 50 µl olacak şekilde hazırlanmıştır.
RT-PCR işleminde, deforme kanat virüsü için, DWV-F2 (5'-TTT GCA AGA TGC TGT ATG TGG-3'), DWV-R2 (5'-GTC GTG CAG CTC GAT AGG AT-3') primerleri kullanılırken, TULUMSU YAVRU ÇÜRÜKLÜĞÜ VĐRÜSÜ için ise SBV-F1 (5'-GCT GAG GTA GGA TCT TTGC GT-3'), SBV-R1 (5'-TCA TCA TCT TCA CCA TCC GA-3') primerleri kullanıldı.
2.2.2.1. RT-PCR için Thermal cycler’ın Program Ayarı
Çizelge 2.1.Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR reaksiyon koşulları.
Sıcaklık (ºC) Süre Döngü Sayısı
RT Reaksyon 50 20 dk Ön Denatürasyon 94 7 dk 1 Denatürasyon 94 10 sn Bağlanma 55 30 sn Uzatma 68 10 sn 35 Son uzatma 68 7dk 1
2.2.3 Polimeraz Zincir Reaksiyonu PCR
RT-PCR sonucunda elde edilen örneklerin Promega kiti kullanılarak PCR’ları yapıldı. 5x Green or Colorless Go Taq®Flexi Buffer 10 µl
dNTP 1 µl
MgCl2 Solution, 25 mm 8 µl
Upstream primer 2 µl Downstream primer 2 µl Go Taq® DNA Polymerase 0,25 µl
Template DNA 3 µl
Nuclease-Free Water to 23,75 µl
Bu işlemler sonucunda numunelerin toplam hacmi 50 µl’ ye tamamlanacak şekilde hazırlandı.
PCR işleminde, deforme kanat virüsü için, DWV-F2 (5'-TTT GCA AGA TGC TGT ATG TGG-3'), DWV-R2 (5'-GTC GTG CAG CTC GAT AGG AT-3') primerleri kullanılırken, TULUMSU YAVRU ÇÜRÜKLÜĞÜ VĐRÜSÜ için ise SBV-F1 (5'-GCT GAG GTA GGA TCT TTGC GT-3'), SBV-R1 (5'-TCA TCA TCT TCA CCA TCC GA-3') primerleri kullanıldı.
2.2.3.1. PCR için Thermal cycler’ın Program Ayarı
Çizelge 2.2.Promega kitine göre PCR reaksiyon koşulları
Sıcaklık (oC) Süre Döngü Sayısı
Ön Denatürasyon 95 2 dk 1
Denatürasyon 95 1 dk
Bağlanma 58 30 sn
35
2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi
RT-PCR işlemi sonucunda oluşan PCR ürünleri aşağıda açıklandığı şekilde %1’lik Agaroz jel elektroforezde koşturulmuş ve görüntülenmiştir. Kısaca, 0.30 mg. agaroz ve 30 ml 1x TAE (pH’ı 7.5-8.5 olan yaklaşık 50 mM) tamponu içinde bir mikrodalga fırın kullanılarak tamamen çözdürülür ve tanka dökmeden önce bu eritilmiş agaroza 0.70 µl etidium bromür katılarak karışım tanka dökülür. Tanka jel döküldükten sonra taraklar yerleştirilir. Jel katılaştıktan sonra tank 350 ml TAE tamponu ile doldurulur. 2 µl Bromfenol blue (BFB) ve 3 µl örnek karışımı jeldeki kuyucuklara yüklenir. Jelin ilk kuyucuğuna ise 2 µl Vivantis (100 bp) standardı eklenir. Örnekler 100 mA’de yaklaşık 16 dakika koşturulur. Koşturma işleminden sonra Agaroz jel bir UV transillüminatör kullanılararak görüntülenir ve fotoğraflanır.
2.2.5. Jelden DNA Saflaştırılması
Dizi analizinde kullanmak üzere PCR ürünlerinin bir kısmı jelden Montage Gel Extraction kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. Kısaca, elde edilen ürün, % 1’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülür.
Oluşan bantlar jelden kesilip çıkartıldıktan sonra şekilde de görüldüğü gibi mikrosantrifüj tüpüne alınır. Tüpler 10 dk. 5000 rcf’ de santrifüj edilir. Santrifüj sonrası filtreli üst kısım atılıp, ürünler -20 0C’ye kaldırılır.
2.2.6. PCR Ürünlerinden DNA Saflaştırılması
Dizi analizinde kullanmak üzere PCR ürünlerinin bir kısmı Qiagen’nin ‘QIAquick PCR Purification kiti’ kullanılarak saflaştırılmıştır.
1. 1 volüm PCR için 5 volüm buffer PBI (guanidin hidroklorid ve isopropanol) kullanıyoruz. Bu karışımın sonucunda renk değişimi turuncu ya da mor olursa, karışıma 10 µl 3 M sodyum asetat ekliyoruz ve rengin sarıya döndüğünü görüyoruz (PH: 5.00).
2. Hazırladığımız bu karışımı kitteki filtreli tüpe alıyoruz ve 30-60 sn. 13.000 rpm’de santrifüj yapıyoruz. Çıktıktan sonra alttaki kısmı döküp üst kısmı ayrı bir tüpe alıyoruz.
3. 750 µl buffer PE ekleyip 30-60 sn. 13.000 rpm’de santrifüj edilir. Çıkan tüpün filtreli kısmı başka bir tüpe koyulur.
4. 1 dk. 13.000 rpm’de santrifüj edilir. Daha sonra ependorf tüplerinin kapakları kesilir ve kesilen tüp üzerine santrifüjden çıkan fitreli kısım yerleştirilir.
5. Filtrenin tam ortasına gelecek şekilde 50 µl buffer EB eklenir ve 1 dk. 13.000 rpm’de satrifüj edilir.
6. Çıkan tüpün filtresinin yine tam ortasına gelecek şekilde 30 µl elution buffer eklenir ve 1 dk. bekletilir daha sonra 1 dk. 13.000 rpm’de satrifüj edilir.
7. Çıkan tüplerin filtreli kısımları atılır ve daha önceden kesmiş olduğumuz ependorf tüplerinin kapaklar kapatılır.
2.2.7. DNA Dizi Analizi
RT-PCR’ dan DNA saflaştırılması sonucunda elde edilen saf DNA’nın nükleotid dizilerini belirleyebilmek için numuneler, primerler ve gerekli bütün bilgiler Đontek firmasına gönderildi. 1-2 hafta içinde çift zincirli DNA nükleotid dizileri belirlendi.
3. BULGULAR ve TARTIŞMA
Arı hastalıkları arasında arı virüsleri önemli yer tutmaktadır. Arı virüslerinin sebep olduğu hastalıkların belirtileri genelde fark edilmediği için gözden kaçmakta ve kolonilerde kayıplar meydana gelmektedir. Ülkemizde balarısı virüsleriyle ilgili çok sınırlı çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada Tokat ve Ordu illerinde sınırlı sayıda arılıktan toplanan bal arılarında SBV (Tokat) ve DWV (Ordu) varlığı RT-PCR yöntemi ile araştırılmıştır.
3.1. Tokat Bölgesi balarılarında SBV varlığı:
Bu çalışmada Tokat bölgesinden toplanan hastalık şüphesi olan balarılarının bazılarında SBV spesifik primerlerle yapılan RT-PCR testlerinin sonucuna göre işçi arı larva, pupa ve tam gelişmemiş işçi arılarda SBV varlığı tespit edilmiştir. Fakat bu bulgunun daha ileri derecede çalışmalarla DNA sekansı düzeyinde daha net olarak doğrulanması gerekmektedir.
Bu çalışmada SBV bulunan bal arısı örnekleri yavru çürüklüğü belirtileri gösteren peteklerden toplandığı düşünüldüğünde test sonuçlarının mantıklı olduğu aşikardır. Test sonuçları sekans düzeyinde doğrulandığı taktirde, SBV'nin ülkemizdeki varlığı ilk defa bu çalışmayla ortaya konmuş olacaktır. Buna rağmen örnek toplanan balarısı kolonilerinde SBV’nin balarılarına bulaşmasına ve yayılmasına neden olan Varroa akarının da bulunuyor olmasıyla elde edilen sonuçlar arasında paralellik olduğu görülmektedir.
500 bç 1000 bç 1000 bç 500 bç 825 bç 825 bç 500 bç 1000 bç 1000 bç 500 bç 825 bç 825 bç
Şekil 3.1 Tokat Bölgesi balarılarında SBV spesifik primerler kullanılarak yapılan RT-PCR ürünlerin Agaroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi (MW: Moleküler ağırlık standart, PK: Pozitif Kontrol ve IA1, IA2, IA3, IA4, IA5, IA6 : işçi arı örnekleri , KP1, KP2 : Kraliçe pupa örmekleri).
3.2. Ordu bölgesi balarılarında DWV varlığı ve genetik analizi:
Çalışmamızda Ordu bölgesinden toplanan hastalık şüphesi (kanat ve vücut anormallikleri) olan bal arılarının bazılarında DWV spesifik primerlerle yapılan RT-PCR testlerinin sonucuna göre DWV varlığı tespit edilmiştir. DWV pozitif bulunan RT-PCR ürünlerinin DNA dizileri belirlenmiş ve bu dizilerin BLAST araştırması sonucunda DWV sekansı ile %98 oranında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Böylece Ordu bölgesi balarılarında DWV varlığı kesinleşmiştir. Bu durum bu konuda daha önce yapılan çalışmalarda (Gülmez et al., 2009) elde edilen bulgularla paralellik göstermektedir. Bu çalışmada DWV bulunan balarısı örneklerinde kanat ve vücut anormallikleri varlığının ve bu virüsün vektörü olan Varroa’nın bulunması test sonuçlarıyla uyuşmaktadır. Bu çalışmayla DWV nin ülkemizdeki varlığı bir kez daha doğrulanmıştır.
Şekil 3.2 Ordu Bölgesi bal arılarında DWV spesifik primerleri kullanılarak yapılan RT-PCR ürünlerin Agaroz jel elektroforezi (%1’lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi (MW: Moleküler ağırlık standart, PK: Pozitif Kontrol ve IA, IA1, IA2 : işçi arı örnekleri).
Çalışmanın doğrulanması amacıyla RT-PCR ürünlerinin dizi analizi belirlenmiş ve elde edilen Ordu işçi arı DWV dizisin BLAST analizleri yapılmıştır. Buna göre DWV RT-PCR ürünlerinin dizi analiz sonuçlarının BLAST analizi, Ordu bölgesindeki bal arılarında tespit edilen DWV virüsünün dünyanın diğer bölgelerinde bulunan DWV ve Kakugo virüs isolatlarının polyprotein sekansına % 98 oranında benzerlik gösterdiğini ortaya koymuştur (Şekil 3.3).
500 bç 1000 bç
Şekil 3.3. Ordu bölgesindeki bal arılarında tespit edilen DWV virüsünün, daha önce tespit edilmiş DWV virüsleriyle olan dizi benzerliği.
4. SONUÇ
Sonuç olarak bu çalışmayla bal arısında (Apis mellifera L.) virüslerin varlığı moleküler
biyoloji teknikleri kullanılarak test edilmiştir. Tokat ilinden toplanan örneklerde Yavru Çürüklüğü Virüsü (SBV), Ordu ilinden toplanan örneklerde ise Kanat Deforme Edici Virüs (DWV) tespit edilmiştir. Hastalık belirtisi gösteren arılarla birlikte Varroa akarında da bu virüslerin bulunması, bunların arı kolonilerinde kayıplara neden olabileceğini düşündürmektedir. Varroa mücadelesinin, aynı zamanda arı virüsleri ile de mücadele anlamına geldiği unutulmamalı ve uygulanan yöntemlerin çevreye duyarlı olmasına dikkat edilmelidir. Ayrıca hastalık belirtisi taşımayan sağlıklı kolonilerle üretim konusunda da önlemler alınmalıdır.
KAYNAKLAR
Akyol, E., Camcı, Ö., 1999. Arıcılığın Bitkisel Üretimdeki Yeri ve Önemi. GAP 1. Tarım Kongresi. 26- 28 Mayıs 1999. Şanlurfa
Akyol, E., Korkmaz, A., 2005. Bal Arısı ( Apis mellifera) Zararlısı Varroa destructor’un Biyolojisi. Niğde Ünivesitesi
Allen, M., and Ball, B., 1996. The Incidence and World Distribution of Honey bee Viruses. Bee World 77, 141- 162
Anonim, 2009. Koloni Nasıl Đşler www.tarimsektor.com Anonim, 2008. Bal Arısı Kolonisi www.balarisi.wordpress.com Anonim, 2008. Varroa hastalığı www.giresunvho.org.tr
Anderson, D. L. 1984. A comparison of serological techniques for detecting and identifying honeybee viruses. J. Invertebr. Pathol. 44: 233–243.
Anderson, D. L., and A. J. Gibbs. 1989. Transpuparial transmission of Kashmir
bee virus and sacbrood virus in the honey bee (Apis mellifera). Ann. Appl. Biol. 114:1–7.
Anderson, D. L., and J. W. H. Trueman. 2002. Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae) is more than one species. Exp. Appl. Acarol. 24: 165–189.
Ball, B. V. 1983. The association of Varroa jacobsoni with virus diseases of honey bees, p. 21–23. In R. Cavallovo (ed .), Varroa jacobsoni Oud affecting honey bees: present status and needs. Commission of the European Communities, Wageningen. A. A. Balkema, Rotterdam, The Netherlands.
Ball, B.V., Allen, M.F., 1988. The prevalence of pathogens in honey bee (Apis
mellifera) colonies infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni. Ann. Appl. Biol. 113, 237–244.
Ball, B. V., and L. Bailey. 1997. Viruses, p. 11–31. In R. A. Morse and K. Flottum (ed.), Honey bee pests, predators and diseases, 3rd ed. A. I. Root, Medina, Ohio. Ball, B.V., Bailey, L., 1999. Honey Bee Viruses. IACR- Rothamsted, Harpenden, UK. Bailey, L., A. J. Gibbs, and R. D. Woods. 1964. Sacbrood virus of the larval honey bee (Apis mellifera Linnaeus). Virology 23: 425–429.
Bailey, L. 1968. Honey bee pathology. Annu. Rev. Entomol. 13:1 191–212.
Bailey, L. 1969. The multiplication and spread of sacbrood virus of bees. Ann. Appl. Biol. 63:483–491.
Bailey, L., and E. F. W. Fernando. 1972. Effects of sacbrood virus on adult honey bees. Ann. Appl. Biol. 72: 27–35.
Bailey, L. 1975. Recent research on honey bee viruses. Bee World 56:55–64. Bailey, L. 1976. Viruses attacking the honey bee. Adv. Virus Res. 20:271– 304. Bailey, L., M. Carpenter, and R. D. Woods. 1979. Egypt bee virus and Australian isolates of Kashmir bee virus. J. Gen. Virol. 43: 641–647.
Bailey, L., J. M. Carpenter, and R. D. Woods. 1982. A strain of sacbrood virus from Apis cerana. J. Invertebr. Pathol. 39:264–265.
Bailey, L., and B. V. Ball. 1991. Honey bee pathology, 2nd ed., p. 10–30, 97–104. Academic Press, London, United Kingdom.
Benjeddou, M., N. Leat, M. Allsopp, and S. Davison. 2001. Detection of acute bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67:2384–2387.
Berenyi, O., Bakonyi, T., Derakhshifar, I., Köglberger, H., Topolska, G., Ritter, W., Pechhacker, H., Nowotny, N., 2007. Phylogenetic Analysis of Deformed Wing Virus Geneptypes from Diverse Geographic Origins Indicates Recent Global Distribution of the Virus. Applied and Enviromental Microbology, June 2007, p, 3605-3611.
Boot, W.J., Calis, N.M., Beetsma, J., 1992. Differential periods of varroa mite invasion into worker and drone brood cells of honey bees. Exp. Appl. Acarol. 16, 295–301.
Bowen-Walker, P.L., Martin, S.J., Gunn, A., 1999. The transmission of deformed wing virus between honeybees (Apis mellifera) by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni Oud. J. Invertebr. Pathol. 73, 101–106.
Brcˇa´k, J., and O. Kralik. 1965. On the structure of the virus causing sacbrood of the honey bee. J. Invertebr. Pathol. 7:110–111
Chen, Y. P., I. B. Smith, A. M. Collins, J. S. Pettis, and M. F. Feldlaufer. 2004. Detection of deformed wing virus infection in honey bees, Apis mellifera L., in the United States. Am. Bee J. 144:557–559.
Chen, Y. P., J. A. Higgins, and M. F. Feldlaufer. 2005. Quantitative real-time reverse transcription-PCR analysis of deformed wing virus infection in the honeybee (Apis mellifera L.). Appl. Environ. Microbiol. 71: 436–441.
Crane, E., 1978. The varroa mite. Bee World 59, 164– 167.
Daly, H. V., D. DeJong, and N. D. Stone. 1988. Effect of parasitism by Varroa jacobsoni on morphometrics of Africanized worker honey-bees. J. Apic. Res. 27:126–130.
Delfinado, M. D. 1963. Mites of Honeybee in South-East Asia. J. Apic. Res. 2: 113-114.
de Jong, D., 1997. Mites: varroa and other parasites of brood. In: Morse, R.M., Flottum, P.K. (Eds.), Honey Bees Pests, Predators, and Diseases, 3rd edR,
The A. I Root Company, Medina, OH, pp. 281–327.
de Jong, D., De Jong, P.H., Goncalves, L.S., 1982. Weight loss and other damage to developing worker honey bees from infestation with Varroa jacobsoni. J. Apicult. Res. 21, 165– 167.
de Miranda, J.R., Drebot, M., Tyler, S., Shen, M., Cameron, C.E., Stoltz, D.B., Camazine, S.M., 2004. Complete nucleotide sequence of Kashmir bee virus and comparison with acute bee paralysis virus. J. Gen. Virol. 8, 2263– 2270.
Genç, F., Dodoloğlu, A., 2002. Arıcılığın Temel Esasları. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Ders Kitabı.
Genersch, E. 2005. Development of a rapid and sensitive RT-PCR method for the detection of deformed wing virus, a pathogen of the honeybee (Apis mellifera). Vet. J. 169:121- 123
Genersch, E., C. Yue, I. Fries, and J. R. de Miranda., 2006. Detection of deformed wing virus (DWV), a honey bee viral pathogen, in bumble bees (Bombus terrestris and Bombus pascuorum) with wing deformities. J. Invertebr. Pathol. 91: 61–63.
Glinsky, Z., Jarosz, J., 1992. Varroa jacobsoni as a carrier of bacterial infections to a recipient bee host. Apidologie 23, 25– 31.
Ghosh, R. C., B. V. Ball, M. M. Willcocks, and M. J. Carter., 1999. The nucleotide sequence of sacbrood virus of the honey bee: an insect picornalike virus. J. Gen. Virol. 80: 1514–1549.
Govan, V. A., N. Leat, M. Allsopp, and S. Davison. 2000. Analysis of the complete genome sequence of acute bee paralysis virus shows that it belongs to novel group of insect-infecting RNA viruses. Virology. 277: 457–463.
Grabensteiner, E., Ritter, W., J.Carter, M., Davison, S., Pechhacker, H.,
Kolodziejek, J., Boecking, O., Derakhshifar, I., Moosbeckhofer, R., Licek, E., Nowotny, N., 2001. Sacbrood Virus of the Honeybee (Apis mellifera): Rapid Identification and Phylogenetic Analysis Using Reverse Transcription-PCR. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Jan. 2001, p. 93–104
