T.C.
SELÇUK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DAPHNE OLEOIDES SUBSP. OLEOIDES VE DAPHNE SERICEA’ NIN FARKLI ÇÖZÜCÜLERLE ANTİOKSİDAN
ÖZELLİKLERİ Tuba ARKAN YÜKSEK LİSANS Biyoloji Anabilim Dalını
Haziran-2011 KONYA Her Hakkı Saklıdır
iii
Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Hayvan Fizyolojisi-Biyokimya araştırma laboratuarında yürütülmüş olan bu yüksek lisans tez çalışmasında Türkiyeflorası için önemli olan Daphne cinsine ait D. oleoidessubsp. oleoides ve D. sericeatürlerinin antioksidan özellikleri araştırılmıştır.
Bu çalışma konusunu veren ve çalışmanın oluşmasındaki desteklerinden dolayı başta danışman Hocam Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK’ e teşekkür ederim. Ayrıca bitkilerin toplanması ve teşhislerinde emeği geçenDoç. Dr. Murat Aydın Şanday’a teşekkürü borç bilirim. Laboratuarda numunelerin hazırlanmasında, ekstraksiyon çalışmalarındahiçbir zaman desteklerini esirgemeyenÖğr.Gör.Dr. Gökalp Özmen GÜLER’ e, Arş.Gör Gökhan ZENGİN’ e ve doktora öğrencisi Yavuz Selim ÇAKMAK’ateşekkür ederim.
Ayrıca çalışmalarım süresince maddi manevi her türlü konuda yanımda olup desteğini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkür ederim.
iv ABSTRACT……….ii ÖNSÖZ…… ………...iii ŞEKİLLER DİZİN ... ………vi ÇİZELGELER DİZİNİ………viii KISALTMALAR………ix 1. GİRİŞ ... 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 4 2.1. Serbest Radikaller ... 4 2.2. Antioksidanlar ... 6 2.3. Fenolik Bileşikler ... 8
2.4. Antioksidan Kapasite Testleri ... 10
2.4.1. Folin-Ciocalteu yöntemi (Toplam fenolik madde tayini) ... 11
2.4.2. Toplam Flavonoid Tayini ... 12
2.4.3. Total antioksidan kapasite testi (Fosfomolibdat testi) ... 12
2.4.4. DPPH yöntemi (Serbest radikal süpürme etkinliği) ... 12
2.4.5. CUPRAC testi ... 13
2.4.6. β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi ... 13
2.4.7. İndirgeme gücü ... 14
2.5. Thymealaceae Familyası ve Daphne Cinsi ... 14
3. MATERYAL VE METOT ... 16
3.1. Çalışmada Kullanılan Daphne Türleri ve Özellikleri ... 16
3.1.1. Daphne oleoides Subsp. oleoides ... 16
3.1.2. Daphne Sericea ... 18
3.2. Bitkisel Ekstrakların Hazırlanması ... 20
3.3. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesinde Uygulanan Metotlar ... 20
3.1.3. Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi) ... 20
3.1.4. Toplam Flavonoid Tayini ... 21
3.1.5. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi ... 21
3.1.6. DPPH süpürme etkinliği ... 21
3.1.7. β-karoten/Linoleik asit emülsiyon sistemi ... 22
3.1.8. CUPRAC metodu ... 22
v
4.1.1. Toplam Fenolik Madde ... 24
4.1.2. Toplam Flavonoid İçeriği ... 25
4.1.3. Toplam Antioksidan Kapasite ... 26
4.1.4. Demir indirgeme Gücü ... 28
4.1.5. β-karoten/linoleik asit test sistemi ... 30
4.1.6. Bakır İndirgeme Gücü (CUPRAC Metodu) ... 31
4.1.7. Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) ... 33
4.2. D.sericea’ya ait sonuçlar ... 36
4.2.1. Toplam fenolik Madde ... 36
4.2.2. Toplam Flavonoid Tayini ... 37
4.2.3. Toplam Antioksidan Kapasite ... 38
4.2.4. Demir indirgeme gücü ... 39
4.2.5. Bakır İndirgeme Gücü (CUPRAC Metodu) ... 41
4.2.6. Β-karoten/linoleik asit test sistemi ... 43
4.2.7. Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) ... 44
4.3. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının antioksidan özelliklerinin karşılaştırılması ... 47
4.3.1. Toplam Fenolik Madde ... 47
4.3.2. Toplam Flavonoid İçeriği ... 48
4.3.3. Toplam Antioksidan Kapasite ... 48
4.3.4. Demir indirgeme Gücü ... 49
4.3.5. Bakır indirgeme gücü ... 50
4.3.6. β-karoten/linoleik asit test sistemi ... 51
4.3.7. Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) ... 52
5. TARTIŞMA ... 53
6. KAYNAKLAR ... 57
vi
Şekil 2.3. Flavonoid gruplarının kimyasal yapıları ... 10
Şekil 3.1. Daphne Oleoides subsp. Oleoides ... 16
Şekil 3.2. Daphne sericea ... 20
Şekil 4.1. Gallik asitin kalibrasyon eğrisi ... 24
Şekil 4.2. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması ... 25
Şekil 4.3. Rutinin kalibrasyon eğrisi ... 25
Şekil 4.4. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştrılması .. 26
Şekil 4.5. Askorbik asitin kalibrasyon eğrisi ... 27
Şekil 4.6. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması ... 27
Şekil 4.7. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması ... 29
Şekil 4.8. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının EC50 değerlerinin karşılaştırılması ... 29
Şekil 4.9. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması ... 31
Şekil 4.10. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme güçlerinin karşılaştırılması ... 32
Şekil 4.11. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asidin CUPRAC metodunda EC50 değerlerinin karşılaştırılması ... 33
Şekil 4.12. D. oleoides subsp. oleoides’in hekzan ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 34
Şekil 4.13. D. oleoides subsp. oleoides’in etil asetat ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği .. 34
Şekil 4.14. D. oleoides subsp. oleoides’in metanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği .... 34
Şekil 4.15. D. oleoides subsp. oleoides’in etanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 35
Şekil 4.16. BHT’nin konsantrasyon-inhibisyon grafiği... 35
Şekil 4.17. D. oleoides subsp. oleoides ekstrakları ve BHT’nin IC50 değerlerinin karşılaştırılması .... 36
Şekil 4.18. D.sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması ... 37
Şekil 4.19. D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştırılması ... 38
Şekil 4.20. D. sericea ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması ... 39
Şekil 4.21. D. sericea ekstraklarının ve standartların demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması .... 40
Şekil 4.22. D. sericea ekstraklarının EC50 değerlerinin karşılaştırılması ... 41
vii
Şekil 4.25.D. sericea ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit
oksidasyonun inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması ... 44
Şekil 4.26. D. sericea’nın hekzan ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 45
Şekil 4.27. D. sericea’nın etil asetat ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 45
Şekil 4.28. D. sericea’nın metanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 46
Şekil 4.29. D. sericea’nın etanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği ... 46
Şekil 4.30. D. sericea ekstrakları ve BHT’nin IC50 değerlerinin karşılaştırılması ... 47
Şekil 4.31. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması ... 47
Şekil 4.32. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştırılması ... 48
Şekil 4.33. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması ... 49
Şekil 4.34. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması ... 49
Şekil 4.35. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının demir indirgeme gücü metodunda EC50 değerlerinin karşılaştırılması... 50
Şekil 4.36. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının bakır indirgeme güçlerinin karşılaştırılması ... 50
Şekil 4.37. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının CUPRAC metodunda EC50 değerlerinin karşılaştırılması ... 51
Şekil 4.38. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının linoleik asit oksidasyonu inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması ... 51
Şekil 4.39. D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının serbest radikal yakalama aktivitelerinin (IC50) karşılaştırılması ... 52
viii
Çizelge 4.1. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam fenolik madde içerikleri ... 24
Çizelge 4.2. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam flavonoid içerikleri ... 26
Çizelge 4.3. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasiteleri ... … 27
Çizelge 4.4. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların demir indirgeme gücü metodunda 700 nm’de absorbansları ... 28
Çizelge 4.5. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının EC50 değerler ... 29
Çizelge 4.6. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme yüzdeler ... 30
Çizelge 4.7. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme gücü metodunda 450 nm’de absorbansları ... 31
Çizelge 4.8. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının CUPRAC metodunda EC50 değerleri ... 32
Çizelge 4.9. D. oleoides subsp. oleoides ekstrakları ve BHT’nin IC50 değerleri ... 35
Çizelge 4.10. D. sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içerikleri ... 36
Çizelge 4.11. D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içerikleri ... 37
Çizelge 4.12. D. sericea ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasiteleri ... 38
Çizelge 4.13. D. sericea ekstraklarının ve standartların demir indirgeme gücü metodunda 700 nm’de absorbansları ... 40
Çizelge 4.14. D. sericea ekstraklarının EC50 değerleri ... 41
Çizelge 4.15. D. sericea ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme gücü metodunda 450 nm’de absorbansları ... 42
Çizelge 4.16. D. sericea ekstraklarının ve askorbik asidin CUPRAC metodunda EC50 değerleri ... 43
Çizelge 4.17. D. sericea ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonun inhibe etme yüzdeleri ... 44
Çizelge 4.18. D. sericea ekstrakları ve BHT’nin IC50 değerleri ... 46
ix
BHA : Bütillenmiş hidroksianisol BHT :Bütillenmiş hidroksitoluen TBHQ : Tersiyerbutil hidrokinon PG : Propilgallat
GAE :Gallik Asit Eşdeğeri AE :Askorbik Asit Eşdeğeri
DPPH : 2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil IC50 : %50 İnhibisyon Konsantrasyonu
CUPRAC : Bakır(II) İyonu İndirgenme Antioksidan Kapasitesi EC50 :Absorbansın 0.5 olduğu Etkin Konsantrasyon
1. GİRİŞ
Bitkiler insan sağlığının sürdürülmesinde ve insan yaşamının kalitesinin artırılmasında önemli bir rol oynamaktadırlar (Winston, 1999). Tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de çeşitli bitkiler yıllardan beri halk arasında tedavi amaçlı olarak kullanılmaktadır (Tan, 1992). Ülkemiz coğrafi konumu itibarı ile zengin bir bitki örtüsüne sahiptir. Akdeniz, Asya, Avrupa gibi 3 farklı coğrafik alanda ve önemli iklimsel kuşağın ortasında yer alışı, Türkiye’yi bitki çeşitliliği ve endemik bitkiler açısından zengin bir ülke haline getirmiştir (Baser, 2006 ).
İnsanlar yüzyıllardan beri bitkileri çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanmışlar ve başarılı sonuçlar almışlardır (Baytop, 1999). Tedavi amaçlı bitki sayısı, antik çağlardan beri devamlı artış göstermektedir. 19. Yüzyılın başlarında ise bilinen tıbbi bitki miktarı 13000 sayısına ulaşmıştır (Tan, 1992 ). 20. yüzyılda Dünya Sağlık Örgütü yaptığı çalışmada tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin sayısının yaklaşık 20000 civarına ulaştığını belirtmiştir (Kalaycıoğlu ve Öner, 1994).
Tüm dünyada bitkisel ilaçlarla tedavi giderek artmakta ve simdiye kadar görülmemiş bir popülarite kazanmaktadır(Çubukçu ve ark., 2002). Bu uygulama insanların %80 kadarının primer sağlık ihtiyaçları için geleneksel ilaçları kullandıklarını ve bu tedavilerin çoğunun bitki ekstrelerini ve etkin maddelerini kullanarak ortaya çıktığını kanıtlamaktadır (Winston, 1999).Bitkiler yaşam için vazgeçilmez özelliklerinin yanı sıra sahip oldukları sekonder metabolitler ile çeşitli hastalıkların tedavisinde büyük öneme sahiptir (Pokarny, 2007).
Günümüzde dünyanın gelişmiş ülkeleri saf, sentetik veya yarı sentetik hammaddelerle üretilmiş ilaçların istenmeyen yan etkilere sahip olması nedeni ile hastalıkların tedavisinde bitkisel kaynaklara yönelmiş durumdadırlar (Baytop, 1999). Dünya Sağlık Örgütünün yaptığı araştırmalar sonucunda; dünya nüfusunun % 60’nın sentetik ilaçları hiç kullanmadığı, 3/4’nün ise kendi geleneksel kültürlerindeki bitkisel kaynaklı olan ilaçlara güvendiği ve bunları kullandığı saptanmıştır. Amerika’da reçetelenmemiş ilaçların % 25’i doğal ürünlerden, % 25’i de doğal ürünlerden hareketle türevlenen maddelerden oluşmaktadır. Rusya’da kullanılan ilaçlardan 1/3’ünden fazlası bitkisel kökenli olup sentetik birçok ilacın elde edilmesine karşılık bu oran değişmemektedir (Çubukçu ve ark., 2002).
Canlı hücrelerde normal metabolik yolların işleyişi sırasında veya çevresel ajanlar (pestisidler, aromatik hidrokarbonlar, toksinler, çözücüler vb.), stres ve radyasyon gibi çeşitli dış faktörlerin etkisiyle, her saniye milyonlarca serbest radikal oluşur. Serbest radikaller dış orbitallerinde ortaklanmamış elektron bulunduran, kısa ömürlü, reaktif moleküllerdir. Serbest radikaller stabil hale gelebilmek için elektronlarını paylaşmak üzere diğer moleküllerle reaksiyona girerler. Bu radikallerle reaksiyona giren moleküllerin bir elektronu azaldığı için onlarda reaktif hale gelir ve böylece bu olay zincirleme devam eder (Halliwell ve Gutteridge, 1990).
Serbest radikallerin en önemli grubunu teşkil eden reaktif oksijen türleri nötralize edilmezlerse lipitlerin, proteinlerin ve DNA’nın oksidatif hasarlarına yol açabilir (Hsu ve ark., 2005).Bu durum insanlarda kanser, diabet, yaşlanma ve dejeneratif hastalıklar gibi birçok kronik hastalıklara neden olur (Harman, 1998). Canlılarda, reaktif oksijen türlerinin meydana getirdiği zararları ortadan kaldırmak için çeşitli antioksidan savunma mekanizmaları mevcuttur (Hsu ve ark., 2005; Salvatore ve ark., 2005).Ancak, her yaşamsal mekanizma olduğu gibi antioksidan mekanizma da dışarıdan alınan diyetle desteklenmelidir (Halliwell ve ark.,1984). Antioksidan madde bakımından zengin sebze, meyve ve tıbbi bitkilerin kullanılması yada antioksidan ilaçların alınması reaktif oksijen türlerinin neden olduğu doku hasarına bağlı hastalıklardan insanları korumaktadır (Acuma ve ark., 2002;Rang ve ark.,2006 ). Bu yüzden dietle antioksidan alımında artma veya antioksidanlarla zenginleştirilmiş gıdalar giderek önem kazanmaktadır (Halvorsen ve ark., 2002).
Antioksidanlar, reaksiyon mekanizmalarına göre doğal antioksidanlar ve sentetik antioksidanlar olmak üzere ikiye ayrılılırlar (Antolovich ve ark., 2002). Antioksidanların özellikle doğal kaynaklı olanlarının tercih edilmesi tavsiye edilmektedir (Kranl ve ark., 2005). Doğal antioksidanların alımının kanser, kardiovasküler hastalıklar, diabet gibi diğer hastalıklar ve yaşlanma riskinin azaltılması ile ilgili olduğuna dair bilgiler mevcuttur (Hertog ve ark., 1995). İşlenmiş gıdaların bozunmasını önlediği ve raf ömrünü uzattığı için sentetik antioksidanlar gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Günümüzde BHA (Bütillenmiş hidroksi anisol), BHT (Bütillenmiş hidroksi toluen), PG (propilgallat) ve TBHQ (t-bütilhidrokinon) en çok kullanılan sentetik antioksidan maddelerdir. Ancak, yapılan araştırmalar sentetik antioksidanların karsinojenik etkileri başta olmak üzere çeşitli toksik etkilere sahip
olduğu ortaya konmuşur (Ito ve ark., 1986). Bu sebeple doğal antioksidanların kullanımı hergeçen gün artmaktadır.
Türkiye florasında yer alan halk arasındada kullanılan Thymelaeaceaefamilyasına ait türler tropikal ve ılıman bölgelerde yayılış göstermekte olup, ülkemizde üç cins ve 18 tür ihtiva etmektedir (Baytop, 1984;Davis, 1988). Bu familyaya ait olan DaphneL. cinsi ülkemizde sekiz takson ile temsil edilmektedir.
Bu tez çalışmasında, Daphne cinsine ait D. oleiodies subsp. oleiodies ve D. sericea türlerinin toprak üstü kısımlarının antioksidan özelliklerinin farklı çözücüler kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışma sonucunda hem çözücü kullanımının antioksidan kapasite üzerine etkisi belirlenecek hemde kullanılan türlerin çeşitli sektörlerde ham madde kaynağı olarak kullanılıp kullanılmayacağı ortaya çıkarılacaktır.
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1.Serbest Radikaller
Serbest radikaller, bir veya daha fazla eşlenmemiş elektron içeren atom veya moleküllerdir. Serbest radikaller stabil hale gelebilmek için bu elektronlarını paylaşmak üzere diğer stabil moleküllerle hızla reaksiyona girerler. Serbest radikallerle reaksiyona giren moleküllerin bir elektronu azaldığı için, onlar da reaktif hale gelir ve bu reaksiyon zincirleme olarak devam eder (Del Maestro, 1980;Southorn, 1988;Gutteridge, 1994; Aruoma, 1998).
Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijen kaynaklı olanlarıdır. Bu radikaller, oksijenin suya indirgenmesi sırasında tek elektron aktarması sonucunda süperoksit radikali (·O2-),iki elektronaktarması sonucundahidrojen peroksit radikali
(H2O2), üç elektron aktarması sonucunda hidroksil radikali (·OH) oluşur (Winston
1991). Normal fizyolojik şartlarda oksijenin %2-5’i reaktif oksijen türlerine (ROT) dönüşmekte ve antioksidan sistem ile ortadan kaldırılmaktadır (Apel ve Hirt, 2004).
Reaktif oksijen türlerinin ana kaynağının süperoksit radikali olduğu, onun da ana kaynağının mitokondri olduğu düşünülmektedir (Stadtman, 2002). Çünkü mitokondride oksijene her seferinde sadece bir elektron transfer edilebilmesinden dolayı, elektron transferi sırasında süperoksit radikali oluşumu kaçınılmazdır.Süperoksit (O2•−),
dismutasyon reaksiyonu ile bir başka reaktif oksijen türü olan H2O2’i oluşturur. H2O2
ise toksik özelliğinden çok, reaktivitesi yüksek olan hidroksil radikali (OH•) oluşturma potansiyeline sahip olması ile dikkatleri üzerine çekmektedir. İlginçtir ki, mitokondride yaşla beraber istikrarlı bir şekilde O2 ve H2O2 üretim hızı da artar (Sohal, 2002).
Reaktif oksijen türleri (ROT), pekçok redoks işlemlerinde ortaya çıkan başlıca serbest radikallerdir. Bunlar karbohidratlar, proteinler, lipidler ve DNA’yı da içine alan biyomoleküllerin oksidatif zarara uğramasına sebep olabilirler. Reaktif oksijen türleri canlı hücrelere etki ederek, aterosklerosis, parkinson, alzheimer, felç, artrit, kronik iltihap hastalıkları, kanser ve diğer dejenere hastalıklar gibi kronik hastalıkların patojenlerine ortam hazırlarlar (Halliwell ve Grootveld, 1987; McDermott, 2000). Bunun yanında insan vücudunda yaşlanma gibi birçok etkiye sebep olmaktadır (Kehrer, 1993; Aruoma, 1994). Reaktif oksijen türleri birçok hastalığın oluşmasında önemli role sahip olduğu gibiaynı zamanda kozmetik ürünlerin, ilaçların (Branen ve Davidson, 1997) ve gıdaların bozulmasına katkıda bulunmaktadır (Sasaki ve ark., 1996).
Serbest radikallerin dokulardaki zararının, damar sertliği ve kalp hastalıklarının başlıca nedeni olduğu düşünülmektedir. Oksidatif zararla parçalanmış kan hücrelerinin arter duvarına yapışması ve kolesterolun yükselmesi arterlere zarar vermektedir. Bu oluşumların tümü damar sertliğinin ilerlemesine sebep olmaktadır. Daha ileri safhalarda ise kalp ile beyne giden kan ve oksijen azalmakta oksijenden mahrum kalan dokular hastalığın gelişimini ve kalp krizi risk artırmaktadır. Serbest radikaller aynı zamanda hücrenin genetik materyali olan DNA’yı da etkilemektedir. Hücrelerin genetik kodları değiştiğinde ölmekte, aşırı hücre ölümü ise erken yaşlanmaya yol açmaktadır. Ayrıca hücrelerin genetik kodları değiştiğinde kanser ve benzeri hastalıkları destekleyen hücre grupları meydana gelebilmektedir (Floyd, 1990).
Biyolojik sistemlerde serbest radikal oluşumu normal metabolik olaylar esnasında meydana gelebildiği gibi organizmanın çesitli dış etkenlere maruz kalmasıyla da meydana gelebilir. Bu nedenle serbest radikal kaynakları endojen ve ekzojen olarak iki ana gruba ayrılmaktadır (Dündar, 2000).
Vücutta serbest radikal meydana getiren ana kaynaklar aşağıdaki gibi gruplandırılabilir (Southorn, 1988; Morelli, 2003):
Endojen kaynaklar • Mitokondrial sızıntı • Solunumsal patlama • Enzim reaksiyonları • Otooksidasyon reaksiyonları Eksojen kaynaklar • Sigara dumanı, • Alkol • UV ışını • İyonize radyasyon • Ksenobiyotikler • Çevresel kirlenme • İlaçlar • Diet faktörleri
2.2.Antioksidanlar
Yakın zamanda bulunan birçok kanıt, oksidatif stresin pekçok bozukluk ve hastalıkların patojenlerinin ortaya çıkmasında etkili olduğunu göstermiştir. Bu durum bilim adamlarının ve kamuoyunun ilgisini, hastalıkların engellenmesi, tedavisi ve insan sağlığının korunmasında antioksidanların rolüne çevirmiştir (Papas, 1999;Halliwell ve Gutteridge,2007). Antioksidanlar, oksitlenebilen substratlardan daha düşük konsantrasyonda bulundukları zaman, substratın oksitlenmesini durduran veya geciktiren maddeler olarak tanımlanabilirler( Halliwell, 1997).
Vücudumuzdaki ve besinlerdeki lipitler, proteinler, karbohidratlar, nükleik asitler oksidasyona uğrayabilmekte ve böylece canlı organizma için zararlı olabilecek oksidasyon ürünleri oluşabilmektedir. Bu durum “Oksidatif Stres” şeklinde ifade edilmektedir (Zhao ve ark., 2006). Oksidatif stres durumunda reaktif türlerin miktarında artış olur ve bu türler başta biyomoleküllerde olmak üzere vücudumuzun bir çok sistemine zarar verirler (Lambeth, 2004). Olumsuz etkilenen sistemler, ilişkili oldukları diğer sistemleri de etkiler ve bu durum zincirleme olarak devam eder. Bu zincirleme reaksiyonlar “Antioksidan Savunma Sistemleri” tarafından sonlandırılır. Reaktif oksijen ve azot türlerine karşı özellikle aeroblar antioksidan savunma sistemlerine sahiptirler. Organizmada sürekli oksidanlar üretilmekte, buna karşılık antioksidan sistem tarafından bu oksidanlar ve bunların olumsuz etkileri bertaraf edilmektedir.Antioksidan savunmanın yetersiz olması durumunda bu reaktif türler hücrenin doğrudan ya da dolaylı olarak ölümüne sebep olurlar (Moldovan ve Moldovan, 2004).
Antioksidanlar, oksidasyon zincir reaksiyonlarının ileri dönemini veya başlangıcını engelleyerek, diğer moleküllerin oksidasyonun durduran veya erteleyen bileşenlerdir. Antioksidanlar genel olarak doğal ve sentetik antioksidanlar olmak üzere ikiye ayrılır. Genellikle sentetik antioksidanlar alkil şubesinin çeşitli derecelerinin fenolik yapılarını içeren bileşiklerdir. Doğal antioksidanlarsa fenolik bileşikler (tokoferoller, flavonoidler, ve fenolik asitler), nitrojen bileşikler (alkoloidler, klorofil türevleri, amino asitler ve aminler), polifenoller, karetonoidler, askorbik asit ve selenyumdur (Larson, 1988; Hundson, 1990;Hall ve Cuppertt, 1997). Kozmetik ve eczacılığa ait ürünlere ilave edilen antioksidanlar kadar yiyeceklerdeki sentetik antioksidanlara da önem verilmektedir. BHA (bütillenmiş hidroksianisol), BHT (bütillenmiş hidroksitoluen), TBHQ (tersiyerbutil hidrokinon) ve PG (propilgallat) en çok kullanılan sentetik antioksidanlardır (Kırca ve Arslan, 2008). Bunlardan BHA
(bütillenmiş hidroksianisol), BHT (bütillenmiş hidroksitoluen) gibi sentetik antioksidanlar ekonomik oldukları için kullanımları oldukça yaygındır, fakat BHA ve BHT’ nın bazı karsinojenik ve yan etkileri olduğu kaydedilmiştir (Branen, 1975; Ku ve Mun, 2007). Bunedenle sentetik antioksidanların kullanılması sağlık sorunlarına neden olabileceği bulunduktan sonra, pek çok ülkede kısıtlamalar getirilmiştir ( Branen, 1975; Ito, 1983; Kahl ve Kappus, 1993). Son yıllarda kamuoyunda doğal antioksidanlara olan ilginin artmasıyla, sanayide sentetik antioksidanların yerine kullanılabilecek veya en azından gıdalardaki katkıları azaltabilecek doğal antioksidanları araştırma ihtiyacı ortaya çıkmıştır (Shahidi, 2000). Bu nedenle doğal üretilmiş organik antioksidanların izole edilmesiyle ilgili araştırmalar artmıştır. Sebzeler, meyveler, yağlı tohumlar, tahıl ürünleri, ağaç kabukları, kökler, baharatlar ve bitkilerin potansiyel antioksidan kaynakları olduğu kaydedilmiştir (Rababah ve ark., 2004).
Doğal antioksidanların pekçoğu (özellikle flavonoidler) antibakterial, antiviral, antiflamatuar, antialerjik ve antitrombotik özellikleri de içine alan, geniş bir biyolojik etki alanı sergilerler (Cook ve Sammon, 1996). Antioksidan aktivitesi hayat için temel bir özelliktir. Antimutajenik, antikarsinojenik ve antiaging’in de aralarında bulunduğu pekçok biyolojik fonksiyon bu özellikten meydana gelmektedir (Huang ve ark., 1992; Cook ve Samman, 1996).
Antioksidan ajanlar oksidan moleküllere karşı etkilerini dört yolla gösterirler. Bunlar: 1.Süpürme (Scavenging) etkisigösterenler: Radikal oluşumunu engellerler ve oluşmuş olan radikalleri daha az zararlı hale getirirler. Örnek olarak, süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz (GPx) gibi enzimler ve metal bağlayıcı bazı proteinler verebilir.
2. Giderme/Söndürme (Queching) etkisi gösterenler: Oksidanlarla etkileşip, onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini söndüren ve inaktif hale getiren bileşiklerdir. Örnek olarak, vitaminler (A, C ve E vitaminleri), flavonoidler, mannitol ve antosiyanidinler verilebilir.
3. Zincir reaksiyonlarını kırma (Chain Breaking) etkisi gösterenler: Zincirleme olarak devam eden tepkimeleri belli yerlerinden kırarak,oksidan molekülleri kendilerine bağlayarak etkisiz hale getirirler. Örnek olarak ürik asit, bilirubin ve albümin verilebilir.
4. Onarma (Repair) etkisi gösterenler:Hasara uğramış olan biyomolekülü onararak oksidan moleküllerin zararlı etkilerini ortadan kaldırır (Gökpınar ve ark., 2006). Örnek olarak DNA tamir enzimleri, metionin sülfoksit redüktaz gösterilebilir.
Canlılarda mekanizmalar sonucu oluşan serbest radikaller, çoğu zaman lipidoksidasyonuna ve buna bağlı olarak da hücre ölümlerine neden olmaktadır. Antioksidanbir madde bu oksidasyonun çeşitli aşamalarında yukarıda özetlenen mekanizmalaryoluyla koruyucu özelliğe sahip maddelerdir.
2.3.Fenolik Bileşikler
Serbest radikaller besinlerde kalite kaybı, bozulma, besin değerinde azalma, aroma, kıvam, sertlik derecesi, görünüş gibi pekçok önemli gıda parametresinde istenmeyen değişimler olmasına sebep olabilirler. Böyle problemlerle başaçıkmak için; oksidasyona sebep olan faktörleri engelleme, yada gıdalara antioksidan ilave etmek gibi yöntemler kullanılır ( Sims ve Fioriti, 1991). Lipidler, gıda lezzeti konfigürasyonu açısından gereklidir ve gıda bozulmalarının başlıca nedeni doymamış yağ asidinin oksidasyonuyla ilgilidir. Yapılan araştırmalar sonucunda bazı fenoliklerin lipid oksidasyonunu durdurduğu saptanmış, buda ilaç ve kozmetik sanayisinde olduğu gibi gıda muhafazasında BHT, BHA, TBHQ ve PG sentetik antioksidanların kullanılmasına katkı sağlamıştır (Combs, 1992; Halliwell ve ark.; 1992, Giese; 1996).
Fenolik bileşiklerin antioksidanlar gibi davranma kabiliyeti literatürlerde gösterilmiştir. Pekçok araştırmacı, fenolik bileşiklerin antioksidan aktivitesini araştırmış ve aktivitelerine yardım eden flavonoidlerin yapısal karakteristik özelliklerini tanımlamaya çalışmışlardır (Das ve Pereira, 1990; Nieto ve ark., 1993; Foti ve ark., 1996). Fenolik bileşikler, fenolik asitler ve flavonoidler olarak iki ayrı gruba ayrılırlar. Fenolik asitler yaygın olarak bitkilerin taç kısmında bulunur ve antioksidan karaktere sahiptir. Başlıca fenolik asitler gallik asit, protokatekuik asit, p-hidroksibenzoik asit ve vanilik asit gibi hidroksibenzoik asitler ile ferulik asit, kafeik asit ve kumarik asit gibi hidroksisinnamik asitleri içerir. Flavonoidler çeşitli besin ve tıbbi bitkilerde bulunan sekonder metabolitlerin en yaygın grupları arasında olan fenolik bileşiklerdir. Bu bileşikler renk, tat ve koku gibi organoleptik özelliklerden sorumlu oldukları için bu tür ürünlerin kalitesiyle yakından ilgilidirler (Fabre ve ark., 2001; Borbalán ve ark., 2003). Flavonoidlerin antioksidan olarak davranma kapasiteleri onların molekül yapılarına bağlıdır. Hidroksil gruplarının pozisyonu ve sayısı ve flavonoidlerin kimyasal
yapılarındaki diğer özellikler onların antioksidan ve serbest radikal temizleme aktiviteleri için önemlidir (Suschetet ve ark., 1998).
Fenoller hidroksil grupları nedeniyle radikal giderme yeteneğine sahip oldukları için önemli bitki bileşenleridir (Hatano ve ark., 1989). Fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteyle ilişkilendirildiği ve lipid peroksidasyonunda önemli bir rol oynadığı rapor edilmiştir (Yen ve ark., 1993). Fenolik maddelerin insan sağlığı üzerindeki etkilerine bakıldığında, meyve ve sebzelerde zengin olarak bulunan polifenolik bileşiklerin günlük bir gramın üzerinde alındığında mutagenez ve karsinogenez üzerine inhibitör etki gösterdiğikanıtlanmıştır. Flavonollerin polimerizasyon derecesi yükseldikçe süperoksit giderim aktiviteleri de artmaktadır (Yamaguchi ve ark., 1999). Genel bir eğilim olarak fenoksil radikallerinin kararlılığının arttırılması istenilen bir şeydir ancak lipidler için moleküllerin lipofilik yapıları ve antioksidanların benzerliği belirleyici olmalıdır (Von Gadow ve ark., 1997). Aynı zamanda anti-peroksidan etki hem benzen halkasındaki metoksi ve hidroksil gruplarının sayısına, pozisyonuna; hem de çift bağlardaki elektron delokalizasyonuna bağlıdır (Milic ve ark., 1998). Farklı sebzelerden elde edilen flavonların şeker grupları ihtiva etmesi, flavonların antioksidan aktivitesini önemli derecede etkilemektedir (Plumb ve ark., 1999).
Polifenoller, bitkilerde çeşitli meyve, sebze, kuruyemiş, tohum, çiçek, kök ve gövde kısımlarında doğal olarak sentezlenen maddelerdir. (Wollgast ve Anklam, 2000). Son yıllarda pek çok araştırma çalışmaları polifenoller bakımından zengin besinlerin tüketimiyle onların antioksidan özellikleri sayesinde kardiovasküler hastalıklar, belli kanser tipleri ve diğer yaşlanmayla ilgili hastalıklardan korunmayı ilişkilendirmişlerdir (Rise-Evans ve Packer,1998; Fabre ve ark., 2001;Chang ve Kinghorn, 2001; Borbalán ve ark., 2003).
Sekiz binin üzerinde doğal olarak meydana gelen fenolik bileşik bilinmektedir (Balasundram ve ark., 2006). Bu bileşikler en azından bir aromatik halka ile buna bağlı bir veya daha fazla –OH grubu ile ek diğer grupları içermektedir ve bunlar çok sayıda yapısal sınıfa ayrılabilir (Harborne ve Simmonds, 1964). Bu sınıfların başlıcaları şu şekilde gruplandırılabilir; C6 basit fenoller (resorsinol), C6-C1 fenolik asitler
(p-hidroksibenzoik asit), C6-C2 asetofenon ve fenilasetik asit, C6-C3 hidroksisinnamik asit
(kaffeik asit), C6-C4 hidroksiantrakinonlar, C6-C2-C6 stilbenler (resveratrol), C6-C3-C6
(agatisflavon), (C6-C3)n ligninler, (C6-C3-C6)n ve taninler (prosiyanidin) (Robards ve
Antolovich, 1997).
Flavonidler bitkiler aleminde geniş bir dağılıma sahip olup oldukça önemli fenolik bileşikleridir. Genel olarak halkasal yapı ve özel hidroksil grupları içermektedir. Flavonoidler yapılarına göre altı grupta toplanabilirler. Bunlar: Flavanollar, Flavononlar, Flavonollar, Flavonlar, İzoflavonlar ve Antosiyaninlerdir (Feredioon ve ark. 1992; Rice Evans ve ark., 1996).
Flavonol Flavon Flavanon
Flavanol İzoflavon Antosiyanidin Şekil2.3. Flavonoid gruplarının kimyasal yapıları
Kimyasal olarak flavonoidlerin güçlü antioksidan özellikleri üç özellikten kaynaklanır. Aromatik halka yapılarındaki hidroksil grupları sayesinde hidrojen vererek redoks reaksiyonlarına girebilirler. Bu sayede serbest radikalleri yok edebilirler. Aromatik heterosiklik ve çoklu doymamış bağlardan oluşan yapılarıyla dayanıklı bir kimyasal yapı oluştururlar. Metal şelatlama kapasitesine sahip yapısal grupları vasıtasıyla hidroksil ve süperoksit radikalleri gibi reaktif oksijen türlerinin oluşumunu engelleyebilirler (Cam ve Hışıl 2003; Naczk ve Shahidi, 2004).
2.4.Antioksidan Kapasite Testleri
Bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesine için çok sayıda metot olmasına rağmen kullanışlı ve antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtan standart bir metot henüz geliştirilememiştir.
Antioksidan kapasite tayin yöntemleri, kullanılan kimyasal reaksiyon açısındantemel olarak iki sınıfta toplanabilir.
1. Hidrojen atomu transferi reaksiyonuna dayananlar (HAT) 2. Elektron transferi reaksiyonlarına dayananlar (ET)
Hidrojen transferine dayanan analiz yöntemleri hidrojen atomu vererek serbest radikalleri yakalama aktivitesidir. Bu analiz yöntemlerinin çoğu azo bileşiklerinin bozunması sonucu oluşan peroksi radikallerinin antioksidan ve substrat tarafından yarışmalı bir şekilde giderilmesi prensibine dayanır. β karoten/linoleik asit emülsiyon yöntemi hidrojen transferine dayalı testlere örnektir (Apak ve ark., 2007).Elektron transferi temelli analiz yöntemleri antioksidan maddenin, indirgendiğinde renk değiştiren bir oksidan maddeyi, indirgeme kapasitesinin ölçümüne dayanır. Renk değişimininderecesi örneğin antioksidan derişimi ile bağlantılandırılır.Elektron transferine dayalı testlere Folin-Ciocalteu ve DPPH yöntemleri örnek olarak verilebilir.
Bitkilerde antioksidan kapasite, test sisteminin şartları ve ekstrakların komposizyonu gibi birçok faktöre bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Araştırıcılar bu yüzden bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi çalışmalarında tek bir metotun antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtmadığını ve birkaç farklı antioksidan kapasite tayin metodu kullanarak bu durumun doğrulanması gerektiğini belirtmektedirler (Wong ve ark., 2006).
2.4.1. Folin-Ciocalteu yöntemi (Toplam fenolik madde tayini)
Toplam fenolik madde miktarlarının hesaplanmasında genellikle tercih edilen Folin-Ciocalteu metodu, yönteme adını veren reaktif vasıtasıyla oluşan renk yoğunluğunu göre absorbans ölçümüne dayanmaktadır (Huang ve ark., 2005). Bu yöntem, suda ve diğer organik çözücülerde çözünmüş olan fenolik bileşiklerin Folin reaktifi ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturması esasına dayanır (Slinkard ve Singleton, 1977). Metot kolaylığı, tekrarlanabilirliği ve diğer metotlarla gösterdiği korelasyondan dolayı oldukçasık uygulanmaktadır. Ancak metot, ortamda bulunan
ekstrakte proteinleri de ekstrakte ettiği için gıdaların yapısında bulunan bütün fenolik grupları ortaya çıkarır. Bu nedenle spesifik bir metot kabul edilmemektedir. Ayrıca metodun en önemli dezavantajı analiz sırasında ortamda bulunan askorbik asit gibi indirgen maddelerle etkileşime uğramasıdır (Huang ve ark., 2005). Bu duruma uygun olarak metotun total fenolik içeriği tümüyle yansıtmadığı belirtilmektedir. Metot sonuçları standart bir fenolik madde, genellikle de gallik asit ve kateşine eş değer olarak verilmektedir.
2.4.2. Toplam Flavonoid Tayini
Bitkilerde bulunan flavonoidler bitki sekonder metaboliti olan ve antioksidan kapasiteye katkıda bulunan en önemli bileşiklerdendir (Matkowski, 2006). Flavonoid tayini bitkisel ekstraktların toplam flavonoidmadde içeriğini ortaya koymaktadır.Kullanılan bu yötem, flavonoid alüminyum oluşumuna dayanmaktadır ve 415nm’ de UV- visible spektrofotometrede maksimum absorbansa sahiptir. Flavonoid içerik g başına mg rutine eşdeğer (RE) olarak ifade edilir (Djeridane ve ark., 2006). 2.4.3. Total antioksidan kapasite testi (Fosfomolibdat testi)
Fosfomolibdat testi olarak da isimlendirilen bu metod, fenolik bileşiklerin asidik ortamda Mo (VI)’yı Mo (V)’e indirgemesi ve bunu takiben oluşan yeşil renkli fosfat/Mo (V) kompleksinin oluşmasına dayanmaktadır. Oluşan bu kompleks 695 nm’de maksimum absorbans göstermektedir. Bu testin sonuçları antioksidan etkinliği bilinen maddelere eşdeğer olarak (mg/g, mg/ml) verilmektedir. Bu amaçla özellikle askorbik asit ve α-tokoferol kullanılmaktadır. Bu metot özellikle basitliği ve kullanılan reaktiflerin ucuzluğundan dolayı total antioksidan kapasitenin tayininde alternatif bir metot olarak kullanılmaktadır (Prieto ve ark., 1999).
2.4.4. DPPH yöntemi (Serbest radikal süpürme etkinliği)
DPPH metodu, DPPH’ın kullanıldığı en iyi bilinen ve en sık kullanılan metodlardan biridir(Molyneux, 2004). DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)azot köprüsünde eşleşmemiş bir elektron taşıyan stabil bir serbest radikaldir (Eklund ve ark., 2005). Yöntemde antioksidan kapasitesi tayin edilecek ekstrakta DPPH çözeltisi ilave edilir. DPPHantioksidan madde ile reaksiyona girdiği zaman redüklenerek koyu menekşe olan rengi sarı renkli difenilpikrilhidrazine dönüşmekte ve bu renk değişimide UV/visible spektrofotometrede 517 nm de belirlenebilmektedir(Molyneux, 2004). Yöntemin sonunda IC50 adı verilen ve ekstrakın DPPH radikalinin yarısını süpürebildiği
konsantrasyon elde edilir. Bu IC50 değeri ekstrakların serbest radikal süpürme
etkinliğini gösterir (Brand-Williams ve ark., 1995). IC50 değerinin düşük olması
antioksidan kapasitenin oldukça güçlü olduğunu gösterir.
Difenilpikrilhidrazil (DPPH) RadikaliDifenilpikrilhidrazin
DPPH yöntemi antioksidanların radikalleri süpürme kabiliyetlerini gösteren kolay ve geçerli bir yöntem olarak kabul edilmektedir (Sanchez ve ark., 1998).Ancak metot reaktif oksijen ve azot türlerinin fizyolojik şartlarda süpürülme yeteneğini bire bir yansıtmaz.
2.4.5. CUPRAC testi
Cu(II)-neokuproin reaktifi ılımlı bir yükseltgen olduğundan gıda maddelerinde bolca bulunan sitrat ve glukoz gibi bileşenlerle tepkime vermeksizin sadece antioksidanları yükseltger ve reaksiyon ürünü Cu(I)-neokuprin kelatının 450 nm’deki absorbansı okunarak sonuç verilir. Yöntem, tiyol (-SH) tipi antioksidanlarla çabuk ve net sonuçlara ulaşır. CUPRAC, fizyolojik pH’lara yakın olan pH=7 ortamında yürütülür; dolayısıyla fizyolojik koşulları yansıtma şansı daha fazladır. Uygun çözücü seçimiyle hem hidrofilik, hem de lipofilik antioksidanlar tayin edilebilir (Apak ve ark., 2005).
Cu(Nc)2+2 + Ar(OH)n nCu(Nc)2++Ar(=O)n + nH+
2.4.6. β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi
β-Karoten-linoleik asit test sistemi, yüksek sıcaklıkta linoleik asit oksidasyonundan ileri gelen konjuge dien hidroperoksitlerin inhibisyonunun ölçülmesine ve β-Karoten molekülünde renk açılmasına dayanmaktadır (Krishnaiah ve
ark., 2010).Ölçümler sonucunda linoleik asidin oksidayonunu inhibe etme oranının yüksek olması bu numunenin güçlü bir antioksidan kapasiteye sahip olduğunu gösterir. (Apak ve ark., 2007).
2.4.7. İndirgeme gücü
Bu metodun esası doğal antioksidantların ve standart antioksidant maddelerin[K3Fe(CN)6] içindeki Fe+3 ün Fe+2 ye indirgenmesi esasına dayanır. 50 ºC’
de20dakika inkübasyondan sonra indirgeme reaksiyonu sonucu oluşan Prusya mavisi renkli kompleks 700 nm’de maksimum absorbans göstermektedir. Absorbans artışı bitki ekstraktlarının indirgeme gücünün yüksek oldugunun belirtisidir (Benzie ve Strain, 1996).
2.5. Thymelaceae Familyası ve Daphne Cinsi
Türkiye florası yaklaşık 11000 bitki türü içerir ve bunların yaklaşık %34.5’i endemiktir. Türkiye florasının yaklaşık 3000 aromatik bitki türünü kapsadığı belirtilmektedir. Ancak bunların çoğu hakkında yeterli bilgi yoktur (Baser, 2002). Thymelaeaceae familyası tropikal ve ılıman bölgelerde yayılış göstermekte ve ülkemizde ise üç cins ve 18 tür içermektedir (Davis, 1988). Bu familyaya ait olan Daphne cinsi ülkemizde 8 takson ile temsil edilmektedir. Daphne cinsine ait taksonlar Anadolu’da “çıtlak”, “develik otu”, “ezente” ve “tasma” olarak bilinmektedir (Yeşilada ve ark., 1999;Sezik ve ark., 2001).
Eski tarihi literatürlerde Daphne türlerinin kanser tedavisinde kullanıldığı (Kupchan ve Baxter, 1974), geleneksel Çin tıbbında D. genkwa çiçek tomurcuklarının meme kanserine karşı koruyucu olarak kullanıldığı (Zhan ve ark., 2005;Zheng ve ark., 2006), D. acutiloba’nın adenomlara karşı kullanıdığı rapor edilmiştir (Taniguchi ve ark., 1998). Daphne türlerinin fitokimyasal bileşimlerinin belirlenmesi bu türler üzerine yapılan çalışmaların en önemli kısmını oluşturmaktadır. Bu çalışmalarda D. genkwa (Zheng ve ark., 2007; Li ve ark., 2010), D. giraldii (Zhang ve ark., 2008;Wu ve ark., 2009), D. odora var. marginata (Zhang ve ark., 2006), D. oleoides (Ullah ve ark., 1999), D. tangutica (Pan ve ark., 2010), D. gnidium (Cottiglia ve ark., 2001; Deiana ve
ak., 2003; Maistrello ve ark., 2005) ve D. pedunculata (Xu ve ark., 2008) türlerinin etken fitokimyasal bileşimleri ortaya çıkarılmıştır.
Etnofarmokolojik çalışmalar Daphne türlerinin ülkemizde geleneksel halk hekimliğinde çeşitli amaçlarla kullanıldığını göstermiştir. Örneğin, D. oleoides subsp. oleoides romatizma, yaraların iyileştirilmesi, apse, hayvanlarda ağrının dindirilmesinde ve topal hayvanların tedavisinde, D. pontica ise ishal tedavisinde kullanılmaktadır (Yeşilada ve ark., 1999; Baytop, 1999;Sezik ve ark., 2001; Kargıoglu ve ark., 2008; Kargıoglu ve ark., 2010). Ülkemizde D. mezereum’un sulu-alkol ekstraktı kanser tedavisi için rapor edilmiştir (Ulubelen ve ark., 1986).
Ülkemizde Daphne türleri üzerine yapılan çalışmalar genel olarak aktif bileşiklerinin, anti-inflamatuar ve analjezik aktivitelerinin değerlendirilmesine odaklanmıştır fakat türlerin invitro antioksidan kapasitelerine dair herhangi bir literatür bulunmamaktadır (Yesilada ve ark., 2001; Tosun, 2006; Küpeli ve ark., 2007). Bu çalışma ile Daphne cinsine ait iki taksonun antioksidan kapasiteleri belirlenerek gıda ve farmakoloji endüstrisinde kullanılabilecek doğal antioksidanlar olarak değerlendirilebilmesine imkan sağlayacaktır.
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Çalışmada Kullanılan Daphne Türleri ve Özellikleri
Çalışmada kullanılan Daphne türleri Konya ve çevresi ile Karaman ve çevresinden çiçeklenme dönemlerinde toplanılmıştır (http://www.eski.tubitak.gov.tr/tubives).
3.1.1. Daphne oleoides subsp. oleoides Taksonomik Hiyerarşi Kingdom Plantae Subkingdom Tracheobionta Division Magnoliophyta Class Magnoliopsida Subclass Rosidae Order Myrtales Family Thymelaeaceae Genus Daphne
Species Daphne oleoidesSchreber Subsp. Daphne oleoides subps. oleoides
T Şe Ko Ömür Yapı İlk çiçek Son çiçe Habitat Minimum Maksimu Endemik Element Türkiye Genel da aksonun T ehirler:Bolu, onya, Kütahya klenme zaman klenme zam m yükseklik um yükseklik klik dağılımı ağılımı ürkiye Üze Kastamonu, A a, Kahramanm nı anı k erinde Dağı Antalya, Balık maraş, Niğde, ılımı kesir, Burdur, Sivas, Aksara Çok yıllık Çalı Mayıs Eylül Kireçtaşı, ya çalılığı, Pinu Astragalus s 1050 3200 Endemik de ? Dış ve Orta Avrupa, KB Bursa, Denizl ay. amaçlar ve k us nigra orm stepleri ğil Anadolu B Afrika, Lüb li, Erzincan, G kayalar, meşe manları, bnan Gümüşhane, Is e sparta,
Şekil 3.1. Daphne oleoides subsp. oleoides 3.1.2. Daphne sericea Taksonomik Hiyerarşi Kingdom Plantae Subkingdom Tracheobionta Division Magnoliophyta Class Magnoliopsida Subclass Rosidae Order Myrtales Family Thymelaeaceae Genus Daphne
Ömür Çok yıllık Yapı Çalı
İlk çiçeklenme zamanı Şubat
Son çiçeklenme zamanı Mayıs
Habitat kireçtaşı üzerinde, serpantin ve şişt, seyrek
Pinus brutia ormanları, Quercus coccifera
Minimum yükseklik 0
Maksimum yükseklik 1500
Endemik Endemik değil
Element D. Karadeniz
Türkiye dağılımı KB., B. ve G. Anadolu
Genel dağılımı İtalya, Sicilya, Girit, Latakya ve Lübnan
Taksonun Türkiye Üzerinde Dağılımı
Şekil 3.2. Daphne sericea
3.2. Bitkisel Ekstrakların Hazırlanması
Bitkisel örnekler toplanıp gölgede kurutulduktan sonra değirmende iyice toz haline getirildi. Toz haline gelen örneklerden yaklaşık 15 g tartılıpsokselet düzeneğinde 6 saat süreyle sırasıyla hekzan, etilasetat, metanol ve etanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Ekstraksiyon sonunda ekstraklar filtre kağıdından (Whatman mavi band) süzüldü. Daha sonra çözücü rotary evaporatorde 40°C’de tamamen buharlaştırıldı. Ele geçen ham ekstreler antioksidan kapasite testleri uygulanıncaya kadar -20°C’de saklandı.
3.3. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesinde Uygulanan Metotlar 3.1.3. Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi)
Bitki ekstraklarının konsantrasyonu 2 mg/ml olacak şekilde hazırlandı. Standart olarak kullanılacak olan gallik asidin ise 100 µg/ml konsantrasyonu stok olarak hazırlandı ve bu konsantrasyondan seyreltme ile beş farklı konsantrasyon elde edildi. Bitkisel drogların her bir konsantrasyonundan 200 µl ayrı deney tüpülerine alındı. Daha sonra her bir tüpe 1 ml Folin-Ciocalteu reaktifi ilave edildi. Ardından her bir tüpe 2 ml %7.5‘lik Na2CO3 çözeltisinden eklendi ve toplam hacim 7 ml olacak şekilde saf su ilave
edildi. Karışım oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletildikten sonra 765 nm’de absorbansları ölçüldü. Tüm antioksidan kapasite tayin testlerinde spektrofotometrik ölçümler Shimadzu UV-1800 spektrofotometre cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. Aynı işlemler standart olarak kullanılan gallik asit için de tekrarlandı. Bitkilerin fenolik madde içeriği gallik asit eş değeri olarak verildi (mg GAE/g) (Slinkard ve Singleton, 1977).
3.1.4. Toplam Flavonoid Tayini
2 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan bitki ekstrakları (1 ml) aynı miktarda %2’lik AlCl3 ile karıştırıldı ve daha sonra 10 dakika oda sıcaklığında inkube edildi.
Örneklerin absorbansları 415 nm’de okundu. Aynı işlemler standart olarak kullanılan rutin içinde yapıldı ve örneklerin flavonoid içerikleri rutine eşdeğer olarak hesaplandı (mgRE/g) (Arvouet-Grand ve ark., 1994).
3.1.5. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi
Metodun esası Mo(VI)’nın Mo(V)’e indirgenmesi ve asidik ortamda yeşil renkli fosfat/Mo(V) kompleksinin oluşumuna dayanır. Metotta öncelikle bitki ekstraklarının konsantrasyonları 1 mg/ml olacak şekilde çözeltileri hazırlandı. Standart olarak ise askorbik asit 0.5 mg/ml ile 0.0375 mg/ml arasında beş farklı konsantrasyonda kullanıldı. Metotta kullanılacak reaktif çözeltisi aşağıdaki gibi hazırlandı:
0.6 M H2SO4 çözeltisi: 0.83175 ml H2SO4 alınır ve 24.18825 ml saf su üzerine
sızdırılarak ilave edildi.
28 mM Na2HPO4.12H2O çözeltisi: 0.025 g Na2HPO4.12H2O tartılıp hacmi saf su
ile 25 ml’ye tamamlandı.
4 mM Amonyum molibdat çözeltisi: 0.123585 g amonyum molibdat tartılıp hacmi saf su ile 25 ml’ye tamamlandı.
Bu şekilde hazırlanan çözeltiler bir mezürde karıştırılarak reaktif çözeltisi hazırlanmış oldu. 1 mg/ml konsantrasyonunda bitkisel çözeltilerden 0.3 ml bir tüpe alınıp ve bunun üzerine reaktif çözeltisinden 3 ml eklendi. Tüpler kuvvetlice karıştırılıp 95°C’de 90 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sonunda çözeltilerin absorbansı 695 nm’de okundu. Aynı işlemler standart antioksidan olarak kullanılan askorbik asit için de yapıldı. Antioksidan aktivite askorbik asit eşdeğeri (mgAE/g) olarak hesaplandı (Prieto ve ark., 1999).
3.1.6. DPPH süpürme etkinliği
Bitkisel drogların farklı konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlandı. Bunun için öncelikle 0.4 mg/ml konsantrasyonluk çözelti hazırlandı. Bu konsantrasyon seyreltme ile farklı konsantrasyonda çözeltiler hazırlandı (hekzan:400-4000 µg/ml; diğer
ekstraklar: 50-400 µg/ml). Sentetik antioksidan olan BHT ise 3.125µg/ml ile 200µg/ml konsantrasyonları arasında farklı konsantrasyonda hazırlandı.
Farklı konsantrasyonlardaki bu bitkisel çözeltilerden 0.5 ml alınıp bunun üzerine 6x10-5 M konsantrasyondaki DPPH çözeltisinden 3 ml ilave edildi. Tüpler ağızları kapatılıp kuvvetlice karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletildi. Bu süre sonunda absorbanslar 517 nm’de okundu. Bitkisel çözeltilerin ve standart maddelerin inhibisyonu aşağıdaki denklemden hesaplandı:
İnhibisyon(%)=((Akontrol-Aörnek)/ Akontrol)x100
Bitkisel çözeltiler ve standart maddelerin konsantrasyon inhibisyon grafiği çizilerek buradan DPPH radikalinin yarısını süpürebilen konsantrasyon hesaplandı (IC50). IC50 değerinin düşük olması antioksidan kapasitenin yüksek oluşunu
göstermektedir (Sarıkürkçü ve ark., 2008).
3.1.7. β-karoten/Linoleik asit emülsiyon sistemi
Bitkisel materyal ve standart antioksidanlar 2 mg/ml konsantrasyonda hazırlandı. Metotta öncelikle emülsiyon çözeltisi hazırlandı. Bunun için 0.5 mg β-karoten 1 ml kloroformda çözüldü. Bu karışıma 25 µl linoleik asit ve 200 mg Tween 40 eklendi. Karışım iyice karıştırıldı. Kloroform rotary evaporatörde 40°C’de iyice uçuruldu. Kalan kısım üzerine 100 ml saf su eklendi. Böylece emülsiyon çözeltisi hazırlanmış oldu.
2 mg/ml konsantrasyonundaki bitkisel droglar ve standart maddelerden 350 µl alındı ve bunların üzerine 2.5 ml emülsiyon çözeltisinden ilave edildi. Emülsiyon çözeltisi eklenir eklenmez absorbansları 490 nm’de okundu. Daha sonra tüpler oda sıcaklığında 48 saat inkübe edildi. Ayrıca bitkisel materyalin yerine 350 µl metanol eklenip bunun üzerine de 2.5 ml emülsiyon çözeltisi ilave edilerek kontrol çözeltisi hazırlandı. Kontrol çözeltisinin absorbansı da emülsiyon çözeltisi eklenir eklenmez okundu ve aynı şekilde 50°C’de 120 dakika inkübe edildi (Sökmen ve ark., 2004). 3.1.8. CUPRAC metodu
10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi: CuCl2.2H2O’den 0.4262 g tartılarak su ile 250
ml’ye tamamlanarak hazırlandı.
Amonyum asetat tamponu: 1 M (pH=7). NH4Ac’dan 19.27 g tartılarak su ile 250
Neokuproin çözeltisi: 7.5x10-3M, Neokuproin (2,9 dimethyl 1-10 phenantroline)’den 0.039 g tartılarak %96’lık etil alkolle 25 ml’ye tamamlanarak hazırlandı.
Bitki ekstraklarının 50 mg/ml ile 400µg/ml arasındaki beş farklı konsantrasyonları kullanıldı. Metotta öncelikle her bir deney tüpüne 1 ml 10nM CuCl2,
1 ml 7.5 mM neokuproin, NH4Ac buffer (1M, pH 7.0) çözeltisi eklenir. Daha sonra her
bir tüpe farklı konsantrasyonlardaki ekstraktlardan 0.5 ml eklenip, toplam havim 4.1 mL olucak şekilde saf su ilave edildi. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika beklendi. Aynı işlemler aynı konsantrasyonlarda hazırlanan askorbik asit çözeltileri içinde yapıldı. Bu süre sonunda absorbansları 450 nm’de okundu. Testin sonuçlar EC50 değeri kullanılarak değerlendirildi (Apak ve ark., 2006).
3.1.9. İndirgeme gücü (Reducing power)
Bu metotta bitkisel ekstrakların 50µg/ml ile 1000µg/ml konsantrasyonları kullanıldı. Standart olarak aynı konsantrasyonlarda gallik asit ve BHT hazırlandı. Farklı konsantrasyonlardaki bitkisel çözeltilerden 2.5 ml alındı. Bunun üzerine 0.2 M pH 6.6 2.5 ml fosfat tamponu ve %1’lik 2.5 ml potasyum ferrisiyanür eklendi. Tüpler 50°C’de 20 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası tüplerin üzerine 2.5 ml %10’luk TCA ilave edildi. Tüpler iyice karıştırıldıktan sonra üst kısımlarından 2.5 ml başka bir tüpe aktarıldı. Bu tüpün üzerine de 2.5 ml saf su ve 0.5 ml %0.1’lik FeCl3 çözeltisi
eklendi.
Çözeltilerin absorbansları 700 nm’de okundu (Oyaizu, 1986). Absorbans arttıkça indirgeme gücü de artış göstermektedir. Bitkilerin ve standartların EC50 değerleri ayrı
ayrı hesaplandı. EC50 değeri absorbansın 0.5 olduğu etkin konsantrasyonu ifade
etmektedir ve EC50 değerinin düşük olması indirgeme gücünün yüksekliğini
4. 4. 4. Ö da ku eş iç iç ek he Şe Çi . SONUÇ .1. D. oleo .1.1. Topla Bitki zellikle son aha da artırm ullanılan yö ş değer ola çerikleri gall çinde toplam kstraktı sıra ekzan ekstra ekil 4.1. Gallik izelge4.1. D. o *Aritm ÇLAR ides subsp. am Fenolik isel sekonde n zamanlard maktadır. B öntem Folin arak verilm lik aside eş m fenolik içe asıyla etila aktı (3.182 m k asitin kalibr oleoides subsp Ekstrak Hekzan Etil Ase Metanol Etanol metik ortalama± . oleoides’e k Madde er metaboli da fenolik b Bitkilerin içe yöntemidir mektedir. Ça şdeğer olara eriği en yük asetat (341. mgGAE/g) asyon eğrisi p. oleoides ek klar etat l ±S.S. e ait sonuçla itler içinde bileşiklerin g erdikleri top r. Bu metod alışmamızda ak hesapland ksek olan et 818 mgGA esktrakları straklarının to Topla ar fenolik bil güçlü biyolo plam fenolik dun sonuçlar a kullanılan dı. D. oleoi tanol ekstrak AE/g), meta sırasıyla tak oplam fenolik am Fenolik 3 34 18 39 leşikler büy ojik etkileri k maddeleri rı standart b n ekstrakla ides subsp. ktıdır (391. anol (186.2 kip etmekte madde içerikl Madde(mg .182±1.814 41.818±1.92 86.212±3.85 91.970±1.28 yük öneme i bunlara ol i belirlemed bir fenolik m arın toplam oleoides ek 970 mgGA 212 mgGA edir. leri g GAE/g) 4* 28 57 86 sahiptir. lan ilgiyi de en sık maddeye m fenolik kstrakları E/g). Bu AE/g) ve
Şe 4. Ek To sır m Şe ekil 4.2. D. ole .1.2. Topla Fenol kstrakların oplam flavo ralanabilir: mgRE/g)> he ekil 4.3. Rutin eoides subsp. am Flavono lik bileşik toplam fla onoid içeriğ Etilasetat ( ekzan (11.5 nin kalibrasyon oleoides ekstr oid İçeriği klerin en avonoid içe ği açısından (272.948 mg 86 mgRE/g n eğrisi raklarının topl önemli g rikleri rutin n D. oleoide gRE/g)> Et g). lam fenolik m grubunu f ne eşdeğer es subsp. o tanol (94.16 madde içerikler flavonoidler olarak hes leiodes eks 65 mgRE/g) rinin karşılaşt r oluşturm saplandı (m strakların şu )> Metanol tırılması maktadır. mgRE/g). u şekilde (60.078
Çi Şe 4. m an ge eş as yü Et ve ta he izelge4.2. D. o *Aritm ekil 4.4. D. ole .1.3. Topla Fosfo metodun old ntioksidan k enellikle ant şdeğer olara skorbik asid üksek antio tilasetat eks e gallik asi akiben etano ekzan ekstra oleoides subsp Ekstra Hekzan Etil As Metano Etanol metik ortalama± eoides subsp. am Antioks omolibdat te dukça kısa kapasitesinin tioksidan et ak verilmek de eşdeğer oksidan ka straktının to itten daha ol ekstraktı aktı (43,326 p. oleoides ek aklar n etat ol ±S.S. oleoides ekstr sidan Kapa esti son zam sürede son n tayininde tkinliği bilin ktedir. Kul olarak he apasite etil oplam antio yüksek olm ı (280.598 6 mgAE/g) a straklarının to Topla raklarının topl asite manlarda öz nuç vermesi kullanılan a nen bileşikl lanılan eks esaplandı (m lasetat eks oksidan kap ması oldukç mgAE/g), antioksidan oplam flavono m Flavono 11 272 60 94 lam flavonoid zellikle kulla inden dolay alternatif bi lere özellikl trakların to mgAE/g). M straktında b asitesinin s ça dikkat ç metanol ek n kapasiteler oid içerikleri id içeriği (m 1.586±0.446 2.948±13.83 0.078±5.425 4.165±0.261 d içeriklerinin anılan reakt yı bitkisel e ir metotdur. lede askorbi oplam antio Metodun so bulundu (4 standart olar çekicidir. E kstraktı (19 rine göre sır mgRE/g) 6* 39 5 1 karşılaştrılma tiflerin ucuz ekstrakların . Metodun s ik asit ve to oksidan kap onuçlarına 405.977 m rak kullanıl Etilasetat ek 4.159 mgA ralanabilir. ası zluğu ve n toplam sonuçları okoferole pasiteleri göre en mgAE/g). lan BHT kstraktını AE/g) ve
Şe Çi E *A Şe ka ekil 4.5. Askor izelge4.3. D. kstraklar v Aritmetik ortal ekil 4.6. D. ol arşılaştırılması
rbik asitin kal
oleoides subs ve Standart Hek Etil A Met Eta BH Galli lama±S.S. leoides subsp. ı librasyon eğri sp. oleoides ek tlar kzan Asetat tanol anol HT ik Asit oleoides ekst si kstraklarının v traklarının ve ve standartların Toplam standartların t n toplam antio Antioksida (mgAE/g 43.326± 405.977 194.159 280.598 322.417 308.932 toplam antiok oksidankapasi an Kapasit g) ±7.505* 7±6.013 9±7.727 8±2.037 7±8.750 2±2.238 ksidan kapasite iteleri te elerinin
4.1.4. Demir indirgeme Gücü
Bitkisel ekstrakların indirgeme güçlerinin tespiti antioksidan kapasitenin önemli bir belirtecidir. Bu amaçla bitkisel ekstrakların antioksidan özelliklerinin araştırıldığı invitro çalışmalarda indirgeme gücünü gösteren en az bir metot kullanılmaktadır. Demir indirgeme gücünde ekstrakların 700 nm’de absorbanslarının yüksek olması indirgeme güçlerinin yüksekliğini gösterir. Buna göre çalışılan ekstrakların indirgeme güçleri etilasetat>etanol>metanol>hekzan şeklinde sıralanabilir. Ancak standart olarak kullanılan gallik asit ve BHT çalışılan tüm ekstraklardan daha yüksek etkinliğe sahiptir. Ayrıca bu metodun sonuçları EC50 değerleri kullanılarak da yorumlanabilir. Bu
değerlere göre de ekstraklar içinde en etkin olanı etilasetat olarak karşımıza çıkmaktadır.
Çizelge4.4. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların demir indirgeme gücü metodunda 700 nm’de absorbansları *Aritmetik ortalama±S.S. Konsantrasyon (µg/ml) Ekstaklar ve Standartlar 50 100 200 400 1000 Hekzan 0.094±0.004* 0.098±0.004 0.102±0.004 0.112±0.005 0.176±0.004 Etil asetat 0.25±0.013 0.433±0.016 0.577±0.018 0.917±0.041 1.893±0.027 Metanol 0.15±0.007 0.201±0.006 0.274±0.008 0.394±0.016 0.857±0.018 Etanol 0.199±0.004 0.252±0.005 0.38±0.008 0.512±0.015 1.021±0.014 Gallik asit 1.446±0.031 2.034±0.030 2.3±0.035 2.525±0.047 3.055±0.050 BHT 0.773±0.031 1.162±0.042 1.781±0.042 2.218±0.059 2.858±0.049
Şe ka Çi Şe ekil 4.7. D. arşılaştırılması izelge4.5. D. o *Aritm ekil 4.8. D. ole oleoides sub ı oleoides subsp E H E M E B B metik ortalama± eoides subsp. bsp. oleoides p. oleoides ek Ekstraklar Hekzan Etil asetat Metanol Etanol BHA BHT ±S.S. oleoides ekstr ekstraklarını straklarının E raklarının EC5 ın ve standa C50 değerleri EC50 4602 160.6 545.2 384.0 17.80 24.34 50 değerlerinin artların demir 0 (µg/ml) .778±44.78 676±10.357 286±9.091 000±38.184 07±1.054 48±7.852 n karşılaştırılm r indirgeme 83* 7 4 ması güçlerinin
4.1.5. β-karoten/linoleik asit test sistemi
Bu metot yüksek sıcaklıkta linoleik asidin oksidasyonu sırasında meydana gelen peroksit radikallerinin β-karoten molekülünde renk açılımına neden olması ve bu durumun spektrofotometrik olarak ölçümüne dayanmaktadır. Linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme açısından çalışılan ekstrakların en ekili olanı etanol ekstraktı (88.143%) olarak belirlenmiştir. Etanolü metanol (%81.992), etilasetat (%79.527) ve hekzan (%11.242) takip etmektedir. Ancak gıdaların işlenmesinde oldukça sık kullanılan sentetik antioksidanlar BHA (% 94.005) ve BHT (% 93.350) ise çalışılan tüm ekstraklardan daha yüksek inhibisyon yüzdelerine sahiptir. Bu durum sentetik antioksidanların daha etkili olduklarının bir göstergesidir. Ancak bu maddelerin insan sağlığı açısından oluşturduğu kaygılar bunların doğal antioksidanlarla yer değiştirmesi gereğini doğurmuştur. Bu bakımdan çalışılan ekstraklardan özellikle etanol ekstraktı gıdaların işlenmesi sırasında yağ asidi oksidasyonunun önlenmesinde sentetik antioksidanların yerine kullanılabilir.
Çizelge4.6. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme yüzdeleri
Ekstraklar ve standartlar % İnhibisyon
Hekzan 11.242±0.185* Etilasetat 79.527±0.211 Metanol 81.992±0.433 Etanol 88.143±0.033 BHA 94.005±0.069 BHT 93.350±0.318 *Aritmetik ortalama±S.S.
Şe lin 4. yö yü ek ol ye ku sır Çi 45 A *A ekil 4.9. D. ole noleik asit oks
.1.6. Bakır Bitkis öntemi son üksek absor kstraklarda larak kullan eteneğine sa ullanılarak ralanabilir: izelge4.7. D. o 50 nm’de abso Ekstrakla Hekzan Etilasetat Metanol Etanol Askorbik A Aritmetik ortal eoides subsp. sidasyonunu in r İndirgem sel ekstrakl zamanlarda rbans yükse en yüksek nılan askorb ahiptir. Bu yorumlana Askorbik a oleoides subsp orbansları ar 0.199 t 0.591 0.333 0.398 Asit 0.902 lama±S.S. oleoides ekstr
nhibe etme yü
me Gücü (CU ların bakır
a oldukça s ek bir indirg k etkinlik e
bik asit çal metodun so abilir. EC50 asit>Etilaset p. oleoides ek Konsant 50 9±0.002* 1±0.016 3±0.007 8±0.006 2±0.032 raklarının ve s üzdelerinin ka UPRAC M iyonu indir sık kullanılm geme gücün etilasetat ek lışılan tüm onuçları dem 0 değerleri tat>Etanol> kstraklarının v trasyon (µg 100 0.205±0.00 0.77±0.013 0.453±0.01 0.577±0.01 1.762±0.04 standartların β arşılaştırılması Metodu) rgeme yete maktadır. M nün bir gös kstraktına a ekstraklard mir indirge ine göre ç >Metanol>H ve askorbik asi g/ml) 0 06 0.22 3 0.98 13 0.72 12 0.91 41 2.84 β-karoten/lino ı neğinin ölç Metodun son stergesidir. B aittir. Anca dan daha g eme gücünd çalışılan ör Hekzan.
itin bakır indi
200 22±0.003 86±0.026 28±0.022 18±0.019 47±0.031
oleik asit test s
çümünde C nucunda 45 Buna göre ak metotta güçlü bir in de olduğu g rnekler şu rgeme gücü m 40 0.231±0.0 1.747±0.0 1.147±0.0 1.522±0.0 3.855±0.0 sisteminde CUPRAC 0 nm’de çalışılan standart ndirgeme gibi EC50 şekilde metodunda 00 005 028 035 032 041
Şe ka ekil 4.10. D. arşılaştırılması Çizel oleoides sub ı lge4.8. D. ole E H E M E A *Aritmetik bsp. oleoides eoides subsp. Ekstraklar Hekzan Etil asetat Metanol Etanol Askorbik As ortalama±S.S ekstraklarının oleoides ekstr sit . n ve askorbik raklarının CUP EC50 3369 27.12 116.4 76.62 13.72 k asitin bakır PRAC metodu 0 (µg/ml) .444±38.49 26±7.901 441±4.417 22±4.636 25±0.478 r indirgeme unda EC50 değ 98* güçlerinin ğerleri
Şe de 4. ka ku ya yo Bu dü ça et (8 da ekil 4.11. D. eğerlerinin kar .1.7. Serbe Bitkis apasite tes ullanılmasın ani bitkisel orumlanır. B u grafik ku üşük olması alışılan ekst tilasetat (65 8026.875 µg aha güçlü se oleoides sub rşılaştırılması est Radikal sel materyal stleri içind na rağmen l ekstraktın Bu amaçla h ullanılarak h ı serbest ra traklar serb .481 µg/ml g/ml). BHT erbest radik bsp. oleoides l Yakalama lin serbest r de en yay en yaygın n radikalin her bir ekstr her bir ekst adikal süpür est radikal )> etanol (2 T ise 34.06 kal süpürme ekstraklarının a Aktivitesi radikal süpü ygın olanıd olanı DPPH n yarısını raktın konsa traktın IC50 rme etkinliğ süpürme et 273. 126 µg 1 µg/ml IC etkinliğine n ve askorbik i (DPPH Te ürme veya y dır. Bu am H’dir. Bu m süpürdüğü antrasyon-in 0 değerleri ğinin güçlü tkinliklerine g/ml)> meta C50 değeri i e sahiptir. k asidin CUP esti) yakalama ak maçla çok metotun so konsantra nhibisyon g hesaplanmı olduğunu g e göre şu ş anol (374.62 ile çalışılan PRAC metodu ktivitesi ant çeşitli ra onuçları IC5 asyon hesap grafikleri çiz ıştır. IC50 d gösterir. Bu ekilde sıral 26 µg/ml) > n tüm ekstra unda EC50 ioksidan adikaller 50 değeri planarak zilmiştir. değerinin una göre lanabilir: >Hekzan aklardan
Şe Şe Şe ekil 4.12.D. ol ekil 4.13. D. o ekil 4.14. D. o leoides subsp. oleoides subsp oleoides subsp oleoides’in h p. oleoides’in e p. oleoides’in m hekzan ekstrak
etil asetat ekst
metanol ekstra ktının konsant traktının kons aktının konsan trasyon-inhibi santrasyon-inh ntrasyon-inhib syon grafiği hibisyon grafiğ bisyon grafiği ği i
Şe Şe Çi ekil 4.15. D. o ekil 4.16. BHT izelge4.9. D. o *Aritm oleoides subsp T’nin konsantr oleoides subsp Ekstr H E M E B metik ortalama± p. oleoides’in e rasyon-inhibis p. oleoides ek raklar ve B Hekzan Etil asetat Metanol Etanol BHT ±S.S. etanol ekstrak syon grafiği strakları ve BH BHT ktının konsantr HT’nin IC50 d IC50 8026 65.48 374.6 273.1 34.06 rasyon-inhibis değerleri (µg/ml) .875±15.32 81±0.613 626±1.003 126±0.023 61±0.381 syon grafiği 21*
4. 4. ek m ta Ç Şekil 4 .2. D.seric .2.1. Topla D. se kstraktıdır ( metanol (186 akip etmekte Çizelge 4.10. D *Aritm 4.17. D. oleoid ea’ya ait so am fenolik ericea ekstr (287.545 m 6.212 mgGA edir. D. sericea ekst metik ortalama± Ekst Hekz Etil A Meta Etan
des subsp. oleo
onuçlar Madde rakları için gGAE/g). B AE/g) ve he traklarının top ±S.S. traklar zan Asetat anol nol oides ekstrakl nde toplam Bu ekstraktı ekzan ekstra plam fenolik m Toplam F 10. 281 185 287 ları ve BHT’n fenolik iç ı sırasıyla e aktı (3.182 m madde içerikle Fenolik Mad 030±1.181* 1.545±2.040 5.121±2.619 7.545±0.664 nin IC50 değerl çeriği en y etilasetat (3 mgGAE/g) eri dde (mg GA * 0 9 4 lerinin karşıla yüksek olan 41.818 mg esktrakları AE/g) ştırılması n etanol GAE/g), sırasıyla
Şe 4. sır (1 ekil 4.18. D.se .2.2. Topla Topla ralanabilir: 107.788 mgR Çizelg *Aritm ericea ekstrak am Flavono am flavono Etanol (1 RE/g)> hek ge 4.11. D. se Ekstra Hekz Etil A Meta Etan metik ortalama± larının toplam oid Tayini oid içeriğ 180.194 m kzan (4.716 ericea ekstrakl aklar T zan Asetat anol nol ±S.S. m fenolik madd ği açısında mgRE/g)> E mgRE/g). larının toplam Toplam Flav 4.716 119.9 107.7 180.1 de içeriklerini anD. seric Etilasetat ( m flavonoid içe vonoid içer 6±0.479* 962±4.412 788±0.566 94±2.327 in karşılaştırılm ea ekstrak (119.962 m erikleri riği (mgRE ması kların şu mgRE/g)> /g) şekilde Metanol
Şe 4. bu st çe ek ka Çi *A ekil 4.19. D. s .2.3. Topla Meto ulundu (362 andart olar ekicidir. Et kstraktı (21 apasitelerine izelge 4.12. D Ekstrak Aritmetik ortal ericea ekstrak am Antioks odun sonuçl 2.114 mgA rak kullanıla ilasetat eks 12.871 mg e göre sırala D. sericea ekst klar ve Stan Hekzan Etil Asetat Metanol Etanol BHT Gallik Asit lama±S.S klarının toplam sidan Kapa larına göre e AE/g). Etila an BHT ve straktını tak gAE/g) ve anabilir. traklarının ve ndartlar t t m flavonoid iç asite en yüksek a asetat ekstra e gallik asi kiben etano hekzan e standartların Toplam A 57 36 21 27 32 30 çeriklerinin ka antioksidan aktının top itten daha y ol ekstraktı ekstraktı (5 toplam antiok Antioksida 7.038±3.069 62.114±11.9 12.871±6.49 76.962±2.66 22.417±8.75 08.932±2.32 arşılaştırılması kapasite eti lam antiok yüksek olm (276.962 57.038 mg ksidan kapasit n Kapasite 9* 933 98 63 50 28 ı ilasetat ekst ksidan kapa ması oldukç mgAE/g), gAE/g) ant teleri e (mgAE/g) traktında asitesinin a dikkat metanol ioksidan
