i
SİDERİTİS LİBANOTİCA LİNEARİS SUBSP. LİNEARİS BİTKİSİNDEN SEKONDER METABOLİTLERİN İZOLASYONU, YAPI TAYİNİ, ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN
İNCELENMESİ Nuri ÇABUK
Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Ramazan ERENLER
2012
ii T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
Y. LİSANS TEZİ
SİDERİTİS LİBANOTİCA LİNEARİS SUBSP. LİNEARİS
BİTKİSİNDEN
SEKONDER METABOLİTLERİN İZOLASYONU, YAPI TAYİNİ,
ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ
Nuri ÇABUK
TOKAT 2012 Her hakkı saklıdır
ii TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadı ğını , tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i ÖZET Y. Lisans Tezi
SİDERİTİS LİBANOTİCA LİNEARİS SUBSP. LİNEARİS BİTKİSİNDEN
SEKONDER METABOLİTLERİN İZOLASYONU, YAPI TAYİNİ, ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ
Nuri ÇABUK
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Ramazan ERENLER
Bu çalışmada; Sideritis libanotica linearis subsp. linearis bitkisinin sekonder metabolitleri kromatografik yöntemlerle (kolon kromatografisi, PTLC) izole edildi ve spektroskopik metotlarla yapıları belirlendi. Ayrıca izole edilen moleküllerin antioksidan aktiviteleri incelendi. Bitkinin toprak üstü kısmı suda kaynatıldı ve süzüldü ve süzülen kısım etil asetat ile ekstraksiyon yapıldı. Etil asetat ekstraktı kolon kromatagrafisi ve preperatif ince tabaka kromatografisi işlemlerine tabi tutuldu ve iki flavon glikozit bir flavon aglikon ve bir diterpen (sideroksol) olmak üzere toplam dört bileşik izole edildi. İzole edilen bileşiklerin yapıları 1-D NMR (1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT45, DEPT90, DEPT135, APT), 2-D NMR (HETCOR, HMBC, COSY) teknikleri ile belirlendi. Antioksidan çalışmaları sonucunda flavonların yüksek antioksidan aktivite gösterdikleri belirlendi.
2012, 51 sayfa
Anahtar Kelimeler: Sideritis libanotica linearis subsp. linearis, Flavon glikozitler, Sideroksol, Antioksidan aktivite
ii ABSTRACT M.Sc. Thesis
ISOLATION, CHRACTERIZATION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF SECONDER METABOLİTES OF SİDERİTİS LİBANOTİCA LİNEARİS SUBSP.
LİNEARİS
Nuri ÇABUK Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ramazan ERENLER
In this study, secondary metabolites were isolated by chrmatographic methods (column chromatography, PTLC) and identified by spectroscopic methods. Antioxidants activity tests were carried out of isolated compounds. The aerial parts of the plant were boiled in the water and filtered, extracted wiht ethyl acetate and concentrated which was subjected to the column chromatography and preparative thin layer chromatography to isolate two flavones glycosides, a flavone aglikone and a diterpene (sideroxol). The structures of isolated compounds were identified by 1-D NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT45, DEPT90, DEPT135, APT), and 2-D NMR (HETCOR, HMBC, COSY) techniques. The antioxidant studies showed that the flavones exhibited the high antioxidant activities.
2012, 51 pages
Keywords: Sideritis libanotica linearis subsp. linearis, Flavone glycosides, Sideroxol, Antioxidant activity
iii ÖNSÖZ
Tez çalışmam boyunca, bilgi ve tecrübelerini aktaran, her konuda yardımlarını esirgemeyen değerli danışman hocam Doç. Dr. Ramazan ERENLER’e
Antioksidan aktivite çalışmalarında hem bilgi birikimini hem de laboratuvar çalışmaslarında yardımlarını esirgemeyen Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ’a
Çankırı Karatekin Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim üyesi Prof. Dr. İbrahim Demirtaş’a
Bitki materyalinin seçilmesi ve toplanması sırasında yaptığı katkılarından dolayı sayın Prof. Dr. İsa TELCİ’ye,
Tez çalışmaları süresince her zaman yanımda olan, deneyimlerini paylaşan, Uzman Hüseyin AKŞİT’e, Uzman Nusret GENÇ’e, Uzman Özkan ŞEN’e ,
Bana her zaman destek olan aileme teşekkürü bir borç bilirim.
Nuri ÇABUK 2012
iv İÇİNDEKİLER ÖZET ...i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii İÇİNDEKİLER ...iv ŞEKİLLER DİZİNİ ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ ... vii
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ ... viii
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3
2.1. Bitkinin Tanımı ve Familyası ... 3
2.1.1. Labiatae (Lamiaceae) ... 3
2.1.2. Sideritis Cinsi ... 3
2.1.3. Sideritis libanotica Labill. subsp. linearis (Bentham) Borm. ... 4
2.2. Biyolojik Etki Çalışmaları Hakkında Bilgiler ... 4
2.2.1. Antioksidan Aktivite ... 4
2.3. Bitkilerde Bulunan Bileşenler Hakkında Bilgiler ... 6
2.3.1. Flavonoidler ... 6
2.3.2. Terpenler ... 9
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 13
3.1. Bitkisel Materyal ... 13
3.2. Bitki Sekonder Metabolitlerinin Ekstraksiyonu ... 13
3.3. Kolon Kromatografisi ... 14
3.4. İTK (İnce Tabaka Kromatografisi) ... 14
3.5. NMR Spektrumları ... 14
3.6. HPLC Analizleri ... 15
3.7. Antioksidan Aktivite Testleri ... 16
3.7.1. İndirgeme Gücü Aktivitesi Testi ... 16
3.7.2. Katyon Radikali Giderme Aktivitesi Testi ... 17
v
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 18
4.1. Flavon 0’ın (44) İzolasyonu ve Karakterizyonu ... 18
4.2. Flavon 1’in (45) İzolasyonu ve Karekterizasyonu ... 19
4.3. Flavon 2’nin (46) İzolasyonu ve Karekterizasyonu ... 21
4.4. Sideroxol’ün (47) İzolasyonu ve Karekterizasyonu ... 23
4.3. Flavon Türevinin HPLC ile Kantitatif Analizi ... 26
4.4. Antioksidan Aktivite Test Sonuçları ... 29
4.4.1 Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 29
4.4.2 İndirgeme Gücü Aktivitesi ... 30
4.4.3 Katyon Radikali Giderme Aktivitesi ... 31
5. SONUÇ ... 32
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2. 1. Kromon (benzo-γ-piron ve 2-fenil benzopiron ... 6
Şekil 2. 2. Bazı flavonoid bileşiklerinin iskelet yapısı ... 7
Şekil 2. 3. Sideritis öztürkii’den izole edilen bileşiklerin yapısı ... 8
Şekil 2. 4. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşiklerin yapıları (Ghoumari ve ark., 2005). ... 11
Şekil 3. 1. Bitki örneklerinin Özütlenmesi ve sıvı-sıvı ekstraksiyon düzenekleri ... 13
Şekil 3. 2. Flavon türevinin değişik derişimlerin (25, 50 ve 100 ppm) HPLC-UV kromatogramı ve kalibrasyon grafiği (R2 = 0,998782) ... 15
Şekil 4. 1. Flavon 0 molekülü 1 H ve 13C-NMR kimyasal kayma değerleri ... 18
Şekil 4. 2. Flavon 1 molekülü 1 H ve 13C-NMR kimyasal kayma değerleri ... 19
Şekil 4. 3. Flavon 1 molekülü 1 H-NMR spektrumu ... 19
Şekil 4. 4. Flavon 1 molekülü 13 C-NMR spektrumu ... 20
Şekil 4. 5. Flavon 2 molekülü 1 H ve 13C kimyasal kayma değerleri ... 21
Şekil 4. 6. Flavon 2 molekülü 1 H-NMR spektrumu ... 22
Şekil 4. 7. Flavon 2 molekülü 13 C-NMR spektrumu ... 22
Şekil 4. 8. Sideroksol molekülü 1 H ve 13C kimyasal kayma değerleri ... 23
Şekil 4. 9.sideroksolbileşiği 1 H-NMR spektrumu ... 24
Şekil 4. 10.sideroksolbileşiği 13 C-NMR spektrumu ... 25
Şekil 4. 11.sideroksolbirleşiği APT ve DEPT135 spektrumu ... 25
Şekil 4. 12.sideroksolbirleşiği HETCOR spektrumu ... 26
Şekil 4. 13. Kaynatma tekniğinde flavon değişimi (zamana göre) ... 27
Şekil 4. 14. Kaynatma tekniğinde flavon miktarının değişimi ... 27
Şekil 4. 15. klasik demleme yönteminde flavon değişimi (zamana göre) ... 28
Şekil 4. 16. Klasik demleme yönteminde flavon miktarının değişimi ... 28
Şekil 4. 17. Sideritis cinsinden izole edilen flavon ve sideroksol’un DPPH radikal giderme aktivitesi ... 29
Şekil 4. 18. Sideritis cinsinden izole edilen flavon ve sideroksol’un indirgeme gücü aktivitesi ... 30
Şekil 4. 19. Sideritis cinsinden izole edilen flavon ve sideroksol’un katyon radikal giderme aktivitesi ... 31
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2. 1. Terpenlerin sınıflandırılması ... 10 Çizelge 2. 2. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşikleri ... 12
viii SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simge Açıklama Kimyasal Kayma d Dublet dd Dubletin dubleti J Etkileşme Sabiti m Multiplet s Singlet t Triplet Kısaltma Açıklama
APT Attached Proton Test
BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimetilsülfoksit
İTK İnce Tabaka Kromatografi MS Kütle Spektrometresi
NMR Nükleer Manyetik Rezonans ppm Kimyasal kayma birimi TCA Trikloroasetik asit
UV-VIS Ultraviyole-Görünür Bölge
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Corralation HETCOR Heteronuclear Corralation
1. GİRİŞ
Labiate (Lamiaceae) familyası, başta Akdeniz havzası olmak üzere yeryüzünün bütün
bölgelerinde yayılmış, yaklaşık 170-250 cins ve 3000-3500 tür ile temsil edilmektedir
(Feinburg-Dothan, 1978, Baytop, 1991, Heywood, 1978). Son 3 yılda belirlenen 7 tür ile
birlikte Türkiye florasındaki Sideritis türlerinin sayısız alt türü ve iki varyetesi ile 46’ya ulaşmıştır. Bunlardan 34 türü, 4 alt türü ve 2 varyetesi endemiktir (Kırımer ve ark., 1996, Kırımer ve ark., 1995).
Sideritis türlerinin toprak üstü kısımları çay ve halk ilacı olarak eski yıllardan beri kullanılmaktadır. Ayrıca halk arasında genellikle “dağ çayı, yayla çayı, ada çayı” olarak isimlendirilen bu türlerden hazırlanan çaylar soğuk algınlığı, öksürük ve sindirim sistemi rahatsızlıklarında kullanılmakta ve bal yapıcı özelliklerinden dolayı arılarca tercih edilmektedir (Tekeli ve ark., 2008). Sideritisin bir türünün iltihap önleyici ve ağrı giderici olarak etkili olduğu saptanmıştır (Hernendez-Perez 2002).
Biyolojik aktivite ile ilgili bu türün ham ekstresinin sadece antioksidan aktivitesi çalışılmış, sekonder metabolitlerle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. SLL bitkisinin ham metanol ekstresi üzerine çalışılmıştır (Tepe ve ark., 2006).
S. bilgerana P.H. Davis, S.libanotica Labill ssp. linearis ve Sideritis hispida P.H.
Davis’in toplam fenolik madde konsantrasyonu, β-karoten-linoleik asit sisteminde oksidasyonu engelleme oranı ve antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Bu değerler standart antioksidan oldukları bilinen BHT ve BHA ile karşılaştırılmıştır. Sonuç itibariyle türlerin fenolik madde bakımından oldukça zengin olduğu dolayısıyla kullanılan yöntemlerde de kuvvetli antioksidatif özelliğe sahip olduğu anlaşılmıştır (Tekeli ve ark 2008).
Sideritis türlerinin morfolojik ve anatomik araştırmaları üzerinde yurdumuzda çeşitli
çalışmalar yapılmıştır (Başer ve ark., 1997, Başer ve ark., 1994, Kaya, 1990). Son yıllarda Türkiye'de bazı Sideritis türlerinin sulu ekstreleri üzerinde yapılan çalışmalar, bu
2
türlerin farelerde sinir sistemi stimulanı ve antistres aktivitesine sahip olduklarını göstermiştir (Öztürk ve ark., 1996,;Yeşilada ve ark 1998; Aydın ve ark., 1986).
Türkiye'de Sideritis türlerinin uçucu bileşenlerinin belirlenmesi amacıyla pek çok çalışma yapılmasına rağmen (Özek ve ark., 1993, Ezer ve ark., 1996; Kinmer ve ark., 1998) Sideritis libanotica linearis (SLL) bitkisindeki sekonder metabolitlerin izolasyonu ile ilgili çalışma yapılmadı.
Bu çalışmada Sideritis libanotica spp. linearis bitkisinin sekonder metabolitleri saflaştırıldı, yapıları aydınlatıldı ve biyolojik aktiviteleri (antioksidana) incelendi.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Bitkinin Tanımı ve Familyası 2.1.1. Labiatae (Lamiaceae)
Lamiaceae; adaçayı, kekik, nane gibi birçok faydalı bitkileri içine alan çok geniş bir familyadır. Türkiye florasında Lamiaceae familyası 46 cins, 571 tür ve toplam 763 takson ile temsil edilmektedir. Bu 571 türün % 44,2 si endemiktir. Ülkemizde tıbbi ve aromatik bitkiler yönünden Ege ve Akdeniz bölgesi çok zengin bir yapıya sahiptir (Başer, 2006).
Labiatae familyası dünyanın birkaç bölgesinin dışında tüm habitat ve yüksekliklerde yetişmekte olup, Kuzey Kutbu'ndan Himalayalar'a kadar, Güneydoğu Asya'dan Hawai'ye kadar, ayrıca Avustralya’da, tüm Afrika'da ve Amerika'nın kuzeyi ve güneyi boyunca yayılış göstermektedir (Kaya, 1997).
2.1.2. Sideritis Cinsi
Sideritis cinsi, 46 tür ve 53 taksondan oluşmaktadır. İçerdiği taksonlardan 39 tanesi
endemik olan bu cins, % 78,2’lik endemizm oranı ile Türkiye florasında en fazla endemik tür içeren cinslerden biridir (Tekeli ve ark., 2008).
Sideritisler; tek ya da çok yıllık otlar veya küçük çalılar yapısında olan, gövdeleri dik ve
yükseltici, dört köşe, pilos ya da tomentos tüylü nadiren tüysüz, salgı bezli ya da salgı bezine sahip olmayan, yapraklar basit parçalı, kenarları tam ya da krenat - dentat, saplı ve ya sapsız cinslerdir. Vertasillastrum (4-) 6 (-10) çiçekli, seyrek ya da yoğun dizilişli. Brakteoller eksik. Brakteler yaprağa benzer, geniş kaliks tübünü saklayıcı, kaliks tubular - çan şekilli bazen bilabiat, 5 - 10 damarlı, 5 dikensi dişli, dişler eşit ya da üstteki alttaki dört dişten daha geniş, korolla genellikle san, bazen beyaz ya da kırmızı. Korolla tübü kaliks içinde, bilabiat, üst dudak hemen hemen dik, tam ya da iki parçalı
4
(trifit) ortadaki daha geniş ve daha derin, stamenler 4 didinam, korolla tübü içinde, alt stamenler üst stamenlerden daha uzundur. Anterler 2 gözlü ve çoğunlukla şekli bozulmuştur. Stilus korolla tübü içinde, silindirik, ginobazik bifit, üst lob uçta küt, alt lob geniş ve üst lobu sarar. Ovaryum üst durumlu 4 gözlü nuks ovat tepede küt yuvarlak ve tüysüzdür (Davis, 1998).
2.1.3. Sideritis libanotica Labill. subsp. linearis (Bentham) Borm.
Çok yıllık otsu, tabanda odunsu gövde dik, basit veya nadiren dallanmış veya çalı biçimindedir. Bitki 20–100 cm uzunluğundadır. Odunsu bir köke sahiptir. Gövde ve dallar dört köşe, beyaz, yünsü keçemsi tüylü, aşağıda örtü ve salgı tüysüzdür. Yapraklar kısa saplı ya da sapsızdır. Gövde ortasındaki yaprakları sapsızdır Yaprağın iki yüzü uzun örtü tüylü olup tüyler üst yüzde daha uzun ve sıktır. Salgı tüyü her iki yüzde vardır. Yaprak uçları da kör uçludan keskin sivri uçluya değişir. 1100–1800 m yükseltilerinde kireçli ve bitki örtüsünün az olduğu bölgelerde yetişir (Davis, 1988).
2.2. Biyolojik Etki Çalışmaları Hakkında Bilgiler 2.2.1. Antioksidan Aktivite
Antioksidan; canlı organizmalarda serbest radikallerin oluşumunu engelleyen ya da oluşan serbest radikalleri zararsız hale getiren sistemler olarak tanımlanır. Biyolojik olarak ise antioksidan madde, havanın oksijeni ile bozulan ürünlere ilave edilerek bu bozulmayı engelleyen veya geciktiren sentetik ya da doğal madde olarak tanımlanmaktadır.
Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu fenolikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller (Ness ve Powles, 1997). Önemli serbest radikaller superoksit (·Oˉ2), hidroksil radikali (.OH), nitrik oksit (NO·, NO 2·) ve lipit radikalleridir (RO·,
ROO·, R· ). Bu radikaller, kararsız ve canlı sistemlerde diğer madde ve gruplarla kolay bir şekilde reaksiyona girerler. Oluşan yeni ürünler hücre harabiyeti, hücre ölümü, yaşlanma ve birçok hastalığa neden olabilen zararlı ürünlerdir.
Serbest radikallerden etkilenen diğer bir önemli alan ise gıda sektörüdür. Lipitlerin radikalik peroksidasyonu hemen hemen bütün besin ürünlerinde meydana gelmektedir. Özellikle gıda sanayisinde depolama ve nakil sırasında meydana gelen çürüme ve bozulmaları engellemek çok önemlidir. Çünkü çürüme ve bozulmadan dolayı kötü koku yayan maddeler meydana gelir. Bu maddeler çoğu zaman toksik özelliğe sahip, lipit ve vitaminlerin yapısını bozan zararlı maddelerdir. Bu bağlamda, gıda sanayisinde bu istenilmeyen durumları ortadan kaldırmak için yıllardan beri araştırmalar yapılmaktadır. Sanayiciler oksidasyonu önlemek için çoğu zaman sentetik orijinli kimyasal maddeleri kullanmak zorundadırlar.
Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler:
a. Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme, toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronsiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler.
b. Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme, bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler.
c. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki, zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler.
L + Vit E LH + Vit E Vit E + L LH + Vit Eox
6
d. Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması, onarıcı etkidir. Antioksidan sistem; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar.
2.3. Bitkilerde Bulunan Bileşenler Hakkında Bilgiler 2.3.1. Flavonoidler
San renkli olmaları nedeniyle Latince 'san' anlamına gelen 'flavus' sözcüğünden türetilerek 'flavonoid' adını almışlardır, 15 C atomlu 2-fenil benzopiron (difenil propan) yapısı (C6-C3-C6) gösterirler. Bu yapıları nedeniyle polifenolik bileşikler olarak kabul
edilirler (Şekil 2.1). İskelet yapılarının farklı olmasına göre flavon, flavonol, flavonon, biflavonoid, kalkon gibi türleri vardır (Şekil 2.2). Flavonoidleri P vitamini olarak kabul eden görüşler mevcuttur (Sorata ve ark., 1984).
11 A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1 2
O O O O O O OH O O OH O O O O O O O O O O O O O O O C H O 3 4 5
Flavonlar İzoflavonlar Flavonoller
Dihidroflavonoller Flavononlar Kalkonlar
Flavanlar Antosiyanidler İzofalvonlar
Biflavanoitler Neoflavonoitler Oronlar Kumaranlar 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
8
Flavonoidler bitkilerde antioksidan, enzim inhibitörü ve aynı zamanda ışıktan koruma gibi bazı önemli özelliklere sahip (Harborne ve ark.;1975, Harborne ve Mabry, 1982) oldukları gibi, bitkilerde enerjinin dönüşümüne ve büyüme hormonlarına da etki etmektedirler. Flavonoidler ayrıca solunumu ve fotosentezi düzenleme ve bulaşıcı hastalıklara karşı savunma fonksiyonlarına sahiptirler (Smith ve Banks, 1986).
Flavonoidlerin bitkilerde azotun tutulmasını düzenleyen bakteriyel genlerin aktifleştirilmesinde yer aldıklarını gösteren araştırmalar, flavonoidlerle genler arasında belirgin bir ilişki olduğunu göstermektedir (Firmin ve ark., 1986; Peters ve ark., 1986).
Flavonoidlerin kullanım amacı göz önüne alınarak incelenmeleri 1970’li yıllarda daha da hızlanmaya başlamıştır. Gerçekleştirilen araştırmalar sonucu flavonoidlerin çok çeşitli biyokimyasal ve farmakolojik aktivitelere sahip oldukları belirlenmiştir. Örneğin, bu tür bileşiklerin antioksidant (Bors ve Saran, 1987, Larson, 1988), antimikrobiyal (Pratt ve Hudson, 1990), antiviral, antiülserojenik, hipolidemik, hepatoprotektif, (Wagner, 1989; Wagner ve ark., 1991; Hikino ve Kiso, 1988) özelliklere ve iltihaba karşı etkiye (Moroney ve ark., 1988) sahip oldukları açıklanmıştır. Bunun yanında flavonoidlerin (kersetin ve kamferolun) antimutajenetik ve antikarsinojenik etkilere sahip oldukları in vitro ve in vivo şartlarda belirlenmiştir (Kato ve ark., 1983; Huang ve ark., 1983; Verma ve ark., 1988; Deschner ve ark., 1991).
Son yıllarda yeni bulunan Sideritis Öztürkii’den yeni flavonlar bulunmuştur. Bu flavonlar Şekil 2.3’de özetlenmiştir (Ezer ve ark., 2004).
O O OH OCH3 O O O O O OH R1 O R2 OH HO HO HO HO OH R1: OAc R2: OH R1: OH R2: OH R1: OAc R2: H 16 17 18
2.3.2. Terpenler
Terpenler doğal bileşikler içerisinde en yaygın olan bileşikler olup yapıları oldukça farklılık gösteren küçük organik moleküllerdir. Terpenler çeşitli bitkilerden özellikle kozalaklı çam ağacından elde edildikleri gibi bazı böceklerin osmeterium’larından terpen salgılamaları ile de elde edilebilirler. Terpenler karbon iskeletinin oksidasyonu veya düzenlenmesi gibi kimyasal yollarla elde edildiği zaman, alkol, keton, aldehit veya asit grubu taşıyan terpenler oluşur. Oksijen ihtiva eden bu terpen bileşikleri terpenoidler olarak adlandırılırlar. Bitki terpenoidleri aromatik özelliklerinden dolayı geniş bir kullanım alanına sahiptir. Geleneksel ilaç tedavilerinde rol oynarlar. Bugün gerek açık zincirli gerekse halkalı yapıda olan çeşitli fonksiyonel gruplara sahip 20.000 den fazla terpen yapısı bilinmektedir (Gören, 2002; Anonim 1, 2006).
Hemen hemen tüm terpenlerin termal bozunmaları izopren molekülünü vermiştir ve bu da doğal olarak bulunan bütün terpenlerin iskelet yapısının 5 karbonlu izopren ünitesinden oluştuğu fikrine götürmüştür. Bu izopren kuralı veya C5 kuralı olarak bilinir
ve ilk Leopold Ruzicka* tarafından öne sürülmüştür. Ayrıca, Ingold (1925) doğal
terpenlerin içindeki izopren ünitelerinin “baştan kuyruğa” birbirine katıldığını söylemiştir. Bununla birlikte, bu kuralın oldukça kullanışlı olduğu kanıtlansa da, sabit bir kural olarak değil de yol gösterici bir prensip olarak gösterilebilir. Çeşitli istisnalar vardır; karotenler merkezlerinden kuyruk kuyruğa bağlanır, ayrıca bazı terpenlerin içerdikleri karbon beşin katı değildir ve karbon sayısı beşin katı olup da izopren moleküllerine bölünemeyen terpenler vardır (Finar, 1975).
10
Çizelge 2. 1. Terpenlerin sınıflandırılması
İzopren sayısı Sınıfı Karbon Sayısı
1 Hemiterpenler 5 2 Monoterpenler Seskiterpenler 10 3 15 4 Diterpenler 20 5 Seskiterpenler 25 6 Triterpenler 30 8 Tetraterpenler (Karotenoidler) 40 n Politerpenler (5)n
İnsanlar, geçmişten günümüze, bitkilerden organik bileşikler izole etmektedirler. Bitki yavaşça ısıtıldığında ya da buhar destilasyonuna tabi tutulduğunda, uçucu yağlar olarak bilinen kokulu bileşiklerin bir karışımı elde edilir (Solomons, 2002). Uçucu yağlar parfümeride yaygın olarak kullanılmaktadır. Uçucu yağların yapısı aydınlatıldığında ise en önemli bileşenler; monoterpenlerdir.
Terpenoidler olarak ta bilinen Terpenler yaygın olarak bitki aleminde bulunan bir bileşik grubudur (Finar, 1975). 5 karbonlu izopren moleküllerinden oluşmuşlardır. Uçucu yağlarda bulunan C ve H içeren oksijensiz terpenik maddelere hidrokarbür denilmektedir. Ayrıca doğal olarak bulunan her tür terpenin oksijen içeren türleri de vardır ve bunlar temelde alkol, aldehit veya keton formlardır. Bunlar ya dallanmış zincir biçimindedir, ya da siklik yapı (halka yapısı) da bulunurlar (Tanker ve ark., 1990). Bugün gerek açık zincirli gerekse halkalı yapıda olan çeşitli fonksiyonel gruplara sahip 20.000 den fazla terpen yapılan bilinmektedir (Gören, 2002).
Türkiye’deki sideritis türleri daha çok monoterpen içerir Türkiye’de bulunana sideritis türlerindeki terpen çeşitleri aşağıda verilmiştir (Başer, 2002).
Monoterpenler: Amasiaca, argyrea, armeniaca, athoa, bilgerana, brevidens, congesta,
dichotoma, erythrantha var. erythrantha, erythrantha var. cedretorum, galatica, germanicapolitana ssp. germanicapolitana, germanicapolitana ssp. viridis, gulendamii,
hispida, huber-morathii, libanotica ssp. libanotica, libanotica ssp. kurdica, lycia, niveotomentosa, phrygia, rubriflora, scardica ssp. scardica, serratifolia. sipylea, stricta, syriaca ssp. nusairiensis, trojana, vuralii
Oksijenli monoterpenler: Arguta, libanotica ssp. microchlamys, romana ssp. Romana Seskiterpenler: Akmanii, albiflora, brevibracteata, caesarea, cilicica, condensata,
curvidens, hololeuca, leptoclada, libanotica ssp. linearis, libanotica ssp. violascens, montana ssp. montana, montana ssp. remota, ozturkii, pisidica, tmolea, Vulcanica
Diterpenler: Perfoliata OH R1 R2 R2 O R1 O OAc O CHO R2 R1 OH R2 R1 R3 R4 R2 R1 R3 R4 O CHO OH OH OH OH O 19.R1=OH,R2=OAc 20.R 1=OAc,R2=OH 21.R1=H , R2=OH 22.R1=R2=OH 23.R1=R2=OH 24.R 1=R2=OAc 26.R1=OH,R2=OAc 27.R1=OAc, R2=OH 28.R1=H,R2=OH 29.R1=R3=R4=OH,R2=OAc 30.R1=OAc,R2=R3=R4OH 31.R1=R2=R3=R4=OAc 32.R1=R2=R3=R4=OH HO 33.R1=R3=R4=OH,R2=OAc 34.R1=OAc,R2=R3=R4=OH 35.R1=R2=R3=R4=OAc 36.R1=R4=H,R2=OH,R3=OAc 37.R1=R4=H,R2=R3=OH 38.R1=R3=OH,R2=OAc 39.R1=OAc,R2=R3=OH, R4=H 40.R1=R2=R3=OH,R4=H 41.R1=H,R2=R3=R4=OH 1 2 3 4 5 6 7 8 17 9 10 11 12 13 14 15 16 18 20 19 42 43 25
Şekil 2. 4. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşiklerin yapıları (Ghoumari ve ark., 2005).
12
Çizelge 2. 2. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşikleri (Ghoumari ve ark., 2005)
Bileşikler Bölgeler Sideritis türleri
21 İspanya candicans 19, 20, 22, 32 İspanya leucantha 19, 20, 22 İspanya linearifolia 19, 20, 22, 32 İspanya lagascana 36 İspanya glacialis 19, 20, 22 İspanya luteola 19, 20 İspanya voroi
19, 20, 22 İspanya Hirsuta subsp. nivalis
19, 20, 22 İspanya almeriensis
19, 20, 22 İspanya granatensis
19, 20 İspanya zafrae
19, 20, 22 İspanya leucantha var incana
19, 22, 37 Türkiye akmanii 19, 21, 22 Türkiye niveotomentosa 19, 22 Türkiye gulendamii 19, 20, 21, 22 Turkiye argyrea 19, 21, 38 Türkiye sipylea 37, 38 Yunanistan theezans 40 İspanya paulii 36, 37, 38 Yunanistan roeseri 36, 37, 41 İtalya sicula 19, 20, 21, 32 İspanya hirsuta 19, 20, 22 İspanya funkiana 19, 20 İspanya flavovirens 19, 20, 22 İspanya arborescens
19 İspanya leucantha var. Meridionalis
28, 42 İspanya infernalis
21, 28 İspanya cystosiphon
21, 28 İspanya sventenii
21, 42 İspanya ferrensis
21, 28 İspanya canariensis var pannosa
19, 20, 21 Türkiye brevidens
19, 20, 21, 37 Türkiye rubriflora
37 Türkiye dichotoma
19, 20, 21, 22 Türkiye athoa; agryrea
20 Türkiye trojana
19, 20, 37, 38 Türkiye oztürkii
22 Morocco ochreleuca
19, 20, 22, 32, 38-40 İspanya biflora
3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Bitkisel Materyal
Tokat Ballıca yöresinde yetişen (Rakım:942, koordinatlar: 4014858-3617155)
Lamiaceae familyasına ait Sideritis libanotica Labill subsp. linearis (Bentham) Bornm.
bitkisi Haziran–Temmuz ayları arasında toplanmıştır. Kurutulup öğütülmüştür. Kaynatılmak için hazır hale getirilmiştir. Bitkinin tür teşhisi Cumhuriyet Üniversitesi öğretim Üyesi Yard. Doç. Dr. Aşkın Akpulat tarafından yapıldı (Herberyum No: CUFH-8413).
3.2. Bitki Sekonder Metabolitlerinin Ekstraksiyonu
Sideritis libanotica bitkisi (500 gr) destile su (2 L) içerisine atılıp mutfak tipi düdüklü
tencerede suyun kaynama noktasında (~ 96 °C) 2 saat süre ile kaynatıldı. Konfüzyon oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve filtre kağıdı ile süzüldü. Sulu ekstrakt, ayırma hunisinde yeteri kadar etil asetat ile 3 kez ekstrakte edildi. Etil asetat fazı; susuz Na2SO4
ile kurutulduktan sonra evaporatör ile çözücü kuruluğa kadar uzaklaştırıldı. 10. 22 g ham ekstrakt elde edildi. İnce tabaka kromatografisi ile uygun mobil fazı belirlemek için denemeler yapıldı.
14
3.3. Kolon Kromatografisi
Bu çalışmada bitkinin sekonder metabolitlerinin ayrılması ve saflaştırılması basamağında, 10.22 g ekstraktın ayrılması için, 50x120 cm uzunluğunda cam kolon kullanıldı. Uygulamada 500 g silika jel (hekzan içinde bulamaç halinde) kullanıldı. Kolonun şartlanması basamağında ise; kolondan 1 L hekzan normal akış ile (basınçsız ve vakumsuz) geçirildi. Fraksiyonlar 250 mL hacimlerinde toplandı ve çözücüsü uzaklaştırılan fraksiyonlar etiketlenmiş 20 mL flakonlara uygun çözücü ile çözülerek aktarıldı. Toplanan çözücüler aynı polaritenin kullanıldığı basamaklarda tekrar kolonda kullanıldı. Kolon kromatografisinde hekzandan başlayarak etil asetat ve metanol ile kademeli bir şekilde polariteleri arttırılarak toplamda 161 adet fraksiyon toplandı. Fraksiyonlar İTK ve HPLC ile kontrol edilerek birleştirildi.
3.4. İTK (İnce Tabaka Kromatografisi)
Kolon kromatografisi deneyi sonucunda topladığımız 161 adet fraksiyon İTK’ya tabi tutuldu. Çözücü sistemlerinde yürütülen İTK plakalarındaki spotlar UV ışığında ya da UV ışığında görünmeyen spotlar serik sülfat belirteci püskürtülerek hafif ısıtılıp renkler gözlendi.
İTK plakaları incelenerek benzer olduğu tespit edilen fraksiyonlar birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlardaki bileşiklerin saflaştırılması için bir miktar çözücü eklendi ve kristallendirmeye bırakıldı. Maddelerin saflaştırılıp saflaştırılmadığını anlamak için yeniden İTK yöntemi kullanıldı.
3.5. NMR Spektrumları
İzole edilen moleküllerin NMR spektrumları; uygun döterolu çözücüler kullanılarak Bruker Avence II (400 MHz 1H ve 100 MHz 13C) NMR cihazında kaydedildi. Yapı aydınlatma işleminde 1D NMR teknikleri (1H, 13C, APT, DEPT90, DEPT135) ve 2D NMR teknikleri (HETCOR, COSY, HMBC, TOCSY) kullanıldı.
3.6. HPLC Analizleri
İzole edilen flavon türevinin kantitatif analizleri GOPÜ/BALAB’da Elmer Series200 HPLC cihazında yapıldı. Mobil faz olarak %2.5 formik asit içeren deiyonize su (A) ve asetonitril (B) kullanıldı. Mobil faz programı: basamak 1’de 3 dakika % 85:15 (A:B) izokratik akış, 2. basamakta 5 dakika % 25 A ve % 75 B’ye lineer gradiyent, 3. basamakta 15 dakika %50 A ve %50 B’ye lineer gradiyent, 4. basamakta 2 dakika %50 A ve %50 B’de izokratik akış şeklinde programlandı. UV dedektör 280 nm’ye ayarlandı.
İzole edilen flavon türevinden 500 ppm’lik stok çözelti hazırlandı ve seyreltme yöntemiyle 100, 50 ve 25 ppm’lik derişimler hazırlanarak kalibrasyon grafiği çizildi. Elde edilen kromatogram ve kalibrasyon eğrisi Şekil 3.1’de verilmiştir.
14,2 14,4 14,6 14,8 15,0 15,2 15,4 15,6 15,8 16,0 16,2 16,4 16,6 16,8 17,0 17,2 17,4 17,6 17,8 18,0 18,2 18,4 18,6 18,8 19,0 19,2 19,4 19,6
Şekil 3. 2. Flavon türevinin değişik derişimlerin (25, 50 ve 100 ppm) HPLC-UV kromatogramı ve kalibrasyon grafiği (R2 = 0,998782)
16
3.7. Antioksidan Aktivite Testleri
Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu fenolikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiricisi olarak davranır.
Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek/tahmin etmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır.
Bitkiden izole edilen moleküllerin antioksidan aktiviteleri, İndirgeme Gücü aktivitesi, katyon radikali giderme aktivitesi ve serbest radikal giderme aktivitesi ile değerlendirildi. Bu amaçla moleküllerin 1 mg/mL derişiminde metanol içinde stok çözeltileri hazırlanarak testler bu stok çözeltiler kullanılarak yapıldı.
3.7.1. İndirgeme Gücü Aktivitesi Testi
Bitkiden izole edilen moleküllerin indirgeme gücü aktivitesiyle antioksidan aktivite tayini için 300 mM sodyum asetat (pH 3,6) tampon çözeltisi, 20 mM sulu demir (III) klorür çözeltisi ve 10 mM sulu TPTZ çözeltisi 10/1/1 oranında karıştırıldı. FRAP çözeltisi (3 mL) ve izole edilen moleküllerin stok çözeltilerinden (100 μL) ve metanol (900 μL) spektrometre küvetleri içerisine aktarılarak karıştırıldı ve oda sıcaklığında 30 dk bekletildikten sonra 593 nm dalga boyundaki absorbansları ölçüldü. (Benzie ve Strain 1996, 1999). Sonuçlar sentetik antioksidanlarla karşılaştırıldı.
3.7.2. Katyon Radikali Giderme Aktivitesi Testi
Bitkiden izole edilen moleküllerin ABTS radikal katyonu kullanılarak antioksidan kapasite tayini şu yöntemle yapıldı: suda hazırlanan 7 mM ABTS çözeltisi ve 2,45 mM potasyum persülfat çözeltisi karışımı (1/1, v/v) 6 saat süreyle oda sıcaklığında karanlık bir ortamda saklanarak ABTS radikal katyonu (ABTS˙+) çözeltisi hazırlandı. Analizler öncesinde ABTS˙+ stok çözeltisi metanol ile seyreltilerek 734 nm dalga boyundaki absorbansı 0,700±0,020’ye ayarlandı. ABTS˙+çözeltisi (3 mL) ve izole edilen moleküllerin stok çözeltilerinden (100 μL) ve metanol (900 μL) spektrometre küvetleri içerisine aktarılarak karıştırıldı ve oda sıcaklığında 15 dk bekletildikten sonra 734 nm dalga boyundaki absorbansları ölçüldü. (Pellegrini ve ark., 1999).
3.7.3. DPPH Serbest Radikal Giderme Aktivite Testi
Serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi Liyana-Pathirana’nın özetlediği metotta bazı modifikasyonlar yapılarak değerlendirildi (Liyana-Pathirana ve Shaihidi, 2005). DPPH· (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) 0,26 mM’lik etanol çözeltisin 1 mL si üzerine değişik konsantrasyonlarda (40-80-160 g/mL) numune çözeltisi ilave edildi. Son hacim etanol ile 4 mL’ye tamamlandı. Karışım şiddetli şekilde vortekslenerek oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildi. Spektrofotometrik ölçüm (Jasco V-530, Japan Servo Co. Ltd., Japan) oda şartlarında, 517 nm’de yapıldı. Denemeler üç tekrarlı olarak yapıldı. Numunelerin % serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplandı
% SRG = [ (Abskontrol-Absnumune)/Abskontrol]x100
Abskontrıol: etanol + DPPH çözeltisinin absorbansı, Absnumune= etanol + DPPH + ekstrakt
18
4. BULGULAR VE TARTIŞMA
4.1. Flavon 0’ın (44) İzolasyonu ve Karakterizyonu
44
Şekil 4. 1. Flavon 0 (44) molekülü 1H ve 13C-NMR kimyasal kayma değerleri
Flavon 0 molekülü, bu bitkinin metanol ekstraktına uygulanan kolon kromatografisi ile daha önceki çalışmada izole edilerek antioksidan aktivitesi değerlendirildi. Bundan dolayı; bu molekülün antioksidan aktivitesi yapılmadı. Şekil 4.1’de molekül üzerinde
1H ve 13C kimyasal kayma değerleri verilmektedir (Şekil 4.1). 7.10 ppm’deki dublet
(j=7.92 Hz), 7.60 ppm’de dubletin dubleti (j= 1.99 Hz ve j= 7.92 Hz) ve 7.48 ppm’deki d (j=1.99 Hz) flavon halkasının B halkasının 3' ve 4' sübstitüe olduğunu gösterir. 6.79 ppm ve 6.62 ppm’de singlet olarak gözlenen iki sinyal molekülün; A halkasının 5,7,8-sübstitüe olduğunu ve bir flavon türevi olduğunu gösterir. Molekülün DEPT90 spektrumunda aromatik halkaya ait 5 adet sinyalin gözlenmesi yapıyı doğrulamaktadır. Kimyasal kayma değerleri literatürle de (Demirtaş ve ark., 2011) uyum içindedir.
4.2. Flavon 1’in (45) İzolasyonu ve Karekterizasyonu
45
Şekil 4. 2. Flavon 1 (45) molekülü 1H ve 13C-NMR kimyasal kayma değerleri
Yapılan kolon kromatografisinde toplanan fraksiyonlardan 52-65 aralığı İTK ve HPLC kontrolü ile birleştirildi. Çözücüsü uzaklaştırılan fraksiyon sırası ile hekzan, diklormetan ve etilasetat ile yıkandıktan ve tekrar yapılan saflık kontrolünden sonra DMSO-d6 ile çözülerek proton ve karbon NMR spektrumları kaydedildi.
20
Proton spektrumunda; 3.85 ppm’de rezonans olan ve HMBC spektrumunda 151.7’de gelen karbon sinyali ile korele olan sinyal metoksi pikine aittir. 6.81 ppm’deki 3 numaralı protonun 182.8, 105.8 ve 164.4 karbonları ile gözlenen HMBC korelasyonu molekülün flavon türevi olduğunu gösterir.
Şekil 4. 4. Flavon 1 molekülü 13C-NMR spektrumu
Molekülün proton ve karbon NMR spektrumları incelendiğinde; kimyasal kaymaların çok küçük farlılıklarla Flavon 0 (44) molekülüne benzediği görüldü. Bundan yola çıkarak; molekülün aynı flavon iskeletine sahip olduğu sadece Flavon 0 (44) molekülünde 170.8 ve 170.6 ppm’de gözlenen asetil karbonillerinin sinyallerinin olmadığı dolayısıyla Flavon 1’in (45) 3'-O-methylhypolaetin-7-O-[6'''-β-D-allopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)] olduğu kanısında varıldı. Flavon 1’in (45) sırasıyla; 63.6 ve 63.9 ppm’de rezonans olan 6'' ve 6''' karbonlarının asetil gruplarından dolayı daha aşağı alanda gözlenen sinyallerin Flavon 1’de (45) sırası ile 60.9 ve 61.4 ppm’de gözlenmesi; molekülün yapısını doğrulamaktadır
4.3. Flavon 2’nin (46) İzolasyonu ve Karekterizasyonu
Şekil 4. 5. Flavon 2 (46) molekülü 1H ve 13C kimyasal kayma değerleri 3'-O-methylhypolaetin
Flavon 2 (46)’nin Şekil 4.6 ve Şekil 4.7’de sırası ile proton ve karbon NMR spektrumları verilmektedir. Protonların kimyasal kayma değerleri ve etkileşme sabitleri incelendiğinde 6.81 ppm’de singlet ve 6.65 ppm’de yine singlet olarak gözlenen 3 ve 6 protonları yapının flavon türevi ve A halkasının 5,7,8 trisübstitüe olduğunun kanıtıdır. 7.52’de brs ve 7.62 ve 7.12 ppm’de dublet olarak rezonans olan sinyaller B halkasının 3', 4' –disübstitüe olduğunu gösterir. Proton NMR spektrumunda 3.85 ppm’de gözlenen ve (intregrasyon değeri 3.1) HETCOR spektrumunda 56.20 ppm’deki karbon sinyali ile korale olan pik metoksi grubuna aittir. Aynı sinyal HMBC spektrumunda 151.5 ppm’deki karbon sinyali ile etkileşmiştir. Bu da metoksi grubunun 3'-konumundan bağlı olduğunu gösterir.
22
Şekil 4. 6. Flavon 2 (46) molekülü 1H-NMR spektrumu
Flavon 2 (46)’nin karbon NMR spektrumu incelendiğinde; toplamda 16 sinyal gözlenmektedir. 182.52 ppm’de gözlenen karbonil sinyali yapının flavon iskeletine sahip olduğunun, 56.22 ppm’deki sinyalin varlığı ise metoksi grubunun varlığının bir delilidir. 3 karbonunun 103.8’de, 5 karbonunun 151.5’de 7 karbonunun 153.9’da rezonans olması yapının Şekil 4.5’de verildiği şekilde olmasının delilidir. 8 karbonunun 125 ppm’e, ve 5 karbonunun 151.5 ppm’e kadar kayması B halkasının 7,8-disübstitüe olduğunu düşündürmektedir.
4.4. Sideroxol’ün (47) İzolasyonu ve Karekterizasyonu
Şekil 4. 8. Sideroksol (47) molekülü 1H ve 13C kimyasal kayma değerleri
Sideroksol (47) molekülü yapılan kolon kromatografisinde 40-46 fraksiyon aralığından beyaz kristaller halinde saf olarak elde edildi. 40-46 fraksiyon aralığı TLC’de tek spot halinde gözlendi ve bu fraksiyon aralığı birleştirilerek çözücüleri uzaklaştırıldıktan sonra 1:3 (metanol:aseton) sisteminde yeniden kristallendirildi. Kristaller; çözücü pipet yardımıyla ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra kurutulmuş ve amber renkli şişelerde korundu.
24
40-46 fraksiyonların yapısının aydınlatılması için fraksiyonlar DMSO-d6 ile çözülerek proton, karbon ve HETCOR, COSY ve HMBC spektrumları kaydedilmiştir. Molekülün proton NMR spektrumu Şekil 4.9, karbon NMR spektrumu Şekil 4.10 ve APT ve DEPT135 Şekil 4.11’de verilmektedir.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 ppm 0 . 6 6 4 0 . 7 1 5 0 . 7 4 6 0 . 7 7 6 0 . 8 7 5 0 . 8 9 2 0 . 9 5 7 1 . 0 2 6 1 . 2 1 0 1 . 2 4 1 1 . 2 8 6 1 . 3 1 5 1 . 3 4 4 1 . 4 2 0 1 . 4 6 2 1 . 4 9 7 1 . 5 7 2 1 . 6 9 7 1 . 7 2 8 1 . 7 5 8 2 . 0 3 1 2 . 5 1 0 2 . 8 9 7 2 . 9 2 3 2 . 9 3 9 2 . 9 7 9 3 . 0 9 1 3 . 1 0 4 3 . 1 1 6 3 . 1 3 1 3 . 1 7 8 3 . 3 9 7 3 . 4 6 2 4 . 2 1 8 4 . 2 8 6 3 . 0 2 1 . 0 7 0 . 9 9 3 . 0 0 1 . 0 9 1 . 9 1 3 . 8 0 1 . 4 8 4 . 4 6 2 . 4 7 2 . 2 0 1 . 0 7 1 . 1 0 1 . 0 3 1 . 1 9 1 . 3 2 1 . 0 3 0 . 9 8
Şekil 4. 9. Sideroksol (47) bileşiği 1H-NMR spektrumu
Birleşiğin 1H-NMR spektrumunda (Şekil4.9) iki metil sinyali 0.71 ve 1.03 ppm’de gözlendi. 2.97 (J=12Hz) ve 3.52 (J=12 Hz) ppm’lerde gözlenen AB sistemine ait protonlar karakteristik (C-18) hidroksimetilen grubunun varlığına işaret etmektedir. 3.91 ppm’de gözlenen triplet (J=2.5 Hz) H-7 protonuna, 4.13 ppm’de gözlenen genişlemiş singlet ise H-15 protonuna işaret etmektedir. 5.08 ve 5.23 ppm’lerde gözlenen singletler ise bize halka dışı metilen (H-17) protonlarının varlığını gösterir. Bu birleşiğin 13C NMR spektrumunda (Şekil 4.9) oksijene komşu olan C-7 ve C-15 karbonlarına ait sinyaller 71.30 ve 71.31 ppm’lerde gözlenirken karakteristik C-18 karbonuna ait sinyal 63.7 ppm’de gözlendi.
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 ppm 1 4 . 9 1 6 1 7 . 6 3 6 1 7 . 7 6 1 1 7 . 8 7 1 1 8 . 0 3 0 2 6 . 9 2 0 2 7 . 5 5 4 3 1 . 1 9 7 3 5 . 7 6 1 3 7 . 1 9 7 3 8 . 8 6 9 3 9 . 0 7 9 4 0 . 1 5 1 4 5 . 5 0 8 4 7 . 6 1 5 6 1 . 1 9 4 6 3 . 8 1 0 7 0 . 5 5 1 7 1 . 0 4 6
Şekil 4. 10. Sideroksol (47) bileşiği 13C-NMR spektrumu
26 ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 ppm 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Şekil 4. 12. Sideroksol (47) bileşiği HETCOR spektrumu
Şekil 4.10 ve Şekil 4.11 incelendiğine moleküle ait 20 karbon sinyali gözlenmektedir. Bu sinyallerden 14.92, 17.62 ve 17.82 ppm’deki sinyaller APT spektrumunda pozitif olarak gözlenirken DEPT135 spektrumunda ise negatif olarak gözlendi. Bu veriler molekülde 3 metil grubunun varlığını gösterir. DEPT135 spektrumunda negatif sinyal molekülün 8 adet CH2 karbonu içerdiğini gösterir. Sideroksol (47) molekülünün
karbon-proton korelasyonu ve moleküldeki 8 diastrotopik CH2 protonları HETCOR
spektrumundan elde edilen verilerle belirlenmiştir.
4.3. Flavon Türevinin HPLC ile Kantitatif Analizi
Sideritis türleri halk arasında sıcak su ile demleme suretiyle çay olarak tüketilmektedir. Ancak demleme işlemi ekstraksiyon işleminin kısalığından dolayı bitkideki biyoaktif moleküllerin suya geçmesini kısıtlamaktadır. Daha fazla biyoaktif maddenin bitki örneğinden alınması için ekstraksiyon süresinin uzatılması gerekmektedir. Bu çalışmada; bitkiden izole edilen flavon 0 (46) molekülünün demleme ve kaynatma tekniklerindeki değişimi HPLC ile incelendi. Bu amaçla bitki (2 g) 100 mL su ile geri soğutucu altında kaynatıldı, belirli süreler içerisinde (0, 10, 20, 30 ve 50 dakika)
örnekler alınarak HPLC’de flavon miktarı kalitatif olarak tayin edildi. Biyoaktif moleküllerin maksimum miktarda alınabilmesi için gerekli optimum kaynatma süresi belirlendi. Elde edilen kromatogram Şekil 4. 13’de verilmektedir.
Şekil 4. 13. Kaynatma tekniğinde flavon değişimi (zamana göre)
Kromatogram incelendiğinde 20. dakikaya kadar flavon derişimi arttığı sonrasında ise flavon değişiminin düştüğü gözlendi. Bundan yola çıkarak en biyoaktif moleküllerin ekstraksiyonu için optimum sürenin 20 dakika olduğu kanısına varılabilir.
Şekil 4. 14. Kaynatma tekniğinde flavon miktarının değişimi
Şekil 4.14 incelendiğinde flavon miktarının en fazla olduğu kaynatma süresi 20 dakikadır. Bu noktadan sonra ekstrakte edilebilir bitki şekerlerinin çözelti içindeki miktarı başlangıca göre daha da arttığından flavon miktarı kaynatma süresinin uzatılmasıyla düşmektedir.
28
Bitkinin halk arasındaki kullanım şekli olan demleme yönteminde ise yine 2 g bitki 100 mL de sıcak suda bekletilmiş ve belirli aralıklarla karıştırılmıştır. Demden 0, 5 ve 10. dakikalarda örnekler alınarak HPLC’de analiz edilmiştir. 10 dakikadan sonra bitkisel çay soğuduğundan dolayı içim kalitesi düşeceğinden bu noktadan sonra örnek alınmamıştır. Analizden elde edilen kromatogramlar Şekil 4. 15’de verildi.
Şekil 4. 15. Klasik demleme yönteminde flavon değişimi (zamana göre)
Demleme tekniğinden elde sonuçlar şunu göstermiştir; demleme süresi uzadıkça bitkiden alınabilecek flavon miktarı artmaktadır. Ancak ekstraksiyon süresi; çayın içim kalitesinin de düşmemesi için kısa tutulmalıdır. Bundan dolayı bu teknikte, demleme işleminin kısa tutulmaması en az 10 dakika tutulması önerilebilir.
4.4. Antioksidan Aktivite Test Sonuçları
Sideritis libonatica bitkisinden saflaştırılan flavon türevleri ve sideroksol bileşiklerinin
antioksidan aktiviteleri; serbest radikal giderme aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi ve katyon radikali giderme aktivitesi testleri ile değerlendirildi.
4.4.1 Serbest Radikal Giderme Aktivitesi
İzole edilen bileşiklerin serbest radikal giderme aktivitesi DPPH kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlendi. Aktivitenin karşılaştırılması için BHT ve BHA ve troloks gibi sentetik antioksidanlar kullanıldı. Test Bölüm 3.8.3’te verilen metotla yapılarak sonuçlar % aktivite olarak ifade edildi.
Şekil 4. 17. Sideritis cinsinden izole edilen flavon türevleri (45,46) ve sideroksol’un (47) DPPH radikal giderme aktivitesi
Şekil 4.15’de görüldüğü gibi sideroksol bileşiğinin serbest radikali giderme aktivitesi izole edilen diğer flavon türevlerinden ve standartlardan oldukça düşüktür. Flavon türevlerinin aktiviteleri ise; derişimle artışa bağlı olarak artmakta ve % aktivite olarak da kullanılan sentetik antioksidanlarla yakın aktiviteye sahip olduğu gözlendi.
30
4.4.2 İndirgeme Gücü Aktivitesi
İzole edilen moleküllerin indirgeme gücü aktiviteleri Bölüm 3.8.1’de özetlenen yöntemle yapıldı. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.18’de özetlendi.
Şekil 4. 18. Sideritis cinsinden izole edilen flavon türevleri (45,46) ve sideroksol’un (47) indirgeme gücü aktivitesi
Şekil 4.18’de görüldüğü gibi sideroksol ve flavon birleşiklerinin indirgeme gücü aktivitesi pozitif kontrollerle karşılaştırıldığında sideroksol’un indirgeme gücü aktivitesinin düşük olduğu gözlendi. Flavon türevlerinin ise BHT ve trolox dan daha yüksek aktivite gösterdiği BHA dan ise aktivitesinin daha düşük olduğu görülmektedir. İndirgeme gücü büyükten küçüğe doğru sırasıyla BHA> flavon > BHT > trolox > sideroksol şeklindedir.
4.4.3 Katyon Radikali Giderme Aktivitesi
Katyon radikali giderme aktivitesi ABTS katyon Radikali kullanılarak Bölüm 3.8.2’de özetlendiği gibi yapılmış ve sonuçlar % aktivite olarak ifade edilmiştir.
Şekil 4. 19. Sideritis cinsinden izole edilen flavon türevleri (45,46) ve sideroksol’un (47) katyon radikal giderme aktivitesi
Şekil 4.19’da görüldüğü gibi sideroksol bileşiğinde katyon radikal giderme aktivitesi diğer testlerde de olduğu gibi standartlardan ve izole edilen diğer flavon türevlerinden oldukça düşüktür. Flavon türevlerinin ise katyon radikali giderme aktivitesine sahip olduğu hatta trolokstan daha yüksek aktiviteye sahip olduğu söylenebilir.
32
5. SONUÇ
Bu çalışmada Sideritis libanotica spp. linearis bitkisinin toprak üstü kısmından üç adet flavon bir diterpen kromatografik yöntemlerle (kolon kromatografisi ve PTLC) saflaştırıldı ve spektroskopik metotlarla (1D-NMR, 2D-NMR) yapıları belirlendi.
Sideritis libonatica bitkisinden izole edilen moleküller elüsyon sırasına göre sideroksol
(47), 3'-O-metilhipolaetin-7-O-[(6"'-O-asetil-beta-D-allopiranosil-(1-2)-6"-O-asetil-beta-D-glukopiranoz)] (45) 3'-O-metilhipokaetin-7-O-beta-D-allopiranozil-beta-D-glukopiranoz (44) ve 3-O-metilhipokaetin (46) şeklindedir.
Antioksidan aktivite testlerinde izole edilen flavon türevlerinin oldukça yüksek aktivite gösterdiği sideroksol’ün ise düşük aktivite gösterdiği belirlendi. Standartlarla karşılaştırıldığında aktivite sıralaması Flavon 2 (46) flavon 1 (45) sideroksol (47) şeklindedir.
Yapılan HPLC analizlerinde; bitkiden izole edilen flavon 0 (44) molekülünün klasik demleme ve kaynatma tekniklerinde ki değişimleri değerlendirildi. Sonuçlara göre optimum demleme süresi 10 dakika optimum kaynatma süresi ise 20 dakika olarak belirlendi. Bu surelerin üstünde işleme devam edilmesi durumunda flavon 0 (44)’ın derişimi zamana göre daha da düşmektedir.
Sideritis türleri ülkemizde adaçayı yada dağ çayı olarak bilinen bitki türlerinin büyük
bir kısmını oluşturmaktadır. Sideritis libonatica linearis türü ülkemize endemik bir bitki olması bu bitkinin önemini arttırmaktadır.
KAYNAKLAR
Anonim 1. 2006. The Free Encyclopedia, http://en.wikipedia.org/wiki/Terpene, Harborne, J. B., Marby, T. J., Marby H., 1975, The Flavonoids, Chapman and Hall, London.
Aydın, S., Öztürk, Y. and Baser, K.H.C., Investigation of Origanium ornites, Sideritis
congesta and Satureja cuneifolia Essential Oils for Analgesic Activity,
Phytoterapy Res., 10, (1986), 342-344.
Başer, K. H. C., 2002. Aromatic biodivestry amon the flowering plant taxa of Turkey. Pure Appl. Chem.,Vol.74, No.4, 527-545.
Başer., K.H.C., 2006. I International Symposium on the Labiatae: Advances in Production. Biotechnology and Utilisation, Sanremo, İtalya.
Başer, K.H.C., Koca, F., Tümen, G, Akyalçın, H., XII. Ulusal Biyoloji Kongresi, 6 8 Temmuz, Edirne (1994), 79-85.
Başer, K.H.C., Tümen, G., Çakır, H, Kaya, A., "Balıkesir Kazdağ Yöresinde Çay Olarak Kullanılan Bitkiler Üzerine morfolojik, Anatomik ve Palijonik Çalışmalar" Fırat Üniversitesi, XI. Ulusal Biyoloji Kongresi, 24-27 Haziran, Botanik, Elazığ (1997), 53 71.
Baytop, A., Farmasötik Botanik, Istanbul Üniv. Yay No:3637, Ecz. Fak.Yay No:58, Istanbul, (1991), 234-237.
Benzie, I.F.F. and Strain, J.J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239, 70-76.
Benzie, I.F.F. and Strain, J.J., 1999. Ferric reducing antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Methods in Enzymology, 299, 15-27.
Bors, W., Saran, M., 1987, Free Radical Res. Commun., 2, 131,
Davis, P.H., Flora of Turkey and The East Aegean Islands, Vol. 10, Univ. Press, Edinburg,(1998)
Davis, P.H., 1988. Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Edinburgh Universty Press, Edinburg, (7)
Deschner, E. E., Ruperto, J., Wong, G., Newmark, H. L., 1991, “Quercetin and rutin as inhibitors of azoxymethanol-induced colonic neoplasia”, Carcinogenesis, 7, 1193.
Demirtas, I., Sahin, A., Ayhan, Aksit, H., B., Aksit, H., Elmastas, M., Telci, I., 2010. Antioxidant activity and chemical composition of Sideritis libanotica Labill. ssp. linearis (Bentham) Borm. (Lamiaceae), Natural product Research.
Ezer, N., Vila, R., Canigueral, S. and Adzet, T., "Essential Oil Composition of Four Species of Sideritis", Phytochemistry, 41/1, (1996), 203- 205
Feinburg-Dothan, N., Flora Palaestina, The Israel Academy of Sciences and Humanities, Jarrussalem, Three Text, (1978), 155-56.
Finar, J.L., D.Sc, Ph.D.,ARIC, Organic Chemistry, Vol.2, Chp:8, "Stereochemistry and The Chemistry of Natural Products", Longman, Fifth Edition, (1975), p:354 358,440-441,451,459.
Firmin, J. L., Wilson, K. E., Rossen, L., Johnston, A.W.B., 1986, “Flavonoid activation of nodulation genes in rhizobium reversed by other compounds present in plants”, Nature, 324, 90.
34
Ghoumari, H., Benajiba, M., Azmani, A., Garcia-Granados, A., Martinez, A., Parra, A., Rivas, F., Socorro, O., 2005. ent–Kauranoid derivatives from Sideritis moorei. Phytochemistry 66, 1492–1498.
Gören, A.,C, Bazı Sideritis (Sideritis Argyrea, Sideritis Dichotoma, Sideritis Trojana) Türlerinin Diterpenik Bileşerderinin İzolasyonu ve Yapılarının Tayini, Doktora Tezi, Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Balıkesir (2002). Gören, A.,C., Bazı Sideritis (Sideritis Argyrea, Sideritis Dichotoma, Sideritis Trojana)
Türlerinin Diterpenik Bileşenlerinin İzolasyonu ve Yapılarının Tayini, Doktora Tezi, Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Balıkesir (2002).
Harborne, J. B. ve Marby, T. J., 1982, The Flavonoids: Advances in Research, Chapman and Hall, London.
Hernendez-Perez, M., Rabanal R. M., 2002 Evaluation of the antinflammatory and analgesic activity of Sideritis canariensis var. pannosa in mice, Journal of Ethnopharmacology, 81, 43–47.
Heywood, V.H., Flowering Plants of The World, Oxford Univ. Pres, Londra, (1978), 239.
Hikino, H., Kiso, Y., 1988, Econ. And Medicinal Plant Research, Academic Press, London, 2, 39, 698.
Huang, M.T., Wood, A. W., Newmark, H. L., Sayer, J. M., Yagi, H., Jerina, D. M., Conney, A. H., 1983, “Inhibition Of The Mutagenicity Of Bay-Region Diol- Epoxides of Polycyclic Aromatic-Hydrocarbons By Phenolic Plant Flavonoids”, Carcinogenesis, 4, 1631.
Kato, R., Nakadate, T., Yamamoto, S., Sugimura, T., 1983, “Inhibition Of 12- OTetradecanoylphorbol-13-Acetate-Induced Tumor Promotion And Ornithine Decarboxylase Activity By Quercetin - Possible Involvement Of Lipoxygenase Inhibition”, Carcinogenesis, 4, 1301.
Kaya, A., "Sideritis germanocopolitana Türü Üzerine Morfolojik Anatomik Araştırmalar", Yüksek Lisans Tezi, Anadolu Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Eskişehir (1990)
Kaya, A., "Türkiye'de Yetişen Acinos Miller Türleri Üzerinde Morfolojik, Anatomik ve Kimyasal Araştırmalar, Doktora Tezi, Anadolu Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Eskişehir (1997).
Kırımer, N., Kürkçüoğlu, M., Başer, K.H.C. and Tümen, G, "A Review, 13th International Congress of Flavours" Fragrances and Essential Oils, 15-19 October, Istanbul, (1995).
Kırımer, N., Kürkçüoğlu, M., Özek, T., Başer, K.H.C. and Tümen, G., "Composition of The Essential Oil of Sideritis Condensata Boiss. et Heldr." Flavour and
Fragrance Journal, 11, (1996), 315-317.
Kırımer, N., Tabanca, Baser, K.H.C., and Tümen, G., Composition of The Essential Oils of Sideritis congesta p.H. Davis et Hub.-Mor. Proceeding of XII. International Symp. On Plant Originated Crude Drugs, Ankara, Turkey, May. 20-22, (1998), pp 164 167.
Larson, R. A., 1988. The Antioxidants Of Higher Plants, Phytochemistry, 27, 969. Liyana-Pathirana, C. M., Shahidi, F., and Alasalvar, C., 2006. Antioxidant activity of
cherry laurel fruit Laurocerasus officinalis Roem.) and its concentrated juice. Food Chemistry. (99),121–128.
Moroney, M. A., Alcanaz, M. J., Forder, R. A., Carey, F., Hoult, J. R. S., 1988. Selectivity of neutrophil 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase inhibition by an antiinflammatory flavonoid glycoside and related aglycone flavonoids, J. Pharm. Pharmacol., 40, 787.
Özek, T., Baser, K.H.C. and Tümen, G, The Essential Oil o f Sideritis athoa Papanikolau et Kokkini, The Essent Oil Res., 5, (Nov / Dec 1993), 669- 670. Öztürk, Y., Aydm, S., Öztürk, N. and Baser, K.H.C., Effects of Extracts from Certain
Sideritis Species on Swimming Performance in Mice, Phytotheraphy Res.,10,
(1996), 70- 73.
Pellegrini, N., Re, R., Yang, M., and Rice-Evans, C.A., 1999. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying the 2, 2’-azobis (3-ethylenebenzothiazoline-6-sulfonic) acid radical cation decolorization assay. Methods in Enzymology, 299, 379-389.
Peters, N. K., Forst, J. W., Long, S. R., 1986. A plant flavone, luteolin, induces expression of rhizobium-meliloti nodulation genes, Sience, 233, 978.
Pratt, D. E., Hundson, B. J. F., 1990, Food Antioxidants, Elsevier, London, 171.
Sakar, M.k., Tanker, M., "Fitokimyasal Analizler", Ankara Üniversitesi Eczacılık Fak. Yay. No:67, (1991), s:181.
Solomons, G., Fryhle, C, Organik Kimya, 7. basımdan Çeviri, Ed. Okay, G., Yıldır, Y. İstanbul (2002), 1152-1155.
Smith, D. A., Banks, S. W., 1986, Plant Flavonoids in Biology and Medicine : Biochemical, Pharmacological and Structure Activity Relationship, 113-124. Sorata Y, Takahama U, Kimura M. Protective effect of quercetin and rutin on
photosensitized lysis of hematoporphyrin. Biochim. Biophys. Acta. 799 : 313 317. (1984)
Şahin, P., Ezer,N., Çalış.İ., 2004. Three acylated flavone glycosides from Sideritis
Özturkii Aytaç &Aksoy, Phtyshemistry 65, 2095-2099.
Tanker, M., Tanker, N., Farmakognozi, Ankara Ünv. Eczacılık Fak. Yay. No:65, (1990), s:282-284,287,300,317,332,343-344.
Tekeli,Y.,Sezgin,M.,Demirel,H., Ulusal Biyoloji Kongresi 23-27 Haziran 2008 Trabzon Tepe, B., Sokmen, M., Akpulat, H. A., Yumrutaş, Ö., Sokmen, A., 2006. Food
Chemistry, Screening of antioksidant properties of the methanolic extracts of
Pelargonium endlicherianum Fenzl., Verbascum wiedemannianum
Fisch.&Mey., Sideritis Lİbanotica Labill. subsp. linearis (Bentham) Borm.,
Centaurea mucronifera DC. and Hieracium cappadocicum Freyn from Turkish
flora ,98, 9-13.
Verma, A. K., Johnson, J. A., Gould, M. N., Tanner, M., 1988. Inhibition Of 7,12-Dimethylbenz(A)Anthracene-Induced And N-Nitrosomethylurea-Induced Rat Mammary-Cancer By Dietary Flavonol Quercetin, Cancer Res., 48, 5754. Yeşilada, E., Ezer, N., The Antiinflammatory Activity of Some Sideritis Species
Growing in Turkey, Int. /. Crude DrugRes.,21, (1998), 38-40.
Wagner, H., Elbi, G., Lotter, H., Guinea, N., 1991. Pharm. Pharmacol.,1, 15.
Wagner, H., 1989. Search for New Plant Constituents with Potential Antiphlogistic and Antiallergic Activity, Planta Med., 55, 235.
36
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı : Nuri Çabuk
Doğum Tarihi ve Yer : 18.05.1975- TOKAT Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce Telefon : 0506 500 37 96 Faks : -
e-mail : nuri.cabuk@hotmail.com
Eğitim
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi
Yüksek Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2012
Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 1997
