T
e k n
I
k
R
a p o r
T A E K T R 2 0 1 0 - 3
COXIELLA BURNETII’NIN KENELERDEN
POLlMERAZ ZtNClR
r e a k s i y o n u
(PCR)
v e
TÜ
R
K
İY
E
a
t
o
m
e
n
e
r
ji
s
i
k
u
r
u
m
u
،
٢
ع
ﺀ
.
٠
ل
I
TURKIYE ATOM
e n e r j i s i k u r u m ut e k n i k
r a p o r
COXIELLABURNETIUNIN KENELERDEN
POLIMERAZ z i n c i r
r e a k s i y o n u
(PCR) v e
PCR-RFLP i l e
SAPTANMASI
2010
T U R K IY E A T O M E N E R JISIK U R U M U
2690 sayılı kanun ile kurulmuş olan Türkiye Atom Enerjisi Kurumu’nun ana gOrevi; atom enerjisinin barışçıl amaçlarla ülke yararına kullanılmasında izlenecek ulusal politikanın esaslarım ve bu konudaki pla؟ ve programları belirlemek; ülkenin bilimsel, teknik ve ekonomik
inceleme ve çalışmayı yapmak ve yaptırmak, bu alanda yapılacak çalışmaları koordine ve teşvik etarektir.
Bu çalışma TAEK personeli arafmdan gerçekleştirilmiş araştırma, geliştirme ve inceleme sonuçlarının paylaşımı amacıyla Tefalik Rapor olarak hazırlanmış ve basılmıştır.
Teknik Rapor 2010/3
Türkiye Atom Enerjisi Kurumu yahnidir. izin a İ ! a k s ; z ı n ç0ğaltılabilir. Referans verilerekkUllanilabilir. T J^K IY E A T O M e n e r j i s ik u r u m u
Adres : Eskişehir Yolu 9. km 06530 Ankara/TUrkiye Tel :+ 9 0 (312)295 87 00
Fax :+ 9 0 (3 1 2 ) 287 87 61
ONTSOZ,
C o x ie k k m e tii, Q > m m ast Rastattgmm e ti^ o fc ji^ e .w i otup, o&tigat iwtrasetiiter6ir &akteriiir. ®ogacta a g w o k a ^ k tu T O tr w çeşitti R a p n k c ta (stğtr, ﺍﻼ ﻟ ﻵ ﺍ, R^çi) w
tr in k e ta ^krraitast ew؛ eR^İ50TOiTOi otaştww. c. km etii stteriew, R^wferiew w akÿt
ﺝ
٩ RjoniilClRfim ast ife e fe k te insanketan izote eiitmiştir. pewter, c. k m e t i i n n
r e z e r n m &i^citwR٤örteriiir. ^ . ^ a z t a tiirtoto c. k m e tiiite e fe k te o t i .
saptaégténRpCer، £oga، £aenfe؛^ipi6e&rCe5icisiokaR#rüCmeRtec[irCer.
«Bu çatışmaia, rftirRjynin 38 ik ie w to ç k ıt 2472 (1446 İİŞİ, 1021 5 n p p ft) aiet
ﻊ ﺳ ta k m ış tır . « n k^weter to p k itg t ite, tür w e k s i^ e tk göre 1-7 a ie ii &ir a٣a^a
g e t i k r e ^ a ç k i m t r r a ş w grtt؟ k ® ;N٨ ek^trak^i^oTOi sowaswia C®1 -te c®2 fimerteri
^ k ™ k a ^٠ t f e C k ^ i i k t t t a . } ^ N Æ itcefeTOltiştir.
«Bu ٤6ﻊ ﺧ ra؟ or, ؟ﲑ ﺣ stratejisi çerçeteske 2007(11 notu ؟ eaetgeie Retirtitea
؛ ornata Itgtta okaR i ﺀ١ﺩ€ ؟ü tea kO l(٦2 ^ 2 1 0 0 -؟ ) “C oxiek k r n e tii’k .Kenetercfen
(potimeraz Ziacir (Reak^i^oTOt ((PGR te ؟ GR^RTPTP ite Saçtaamast (projesi” s o m u t a e k eiitea Ritgiteria te ç a ttşa m e to c fn g e r e ^ a ^ O T okaR i gere^çeşitti R ^rataşkia iüzeafeaea Ritimset t o p k t t k i a : ş k ı sttTOtk çerçetesiaie Ritim İüa^asrna sttTOttmast
i ç i n d e k i l e r TablolarDizini...i Şekiller Dizini...ii Yönetici özeti...iii Executive Summary... iv Terimler ve Kısaltmalar... V 1 . GİRİŞ... 1 2. MATERYAL ve METOT... 5
2.1 Kenelerin toplanması ve saklanması... 5
2.2 Kenelerin tiir ve cinsiyet tayini... 5
2.3 Kenelerin ^"uplandirilmasi...5
2.4 Kenelerin DNA ekstraksiyonu İçin hazırlanması... 5
2.5 Kenelerden DNA ekstraksiyonu... 5
2.6 Pozitifkontrol DNA... 5
2.7 Kullanılan primerler... 6
2.8 Negatifkontrol... 6
2.9 PCR İçin uygun primer seçimi... 6
2.10 PCR amplifikasyonu... 6
2.HEkstraksiyonkitininkontrolU... 7
2.12 Eleltiroforez ve görüntiileme...7
2.13 Restriction fragment length polymorrphism(RFLP)...7
3. BULGULAR...8
3.1 Kenelerin tiir ve cinsiyet tayini sonuçları... 8
3.2 Ekstraksiyon kitinin kontrol sonucu... 13
3.3 PCR standardizasyon bulguları...13
3.4 PCR bulguları...13
3.5 PCR ile C. burnetii pozitifbulunan kene ^"uplarinin tiir ve cinsiyet dağılımları... 14
3.6 Restriction fra^nent length polymorrphism(RFLP) bulguları....15
4. TARTIŞMA ve SONUÇ... 16
Tablolar Dizini
Tablo 1. Toplanan kenelerin illere gOre ttir ve cinsiyet dağılımları.. Tablo 2. Türkiye’nin 38 ilinden toplanan toplam 2472 kenenin tür
ve cinsiyet dağılımları... 13
Tablo 3. PCR ile C. burnetii pozitifbulunan kene ^"uplarinin
tür ve cinsiyet dağılımları...15
Şekiller Dizini
. Resim 1: Pozitif PCR ürünlerinin görüntüleri. 50M: 50’lik marker; p: Coxiella burnetii Nine Mile RSA493 suşu; N: Negatif kontrol; 302-307: Denizli pozitif örnekler; 516 Ankara pozitif örnek; 100M:100’lük marker...14 257 .؛’lik pozitif PCR ürünlerinin restriksiyon profil
analizi. 50 M: 50’lik marker; p: Coxiella burnetii Nine Mile RSA493 suşu; N: Negatifkontrol; 302-307: Denizli pozitif örnekler; 516: Ankara pozitif örnek; 100M: 100’lükmarker...15
Resim
Resim
Yönetici Ozeti
Coxiella burnetii, Q humması hastalığının etiyolojik etkeni olup, obligat
intraseluler bir bateridir. Doğada yaygın olarak bulunur ve çeşitli hayvanlarda (sığır, konin, keçi) ve insanlarda Q-hummasi enfeksiyonunu oluşturur. C. burnetii sütlerden, kenelerden ve akut veya kronik Q humması ile enfekte insanlardan izole edilmiştir. Keneler, C. burnetii’nin rezervuarı ve birincil velflörleridir. Kırktan fazla kene türünün C. burnetii ile enfekte olduğu saptandığından keneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak görülmededirler.
Bu çalışmada, Türkiye’nin 38 ilinden toplam 2472 (1446 dişi, 1021 erkek, 5 nymph) adet kene toplandı. Bu keneler toplandığı ile, tür ve cinsiyetine göre 1-7 adedi bir araya getirilerek gruplandırıldı. Gruplar DNA ekstraksiyonu sonrasında CBl ve CB2 primerleri drllanılarak PCR ile C. burnetii’nin varlığı yönünde incelendi.
Denizli’den toplam 56 kene toplanmış olup, bu keneler tür ve cinsiyetlerine göre 13 gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6’sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur. Ankara’dan toplanan toplam 160 kene ise ayni şekilde 53 gruba ayrılmış ve bu gruplardan sadece birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır.
PCR ürünlerinin spesifisitesi restriksiyon analizi ile değerlendirildi. Pozitif PCR ürünleri Taql enzimi ile kesildiğinde C. burnetii Nine Mile RSA493 suşunda görüldüğü gibi yaklaşık 118, 57, 43 ve 39 bp’lik 4 bant ortaya konuldu.
Executive Summary
Coxiella burnetii, as an obligate intracellular bacterium, is the etiologic agent
of Q- fever. It is widely distrubuted in nattire and is responsible for infection in various animals (cattle, sheep, goat) and humans. C. burnetii has been isolated from milk, ticks and human patients with acute and chronic Q fever. Ticks are the principal vectors and reservoirs of C. burnetii. Since over 40 species ofticks have been found to be infected with C. burnetii, ticks can serve as indicators of infection in nature.
In this study, total of 2472 ticks (1446 female, 1021 male and 5 nymphs) were collected from 38 provinces of Turkey. The ticks were gathered into ^.oups of lto 7 ticks as to the provinces, species and gender for DNA extraction. Following DNA extraction, the ^.oups were examined for the presence of C. burnetii by using the primers CBl and CB2.
The ticks collected from the province of Denizli (56 in total) were gathered into 13 ^-oups according to the species and gender. From these groups, 6 were positive for C. burnetii. The ticks collected from Ankara province, total of 160 ticks, were Rouped into 53 as to their species and gender, and only one group was found to be positive for C. burnetii.
The specificities of the PCR products were evaluated by restriction analysis. The positive PCR products were digested with the enzyme Taql and four bands in order of 118, 57, 43 and 39 bp’s were appeared such as seen in the positive control DNA (C. burnetii Nine Mile RSA493).
Kısaltmalar ve Terimler
Kısaltmalar
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu DNA : DeoksiribonUkleik asit OMP : Dış membran proteini ddH2O : Çift distile su
TAE : Tris-Asetat-EDTA solUsyonu Bp :Bazçifti
PCR-RFLP : Polimeraz zincir reaksiyonu-Restriksiyon enzim analizi
Terimler
PCR : Laborafilar ortamında spesifik DNA dizilerinin primer denilen sentetik oligonUkleotid diziler yardımıyla çoğaltılması İşlemi.
Transstadial bulaşma : Hastalık etkeninin parazitin bir gelişme
aşamasından diğer gelişme aşamasına aktarılması, öm : Kenenin nymfaşamasmdan ergin keneye atoarilmasi.
.GİRİŞ
Q humması, obligat infiaselluler bir midoorganizma olan Coxiella burnetifnin neden olduğu zoonotik bir enfeksiyondur. Etken insana öncelikli olarak aerosol yolla bulaşır ve rüzgar aracılığıyla yayılabilir. Diğer bulaşma yolları ise çok az öneme sahiptir. C. burnetii’â reze^marlan sayısızdır ve bunlar arasında evcil ve yabani memeliler, kuşlar ve artropodlar yer almaktadır [6,17]. Bunların İçinde en önemli reze^marlar sığır, ko^ın ve keçidir. Bu hayvanlarda enfeksiyonun sonucu olarak abortus oluşmasına karşın hastalık genellikle asemptomatik seyreder [19, 21]. C. burnetii birçok fiziksel ve kimyasal fadörlere karşı dirençli olduğundan çevrede uzun süre canlı kalabilme yeteneğine sahiptir. Bu özellik hastalığın kontrolünde önemli bir engel oluşturmaktadır [6].
Keneler C. burnetii’nin doğadaki vektörüdür. Keneler etkeni sadece dışkılarıyla veya ısırarak horizontal olarak bulaştırmazlar ayni zamanda transstadial ve transovarial olarak da aktarabilirler. Kene dışkıları doğada C. burnetifnin muhtemelen en yoğun kaynağıdır. C. burnetifnin konak h a ^ n la r a bulaşması kenelerin ısırmasıyla ya da enfekte salgılarla temas aracılığıyla olmaktadır [19]. K ırdan fazla kene türünün C. burnetii ile infede olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle keneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak görülmektedir, ömeğin; Slovatya’nm farklı bölgelerinden toplanan Ixodes ricinus,
Dermacentor retlculatus, marginatus, Haemaplysalts concinna
ve Haemaphysalis inermis «filerinden 10 C. burnetii suşu izole edilmiştir [17].
C. burnetii çeşitli kene «filerinden izole edilebilmesine karşın, insanlarda
kene aracılığıyla enfeksiyon yaygm değildir. Çündi enfeksiyon kontamine aerosollarm inhalasyonundan, taze çiftlik ürünlerinin tüketiminden ve enfekte handanlarla temastan sonra oluşmaktadır. Enfeksiyon insanlarda akut ve don ik olmak «zere iki formda ortaya çıkar. A drt formda; pnömoni, ateş, granUlamatöz hepatitis ve nadiren meningoensefalitis görülmektedir. Kronik formda ise endokarditis oluşmaktadır. Farklı ülkelerden elde edilen veriler, hastalığın klinik [19]. Kenelerin bu etkenin çevrede canlılığını devam ettirmesinde önemli bir rol oynadığı görülmededir.
C. burnetii önceden bir riketsiyal etken olarak sınıflandırılmıştır. Daha sonra
16 S rRNA geninin molediler sekansına dayanarak proteobacteria kategorisinin
y altbolümüne yerleştirilmiştir. C. burnetii’nin Rickettsia’à n ziyade Legionella ve Francisella birleri ile daha yakm ilişkili olduğu görülmüştür [4, 6].
C. burnetii Idiçük pleomorfik çomakciklar şeklindedir ve zorunlu hücre İ Ç İ
parazitidir. Gram negatif bakterilerinkine biraz benzeyen membrana sahiptir. Etken bazı ayırıcı özelliklere sahiptir ve bu da patojenitelerine katkıda bulunur. Etken sporulasyona benzer bir süreç geçirir ve bu dış çevreden korunmasını ve dolayısıyla uzun süre canlı kalmasını sağlar. C. burnetii 4.5 pH’daki fagolizozomlar içerisinde bile canli kalabilir, çoğalabilir ve metabolizmalarım devam ettirebilir [4].
Memeli konakçılarda, C. burnetii makrofajlari infeltte eder ve konak hücresi olarak buralara yerleşir. Etken büyük vakuollerde (fagolizozom) çoğalır ve makrofajlar bu etkenleri oldüremezler. C. burnetii’nin çeşitli lipopolisakkarit presantasyonlarımn olduğu ve faz varyasyonları denilen antijenik varyasyon tiplerinin bulunduğu görülmektedir. Faz 1 antijen insan veya h a ^ n d a n izole edildiğinde etken tarafından ekspresse edilir. Bu formdaki etken enfeksiyözdür. Bir mikroorganizma bile insanların enfekte olması İçin yeterli olabilir. Etkenin hücrelerde veya embriyolu ^imurtada subldiltUrUnden sonra antijenik yapı faz 2 antijenine dönüşür [4].
En azmdan 20 farklı C. burnetii genotipi identifiye edilmiştir. Farklı suşlar arasında lipopolisakkarit kompozisyonunda değişiklik saptanabilir. Buna karşın, C. burnetifnin farklı suşları arasında fazla genetik farklılık bulunmaz. Etkenin genomu integre olmuş plazmid sekansı içerebilir. Dört farklı plazmid tipi tanımlanmıştır [4].
C. burnetifnin saptanmasına yönelik olarak uygulanan molekuler biyolojik
metotlarda keneler, taze dokular, dondurulmuş örnekler, parafinde saklanan klinik örnekler, formalinde fikze edilen dokular, serum örnekleri ve sütler materyal olaraklrnllanmaktadir [17].
Spyridaki ve ark. [18], C. burnetii ile enfeltte olduğundan şüphelenilen 3300 hastanın kan serumlarım indireltt immunofluoresan antikor tekniği ile etkenin faz II antijenlerine karşı antikorların varlığı açısından incelediklerinde, serumların 152’sini pozitif olarak tespit etmişlerdir. 17 hastadan aldıkları kan örneklerini patojenin izolasyonu İçin santrifugasyon shell vial telmiği ile IdiltUre ettiklerinde, 8 suş izole etmişlerdir. Bu suşlarm C. burnetii olduğunun doğrulamasını nested- PCR ile yapmışlardır. Çalışmalarının sonucunda C. burnetifnin Yunanistan’da endemik bir hastalık olduğunu ve enfeksiyonun teşhisinin nested-PCR ile hızlı bir şekilde yapılabildiğini bildirmişlerdir.
Masala ve ark. [13], Sardinya adasında bulunan 675 koyun ve 82 keçi çiftliğinden 9349 serumu ELISA ile ve 517 atik materyalini (422 fotus ve 95 plesanta) de PCR ile C. burnetii yönünden incelemişlerdir. Koyun çiftliklerinden 255’inde ve
keçi çiftliklerinden de 39’unda ELISA ile antikor saptarlarken, 40 ko^ın fötusu ve 3 keçi fötusunu PCR ile pozitifbulmuşlardır.
Koyunlarda C.burnetii enfeksiyonunun seroprevalansi Hollanda’da [9] % 3,5, Japonya’da [10] %28,1, Türkiye’de [3] % 10,5, Sudan’da [16] ise % 62,5 bulunmuştan
Kalender [12], Elazığ ve komşu illerden yavru atmış koyunlardan aldığı 184 serum örneğinin 71(%38,59)’ini ve yavru atmamış koyunlardan aldığı 227 serum örneğinin 25(% ll,01)’ini indirekt flouresan antikor testi ile C. burnetii pozitif bulmuştur. Elazığda %20, Malatya’da %20, Bingöl’de % 27,95 ve Muşta %27,27 oranında pozitiflik saptamıştır.
Psaroulaki ve ark. [15], nested-PCR ile 141 kenenin (100Rhicephalus sanguineus ve41 Hyalomma spp.) İ l ’ini C. burnetii yOnUndenpozitifbulmuşlardır.
Spitalska ve Kocianova [17], 1998-2000 yılları arasında Slovatya ve Macaristan’dan topladıkları235adetyetişkinkeneyiPCRileC. burnetiiyonünden
Ixodes ricinus, Dermacentor m^ı^^lnatus ve Haemaphysalls concinna türlerine ait 6 keneyi pozitifolarak saptamışlardır.
Spitalska ve Kocianova [17], C. burnetifnin com 1 geni İçin CBCOS (GCT GTT TCT GCC GAA CGT AT] ve CBCOE (AGA CAA CGC GGA GGT TTT TA] primerlerini kullanmışlardır. Com 1 geni, hem atait hem de kronik hastalık izolatlarmdan saptanan dış membran-ilişkili immunoreataif proteini kodlar. Araştırıcılar, taillandiklari primerlerin spesifik olduğunu çünkü birçok bataeriden elde ettikleri DNA’lan bu primerlerle reaksiyona soktaklarmda C.
burnetii dışında hiçbir amplifiye bant görmediklerini bildirmişlerdir.
Zhangveark. [21],OMPlveOMP2primersetinikullanarakPCRuygulamışlardır OMPl ve 0M P2 primerleri Nine Mile suşunun coml gen sekansından elde edilmiştir.
Spyridaki ve ark. [19], ezilmiş kenelerden C. burnetii’nin direkt saptanmasında nested PCR uygulamışlardır. Nested PCR’nin kenelerden patojenleri çabuk, sensitif ve spesifik olarak saptadığını bildirmişlerdir. Ayni zamanda, sahadan çok fazla mitaarda toplanan kenelerin alkolde veya formaldehitte fikzasyondan sonra ItaltUrUnUn mUmltan olmamasına karşın, PCR ile test edilme İmkanı bulunmataadir. Araştırıcılar, ilk PCR’da Hfragl/ Hfrag2 primerlerini ve ikinci PCR’da ise HF1/HF2 primerlerini kullanmışlardır. Kıbrıs izolatlarımn DNA amplifikasyonunu yapmak ve referans suşlar ile karşılaştırmak İçin CB1/CB2 genomik primerlerini kullanmışlardır.
Bernasconi ve ark. [2], keneye ait mitokondriyal 12S rDNA geninin 338 339 bp parçası İçin T2A (5’ AATGAGAGCGACGGGCGATGT 3’) ve TIB (5’ AAACTAGGATTAGATTAGATACCCT 3’jprimerlerini kullanmışlardır. Rickettsia’larm sitrat sentezini kodlayan genin(gltA) 380 bp parçasının
amplifikasyonu İçin Cs.Rp877p ve Cs.Rpl258n primerlerlerinden OmpA geninin 632 bp parçasının amplifikasyonu İçin ise Rr 190.70p ve Rrl90-701 primerlerinden yararlanmışlardır. C. burnetii’à 16S rDNA geninin 1484 bp parçasını amplifiye etmek İçin ise © 1 (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’) ve rp2 (5’ ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’) primerlerini Yıllanmışlardır, © 1 primerinde 441 bp Rickettsia ve 364 bp Coxiella içindir.
Zhang ve ark. [21], sığır, kene ve insanlardan izole edilen 10 suş ile 11 adet referens suşun com 1 gen sekans analizini yapmışlar ve buna göre com 1 geninin bütün suşlarda bulunduğunu; ancak, nfikleotidte bazı farklılığın olduğunu, amino asit sekanslarının deduce olduğunu ve 21 adet suşun 4 gruba ayrıldığını tespit etmişlerdir.
insanlarda Q hummasmm klinik tanısı semptomlarının spesifik olmaması nedeniyle son derece zordur. Bu nedenle tanısı esas olarak serolojik testlere dayanmaYadir. Serolojik tamda sik kullanılan testler; indireY immunfloresan tekniği, komplement fikzasyon, ELISA ve miYoaglutinasyon teknikleridir, immunfloresan tekniği Q ateşinin serolojik tanışında referans test olarak kabul edilmektedir [5]. Ancak, serolojik testler retrospeYif teşhise imkan verdiklerinden şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun ayrımı kesin olarak yapılamaz. Bunun yani Sira enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir [1]. AkgUn ve ark. [1], 2003 yılının Nisan-Ağustos ayları arasında c .ü . Araştırma Hastanesinde Q humması şüphesi ile gözlem altma alınmış hastaların kan ve serum örneklerinde C. burnetifnin saptanması İçin nested-PCR yöntemini kullanmışlardır. C. burnetifnin dış membran proteinini kodlayan com-1 genini amplifiye etmek İçin OMPl, 0MP2, 0MP3 ve 0M P4 primerlerinden yararlanmışlarve 80hastanm 15 (%18,75)’inde C. burnetii saptamışlardır. Esen ve ark. [5], 2002 yılı Mayis-Haziran arasında Karadeniz bölgesinde 5 ölüm olayının olduğu olası bir salgm tespit edildiğini, bu salgında 46 hastada görülen semptomların sıklık Sirasma göre; karin ağrısı, bulantı, Yisma, artralji/myalji, baş ağrısı, ateş, ishal ve dokuntti olarak tespit edildiğini, bu olguların 38’inin Tokat ilinden, 4’ünün Sivas, 3’ünün Yozgat ve birinin de Çorum ilinden çıYıgını bildirmişlerdir. Bu vakaların hemen «imünün kırsal alanda yaşadığına dikkat çekmişlerdir.
2. MATERYAL ve METOT
2 1 K e n e le rà iT o p la n a stv e S a k la n a st
Türkiye’nin 38 ilinden toplam 2472 (1446 dişi, 1021 erkek ve 5 nymph) kene toplandı, illerden toplanan keneler, içerisinde % 70’lik alkol bulunan şişelerde, tür ve cinsiyet tayinleri yapılıncaya kadar, +4٠C’de saklandı.
2 .2 K e n e le r à ilv e C im iy e tT a y in i
Stereo mikroskop Nikon-AFX) ile ttir ve cinsiyet tayinleri yapılan keneler, ayrı ayrı, içlerinde % 70’lik alkol [7] bulunan şişelerde + 4٠C’de muhafaza edildi.
2.3K enelennG m plandınlm ası
Keneler alkolün uzaklaştırılması İçin distile sudan geçirilerek [7] toplandığı illere, tür ve cinsiyetlerine göre 1-7 adedi bir araya getirilerek gruplandırıldı ve numaralandırıldı.
2.4K enelerinD N AE kstraksiyoiiçinH azirlcm m asi
Gruplandırılmış ve numaralandırılmış keneler alümin^mm folyo içerisine konularak SIVI azot içerisinde dondurulduktan sonra bir havan eli yardımıyla toz haline gelinceye kadar iyice ezildi.
2.5 KenelerdenDNA E kstra ksiy o l
Kenelerden total DNA ekstraksiyonu NucleoSpin Tissue kit (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Almanya) Gillanilarak gerçekleştirildi. Ezilmiş kenelerden ependorf tüplerine 50 mg kadar örnek aktarılarak, ekstraksiyon İçin kitte önerilen protokol izlendi. DNA ekstraklan çoğaltılmcaya kadar -20٠C’de saklandı.
2.6Pozltl؛ KoKtrolDNA
Coxiella burnetii Nine Mile RSA493 suşuna ait DNA, Institut für Hygiene und InfeGionsfa-anMieiten der Tiere de Justus-Tiebig-Universitat Giessen’den Gf. Direktör Prof. Dr. Dr. Habil G Baljer’den sağlandı. Kullanılan pozitif DNA % 0.9 tuzlu suda 3.3 X 10® konsantrasyonunda Gillanildi.
2.7 K iiU dlcm Prim erler
Hfragl : 5’-ATT GCTATC ACT GAG GGT GAC G-3’ Hfrag2 : 5’-CTG ACG AAG AAG CAG CAT TAG C-3’ HFl : 5 ’-TCCTA ^A CA A G TG A TG G TCTCC-3’ HF2 : 5 ’-TTCGCAGAAGTCAGCTATGC-3’ CBl : 5 ’-A C T C ^ C G C A C T G G A A C C G C -3 ’ CB2 : 5’-TAG CTG AAG CCAATT CGC C-3’ 28 SF : 5 ’-GACTCTA GTCTG ACTCTG TG-3’ 28 SR : 5’-GCC ACAAGC CAG TTATCC C-3’
2.8Negatt؛ Kottfrol
PCR reaksiyonunda Yıllanılan reagentlerin kontaminasyon kontrolü amacıyla, bir reagent kontrol tüpü Yıllanıldı. Bu fiipe DNA yerine ddH20 konuldu.
2 .9 P C R iç in U y g iP rim e rS e ç im i
Uygun primerin seçiminde pozitif ve negatif kontroller ile ilk tarda Hfragl ve Hfrag2 ve ikinci turda da HFl ve HF2 primer setleri Yıllanılarak nested -PCR denendi. Daha sonra ayni şekilde pozitifve negatifkontrol kullanılarak CBl ve CB2 primerleri denendi.
2.10PCR Arnpl٠
asyoHtt
PCR amplifikasyonu PTC-100 thermal cycler (MJ Research, Watertown, MA) ile yapildi. DNA amplifikasyonu 30 pi hacimde gerçekleştirildi. Her bir testte bir p o z i t i f i n e Mile RSA493) ve bir de negatifkontrol (distile su) kullanıldı. Her bir reaksiyon İçin;
MgCl (25 mM, Bioron) 2,4 pl 10X reaksiyon buffer (Bioron) 3,0 pl dNTPM ix(10mM ,Fermentas) 0,5pl Taq DNA polimeraz (5 ٧ /pl, Bioron) 0,25 pl CBl 0,5 pl CB2 0,5 pl DMSO (Fermentas) 1,8 pl ddH20 18,05 pl DNA 3 pl Yıllanıldı.
CBl ve CB2 primerleri kullanıldığında PCR provam ı aşağıdaki gibi uygulandı.
94.C 5d k
52 ؛c : }
50.C l d k 72.C lOdk
Nested-PCRde ise her iki hırda da aşağıdaki program uygulandı. 94.C 5d k
5؛؛c
ل
;
ت
}
72 ٠c 3 5 ^ ﻪ ﺛإ hır 50.C l d k
72.C lOdk
211 E kstra ksiy cm K itiK o n tro lü
Kullanılan kitin DNA ekstraksiyonunu sağlayıp sağlayamadığının kontrolü İçin ekstraltie edilen DNA ile kenenin 28S rRNA geninin saptanmasına yönelik olan 28SR ve 28SF primerleri [1 l]ile PCR yapıldı.
2 1 2 E lt^ k tı^ ^ o ıt^ z ١^eG 0ıttK tttlem e
PCR ürünleri Ethidium bromide ile boyalı % 1,5’luk agaroz jelde (Ambresco) yürütiddü. EleGroforez tamponu olarak 0,5X TAE (Fermentas) kullanıldı. DNA bantlarının görüntülenmesi ise görüntüleme cihazında (Vilbert Loumart) gerçekleştirildi.
2.13 RestricticmFragmentLengthPolFiorphism(RFLP)
PCR ürünlerinin spesifisitesi PCR ürünlerinin restriksiyon analizi ile değerlendirildi. PCR ürünleri Taql enzimi (Fermentas) ile kesildi. Restriksiyon fragmentleri % 3,5 agaroz jelde elektroforez ile incelendi. Omekler Coxiella
burnetii Nine Mile RSA493 suşuna ait fragmentlerle karşılaştırıldı.
3. BULGULAR
1. ة K e n e le r à ilv e C tm ty e tT a y im S o iç la n
Toplanan kenelerin illere göre ttir ve cinsiyet dağılımları tabİ0- l ’de verilmiştir.
Tablo 1. Toplanan kenelerin illere göre tür ve cinsiyet dağılımları.
C o ğ r a fi B ö lg e v e i ll e r D iş i E r k e k M A R M A R A B Ö L G E S İ E d ir n e (1 2 5 ) R h ip icep b a la s t w a n i d 9 9 R h ip icep b a la s sa n g a in ea s 5 1 R h ip icep b a la s baissa 61 36 H v a l o m . a n a t o l i c n abatolicarn 1 3 T e k ir d a ğ (6 9 ) R. taranicas 4 24 R. b ııis a 2 2 16 H a .a n a t o l i c a i 1 1 H a l o m m a a i a t o l i c i i e x c a ^ a t i i 1 B u r s a (1 8 ) R. b ııis a 16 2 Ç a n a k k a le (1 0 4 ) R. taranicas 34 32 R. sa n ^ a in ^ a s 12 26 B a lık e s ir (1 0 7 ) R. taranicas 33 19 R. sa n ^ a in ^ a s 12 10 R. b ııis a 12 17 H a .a n a to lica rn 2 2 E G E B O L G E S I I z m ir (1 0 2 ) R. taranicas 9 21 R. b ııis a 17 10 H a .a n a to lica rn 9 23 H. a. excavatarn 2 11 A f y o n (1 9 ) R. b ııisa 9 1
H^١^alc^w^n^a d e tr ita m d e trita m 1 2
C o ğ r a fi B ö lg e v e i ll e r D iş i E r k e k D e n iz li (5 6 ) cus ؛^ R. t w ^ n 4 1 R. sa n g u in eu s 5 6 R. Alırsa 24 10 M u ğ la (9 9 ) cus ؛^ R. t w ^ n 3 1 R. sa n g u in eu s 6 6 R. Alırsa 3 5 H a .a n a to lic u m 6 11 H. a. exca va tu m 8 24 H. d .d e tr itu m 21 5 K ü t a h y a (5 0 ) R. tui^^utcus 2 3 R. Itır s a 25 14 H a .a n a to lic u m 1 H d .d e tr itu m 1 l^t^c^c^t^sric^i^r^ı^s 1 1 Ix o d e s h e x a g o n u s 2 U ş a k (3 7 ) R. b ursa 19 1 H . a. exca va tu m 1 H . d, d etritum 1 H y a lo m m a m a rg in a tu m m arainatum. 1 -I. ricin u s 1 B o o p b ilu s a n n u la tu s 1 M a n is a (5 7 ) R. tut^^uicus 3 8 R. b^t^sa 24 8 H a .a n a to lic u m 2 1 I. ١^i^c^i^v^t^s 8 D e rm a c e n to r n iveus 3 A K D E N İ Z B Ö L G E S İ A n t a ly a (9 3 ) R. b^t^sa 55 32 H a .a n a to lic u m 1 N y m p h (R b ip ic e p h a lu s) 5 adet A d a n a (4 2 ) R. turanicus 5 3 R. b^t^sa 27 3 H a .a n a to lic u m 3 1 B u r d u r (4 3 ) R. b^t^sa 2 9 14 9
C o ğ r a fi B ö lg e v e i ll e r D iş i E r k e k H a ta y (7 0 ) R. b w s a 5 H a .a n a to lic u m 2 1 H. a. exca va tu m 14 2 H d . d e t r i t n 32 3 H. m. rnaı^g^aaturn 10 1 K a h r a m a n m a r a ş (1 6 ) H a . ^١ıatoli^ı، m 3 3 H. a. exca va tu m 1 5 H d .d e tr itu m 4 İ ç A N A D O L U B Ö L G E S t A n k a r a (1 6 0 ) R. tui^^nlcus 4 6 ﺓ٦ R. sa n g u in eu s 12 21 R. Itır s a 9 2 H. a. exca va tu m 2 D. n iveus 1 E s k iş e h ir (4 7 ) R. tut^^ulcus 10 11 R. sa n g u in eu s 2 R. Itır s a 1 1 H. m. 2 I. ricinus 14 1 ^ a e m a p ^ y s a lis su lc a ta 1 H a e m a p h y sa lis p u n c ta ta 2 B. an n u la tu s 1 D e rm a c e n to r m ^î^^inatus 1 S iv a s (2 2 ) R. tut^^nlcus 5 R. s^ n ^u ^ n ^u s 9 1 R. Itır s a 3 3 D. m arginatus 1 K o n y a (5 2 ) R. tut^^nlcus 17 5 R. s^ n ^u ^ n ^u s 11 8 R. Itır s a 2 2 H d .d e tr itu m 1 H su lca ta 1 I. ricinus 2 I. hexa g o n u s 1 D. n iveus 1 B. an n u la tu s 1 10
C o ğ r a fi B ö lg e v e i ll e r D iş i E r k e k Ç a n k ır ı (5 1 ) R. turanlcus 8 3 R. san^wln^w s 8 6 R. Alırsa 1 H. m. m arginatum 2 5 D. n iveus 5 3 D. m arginatus 2 3 B . n l a t u s 5 Y o z g a t (2 8 ) R. Alırsa 16 12 N iğ d e (2 1 7 ) R. tui^^nicus 11 1 R. sa n ^ u in ^ u s 1 2 R. Alırsa 152 4 4 K A R A D E N İ Z B Ö L G E S t K a s t a m o n u (5 4 ) R. tui^^nicus 12 13 R. sa n ^ u in ^ u s 6 4 R. Alırsa 1 H. a. exca va tu m 1 H d .d e tr itu m 11 S a m s u n (3 6 ) R. Itır s a 17 19 O r d u (1 7 ) R. turanicus 6 R. Itır s a 10 1 G ir e s u n (2 6 ) R. Itır s a 11 10 H. a. exca va tu m 3 H d .d e tr itu m 2 A m a s y a (8 3 ) H a .a n a to lic u m 6 32 H. a. exca va tu m 1 3 H d .d e tr itu m 4 25 H m. m arginatum 1 2 H su lca ta 4 1 H p u n c ta ta 1 1 D. n iveus 2 B o lu (2 5 ) D. n iveus 8 11 D. m arginatus 2 4 Ç o r u m (4 0 ) 11
C o ğ r a fi B ö lg e v e i ll e r D iş i E r k e k R. sa n g u in eu s 2 3 R. Alırsa 2 H a .a n a t o l i c u i 4 6 H. a. exca va tu m 5 6 H d .d e tr itu m 10 2 D O Ğ U ^ A D O L U B Ö L G E S İ M a la t y a (8 6 ) R. sa n g u in eu s 1 2 R. ^ı^rsa 58 17 H d .d e tr itu m 1 2 H. m. m arginatum 1 4 E r z u r u m (3 8 ) R. tui^^nicus 5 5 R. Itır s a 5 4 H a .a n a to lic u m 1 5 H. a. exca va tu m 5 3 H d .d e tr itu m 3 2 İ ğ d ır (4 4 ) H. a. exca va tu m 6 H d .d e tr itu m 3 1 I. ricin u s 2 H su lca ta 4 H p u n c ta ta 12 8 D. n iveus 2 G Ü N E Y D O Ğ U A N A D O L U B O E G E S t G aziaU tC p (2 2 ) R. Itır s a 2 0 2 Ş a n l ı u r f a ( 1 8 4 ) R. turanicus 68 34 R. s^ n ^u ^ n ^u s 23 2 2 R. b^t^sa 2 0 15 H a .a n a to lic u m 2 D iy a r b a k ır (1 1 6 ) R. turanicus 25 17 R. s^ n ^u ^ n ^u s 18 37 R. b^t^sa 13 6 M a r d in (1 7 ) R. tut^^nicus 5 5 R. Itır s a 5 2 12
Tablo 2. Türkiye’nin 38 ilinden toplanan toplam 2472 kenenin ttir ve cinsiyet dağılımları T ü r T o p la m (% ) D iş i E r k e k R. turauicus 6 1 2 ( 2 4 ,8 ) 3 2 4 2 8 8 R. 2 9 4 (1 1 ,9 ) 137 157 R. Alırsa 1021 (4 1 ,3 ) 7 0 0 321 H. a .a n a to lic u m 1 3 3 ( 5 ,4 ) 40 93 H. a. exca va tu m 1 0 4 ( 4 ,2 ) 38 66 H, d .d e tr itu m 143 (5 ,8 ) 92 51 Tl، , rn. m arginatum 2 9 ( 1 ,2 ) 17 12 D. niveu s 3 6 ( 1 ,5 ) 22 14 D. m arg in a tu s 1 3 ( 0 ,5 ) 6 1 H. su lca ta 1 1 ( 0 ,4 ) 10 1 H. p u n c ta ta 2 4 (0 ,9 ) 15 9 1. tic in u s 3 6 ( 1 ,5 ) 34 2 l.h e x a g o n u s 3 ( 0 ,1 ) 3 B .a n n itla tu s 8 ( 0 ,3 ) 8 N ym ph 5 ( 0 ,2 )
3 .2 E k s tr a k s iy o n K itiK o n tr o lS o ia i
Kullanılan kitin DNA ekstraksiyonunu sağlayıp sağlayamadığının kontrolü İçin ekstrakte edilen DNA ile kenenin 28S rRNA geninin saptanmasına yönelik olan 28SR ve 28SF primerleri ile PCR yapıldı. 449 bp’lik bir PCR ürününün görülmesi kenenin 28S rRNA geninin PCR ile saptandığını ve dolayisi ile bu genin ekstralfle edilebildiğini ortaya koydu.
3.3PCRStandardizasyonBulgulan
PCR’nin Hfragl ve Hfrag2 primerleriile yapılan ilk turunda vermesi gereken 508 bp’lik bant net olarak gOrUntiilenirken, HFl ve HF2 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen 2. turunda vermesi gereken 183 bp’lik bant çok silik olarak gOrUntUlenmiştir. Bu primerler kullanıldığında saha örneklerinde bulunması muhtemel olan Coxiella burnetii DNA’simn tespit edilemeyeceği ve yanlış negatiflik çıkabileceği düşünülerek PCR çalışmasında daha kuvvetli bantların elde edildiği CBl ve CB2 primerlerinin kullanılmasına karar verilmiştir.
3.4PCRBıılgıdan
Denizliden toplam 56 kene toplanmış olup, bu keneler tür ve cinsiyetlerine göre 13 gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6’sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur.
Ankara’dan toplanan toplam 160 kene ise ayni şekilde 53 gruba ayrılmış ve bu gruplardan birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır. PCR çalışmaları pozitif ve negatif kontrollerle birlikte yürütülmüş olup, pozitiflik durumunda 257 bp’lik bir PCR ürünü elde edilmiştir.
Resim 1. Pozitif PCR ürünlerinin görünttileri. 50M: 50’lik marker; P: Coxiella burnetii Nine Mile RSA493 suşu; N: Negatif kontiol; 302-307: Denizli pozitif örnekler; 516: Ankara pozitif örnek;
lOOM: 100’lükmarker.
3.5 P C R ile C .b w n e tiiP o z itp u lim a n K e n e G m p la n n in T iln e
C iR siyetD a g ilim la p i
PCR ile C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları tab!o-3’de verilmiştir.
Tablo 3. PCR ile C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları. 1ı T ü r C in s iy e t G r u p t a k i k e n e s a y ıs ı D e n iz li G u p n o . 3 0 2 R . bursa d işi 5 G u p n o . 3 0 3 R . bursa d işi 5 G u p n o . 3 0 4 R . bursa d işi 5 G u p n o . 3 0 5 R . bursa d işi 4 G u p n o . 3 0 6 R . bursa erk ek 5 G u p n o . 3 0 7 R . Uiranicus erk ek 2 A n k a r a G u p n o . 5 1 6 H . a. excavaU im erk ek 1
3.6RestrictioriFragmeritLerigthPolFtorphism(RFLP)Biilgiilan
PCR ürünlerinin spesifisitesi PCR ürünlerinin restriksiyon analizi ile değerlendirildi. PozitifPCR ürünleri Taql enzimi ile kesildiğinde, 118 ve 57 bp’lik bantlar net olarak görülürken, 39 ve 43 bp’lik bantlar birbirine yakm olmaları nedeniyle Resim-2’de görüldüğü gibi kaim bir bant olarak görülmededir ve bu iki bantm ayrı görünttilenebilmesi İçin özel agarozlara ihtiyaç d u rm ak tad ır. Bantlar pozitifve negatifkontrollerle kıyaslanarak değerlendirildi.
N M2 M3 04 ت MS 3٥fl 3.7 SIS 100M
_ _ _ _ _ _
Resim 2. 257’lik pozitif PCR ürünlerinin restriksiyon profil analizi. 50 M: 50’likmarker; P: Coxiella burnetii Nine Mile RSA493 suşu; N: Negatif kontrol; 302-307: Denizli pozitif örnekler; 516: Ankarapozitifdrnek; lOOM: 100’lükmarker.
4. TARTIŞMA ve SONUÇ
Q fever büüin co^afik ve iklim zonlarmda ortaya çıkabilen bir zoonozdur. 1955de, Q hummasi’nm beş kıtada 51 ülkede görüldüğü bildirilmiş, 1999da hastalık 8 ülkede daha rapor edilmiştir, üstelik, seroepidemiyolojik veriler başka ülkelerde de Q humması’mn varlığına İşaret etmededir.
C. burnetii keneleri bütün yaşamları bo^mca canlılıklarım, çok yüksek titrelerde
sürdürebilmededir ve yeni nesillere transovariyal olarak adarilabilmektedir. Enzootik siklusta rodentler gibi keneler ve vertabralilar önemli komponentlerdir. Her bir kene türü, Q humması yönünden endemik bir bölgede duyarlı bir konakçıya yapışabilir ve C. burnetii,yi yayabilir. Kenelerin çevrede bu hastalığın yayılmasında merkezi bir rol oynadığı görülmektedir. Doğada
C. burnetii evcil hayvanlara kene ısırmasıyla ya da enfede kene salgılarıyla
temas aracılığıyla bulaşabilmektedir. Kene dışkıları da C. burnetii’nin en yoğun muhtemel kaynağıdır. Kırktan fazla kene üirünün C. burnetii ile enfede olduğu tespit edildiğinden dolayı keneler doğada enfeksiyonun indikatörü olarak görülmektedir.
C. burnetii’nin tanısı esas olarak serolojik testlere dayanmaktadır. Serolojik
tamda sik kullanılan testler; indirekt immunfloresan tekniği, komplement fikzasyon, ELISA ve midoaglutinasyon teknikleridir, immunfloresan tekniği Q hummasmm serolojik tanışında referans test olarak kabul edilmektedir [5]. Ancak, serolojik testler retrospedif teşhise imkan verdiklerinden şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun ayrımını kesin olarak yapamaz. Bunun yani Sira enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir [1].
C. burnetii izolasyonlarının tehlikeli, zaman alıcı ve güç olması ve ayrıca
midoorganizmanm zoonotik özelliğine bağlı olarak çalışmalar İçin biyogüvenlik 3 düzeyi laboratuarları geredirmesi etken izolasyonlarında sıkıntı yaratmaktadır [13].Aynca, C. burnetii’nindiğerbirçokbakterininaksinekültürlerininembriyolu yumurta ve doku diltüründe yapılması da teşhiste moleküler yöntemleri cazip klimadadır.
Son dönemlerde PCR yöntemi bir çok örnekte hastalık etkenlerinin saptanması İçin oldukça kullanışlı bir yöntem olarak benimsenmiştir. PCR yöntemi, çok az midardaki örneklerde dahi hedef DNA sekanslarının ortaya Çikanlabilmesini
sağladığından insan ve hayvan orijinli bir çok materyalden C. burnetii enfeksiyonlarının laboratuvar teşhisinde oldukça güvenli ve dıllanışlı bir metot olarak karşımıza çıkmağadır. Ayrıca, PCR yöntemi, sahadan toplanan alkol ve formaldehitte fikze edilen çok sayıda ömeğin de test edilmesine imkan sağlamadadır.
Spitalska ve Kocianova [17], kenelerden PCR ile C. burnetii saptanmasına yönelik çalışmalarında, pozitifliği en yüksek D. marginatus kenelerinde
M u t Y a t k t t k i I. rlclnus, bl^c^؛^m^c^f^f^)^؛^al:^s ^ner^mls, Haemaph^^s^lls conclnna
türlerinin izlediğini; Dermacentor reticulatus ve H. punctata türlerinde ise hiç pozitiflik saptamadıklarım bildirmişlerdir.
Bu çalışmada görüldüğü üzere sahadan toplanan kenelerin % 41,3’ünü R. bursa, % 24,8’ini R. turanicus ve % 11,9’unu R. sanguineus oluşturmaktadır. Spitalska ve Kocianova [17]’mn C. burnetii pozitifliği saptadıkları kene türlerinden D.
marginatus çalışmamızda % 0,5 oranında ve I. ricinus ise % 1,5 oranında tespit
edilmiştir ve bu kenelerde Spitalska ve Kocianova [17]’nm aksine C. burnetii saptanmamıştn.Bukenelerinsa
C. burnetii taşıma olasılığı da doğal olarak düşmektedir. Bu çalışmada sahada %
0,9 oranında bulunan H. punctata kene türünde Spitalska ve Kocianova [17]’nm bulgularına benzer şekilde C. burnetii tespit edilememiştir.
Bernasconi ve ark. [2], Güney İsviçre’de R. sanguineus ve R. turanicus varlığını ortaya koymuşlar ve test ettikleri 48 keneden 3 adet R. sanguineus ve 5 adet
R. turanicus kenesinde Coxiella saptamışlardır. Bu çalışmada da sahadan R.
bursa’dan sonra en fazla R. turanicus ve R. sanguineus tespit edilmiştir. Ayni şekilde kenelerde C. burnetii pozitifliği R. bursa’dan sonra R. turanicus 'da bulunmuşttrr. Psaroulaki ve ark. [15], topladıkları 141 kenenin % 7,8’ini PCR ile
C. burnetii yönünden pozitif bulmuşlardır. Pozitif kenelerin ayni bu çalışmada
olduğu gibi Rhipicephalus ve Hyalomma genusuna ait olduklarım bildirmişledir. Bu çalışmada ise toplanan 2472 kenenin PCR ile incelemesi sonucunda bir pozitiflik oram verilmesi İmkânsızdır. Kenelerin tek tek incelenmemesi, 1-7 adedinin toplandıkları il, ttir ve cinsiyetlerine göre bir araya getirilerek gruplandirilmasi ve bu ^"uplarin DNA ekstraksiyonlari yapılarak PCR ile incelenmesi nedeniyle ancak grup bazmda pozitiflik verilebilmeğedir.
Bu çalışmada kenelerin cinsiyeti ile C. burnetii pozitifliği arasında bir İlişki olmadığı görülmüştür. C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının yaklaşık yarısının dişi kene grubu yarısının da erkek kene grubu olması bu şekilde düşünülmesine neden olmuşttrr, bu konu ile ilgili literatür verilerine de rastlanmamıştır.
C. burnetifnin isocitrate dehydrogenase geni [14], süperoksit dismutase geni
[20] ve kromozomal transpozon-benzeri sekanslar [8] PCR targetleri olarak kullanılmadadır ve C. burnetii suşlarmm identifikasyonunda yararlı olduğu
bulunmuşta". Masala ve ark. [13], koyun ve keçi yavru atıklarında C. b u rn e tiV â etkisini araştırdıkları çalışmalarında, C. burnetii DNA’sının varlığını saptamak İçin süperoksit dismutase genini hedefleyen PCR Villanmışlar ve bu amaç İçin de CBl ve CB2 primerlerinden yararlanmışlardır. Bu çalışmada da kenelerden C. burnetii DNA’sının saptanmasında süperoksit dismutase geninin saptanmasına
yönelik CBl ve CB2 primerleri kullanılmıştır.
Bu çalışmada öncelikle Hfragl ve Hfrag2 ve ikinci turda da HFl ve HF2 primerlerinin Vıllanıldığı nested-PCR yapılması planlanmıştır. Ancak, yapılan standardizasyon çalışmalarında ilk ta d a elde edilmesi gereken 508 bp’lik bant net olarak elde edilirken, ikinci ta d a elde edilmesi gereken 183 bp’likbant çok silik olarak görülmüş ve saha örneklerinde bulunması olası olan C. burnetii DNA’sının tespit edilemeyeceği anlaşılmıştır. Dolayısıyla, yalancı negatiflik durumu göz önünde bulundurularak, bu primerler ile kullanılarak yapılması planlanan nested-PCR’den vazgeçilmiştir. Spyridaki ve ark. [18], insanlardan aldıkları kan örneklerinden QIAmp blood kit Villanarak genomik DNA ekstraksiyonu yapmışlardır. Nested-PCR’de ise plasmidik DNA’yı hedefleyen Hfragl-Hfrag2 ile HF1-HF2 primerlerini kullanmışlardır. Bu şekilde nested-PCR ile C. burnetii enfeksiyonlarının çabuk ve başarılı olarak tespit edilebileceğini bildirmişlerdir. Benzer şekilde çalışmamızda genomik DNA ekstraksiyonuna yönelik NucleoSpin Tissue kit kullanılmış ve PCR sırasında başarılı olduğu belirtilen plasmidik Hfragl-Hfrag2 ile HF1-HF2 primerleri denenmiştir. Literatade belirtilen bulguların aksine başarılı sonuç elde edilememiş ve yine ayni literatürde verilen genomik primerler Vdlanılmıştır. Bu değişiklik ile istenilen bantlar, pozitif DNA örneğine paralel şekilde elde edilmiştir. Sonuç olarak, genomik DNA ekstraksiyonu yapıldığı zaman Villandan primerlerin de genomik DNA’yı hedeflemesi gerektiği ortaya çıkmıştır.
Nine Mile referens suşu ABD’de kenelerden izole edilmiştir. Fransa’da [20] ve Yunanistan’da [18] Q humması hastalarından izole edilen C. burnetii suşlarmm da Nine Mile ile ayni profile sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada da pozitif bulunan 7 ömeğin profilinin C. burnetii Nine Mile ile ayni profile sahip olduğu restriksiyon analizi sonucunda ortaya konmuştur.
PCR-RFLP analizinin kenelerden C. burnetii saptanması, izolasyonu ve identifikasyonu çalışmalarında faydalı olduğu belirtilmiştir [17, 18, 19]. Bulgularımız bu görüşü destekler nitelikte olmuştur.
5. KAYNAKLAR
1. Akgün, E., Yılmaz, M., Pınarbaşı, E.: Q-fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan OrneklerindeNested-PCR Yöntemiyle Coxiella burnetii’mn Saptanması, c .ü . Tip Faldiltesi Dergisi, 28(2): 50-54, (2006).
2. Bernasconi, M.V., Casati, s., Peter, 0., Piffaretti, J.C.: Rhipicephalus Ticks Infected with Rickettsia and Coxiella in Southern Switzerland (Canton Ticino). Infection, Genetics andEvolution, 2(2):111-120, (2002).
3. Çetinkaya, B., Kalender, H., Ertaş, H.B., Muz, A., Arslan, N., Öngör, H., GUrcay, M.: Seroprevalence of Coxiellosis in Cattle, Sheep and People in the East ofthe Turkey. Vet. Rec., 146: 131-136, (2000).
4. Choi, E.: Tularemi and Q Fever. Medical Clinics of North America, 86(2): 393-416, (2002).
5. Esen, B., GOzalan, A., Akin, T.,Noyan, N., Bu^mrgan, V.: Bir Salgın İhbarının Epidemiyolojik Araştırması. Aylik Epidemiyoloji Raporu, Cilt 1, Sayi 6,
(2002).
6. Fournier, P.E., Marrie, T.J., Raoult, D.: Diagnosis of Q Fever, j. Clin.
Microbiol., 36(7): 1823-1834, (1998).
7. Higgins,J.A.,Azad,A.F.:UseofPolymeraseChainReactiontoDetectBacteria in Arthropods: aReview. j. Med. Entomol., 32(3): 213-222, (1995).
8. Houver, A.T., Vodkin, M.H., Williams, J.C.: A Coxiella burnetii Repeated DNA Element Resembling a Bacterial Insertion Sequence, j. bacteriol., 174: 5540-5548,(1992).
9. Houwers, D.J., Richardus, J.H.: Infections with Coxiella burnetii in Man and Animals in the Netherlands. Zentr. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. A, 267:30-36, (1987).
10. Htwe K.K., Amano, K., Sugiyama, Y., Yagami, K., Minamota, N., Hashimoto, A.,Yamaguchi, T., Fukushi, H., Hirai, K.: Seroepidemiology of Coxiella
burnetii in Domestic and Companion Animals in Japan. Vet. Rec., 131: 490
11. Inolrnma, H., Yoshizaki, Y , Shimada, Y , Sakata, Y , Okuda, M., Onishi, T.: Epidemiological Survey of Babesia species in Japan Performed with Specimens from Ticks Collected from Dogs and Detection ofNew Babesia DNA Closely Related to Babesia odocoilei and Babesia divergens DNA. j. Clin. Microbiol., 41(8): 3494-3498, (2003).
12. Kalender, H.: Elazığ ve Komşu illerde Koyunlarda Coxiella burnetii Enfeksiyonunun Yaygınlığı. Turk. j. Vet. Anim. Sci., 25: 51-55, (2001). 13. Masala, G., Porcu, R., Sana, G., Chessa, G., Cillara, G., Chisu, V., Tola,
S.: Occurence, Distrubition, and Role in Abortion of Coxiella burnetii in Sheep and Goats in Sardinia, Italy. Vet. Microbiol., 99: 301-302, (2004). 14. Nguyen, S.V., Hirai, K.: Differentiation of Coxiella burnetii Isolates
by Sequence Determination and PCR-Restriction Fra^nent Length Polymorphism Analysis of Isocitrate Dehydrogenase Gene. FEMS Microbiol. Lett., 180: 249-254, (1999).
15. Psaroulaki, A., Hadjichristodoulou, c., Loukaides, F., Soteriades, E., Konstantinidis, A., Papastergiou, p., Ioannidou, M .c, Tselentis, Y.. Epidemiological study of Q fever in Humans, Ruminant Animals, and Ticks in Cyprus Using a Geographical Information System. Eur. j. Microbiol. Infect. Dis., 25: 576-586, (2006).
16. Reinthaler, F.F., Mascher, F., Sixl, w., Arbesser, C.H.: Incidence of Q Fever Among Cattle, Sheep and Goats in the Upper Nile Province in Southern Sudan. Vet. Rec., 122: 137, (1988).
17. Spitalska, E., Kocianova, E.: Detection of Coxiella burnetii in Ticks Collected in Slovakia and Hungary. European Journalof Epidemiology, 18: 263-266,(2003).
18. Spyridaki, I., Gikas, A., Kofteridis, D., Psauroulaki, A., Tselentis, Y.: Q fever in the Greek Island of Crete: Detection, Isolation and Molecular Identification ofEight Strains of Coxiella burnetii from Clinical Samples, j. Clin. Microbiology. 36(7): 2063-2067, (1998).
19. Spyridaki, ل., Psaroulaki, A., Loukaides, F., Antoniou,M.,Hadjichristod olou,C., Tselentis,Y.: Isolation of Coxiella Burnetii by a Centrifugation Shell-Vial Assay from Ticks Collected in Cyprus: Detection by Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) and by PCRRestriction Fra^nent Length Polymorphism Analyses. Am. j. Trop. Hyg., 66(1): 86-90, (2002). 20. Stein, A., Raoult, D.: Detection of Coxiella burnetii by DNA Amplification
Using Polymerase Chain Reaction, j. Clin. Microbiol., 30: 2462-2466, (1992).
21. Zhang, G.Q., To, H., Yamaguchi, T., Fukushi, H., Hirai, K.: Differentiation of Coxiella burnetii by Sequence Analysis of the Gene (com 1) Enconding a 27-kDa Outer Membrane Protein. Microbiol. Immunol., 41(11): 871-877, (1997).
TAEK Y A Y ^ b i l g i f o r m u
Rapor Bilgileri
I. Yayın Yılı/No 2010/3 2. Rapor Başlığı
Coxiella burnetifmnKenelerden Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve PCR- RFLP ile Saptanması
3.YayınKurulu Tarih (Gün/Ay/Yıl)-No 25 03 2009-1-1
4. Yazarlar
Dr. Gülay ALTAY, Doç. Dr. Zişan EMRE, Dr. Seyit CAOTOLAT, Dr. Ali
DUZGTO, Yusuf VATANSEVER, Hülya MERT
5. Yayın Türü Teknik Rapor 6. Çalışmayı Yapan Birim
TAEK, SANAEM Uygulama Bölümü Hayvancılık Birimi
7. Destekleyen veya Ortak Çalışılan Kuruluşlar TAEK, TÆÎTAK
8. Özet
Coxiella burnetii,Q humması hastalığının etiyolojik etkeni olup, obligat intraselüler
bir bakteridir. Doğada yaygın olarak bulunur ve çeşitli hayvanlarda (sığır, koyun,
keçi) ve insanlarda Q-humması enfeksiyonunu oluşturur. C. burnetiisütlerden,
kenelerden ve akut veya kronik Q humması ile enfekte insanlardan izole edilmiştir.
Keneler, C. burnetifmnrezervuarı ve birincil vektörleridir. Kırktan fazla kene
türünün C. burnetiiile enfekte olduğu saptandığından keneler doğada enfeksiyonun
belirleyicisi olarak görülmektedirler.
Bu çalışmada, Türkiye’nin 38 ilinden toplam 2472 (1446 dişi, 1021 erkek, 5 nymph) adet kene toplandı. Bu keneler toplandığı ile, tiir ve cinsiyetine göre 1-7 adedi bir araya getirilerek gruplandırıldı. Gruplar DNA ekstraksiyonu sonrasında CB1 ve CB2
primerleri kullanılarak PCR ile C. burnetifmnvarlığı yönünde incelendi.
Denizliden toplam 56 kene toplanmış olup, bu keneler tiir ve cinsiyetlerine göre 13 gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6’sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur. Ankara’dan toplanan toplam 160 kene ise aynı şekilde 53 gruba ayrılmış ve bu gruplardan sadece birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır.
PCR ürünlerinin spesifisitesi restriksiyon analizi ile değerlendirildi. Pozitif PCR
ürünleri Taq1 enzimi ile kesildiğinde C. burnetiiNine Mile RSA493 suşunda
görüldüğü gibi yaklaşık 118, 57, 43 ve 39 bp’lik 4 bant ortaya konuldu. 9. Anahtar Kelimeler
Coxiella burneti, Kene, PCR
10. Gizlilik derecesi TasnifDışı
g i z l i l i kd e r e c e l e r i
T A S . DIŞI (UNCLASSIFIED): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli bilgi taşımayan, ancak
devlet hizmetiyle ilgili bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen en düşük gizlilik derecesidir.
hizmeteözel (restricted): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli konular dışında olan, ancak güvenlik işlemine ihtiyaç gösteren ve devlet hizmetine özel bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.
ÖZEL (COMfroENTiAL): İçerdiği konu itibarıyla, izinsiz olarak açıklandığı takdirde, milli
menfaatleri olumsuz yönde ekileyecek evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.
gizli(SECRET): İzinsiz açıklandığı takdirde, milli güvenliği, milli prestij ve menfaatleri ciddi ve önemli bir şekilde zedeleyecek olan evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.
