A N K A R A ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ M E C M U A S I Cilt 53, S a y ı l , 2000 1-4
HÜCRE KÜLTÜRÜNDE VE FARE PERİTONUNDA ÜRETİLEN TOXOPLASMA
GONDİİ
TROFOZOİTLERİNİN SABİN-FELDMAN TESTİNDE KULLANILMASI
Çiğdem Göngör* • Murat Özsan"
ÖZET
Bu çalışmada, Toxoplasma trofozoitleri Balb-c fare peritonunda ve hücre kültüründe çoğaltılmıştır. İki ayrı kaynakta çoğaltılan bu trofozoitlerle, anti-toxoplasma antikorları yönünden pozitif ve negatif olduğu bilinen hasta serumları Sabin-Feldman testiyle çalışılmış ve so-nuçlar birbiri ile uyumlu bulunmuştur. Bu nedenle, hücre kültürü laboratuvarı olan yerlerde Sabin-Feld-man Testi için kullanılacak Toxoplasma gondii' nin üretiminde hücre kültür yönteminin daha uygun olabi-leceği düşünülmüştür.
Anahtar kelimeler: Toxoplasma gondii, Sabin-Feldman testi, Hücre kültürü.
SUMMARY
Use Of Toxoplasma Gondii Tmphozortes Crovvn At Celi Culture And Mouse Pentoneal Cavhy in Sabin-Feldman Test İn this study, viable Toxoplasma trophozoites are grown in Balb-c mouse peritoneal cavity and celi cul-ture. Trophozoites from these two origins are studied by Sabin-Feldman test with anti-toxoplasma antibodies positive and negative sera and the results are found to be the same. Therefore, at the units where celi culture laboratory is available, celi culture method for the growth of Toxoplasma gondii for Sabin-Feldman test is thought to be more suitable.
Key vvords: Toxoplasma gondii, Sabin-Feldman test, Celi culture.
Toksoplasmosis, zorunlu hücre içi protozoon olan
Toxoplasma gondii'nin neden olduğu, insanların %15-85'ini infekte eden bir zoonozdur (1,2,3). Bu hastalık sağlıklı kişilerde genellikle herhangi bir belirti vermezken, immün yetmezlikli şahıslarda ve hamile-lerde ciddi tablolara yol açabilmekte, konjenital tok-soplasmosise sebep olabilmektedir (4,5). İnsanlarda toksoplasmosis bulaşı edinsel ve konjenital olmak üzere iki yolla ortaya çıkmaktadır. Edinsel bulaş, esas olarak kedi dışkısıyla dış ortama atılan ookistlerin oral yolla alınmasıyla veya doku kisti içeren etlerin çiğ ya da az pişmiş olarak yenmesiyle meydana gelmektedir (2,3,6).
Toksoplasmosis tanısında seroloji, histoloji, kültür ve PCR gibi çok çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Sa-bin ve Feldman tarafından 1948 yılında tanımlanan Sabin-Feldman testi, tüm dünyada referans test olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde, canlı toxop-lasma trofozoitleri kullanılarak, şüpheli serumda anti-toxoplasma antikorlarının varlığı araştırılmaktadır (7,8,9).
Bu çalışmada, hücre kültüründe ve fare peritonun-da üretilen toxoplasma trofozoitleri kullanılarak yapı-lan Sabin-Feldman test sonuçlarının karşılaştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Serumlar: Bu çalışmada Ankara Üniversitesi Tıp
Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalına toxoplasmosis şüp-hesiyle gönderilen ve ELISA ve Sabin-Feldman testle-riyle anti-toxoplasma antikoru pozitif bulunan 10 adet hasta serumu ile anti-toxoplasma antikoru negatif bu-lunan 10 adet hasta serumu kullanılmıştır.
Farelerden T.gondii trofozoitlerinin elde edilmesi:
Balb-c cinsi laboratuvar fareleri 2.5-5 X 105 olacak
şe-kilde hazırlanmış T. gondii trofozoitleri ile
intraperito-neal olarak infekte edilmiştir. Bu farelerden üç gün sonra periton sıvısı alınarak ikiye ayrılmıştır. Bu sıvının bir kısmı mikroskop alanında ortalama 40 trofozoit olacak şekilde sulandırılmış ve Sabin-Feldman testin-de kullanılmıştır. Diğer kısmına 200mg/ml sefotaksim, 150mg/ml gentamisin eklenerek 37°C'de 30 dakika
* Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Parazitoloji Bilim Dalı * Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
2 HÜCRE KÜLTÜRÜNDE VE FARE PERİTONUNDA ÜRETİLEN TOXOPLASMA GONDİİTROFOZOİTLERİNİN.
bekletildikten sonra 2500 rpm/dk'da 5 dakika santrifüj edilmiş ve sedimentteki trofozoitlerden hücre kültürü-ne ekim yapılmıştır (11).
Hücre kültürü ve T. gondii üretimi: Bu
araştırma-da Vero hiicre kültürü kullanılmıştır. Hücreler 75 cm2
kültür şişelerinde, %10 Fetal Calf Serum içeren Dul-becco's MEM içinde üretilmiştir. Monolayer hale ge-len flasklara 105 T. gondii trofozoiti eklendikten sonra
1 saat 37°C'de bekletilmiş ve bu süre sonunda sürdür-me besiyeri eklenen flasklar 37°C'lik C02'li etüve
ko-nulmuştur. Flasklar her gün kontrol edilerek hücrele-rin %80-90'ının parçalandığı görüldüğünde kültür sı-vısı alınmış, 2500 rpm/dk'da 5 dakika santrifüj edil-miş, sedimentteki trofozoitlerle Sabin-Feldman testi çalışılmıştır (11,12,13).
Sabin-Feldman testi: Bu çalışmada Lelong ve
Des-mont tarafından modifiye edilmiş Sabin-Feldman test yöntemi uygulanmıştır (8). Hücre kültüründen ve fare peritonundan elde edilen toxoplasma trofozoitleriyle pozitif ve negatif serumlar ayrı ayrı çalışılmıştır. Se-rumlar 1/4, 1/16, 1/64, 1/256, 1/1024 olacak şekilde sulandırılmıştır. Bir damla sulandırılmış hasta serumu üzerine, bir damla toxoplasma trofozoiti içeren sıvı ve iki damla aktivatör konulmuş. 37°C'deki su banyosun-da 30 banyosun-dakika inkübe edilmiş ve sonuçlar lam lamel arası preparat hazırlanarak faz kontrast mikroskopun-da incelenmiştir. Parlak ve kenarları belirgin görünen toxoplasmaları içeren preparat sulandırımları negatif, toxoplasmaların kararmış ve granüllii bir görünüm al-dığı preparat sulandırımları da pozitif olarak değerlen-dirilmiştir.
BULGULAR
Toxoplasma hücre kültürü: Günlük yapılan
mik-roskopik değerlendirmeler sonucunda, Vero hücre kültüründe toxoplasma inokülasyonunu izleyen 2. Günden itibaren hücrelerin içinde trofozoitler tespit edilmiştir (Şekil 1 ve 2). Toxoplasmaların çoğalmasına bağlı total hücre harabiyeti inokülasyonu izleyen 4. Günde saptanmıştır.
Sabin-Feldman testi: Her iki kaynaktan elde edilen
toxoplasma trofozoitleri ile anti-toxoplasma antikoru pozitif serumlarla ayrı ayrı yapılan Sabin-Feldman testlerinin sonuçları aynı fitrelerde pozitif görüntü ver-mişlerdir (Şekil 3). Anti-toxoplasma antikoru negatif serumlarda da her iki kaynaktan alınan toxoplasma trofozoitleri ile negatif görüntü elde edilmiştir (Şekil4).
TARTIŞMA
Toxoplasmosis'in teşhisinde çok çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Serolojik teknikler içinde 1948 yılın-dan itibaren kullanılmaya başlanan Sabin-Feldman testi referans laboratuvarlarda uygulanan bir yöntem olmuştur (14). Boya testinin 1952 yılında Lelong ve Desmont (10) tarafından modifiye şekli olan lizis testi, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalı laboratuvarında uzun yıllardır uygulanmaktadır. Sabin-Feldman testinde kullanılan canlı organizmalar fare peritonunda veya hücre kültüründe çoğaltılarak elde edilebilmektedir. Fareden fareye pasajlarla to-xoplasmaların canlılığının sürdürülmesi laboratuvarda sürekli bir hayvan ünitesinin bulundurulması zorunlu-luğuna ve çok fazla sayıda hayvan tüketilmesine ne-den olmaktadır. Bu da sadece toxoplasma teşhisi için
Şekil 1. Vero hücre kültüründe 2. Günde hücre içindeki Şekil 2. Vero hücre kültüründe 3. Günde hücre içindeki ve
Çiğdem Güngör, Murat Özsan 3
Şekil:!. Sabin-Feldman testinde anti-toxoplasma antikor pozitif Şekil 4. Sabin-Feldman testinde anti-toxoplasma antikor
ne-göriintü gatif görüntü
kullanılabilecek, pahalı olmasa da emek ve yer gerek-tiren bir durum ortaya koymaktadır. Çeşitli amaçlara yönelik olarak kullanılan hücre kültür laboratuvarı bu-lunan birimlerde, toxoplasma üretiminin hücre kültü-rüyle yapılmasının ek bir yiik getirmeyeceği açıktır.
Çalışmamızda fare peritonu ve Vero hücre kültürü olmak üzere, iki farklı kaynaktan elde edilen toxoplas-ma trofozoitleri, Sabin-Feldtoxoplas-man testinde kullanılmış-tır. Her iki kaynaktan alınan toxoplasmalarla, daha önceden anti-toxoplasma antikoru pozitif ve negatif olduğu bilinen hasta serumları ile yapılan
Sabin-Feld-man testi sonuçlan arasında bir fark olmadığı saptan-mıştır. Benzer şekilde, Akısıı ve Budak (15) tarafından yapılan bir çalışmada hücre kültüründe çoğaltılmış ve fare periton sıvısından elde edilmiş toxoplasma trofo-zoitleri ile hazırlanan IFAT ve ELİSA testleriyle uygula-nan hasta serumu çalışmalarının sonuçlan arasında bir fark olmadığı bildirilmiştir.
Sonuç olarak, hücre kültürü laboratuvarı olan yer-lerde, Sabin-Feldman testinde kullanılacak T. gondii trofozoitlerinin üretilmesinde, hücre kültür yönteminin kullanılmasının uygun olabileceğini düşünmekteyiz.
KAYNAKLAR
1. James GS, Sintchenko VC, Dickeson DJ ve ark. Comparison of celi cultııre, mouse inoculatıon and PCR for detecti-on of Toxoplasma gdetecti-ondii: Effects of storage cdetecti-onditidetecti-ons on sensitivity. J Clin Microbiol 1996; 43: 1572-5. 2. Frenkel JK. Toxoplasmosis. PediatrClin North Am 1985; 32:
917-32.
3. Gellin BG, Soave R. Coccidian infections in AİDS. Med Clin North Am 1992; 76: 205-33.
4. Candolfi E, Blay F, Ray D. A parasitologically proven case of Toxoplasma Pneumonia in an immııno-competent pregnant women.J Infect 1993; 26: 79-81.
5. Guay JM, Dubois D, Morrency MJ ve ark. Detection of pat-hogenic parasite Toxoplasma gondii by specific ampli-fication of ribosomal seqııences using copolymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1993; 31: 203-7. 6. Ahlfors K, Borjeson M, Huldt G ve ark. incidence of
Toxop-lasmosis in pregnant women inm the city of Malmö, Svveden. Scand I Infect Dis 1989; 21: 315-21.
7. Ades AE. Evaluating the sensitivity and predictive value of tests of recent infection: Toxoplasmosis in pregnancy. Epidemiol Infect 1991; 107: 527-35.
8. Barker KF, Holliman RE. Laboratory techniques in the inves-tigation of toxoplasmosis. Genitourin Med 1992; 68: 55-9.
9. Hail SM. Diagnosis of toxoplasmosis. British Med J 1984; 289: 270-1.
10. Altıntaş K. Toksoplazmosis tanısında uygulanan başlıca yöntemlerin kalitatif ve kantitatif değerleri. Mikrobiyol Bült 1974; 8: 1-8.
11.Griffiths B. Scaling up of animal celi cultures . İn: Fresh-ney Rl, ed. Animal Celi Culture: A Practical Aproach. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992: 47-93.
12. Chang CH, Stulberg C, Bollinger RO ve ark. İsolation of To-xoplasma gondii in tissue culture. J Pediatr 1972; 81: 790-1.
4 HÜCRE KÜLTÜRÜNDE VE FARE PERİTONUNDA ÜRETİLEN TOXOPLASMA GONDİİ TROFOZOİTLERİNİN.
13. Derouin F, Thulliez P, Candolfi E ve ark. Early prenatal di-agnosis of congenital toxoplasmosis using amniotic fluid samples and tissue cıılture. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988; 7: 423-5.
14. Sabin AB, Feldman HA. Dyes as microchemical indica-tors of a new immunity phenomenon affecting a
pro-tozoon parasite (Toxoplasma). Science 1948; 108: 660-4.
15. Akısu Ç, Budak S. invivo ve invitro olarak üretilen Toxop-lasma gondii antijenlerinin IFAT ve ELİSA yöntemi ile karşılaştırılması. 1. Ulusal Tropikal Hastalıklar Kongre-si, Van 15-20 haziran 1998. Kongre Kitapçığı: 306
