T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
KADIN HASTALIKLARI ve DOĞUM ANABİLİM DALI
TEKRARLAYAN ART BAŞARISIZLIĞI OLAN KADINLARDA
ENDOMETRİAL MİKROBİYOTA İLE REKTAL MİKROBİYOTANIN
KARŞILAŞTIRILMASI
TIPTA UZMANLIK TEZİ
Dr. Gizem GENCOSMAN
Tez Danışmanı
Prof Dr Erol TAVMERGEN
ÖNSÖZ
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı’nda almış olduğum eğitim boyunca bize destek olan Anabilim Dalı başkanımız Prof. Dr. İsmail Mete İtil’e ve asistanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan diğer tüm hocalarıma teşekkürlerimi borç bilir, sevgi ve saygılarımı sunarım.
Tez danışmanım olarak Prof. Dr. Erol Tavmergen’e teşekkür ederim.
Tez hazırlama sürecimde tezimle desteğini esirgemeyen Prof. Dr. Ege Tavmergen Göker’e, Uzm. Dr. Ferruh Acet’e, Uzm. Dr. Gülnaz Şahin’e ve tüm Ege Üniversitesi Rektörlüğü Aile Planlaması ve Kısırlık Araştırma Uygulama Merkezi ekibine teşekkürlerimi sunarım.
Ege Üniversitesi Tıbbi Biyoloji A.B.D’de görev yapmakta olan Doç.Dr.Vildan Çetintaş ve ekibine teşekkür ederim.
Asistanlık eğitimim boyunca gerek teorik gerek pratik gerekse sosyal becerilerimi geliştirmemde kendime örnek olarak aldığım Prof. Dr. Teksin Çırpan’a, Prof. Dr. Coşan Terek’e, Doç. Dr. Ahmet Mete Ergenoğlu’na, Doç. Dr. Ahmet Özgür Yeniel’e, Doç. Dr. Ali Akdemir’e, Yar. Öğr. Üyesi Nuri Yıldırım’a, Uzm. Dr. Fırat Ökmen’e, Uzm. Dr. Hüseyin Ekici’ye, Uzm. Dr. Çağdaş Şahin’e, Uzm. Dr. İsmet Hortu’ya çok teşekkür ederim. Zor zamanlarımda beni her zaman pozitif yönde motive eden yakın arkadaşım Uzm.Dr.Zeynep Fettullahoğlu başta olmak üzere tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Her şeyin ötesinde, beni her zaman seven ve destekleyen, arkamı dönüp baktığımda orada olacağını bildiğim ve onlara sahip olduğum için kendimi çok şanslı hissettiğim canım aileme her şeyden çok teşekkür ederim. İyi ki varsınız.
İÇİNDEKİLER
1. GİRİŞ………... 2. GENEL BİLGİLER……….. 2.1. İnfertilite ve Tekrarlayan ART başarısızlığı………... 2.1.1. Tanımı ve insidansı………... 2.1.2. Epidemiyoloji……… 2.1.3. Etiyoloji………. 2.2. Mikrobiyota………. 2.2.1. Tanımı………... 2.2.2. Üst Genital Sistem Mikrobiyotası………. 2.2.3. Rektal Mikrobiyota………... 2.2.4. Mikrobiyomun Teknik Değerlendirilmesi……… 3. AMAÇ……….. 4. MATERYAL VE METOD………... 5. İSTATİSTİKSEL ANALİZ……….. 6. BULGULAR………. 7. TARTIŞMA……….. 8. SONUÇ………. 9. KAYNAKLAR……….
1. GİRİŞ
In vitro fertilizasyon (IVF) ve bunu kapsayan tüm asiste reproduktif teknolojiler (ART), infertilitenin üstesinden gelmek ve müdahalenin doğrudan bir sonucu olarak bir gebelik üretmek için tasarlanmış bir prosedürü ifade eder. Genel olarak, yumurtalıklar ovulasyonu indükleyen ilaçların bir kombinasyonu ile uyarılır ve daha sonra bir veya daha fazla oosit yumurtalıktaki foliküllerden aspire edilir. Bunlar embriyoloji laboratuarında ("in vitro") fertilize olur. Bundan sonra bir veya daha fazla embriyo endometrial kaviteye transfer edilir. Bu adımlar, yaklaşık iki haftalık bir zaman diliminde gerçekleşir ve buna IVF döngüsü denir.
İki ve daha fazla kez ART tedavileriyle gebelik sağlanamayan durumlarda tekrarlayan ART başarısızlığından bahsetmek mümkündür. Eldeki veriler ışığında bugün tekrarlayan ART başarısızlığı: 40 yaş altı hastalarda dondurulmuş veya taze, en az üç siklusta (bazı kaynaklara göre iki) ve toplamda en az dört adet iyi kalite embriyo verilmesine rağmen gebelik kesesinin oluşmaması olarak tanımlanabilir (1). ART başarısızlığı, IVF’in basamaklarının herhangi bir proçesinden kaynaklanıyor olabilir (2).
Tekrarlayan ART başarısızlığı olan normal bir uterin kaviteye ve yeterli endometrial gelişmeye sahip kadınlar için embriyo kalitesi tipik olarak sınırlayıcı faktördür. Risk faktörleri arasında ileri maternal yaş, sigara içme alışkanlığı ve beden kitle indeksi (BMİ) sayılabilir (3). Tıp dünyasında birçok araştırmanın konusu olmuş ve yıllardır bilinmekte olan bu
faktörlerden bağımsız olarak, literatürde henüz yeni olan mikrobiyota kavramı, yapılan güncel çalışmalarla birlikte, tekrarlayan ART başarısızlıkları içerisinde araştırılmakta ve
implantasyonu etkileyen bir faktör olduğu savunulmaktadır (4) Mikrobiyota teriminden bahsedecek olursak, her organizma tarafından barındırılan mikroorganizmaların toplamı anlamına gelmektedir. Mikrobiyom ise bu mikroorganizmaların konak ile birlikte oluşturdukları genler ve ürünleri olarak tanımlanmaktadır (4).
Geçmişte uterin kavite her zaman steril bir bölge olarak kabul edilip buradaki mikrobiyal kolonizasyonlar patojenik bir proçes olarak değerlendirilmiştir; ancak 2007 yılında Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yürütülmeye başlanan “İnsan Mikrobiyom Projesi” ve bunun üzerine yapılan yeni çalışmalar ve güncel literatürle birlikte, bu görüş artık yanlış olarak kabul edilmektedir (5). DNA fingerprinting, microarray ve genom sekanslama gibi yeni araştırma teknikleri, genetik bilgilere dayanarak numunelerde bulunan bakteriyel toplulukları analiz ederek metagenomik çalışmasını güçlendirmiştir (6). Bu moleküler teknikler, her bakteri için benzersiz olan ve bir cins bakteri türü için benzersiz tanımlayıcılar olarak hizmet veren birkaç
değişken bölge içeren 16s rRNA geninden faydalanır. Teknoloji geliştikçe, mikrobiyomun insan sağlığı üzerindeki rolü daha iyi anlaşılmaktadır (7).
Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olan infertil kadınlarda, endometriumdan alınan örneklerde 16s rRNA gen sekanslaması yapılarak endometiral mikrobiyotada, fertil olan kadınlardaki Lactobasil dominansı yerine Phylafirmicutes, Bacteroides, Prpteobacteria predominansı olduğu izlenmiştir (8).
Klasik ve moleküler teknikler kullanılarak bugüne kadar yapılan birçok çalışmada, endometrial disbiyozun implantasyon başarısızlığında ve gebelik kaybında etkili bir faktör olduğu belirtilmektedir (5) (9) (10). Bu nedenle endometrial miktobiyotanın infertil hastalar üzerindeki etkileri ve tedavi seçenekleri hala araştırma konusudur.
İnsan gastrointestinal sistemi ise, insan vücudundaki konakçı, çevresel faktörler ve
antijenler arasındaki en büyük ara yüzlerden birini (250-400m2) temsil eder. Gastrointestinal sistemi kolonileştiren mikroorganizmalara ise “gut mikrobiyota” denmektedir ve insan vücudu ile karşılıklı olarak yararlı bir ilişki oluşturmak üzere yıllar boyu gelişmişlerdir. Gastrointestianl kanalda yaşayan mikroorganizma sayısının 1000’i geçtiği varsayılmaktadır. Bu insan hücrelerinin sayısından yaklaşık 10 kat daha fazla bakteri hücresi anlamına
gelmektedir; ayrıca bu genomik içerik insan genomundan yaklaşık 100 kat daha fazladır. Gastrointestinal mikrobiyota, bağırsak bütünlüğünün güçlendirilmesi, enerji harmanlanması, patojenlere karşı koruma ve konakçının bağışıklığının düzenlenmesi gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlar yoluyla konakçıya fayda sunar (11).
Yeni gen sekanslama teknikleri, endometrial miktobiyotanın identifikasyonunda olduğu gibi, özellikle anaerob mikroorganizmaların gastrointestinal sistemdeki yerleşimlerini belirlemede ışık olmuştur.
Alt gastrointestinal sistem kadın iç ve dış genital organları ile yakın anatomik komşuluk içinde olmakla birlikte lenfatik kanalların ortak lenf nodlarına dökülmesi nedeni ile birbiri ile ilişkilidir. Daha önce belirtildiği gibi literatürde endometrial ve gastrointestinal sistem
mikrobiyotasıyla ilgili birçok çalışma bulunmakta olup her iki sistem için dominant olan mikroorganizmalar gen sekanslama teknikleri ile belirlenmiştir. Bu çalışma, literatürden farklı olarak, tekrarlayan ART başarısızlığı olan kadınlarda her iki sistem arasındaki etkileşimin fertilite üzerindeki etkisini araştırmak üzere planlanmıştır. Bu çalışmada çalışmaya katılma koşullarını karşılayan ve çalışmaya katılmayı kabul etmiş her kadından endometrial ve rektal mikrobiyota için örnekler alınarak birbirleri ile kıyaslanacaktır. Endometrial örnekler, infertil hastaların değerlendirilmesinin ayrılmaz bir parçası olan transvajinal ultrasonografi esnasında alınacaktır. Transvaginal ultrasonografi(TVUSG) ile uterusun değerlendirilmesi esnasında
salin infüzyonu kullanarak endometrial görüntüleme günümüzde artık klinik pratiğe girmiştir. Bu metot histerosalfingografi (HSG) ve histeroskopiye(H/S) göre daha az invazif ve daha ucuzdur. Salin infusion sonohisterografi(SİS); TVUSG esnasında steril serum fizyolojik solüsyonunun endometrial lümene transservikal infüzyonundan ibarettir. Serum fizyolojik (salin) hem uterin kaviteyi genişletir hem de anekoik oluşu nedeniyle ekojenik
endometriyumun tanımlanmasında mükemmel bir kontrast oluşturur. Bu teknik ilk defa 27 yıl önce tanımlanmıştır. Endometrial polip, submukoz fibroid (myom), sineşi ve uterin
anomalilerin teşhisindeki yüksek duyarlılığı ve etkinliği, yapılan çeşitli çalışmalarla
kanıtlanmıştır. Son zamanlarda yapılan metaanalizlerde, anormal uterin kanamaların tanısında kolay uygulanabilir ve yüksek doğruluk oranlarına sahip olduğu saptanmıştır. Buna ilaveten SİS, HSG ve H/S den daha az invazif ve daha ucuzdur.
Belirtilen anatomik komşuluk ve ortak lenfatik drenaj sisteminin mikrobiyota göçü ve disbiyozis üzerindeki etkilerinin saptanması, tekrarlayan ART başarısızlığı olan kadınlar üzerinde yapılacak antibiyoterapi ve flora düzenleyici ajanlara yönelik çalışmaların hem önünü açacağı hem de gebelik oranlarını artırarak çocuk sahibi olmalarına katkıda bulunacağı kanaatindeyiz.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. İnfertilite ve Tekrarlayan ART Başarısızlığı
2.1.1. Tanımı ve insidansı
İnfertilite, psikolojik, ekonomik, demografik ve medikal etkileri olan önemli bir patolojidir. İnfertilite tedavisine yönelik talep, yıllar içerisinde insidansta önemli bir artış olmamasına rağmen büyük ölçüde artmıştır.
Klinik olarak tek bir birey yerine çiftleri içermesi açısından özellikli bir durumdur. 35 yaşından genç kadınlarda kontrasepsiyon olmaksızın 12 ay düzenli cinsel ilişkiye rağmen gebelik olmaması olarak tanımlanmaktadır. 35 yaş ve üzeri kadınlarda ise tanı için kriter 6 aydır (12). Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), infertiliteyi fonksiyon kaybına neden olan
sakatlık durumu olarak tanımlamıştır (13). Subfertilite ise infertilite terimi ile değişimli olarak kullanılabilmektedir (13). Ayrıca gebelik isteyen çiftlerde doğurganlığın azaldığı durumlar için de kullanılmaktadır (14). Sterilite kavramı ise, infertilite tanımı sınırlı bir zaman dilimine dayanır iken kalıcı kısırlık hali anlamına gelmektedir (13).
İnfertilite, primer ve sekonder olmak üzere iki grupta kategorize edilmektedir. Primer infertil kadınlar, daha önce klinik gebelik tanısı almamış yada gebeliği sürdürememiş kadınları içermektedir. Sekonder infertil tanımı ise önceden doğumu olup, devamında gebe kalmada sorun yaşayan kadınları ifade etmektedir (13).
Bir menstrual siklusta gebelik elde etme olasılığını tanımlayan fekundabilite ise farklı infertilite derecelerini tanıyabildiği için daha kesin bir belirteçtir. Fekundabilite
kavramının, fertilite çalışmalarında normal parametreleri oluşturmak için yararlı olduğu ispatlanmıştır.
Amerika Birleşik Devletleri’nde yapılan Ulusal Aile Büyümesi Anketi (NSFG), infertilite prevalansını tahmin etmek için 15-44 yaş arasındaki 12279 kadınla görüşerek 1982’de %8,5 olan oranın 2006-2010 yılları arasında %6,0’a düştüğünü bildirmiştir. Yapılan çalışmalara göre bu oran %12-18 aralığında tahmin edilen infertil çiftlerin
sayısının altındadır (15). Evli kadınlarda primer infertilite sıklığı 15-34 yaş arasında %7,3-9,1; 35-39 yaş arasında %25; 40-44 yaş arasında %30 olarak saptanmıştır (16). İnfertilite oranındaki düşüş ile daha fazla hastanın infertilite için tedaviye başvurması arasında diskordans bulunmakla birlikte nedeni tartışmalıdır. 2002 NSGF raporunda, reproduktif çağdaki kadınların %2’si bu endikasyonla bir veya daha fazla kez bir sağlık hizmet sağlayıcısına başvurmuş olup bunların %10’u bir dönem infertilite tedavisi almışlardır (17).
Asiste reproduktif teknolojiler (ART), infertilite tedavisinde başarıyla uygulanan tedavi seçeneklerinden olmakla birlikte bu teknikler, doğal fekundite oranlarından belirgin yüksek başarılar sağlayamamaktadır. Tek embriyo transferinin yasal zorunluluk olduğu ülkemizde ortalama canlı doğum oranları %20-30 civarındadır. Altı ardışık IVF
denemesinde bu oran %50-75 arasında bulunmaktadır. İstatistiksel olarak tekrarlayan IVF denemeleri gebelik oranlarını %100’e ulaştıramamakta ve göz ardı edilemeyecek sayıdaki çiftler çocuk sahibi olamamaktadır. Üçün üzerindeki IVF denemelerinde gebelik oranları belirgin olarak azalmaktadır. Ard arda iki (bazı kaynaklara göre üç) siklus ve üzerindeki IVF denemelerine rağmen gebe kalamayan hastalarda tekrarlayan ART başarısızlığından söz etmek mümkündür. Bir subgrup olarak değerlendirilen tekrarlayan implantasyon başarısızlığı (RIF) terimi ise iyi kalite embriyo seçilimine rağmen gebelik elde edilemeyen hastaları kapsamaktadır. Sözü edilen implantasyon oranı ise klinik gebelik verisi olup
ultrasonografik değerlendirmede uterin kavitedeki gestasyonel kese sayısının, transfer edilen embriyo sayısına oranı anlamına gelmektedir.
RIF tanı kriterleri açısından konsensus bulunmamaktadır. Bu tanımlamada transfer edilen embriyo sayısı, taze ya da dondurulmuş (cryo) siklus varlığı, embriyo kalitesi ve transfer edilen embriyo aşamasını değerlendirme içerisine alan farklı parametrelere dayanan tanımlamalar öne sürülmüştür (1). RIF tanımlaması elimizdeki bilgiler ışığında 40 yaş altı hastalarda taze veya dondurulmuş en az üç siklusta (bazı kaynaklara göre iki) ve toplamda 4 adet iyi kalite embriyo verilmesine rağmen gebelik kesesinin ultrasonografi ile görülemediği hastaları kapsamaktadır (18) (19).
2.1.2. Epidemiyoloji
Üreme çağındaki kadınlarda infertilite görülme sıklığının batı ülkelerindeki her yedi çiftten biri ve gelişmekte olan ülkelerdeki her dört çiftten biri olduğu tahmin edilmektedir. Dünyanın belli bölgelerinde; Güney Asya, bazı Sahra altı Afrika, Orta Doğu ve Kuzey Afrika, Orta ve Doğu Avrupa ve Orta Asya’da infertilite oranları %30’lara
ulaşabilmektedir (20).
Erkek faktörünün, infertilite vakalarının %20-30’undan sorumlu olduğu, toplam vakaların ise %50’sine katkıda bulunduğu tespit edilmekle birlikte dünyanın tüm
bölgelerini kesin olarak temsil etmemektedir. Agarwal ve ark. erkek infertilite oranlarının Afrika ve Orta / Doğu Avrupa’da en yüksek olduğunu gösterirken, Kuzey Amerika, Avusturalya ve Orta ve Doğu Avrupa için karşılık gelen oranlar sırasıyla %4,5-6, %9 ve %8-12 arasında değişmektedir (21).
Özetle, infertilitenin dünya genelinde üreme çağındaki çiftlerin %8 ila 12’sini etkilediği tahmin edilmektedir (22). Sekonder infertilite dünyadaki en yaygın kadın infertilitesidir (23). Sekonder infertilite sıklıkla yüksek güvensiz küretaj ve kötü anne bakımı oranlarına sahip dünya ülkelerinde görülmekte olup, abortif ve postpartum enfeksiyonlar nedeniyle sıklıkla görümektedir (24).
In vitro fertilizasyon (IVF) tedavisi, gebe kalmakta zorlanan kadınlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. 2010 yılında, yalnızca Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri’nde 700000’den fazla tedavi döngüsü uygulanmış olup bu sayı dünya genelinde de istikrarlı bir şekilde artmaktadır. (25)
2.1.3. Etiyoloji
Tekrarlayan ART başarısızlığı için en yaygın nedenler şunları içermektedir: Kısıtlı oosit kalitesi
Kısıtlı sperm kalitesi
Parental kromozomal bozukluklar Konjenital uterin anomaliler
Submüköz ve kaviteyi distorsiyona uğratan myomlar Endometrial polipler
Intrauterin adezyonlar Adenomyozis
Hidrosalpinks
Yüksek veya düşük BKİ
Embriyo ve uterus arasındaki implantasyon sürecini etkileyen çok fazla faktör
mevcuttur. Tekrarlayan ART başarısızlığı olgularının araştırılması ve tedavisi embriyonal faktörler ve maternal faktörler üzerine odaklıdır. Embriyo “iyi kalite” olarak transfer edildiği takdirde esas şüpheli uterus ve endometrium ön plana çıkmaktadır; ancak embriyo kalitesi değerlendirme yöntemlerinin %100 doğrulukla iyi kalite embriyo seçilimini sağlaması mümkün olmadığından gamet ve embriyoların da bir takım tekrarlayan ART başarısızlığına neden olacağı da göz önünde bulundurulmalıdır.
Kısıtlı oosit kalitesi, özellikle stimulasyona yetersiz cevabı olan hastalarda RIF sebebi olabilmektedir. Granüloza hücreleri, prostoglandin ve bir takım anjiojenik faktörler salarak implantasyon başarısını etkileyebilir (26). Benzer şekilde sperm kalitesi de embriyo kalitesi ve implantasyonu etkileyerek gebelik oranlarını değiştirebilmektedir. Spermdeki DNA hasarı kötü embriyo gelişimine neden olabilir. Sperm hasarını belirleyen çeşitli yöntemler bulunmakta olup %30 ve daha fazla sperm DNA fragmantasyonu olan erkeklerde implantasyon ve gebelik oranlarının daha düşük olduğu ve abortus oranlarında artış bildirilmiş olup sperm DNA fragmantasyonu halen deneysel bir veri olarak karşımıza çıkmaktadır (27).
Parental kromozomal bozukluklar da tekrarlayan ART başarısızlığına sebep
olabilmektedir. Dengeli translokasyonlar önem taşımaktadır. Bu hastalarda kromozomal anomalilerin arttığı ve bu hastaların yönetiminde karyotip analizini gerekli gören
çalışmalar çalışmalar bulunmaktadır (28). Özellikle dengeli translokasyon taşıyıcılarında pre-implantasyon genetik tanı (PGD) anlamlı olmaktadır (29). Erkek infertilitesi
olgularında, erkek partnerin karyotip analizi IVF öncesi genellikle önerilmektedir. Tekrarlayan ART ve implantasyon başarısızlığı olgularında genetik anomaliler %2,5 ve daha üzerinde olup toplum genelinden yüksek saptandığı için karyotip analizi önemli hale gelmiştir (30) (28).
Konjenital uterin anomalilerin tekrarlayan gebelik kayıpları ile ilgili ilişkileri tanımlanmış olup tekrarlayan ART başarısızlığı ile ilgili ilişkisi tartışmalıdır. En sık görülen anomali olan septat uterusta tekrarlayan abortus oranları yüksek olmakla beraber uterin septum ile infertilite ilişkisi tartışmalıdır (31). Diğer uterin anomalilerin tekrarlayan ART başarısızlığı ile ilişkileri net olarak bilinmemektedir. Histerosalpingografi (HSG), konjenital uterin anomali taramasında tercih edilecek ilk tetkiktir.
Endometrial bütünlüğü etkileyen myom, endometrial polip ve intrauterin adezyonlar da tekrarlayan ART başarısızlığı ile ilişkili olabilmektedir. Bu patolojilerin tanısında ise histeroskopi altın standarttır. Önceki muayenelerinde uterin anomali düşündürmeyen ancak tekrarlayan ART başarısızlığı olan hastaların %10 – 50 kadarında uterin patoloji saptanmıştır (32). H/S’nin endometrial patoloji bulunmayan hastalarda dahi
implantasyonu arttırdığına dair birçok çalışma yayınlanmıştır (32) (33). H/S, patolojilerin varlığını saptamakla birlikte, etkili bir tedavi seçeneği sunması bakımından da önemlidir. Submüköz myomların ve kaviteyi distorsiyona uğratan intramural myomların
implantasyon ve gebelik oranlarını bozduğuna yönelik kanıt düzeyi yüksek veriler bulunmaktadır. Bu myomların eksize edilmesi ile gebelik oranları artmaktadır (34) (35). Kavite bütünlüğünü bozmayan myomların ise gebelik üzerine etkileri hala tartışmalıdır ve yapılan metaanalizlerde myomektominin gebelik üzerine etkisi zayıf olarak saptanmıştır (35) (36).
Önceden saptanan endometrial polip varlığında polipektomi yapılması önerilmekle beraber hangi çaptaki poliplerin çıkarılması ile ilgili yeterli veri bulunmamaktadır. Günümüzde IVF siklusları öncesi polipektomi yapılması ise genel kabul gören bir uygulamadır (36).
Tekrarlayan ART ve implantasyon başarısızlığı olan olgularda %8,4 oranla intrauterin adezyonlar saptanmaktadır. Bu patolojiler H/S ile tedavi edilebilmektedir (37).
Adezyonların H/S ile açılması gebelik oranlarını artırabilmektedir (37).
Adenomyozis, myometrium dokusu içerisinde endometrial glandların bulunması anlamına gelmekte olup subendometrial alanı etkilediği için implantasyona etkisi intramural myomlardan daha fazla beklenmektedir; ancak bu konuyla ilgili yapılmış yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu olgular her zaman ultrasonografi ile tespit
edilememekle beraber hangi adenomyozis odaklarının eksize edilmesi gerekliliği ve diffüz adenomyozis olgularına yaklaşım gibi konular tartışmalıdır (38) (39) (40).
Hidrosalpinks, IVF gebeliklerinde canlı doğum oranını %50 ve üzerinde azaltmakta olup, ancak ultrasonografi bu hastaların tespitinde yetersiz kalmaktadır. Tekrarlayan ART başarısızlığı olan hastalarda, hidrosalpinks açısından risk faktörü taşıyanlarda HSG’nin birkaç yılda bir tekrarlanması önerilmektedir. Salpenjektomi ise gebelik başarısını artırmaktadır. Salpenjektomi yerine tubal okluzyonun da benzer sonuçları verdiği bir takım çalışmalar mevcuttur (41).
Genel olarak obezitenin ART başarısını olumsuz yönde etkilediği kabul görmekte olup, yaş ve polikistik over sendromu (PCOS) gibi faktörler varlığında obezite ile ilişki multiple değişkenlerden dolayı gebelik oranları farklılıklar göstermektedir (42). Bariatrik cerrahi sonrası ilk 1 yıl hızlı kilo kaybı olması nedeni ile gebelik bu dönemde önerilmemektedir (43). Ayrıca bariatrik cerrahi sonrası eşlik edebilecek multivitamin eksiklikleri açısından dikkatli olunmalıdır.
Tüm bunların dışında temel yaşam şekli davranışlarınında etkili olduğunu gösterilmiştir. Bunlar arasında sigarayı bırakma, stres faktörünün azaltılması sıralanabilir (44).
2.2. Mikrobiyota
2.2.1. Tanımı
Mikrobiyota, her organizma tarafından barındırılan mikroorganizmaların toplamı anlamına gelmektedir. Mikrobiyom ise bu mikroorganizmaların konak ile birlikte oluşturdukları genler ve ürünleri olarak tanımlanmaktadır (4).
2.2.2. Üst Genital Sistem Mikrobiyotası
Geçmişte uterin kavite her zaman steril bir bölge olarak kabul edilip buradaki
mikrobiyal kolonizasyonlar patojenik bir proçes olarak değerlendirilmiştir ancak 2007 yılında Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yürütülmeye başlanan “İnsan Mikrobiyom Projesi” ve bunun üzerine yapılan yeni çalışmalar ve güncel literatürle birlikte bu görüş artık yanlış kabul edilmektedir (5).
Birtakım çalışmalar, endometriumun fizyolojik şartlarda fonksiyonel bir mikrobiyoma sahip olduğunu göstermiştir (45). Endometrial kolonizasyona ait ilk ipucu, transservikal olarak çift lümenli bir kateter ile toplanan endometrial örneklerden Lactobasil,
Enterobakter, Mycoplasma hominis ve Gardnerella vajinalisin izole edilmesinden
gelmektedir (46). Daha sonra endometrial bir mikrobiyomun varlığı, histerektomi sonrası elde edilen uterin örneklerde bakteri üremesiyle desteklenmiş ve transservikal yolla alınan örneklerdeki olası vajinal kontaminasyon riskini ortadan kaldırmıştır (47).
Üst genital sistemin bakteriyel kolonizasyonu için en akla yatkın teori, vajendeki
mikroorganizmaların asendan yolla anatomik olarak yukarı çıkması olmuştur. Bu hipotez, bakteriyel vajinozlu kadınların endometrium ve fallop tüplerine bağlı Gardnarella
vaginalis içeren polimikrobiyal biyofilmlerin varlığı ile kanıtlanmıştır (48). Bununla birlikte, gastrointestinal, respiratuar veya oral kavitedeki bakterilerin hematojen yolla üst genital sisteme geçmeleri gibi farklı hipotezler de vardır (49). Bu şekildeki
kolonizasyonar, gebe kadınlardaki oral ve plasental mikrobiyomların benzerliği ile desteklenmektedir (50). Maternal mikrobiyotanın vertikal yolla yenidoğana geçtiği ve hayat boyu mikrobiyal sağlığı etkilediği öne sürülmektedir (49).
Son zamanlarda yapılan başka bir çalışma, benign ve non-enfeksiyöz nedenlerle opere
edilen kadınlarda, tüm üreme sistemi (vajen, posterior forniks, servikal mukus, endometrium, fallop tüpleri ve Dougles boşluğundan alınan periton sıvısı dahil) boyunca
mikrobiyota varlığını bildirmiştir (51).
Çalışmalara göre, sağlıklı ve asemptomatik kadınların endometriumunda Lactobasil dominansı hakimdir. Yapılan güncel bir çalışmada, tekrarlayan ART başarısızlığı olan beyaz ırktan 35 infertil kadından alınan endometrial sıvıdaki mikrobiyomun üreme sonuçları üzerine etkisini analiz etmiştir. Bu analiz, endometriyal mikrobiyotada en fazla olarak Lactobasillus spp ile birlikte 108 farklı bileşeni içermektedir. Bu çalışmanın
cut-off değeri alarak, Laktobasil dominant ve non-Laktobasil dominant olarak ikiye ayrıldığını göstermiştir. Bu cut-off değeri ise üreme başarısını öngörebilecek önemli bir değişken olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle, non-Laktobasil dominant (<%90)
endometrial mikrobiyota, Laktobasil dominant endometrial mikrobiyotaya göre implantasyon, gebelik ve düşük oranları değerlendirilerek, kötü reprodüktif sonuçlarla anlamlı olarak ilişkili bulunmuştur (5).
2.2.3. Rektal Mikrobiyota
Yaklaşık 10 yıl öncesine kadar insan bağırsak mikrobiyotası ile ilgili verilerin elde edilmesi, kültür bazlı metodlar nedeni ile duraklamıştı (52). Geliştirilen kültür bağımsız metodlar, bağırsak mikrobiyotasının genişliğinin araştırılmasına olanak sağlanmıştır. Bağırsak mikrobiyotası, diğer bazı vücut bölümlerindeki mikrobiyota kadar çeşitli değildir (53). Kısa süre önce, insan bağırsak mikrobiyomunun fonksiyonel kapasitesinin kapsamlı bir kataloğu elde edilerek tanımlandı (54). Bu çalışmalarla, ülkeye spesifik mikrobiyotanın varlığını belirterek, konağın genetiği ve çevresel faktörlerin etkili olduğunu düşündürmektedir (54).
Rektal mikrobiyota gelişimini doğumla başladığı düşünülmektedir (55). Doğumdan sonra gastrointestinal kanal hıza kolonize olmakta, antibiyoterapi ve diyet değişiklikleri mikrobiyotada kaymalara sebebiyet vermektedir (56). Bununla birlikte doğum şekli de mikrobiyota kompozisyonunu değiştirmektedir. Vajinal yolla doğan bebeklerde, ilk birkaç gün vajinal floranın bir yansıması olarak laktobasil dominansı izlenmektedir (57). Sezaryenle doğan bebeklere bakıldığında Bacteroides cinsi ile kolonizasyonda gecikme görülmüş olup Clostridium türleri gibi fakültatif anaerobların kolonizasyonu hızlanmıştır (58). Ayrıca vajinal yolla doğan bebeklerin fekal mikrobiyomları annelerine %72
benzemekte iken, bu oran sezaryen ile doğan bebeklerde %41 olarak bulunmuştur (59). Bağırsak mikrobiyotası yaşla birlikte değişmektedir. Gelişimin erken döneminde çeşitlilik fazla olmayıp 2 ana filum tarafından domine edilmektedir: Actinobacteria ve proteobacteria. Yaklaşık 2,5 yaşlarda mikrobiyota kompozisyonu, çeşitliliği ve
fonksiyonel kapasitesi erişkininkine benzemektedir (56). Erişkinlerde ise mikrobiyota dominansı ise filum bazında Bacteroidetes ve Firmicutes olarak bildirilmiştir (60). Rektal mikrobiyota üzerinde etkisi olan durumlar : Doğum şekli, infant dönemde beslenme şekli (anne sütü veya mama), erişkin dönemde beslenme şekli (sebze veya et ağırlıklı), antibiyotik ve antibiyoteik benzeri moleküllerin kullanımıdır (60).
2.2.4. Mikrobiyomun Teknik Değerlendirilmesi
Literatür verileri yorumlanırken metagnomik örneklerin nasıl toplanıp analiz edildiğini anlamak önem taşımaktadır. Mikrobiyom verilerinin sağlanması için iki yöntem
bulunmakta olup bunlar kültür bazlı ve sekanslama bazlı teknolojilerdir (61).
Klasik kültüre dayalı veriler, daha temel ve bilgilendirici olmakla birlikte dikkatli bir şekilde yorumlanmalıdır. Klasik mikrobiyal kültürde organizmaların üretilmesi ile yapılan çalışmalara göre 16s rRNA gen sekanslama yöntemi ile yapılan çalışmalarda, kültürde her mikroorganizmanın üreyememesi nedeni ile mikrobiyota ile ilgili çalışmalara farklı bir bakış açısı getirmiştir.
Bakteri genlerinin sekanslanması, 16s rRNA’yı kodlayan DNA’nın metagnomik analizini içermektedir. Bakteri geninin 16S bölgesi 1,5Kb boyutunda olup küçüktür ve yüksek oranda korunmuş olup bakteri türlerini ayırt etmek için 9 adet “hyper variable” (hiper değişken) bölge bulundurmaktadır (62). Bakteriyel tanımlama için kullanılan bölgeler V3,V4,V6 ve V8’dir (63). Hedeflenen sekanslama ve mikrodizi verileri, bu bölgelere odaklanarak, cins ve tür seviyesine kadar ayrıntılı bilgi verir. Bu teknik, daha önce tanımlanmış bir sekans veya türün bilinen ya da referans genomunu tanıyan
biyoinformatik işlemlere dayanmaktadır. Bu işlemler maliyetli olmakla birlikte genomun tam olarak keşfine izin verir.
Bu şekilde yeni nesil gen sekanslama ile ortaya çıkan harita okumalar, mikrobiyal genetik materyalin varlığının ya da yokluğunun belirlenmesine izin verir ancak önemli olarak mevcut organizmanın viabilitesi hakkında bilgi vermemektedir. Yeni türler analiz edilirken ise bu yöntem zorlayıcı ve daha az doğru veriler verebilir (64).
Sekanslamadan elde edilen veriler genellikle hacimli, fragmante, üst üste binmiş ve kontaminedir. Biyoinformatik analiz, verilerin temizlenmesine ve bakteriyel taksonların tanımlanmasına olanak sağlar. Biyoinformatik platformlar kullanılarak metabolik fonksiyonlar hakkında da bilgi edinilebilir.
3. AMAÇ
Literatürde yeni olan mikrobiyota kavramı, yapılan güncel çalışmalarla birlikte, tekrarlayan ART başarısızlıkları içerisinde araştırılmakta ve implantasyonu etkileyen bir faktör olduğu savunulmaktadır. Daha önce kullanılan kültür bazlı teknikler, her
mikroorganizmanın kültürde üretememesi nedeni ile bu konuda yetersiz kalmış olup, daha yeni olan 16s rRNA sekanslama çalışmaları ile kadın genital sistem mikrobiyotası
literatürde ortaya konmuştur. Endometrial mikrobiyota disbiyozisinin implantasyon üzerindeki negatif etkilerinin fertilite üzerindeki negatif etkileri düşünülecek olduğunda, buna neden olabilecek nedenlerin saptanması, bu nedenlerin ortadan kaldırılmasında yol gösterici olacaktır.
Bu çalışma, tekrarlayan ART başarısızlığı olan kadınlarda prospektif olarak endometrial ve rektal mikrobiyotayı birbirleri ile kıyaslayarak bu kadınlardaki olası endometrial disbiyozu saptamayı ve bunun gastrointestinal sistemin, kadın genital sistemi ile yakın komşuluğu ve ortak lenfatik drenaj sistemi göz önünde bulundurularak rektal mikrobiyota ile ilişkisini ortaya koymayı amaçlamaktadır.
4. MATERYAL VE METOD
Çalışmamıza, Eylül 2019 – Aralık 2019 tarihleri aralığında Ege Üniversitesi Rektörlüğü Aile Planlaması ve Kısırlık Araştırma Uygulama Merkezi’ne başvuran, 18-40 yaş
aralığındaki 2 veya daha fazla kez ART yöntemi ile gebelik sağlanamayan ve kendi isteği ile çalışmaya katılmak isteyen 12 kadın dahil edilmiştir.
Bu çalışmaya genetik anomaliye, infertiliteye neden olacak erkek faktörüne, konjenital uterin anomaliye sahip olmayan hastalar dahil edilmiştir. Çalışmamıza aldığımız
hastaların komorbid hastalığı, düzenli kullanmakta olduğu ilacı, trombofili ve geçirilmiş majör cerrahisi bulunmamaktadır. Çalışma primer infertil hastalar üzerinde yapılmış olup sekonder infertil hastalar çalışma dışı bırakılmıştır.
Kriterleri karşılayan her hastadan, salin histerosonografi sırasında kavite içerisine verilmiş olan salin, enjektör yardımı ile geri çekilerek steril örnek kabına transfer edildi. Steril eküvyon çubuğu rektuma yerleştirilip saat yönünde iki kez rotasyone edilerek ayrı bir steril örnek kabına aktarıldı. Yeterli materyal toplanması adına bu işlem ayrı bir steril eküvyon çubuğu ile tekrar edilerek aynı gün işleme alındı.
Endometrial örnekler, steril 50 ml falkon tüplerinde +4 °C’de 3000 g’de 15 dk santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra süpernatant uzaklaştırıldı. Hücre pelleti steril 1.5 ml ependorflara alındı, 10 dakika daha santrijüj edildi ve süpernatant uzaklaştırıldı. Hücre pelleti 400 ul serum fizyolojik solüsyonu içinde çözüldükten sonra DNA
izolasyonuaşamasına geçildi.
Rektal örneklerde, steril eküvyon çubukları steril 1.5 ml Eppendorflara alınarak 500 ul serum fizyolojik solüsyonu ile ıslatıldı. Cam boncuklar eklenip vorteks ile karıştırıldı ve 10 dk 1500 rpm’de inkübe edilerek homojenize edildi. Eküvyon çubukları içerisindeki tüm sıvı 18.000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi. Santrifüj işlemi sonrasında süpernatant kısmı swab başlığını içeren tüpe geri koyuldu ve homojenizasyon ve santrifüj işlemi tekrarlandı, santrifüj sonrası oluşan hücre pelletleri 400 ul serum fizyolojik solüsyonu içinde çözüldükten sonra DNA izolasyonu aşamasına geçildi.
Örneklerden DNA izolasyonu için High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Science, Germany) kullanıldı. High Pure PCR Template Preparation Kit İçeriği:
1. Doku Lizis Çözeltisi (Tissue Lysis Buffer)
2. Bağlanma Çözeltisi (Binding Buffer): 4 M üre, 200 mM NaCl, 200 mM EDTA, pH 7.4, 25°C
3. Proteinaz K
4. İnhibitör Uzaklaştırıcı Çözelti (Inhibitor Removal Buffer): 5 M guanidineHCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 25°C
5. Yıkama Çözeltisi (Wash Buffer): 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25° 6. Elüsyon Çözeltisi (Elution Buffer): 10 mM Tris, pH 8.5, 25°C
7. High Pure filtre tüpleri 8. Toplama (Collection) tüpleri
DNA izolasyonu sırasında sırasıyla şu basamaklar uygulandı:
1. Hücre pelleti üzerine 200 µl doku lizis çözeltisi ve 40 µl proteinaz K eklenip pipetajla homojenize edildikten sonra, gece boyu 56°C’de inkübasyona bırakıldı.
2. İnkübasyon bitiminde karışımın üstüne 200 µl bağlanma çözeltisi eklendi, pipetajla resüspanse edilerek homojenizasyon sağlandı, tüpler önceden 70°C’ ye ayarlanan kuru ısı bloğunda 10 dakika inkübasyona bırakıldı.
3. İnkübasyon sonunda karışım üzerine 100 µl izopropanol eklendi, pipetaj ile homojenize edildi.
4. Eppendorf tüp içinde bulunan örneğin tamamı, toplama tüpünün içine yerleştirilmiş olan filtreli tüpün içine alındı.
5. 10.000 g’de 1 dakika santrifüj edildi.
6. Santrifüj sonrasında filtreli kısım yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. (Bu aşama tüm hücre lizatı kolondan geçene kadar tekrar edildi.)
7. Filtreli tüpün üzerine 500 µl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi. 8. 10.000 g’de 1 dakika santrifüj edildi.
9. Santrifüj sonrasında filtreli kısım yeni bir toplama tüpüne aktarıldı.
10. 500 µl yıkama çözeltisi eklenerek, 10.000 g’de de 1 dakika santrifüj edildi.
11. Filtreli tüpler yeni toplama tüplerine aktarıldı ve üzerlerine ikinci kez 500 µl yıkama çözeltisi eklendi.
12. 10.000 g’de 1 dakika santrifüj edildi.
13. Santrifüjden sonra tüplerin alt kısmında biriken sıvı döküldü ve tekrar 10.000 g’de 2 dakika kuru olarak santrifüj edildi.
14. Filtreli tüpler temiz birer ependorf tüpün içine yerleştirilip ve 70°C’ ye ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış olan elüsyon çözeltisinden 60 µl ilave edildi. Elüsyon çözeltisinde 1 dakika inkübe edildikten sonra 10.000 g’ de 1 dakika santrifüj edildi. 15. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Ependorf tüpteki filtreden geçen solüsyon
içindeki genomik DNA’nın konsantrasyonu ölçüldü ve örnekler −20 °C’ye kaldırıldı. İzole edilen DNA örneklerinin konsantrasyonları Qubit dsDNA HS assay kit kullanılarak Qubit 4.0 fluorometre (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) cihazında ölçüldükten sonra örnekler kütüphane hazırlığı ve sekanslama işlemine kadar -20°C’de saklandı.
İzolasyon sonrasında her bir örnekteki 16S rDNA V3-V4 bölgelerinin zenginleştirilmesi için 16S Forward ve 16S Forward Reverse kodlu 16S Universal Eubacteriyal primerler kullanıldı. İlgili primerler Klindworth et al.’ın gerçekleştirdiği kapsamlı çalışmada, en yüksek etkinlikte sunan primer seti olarak seçilmiş olup projede kullanıldı.
16S Forward (TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCA G) 16S Forward Reverse (GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCT AATCC)
Projede, kütüphane hazırlığı sırasında 2 basamaklı PCR işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu işlemlerde, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) kullanılarak her bir örnek için ayrı ayrı
25 döngülü PCR gerçekleştirilmiştir. Birinci PCR aşamasında, 95°C’de 3 dk. ardından 25 döngü boyunca 95°C-30sn + 55°C-30sn + 72°C-30sn; ve son olarak tek döngü 72°C’de 5dk. koşulları uygulanmıştır. İkinci PCR uygulamasında, illumina inde ve adaptör dizilerinin eklenmesi için Ne tera T Inde Primer 1 ve Ne tera T Inde Primer 2 setleri (illumina, CA, USA) kullanılmıştır. Bu PCR aşamasında, 95°C’de 3 dk. ardından 8 döngü boyunca 95°C-30sn + 55°C-30sn + 72°C-30sn; ve son olarak tek döngü 72°C’de 5dk. koşulları uygulandı. Her iki PCR işlemi sonrasında Agencourt AMPure P (Beckman Coulter) kiti ile saflaştırma ve pürifikasyon gerçekleştirildi. PCR sonrasında, tüm örneklere ait PCR ürünleri %2’lik agaroz jel üzerinde, bant varlığı ve göreceli bant yoğunlukları kontrol edildi.
Hazırlanan kütüphanenin Qubit florometresi ile ölçümü yapıldı ve normalizasyon sonrası dizileme işlemine alındı. Belirtilen protokolün detaylarına illumina’nın 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation dokümanından erişilebilir.
Dizileme uygulaması, Gen-Era tarafından (Gen-Era Diagnostik, TR) illumina iSe 100 yeni nesil dizileme platformunda (illumina, CA, USA) gerçekleştirilmiştir. Dizileme basamağında, iSeq 100 i1 Reagent (300-cycles) kiti (illumina, CA, USA), üretici firma yönergeleri takip edilerek kullanıldı.
Dizileme uygulaması sonrasında kalite kontrol basamaklarında FastQC3 programı
kullanıldı. Kalite kontrol sonuçlarına göre her bir örneğin, veri miktarları, okuma kaliteleri, GC dağılımları, kmer dağılımları, olası adaptör kontaminasyonları incelendi. Kalite kontrol sonrasında, düşük okuma kalitesine (Phred Score Q20, 30 bplik pencere aralığı) sahip okumalar, tüm veriden çıkarıldı. Ayrıca, okuma uçlarındaki düşük kaliteli baz okumaları, olası adaptör kontaminantları ile kimerik diziler, Genomes OnLine Database (GOLD) temel
alınarak ve Trimmomatic4 aracı ile kırpıldı. Taksonomik profillendirme için okumalar, Wang Q. et al. tarafından geliştirilmiş Ribosomal Database Project (RDP) Classifier kullanılarak Greengenes veritabanları temel alınarak hedef organizmalara hizalandı. Hizalama sonrasında her bir örnekteki OTU grupları belirlendi. Verilerin raporlanması, istatistik analizleri ve veri görselleştirme çalışmalarında R betikleri kullanıldı.
Çalışmamızda kontrol grubu bulunmamaktadır.
5. İSTATİSTİKSEL ANALİZ
IBM SPSS Statistics 25.0 Programı kullanıldı. Nümerik değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro Wilk(n 50) testiyle incelendi. Nümerik değişkenler ortalama ve standart sapma veya medyan (min-ma ) olarak verildi. Kategorik değişkenler sayı ve yüzde olarak verildi. Normal dağılıma uygunluk sağlandığında Bağımsız iki örneklem t test, sağlanmadığında Mann-Whitney U testi kullanıldı. Kategorik değişkenler için Ki-kare testi uygulandı. Tüm hipotezler için anlamlılık düzeyi 0.05 kabul edildi.
6. BULGULAR
Çalışmaya Ege Üniversitesi Rektörlüğü Aile Planlaması ve Kısırlık Merkezi’ne başvuran, tekrarlayan ART başarısızlığı olan 12 primer infertil hasta alınmıştır.
Çalışmamıza anatomik veya genetik anomalisi, komorbid hastalığı, ilaç kullanımı, erkek faktörü, trombofili ve geçirilmiş majör cerrahi ve vejeteryan beslenme öyküsü olan hastalar dahil edilmemiştir. Çalışmaya alınan hastaların her birinden endometrial ve rektal örnekler alınmıştır. Bu hastaların bazal karakteristik özellikleri Tablo 1’de özetlenmiştir. Tablo 1. Bazal karakteristik özellikleri
YAŞ, ort±SD (min-max) 34,25±5,44 (23-40)
BMI*, ort±SD (min-max) 23,19±3,47 (17,30-26,76)
AMH**(ng/ml), ort±SD (min-max)
1,3±0,95 (0,14-3,7)
İNFERTİLİTE SÜRESİ – ay, ort±SD (min-max)
54,83±33,24 (14-120)
Cem***(ng/µl), ort±SD (min-max)
Crektal****(ng/µl), ort±SD (min-max)
33,20±29,53 (5,46-177,40)
TRANSFER SİKLUS SAYISI, n(%) - 2 - 3 - 4 4(33,3) 7(58,3) 1(8,3) KLİNİK GEBELİK, n(%) - 1(VAR) - 0(YOK) 2(16,7) 10(83,3) ABORTUS, n(%) - 1(VAR) - 0(YOK) 2(16,7) 10(83,3) EVLİLİK, n(%) - 0(BİRİNCİ) - 1(BİRDEN FAZLA) 11(91,7) 1(8,3) PARTNER EVLİLİK, n(%) - 0(BİRİNCİ) - 1(BİRDEN FAZLA) 10(83,3) 2(16,7) PARTNERDE ÇOCUK, n(%)
- 0(YOK) - 1(VAR)
10(83,3) 2(16,7)
EĞİTİM DURUMU, n(%)
- 1(Öğrenim yok, okuma yazma yok)
- 2(Öğrenim yok, okuma yazma var) - 3(İlkokul) - 4(Ortaokul) - 5(Lise) - 6(Üniversite/yüksek lisans) 0 0 0 0 7(58,3) 5(41,7) SİGARA KULLANIMI, n(%) - 1(var) - 0(yok) 4(33,3) 8(66,7)
*BMI: beden kitle indeksi **AMH: antimüllerien hormon ***Cem: endometrial DNA konsantrasyon ****Crektal: rektal DNA konsantrasyonu
Çalışma grubunun yaş ortalaması 34,25±5,44 (23-40) olup BMI 23,19±3,47 (17,30-26,76) olarak saptanmıştır. AMH değerleri 1,3±0,95 (0,14-3,7) ng/ml ölçülmüştür. Çalışmadaki hastalar 54,83±33,24 (14-120) aydır herhangi bir kontrasepsiyon yöntemi kullanmamaktadırlar. Bu hasta grubunun endometrial örneklerinden izole edilen DNA konsantrasyonu 107,84±54,42 (5,46-177,4) ng/µl, rektal örneklerden izole edilen DNA konsantrasyonu ise 33,20±29,53 (5,46-177,40) ng/µl olarak ölçülmüştür.
Hastaların %33,3’üne 2 kez; %58,3’üne 3 kez; %8,3’üne 4 kez embriyo transferi yapılmıştır. Bu grubun %83,3’ünde klinik gebelik oluşmamış olup %16,7’sinde klinik gebelik elde edilmiş olup ilk trimester abortus ile sonuçlanmıştır.
Çalışma grubunun %91,7’sinin ilk evliliği olup %8,3’ünün ikinci evliliğidir. Partnerlerin ise %83,3’ünün ilk evliliği olup %16,7’sinin ikinci evliliğidir. Partnerlerin %16,7’sinin, önceki partnerlerinden çocuğu bulunmaktadır.
Çalışmamıza katılan hastaların %58,3’ü lise; %41,7’si üniversite mezunudur. Hasta grubunun %33,3’ü sigara kullanım alışkanlığına sahip olup %66,7’si sigara kullanmamaktadır.
Çalışma grubundan alınan 12 rektal örnek, DNA izolasyonu basamaklarından geçirilmiş ardından 16S rRNA gen sekanslama ile çalışılmış ancak sonuç alınamamıştır. Alınan 12 endometrial örnekler de aynı basamaklardan geçirilmiş olup sadece dördünden sonuç alınabilmiştir. Sonuç alınan ve alınamayan hastaların özellikleri Tablo 2’de belirtilmiştir. Tablo 2.Sonuç alınan ve alınamayan hastaların özellikleri
Sonuç alan Sonuç almayan P değeri
YAŞ, ort±SD (min-max) 34,50±7,76(23-40) 34,13±4,54(26-39) 0,917
BMI, ort±SD (min-max) 23,43±4,71(18,41-29,76) 23,08±3,07(17,30-26,12) 0,879 İNFERTİLİTE SÜRESİ(AY), ort±SD (min-max) 63,00±43,12(24-120) 50,75±29,70(14-108) 0,573
AMH(ng/ml), ort±SD (min-max)
1,05±0,81(0,14-1,90) 1,55±1,02(0,60-3,70)
0,419
Cem(ng/µl), ort±SD (min-max) 103,50±45,34(62,80-165,40) 110,02±61,29(5,46-177,40) 0,856
max) 118,00) 49,80) SİGARA KULLANIMI, n(%) - 1(var) - 0(yok) 2(50,0) 2(50,0) 2(25,0) 6(75,0) 0,547 EĞİTİM DURUMU, n(%)
- 1(Öğrenim yok, okuma yazma yok)
- 2(Öğrenim yok, okuma yazma var) - 3(İlkokul) - 4(Ortaokul) - 5(Lise) - 6(Üniversite/yüksek lisans) 0 0 0 0 3(75,0) 1(25,0) 0 0 0 0 4(50,0) 4(50,0) 0,576 KLİNİK GEBELİK, n(%) - 1(VAR) - 0(YOK) 1(25,0) 3(75,0) 1(12,5) 7(87,5) 1,00 ABORTUS, n(%) - 1(VAR)
- 0(YOK) 1(25,0) 3(75,0)
1(12,5) 7(87,5)
1,00
Sonuç alan hasta grubunun yaş ortalaması 34,50±7,76(23-40); sonuç alamayanlarınki 34,13±4,54(26-39) saptanmış olup istatistiksel olarak fark yoktur. (p=0,917)
Sonuç alan hasta grubunda BMI ortalama 23,43±4,71(18,41-29,76); sonuç alamayanlarda 23,08±3,07(17,30-26,12) olarak ölçülmüş olup istatistiksel olarak anlamsızdır. (p=0,879)
Sonuç alan hasta grubunda ay olarak infertilite süresi 63,00±43,12(24-120) saptanmıştır. Sonuç alamayanlarda ise 1,55±1,02(0,60-3,70) olarak bulunmuş olup aralarında
istatistiksel fark bulunmamaktadır. (p=0,573)
AMH, sonuç alan hasta grubunda 1,05±0,81(0,14-1,90) ng/ml ölçülmüş olup sonuç almayan hasta grubunda 1,55±1,02(0,60-3,70) ng/ml bulunmuştur. Her iki grup arasında istatistiksel olarak fark yoktur. (p=0,419)
Endometrial DNA konsantrasyonu sonuç alan grupta 103,50±45,34(62,80-165,40) ng/µl; sonuç almayan grupta ise 110,02±61,29(5,46-177,40) ölçülmüştür ve her iki grup arasında istatistiksel olarak fark saptanmamıştır. (p=0,856)
Sonuç alan hasta grubunda rektal DNA konsantrasyonu 45,17±48,90(12,90-118,00) ng/µl saptanmıştır. Sonuç almayan grupta ise 27,22±14,92(11,20-49,80) ng/µl olarak ölçülmüştür. İki hasta grubu arasında istatistiksel olarak fark saptanmamıştır. (p=0,865) Sonuç alan grupta 2 hastada (%50) sigara kullanımı öyküsü olup 2 hastada (%50) sigara kullanımı bulunmamaktadır. Sonuç alamayan hastaların ise 2 (%25)’si sigara kullanmakta olup 8(%75)’i sigara kullanmamaktadır. Gruplar arasında istatistiksel olarak fark
bulunamamaktadır. (p=0,547)
Sonuç alanların 3 (%75)’ü lise mezunu olup 1 tanesi (%25) üniversite mezunudur. Sonuç alamayanların 4 tanesi (%50) lise, 4 tanesi de (%50) üniversite mezunudur. Gruplar
Sonuç alan grupta 1 kişide (%25) klinik gebelik öyküsü mevcut olup 3 kişide (%75) hiç klinik gebelik oluşmamıştır. Sonuç alamayan grupta 1 kişide (%12,) önceden klinik gebelik öyküsü olup 7 kişide (%87,5) klinik gebelik öyküsü yoktur. Gruplar arasında istatistiksel olarak fark saptanmamıştır. (p=1,00)
Sonuç alan grupta 1 kişinin (%25) abortus öyküsü olup 3 kişide (%75) abortus öyküsü mevcut değildir. Sonuç alamayan 1 kişide (%12,5) abortus öyküsü olup 7 kişide (%87,5) abortus öyküsü yoktur. Her iki grup arasında istatistiksel fark saptanmamıştır. (p=1,00) Çalışmamızda hazırlanan hastalardan alınan örnekler 1’den 12’ye kadar
numaralandırılmış olup endometriumdan hazırlanan örnekler “A”, rektumdan hazırlanan örnekler ise “B” olarak gruplanmıştır. Çalışmamızda 6A, 7A, 10A ve 11A örnekleri kalite kontrol ve kütüphane çalışmalarını geçerek mikrobiyota çalışılmıştır. Diğer A örnekleri ve tüm B örnekleri dört farklı kez DNA izolasyonu yapılmalarına rağmen kalite kontrol ve kütüphane çalışmalarını geçememiş; üç defa 16s rRNA gen sekanslaması çalışılmasına rağmen veri alınamamıştır.
Sonuç veren örneklerin başlangıç konsantrasyon değerleri Tablo 3’teki gibidir. Tablo 3. Örneklerin başlangıç konsantrasyon değerleri
Örnek Adı Konsantrasyon(ng/µl) Durum
6A 17,2 Uygun
7A 22,9 Uygun
10A 21,4 Uygun
11A 23,3 Uygun
6A örneğinden 17,2 ng/µl; 7A örneğinden 22,9 ng/µl; 10A örneğinden 21,4 ng/µl; 11A nolu örnekten 23,3 ng/µl miktarda DNA izole edilmiştir.
Her bir bireye ait okumalar farklı taksonomik basamaklardaki birimlere tanımlanabildiği oranda yansıtılmıştır. Tür seviyesine gittikçe düşüş beklenmektedir. Bu durum 16S rRNA temelli çalışmalarda beklenen bir durum olup gen üzerinde seçilen değişken (variable) bölgelerin çoğu türde farklılık göstermemesinden kaynaklanmaktadır. Tablo 4’te her bir taksonomik basamağa atanabilen okumalar listelenmiştir.
Tablo 4.Her bir taksonomik basamağa atanabilen okumaların sayısı
No Alem Filum Sınıf Takım Aile Cins Tür
6A 43536 43521 43499 43487 43343 42962 41455
7A 32631 32626 32618 32617 32604 32569 29256
10A 36640 36607 36552 36532 36358 36186 21886
11A 8579 8572 8562 8558 8545 8518 7202
Tablo 5’te en yüksek oranda görülen 20 cins listelenmiştir. Grafik üzerindeki her bir nokta, her bir numuneyi ifade etmektedir.
Tüm örneklerde en fazla Lactobacillus cinsi izlenmektedir. Bir örnekte Bifidobacterium, Gardnerella, Methylobacterium ve iki örnekte Prevotella tespit edilmiştir.
Tablo 6.Cinslerin numunelere göre dağılımı
Tüm numunelerde en yüksek oranda görülen 20 cins Tablo 6’da grafik olarak sunulmuştur. 20 örnekten daha az oranda görülenler “other” olarak belirtilmiştir.
Örneklerde sadece 7A Lactobacillus dominant (>%90) olup 6A,10A ve 11A nolu örnekler, Moreno ve ark.’nın sınıflandırılmasına göre implantasyona uygun olmayan
non-Lactobacillus dominant (<%90) olarak sonuçlanmıştır.
Metagnomik analiz sonucunda, çalışılan örneklerde 12 filum tespit edilmiş olup Tablo 7’de gösterilmiştir.
Tablo 7.Filum dağılımı
Tüm örneklerde en fazla oranda Firmicutes filumu tespit edilmiştir. Firmicutes, gram pozitif hücre duvarına sahip laktik asit bakterileri, anaerop ve aerop sporlu basiller, anaerop gram pozitif kokların yer aldığı filumdur. Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Listeria ve Bacillus bu filumun üyelerindendir.
Metagnomik analiz sonucunda örneklerde 22 sınıf tespit edilmiştir. En yüksek oranda görülen 30 sınıf Tablo 8’de gösterilmiştir.
Tablo 8. Sınıf dağılımı
Tüm örneklerde en fazla oranda Bacilli sınıfı izlenmektedir. Bacillus, Listeria, Lactobacillus, Staphylococcus bu sınıfın üyeleridir.
Metagnomik analiz sonucunda, tüm örneklerde toplam 45 takım tespit edilmiştir. En yüksek oranda görülen ilk 30 takım Tablo 9’da gösterilmiştir.
Tablo 9.Takım dağılımı
Örneklerde en fazla Lactobacillales ve takiben Bacteroidales ve Bifidobacteriales takımı izole edilmiştir.
Metagnomik analiz sonucunda, toplam 93 aile tespit edilmiştir. En yüksek oranda görülen ilk 30 aile Tablo 10’da gösterilmiştir.
Tablo 10. Aile dağılımı
Tüm örneklerde en fazla Lactobacillaceae ailesi saptanmış olup bunu Prevotellaceae ve Bifidobacteriacae takip etmektedir.
Metagnomik analiz sonucunda tüm örneklerde toplamda 166 cins tespit edilmiştir. En yüksek oranda görülen ilk 30 cins Tablo 11’de gösterilmiştir.
Tablo 11. Cins dağılımı
Örneklerde en fazla Lactobacillus cinsi tespit edilmiştir. Bunu Gardnerella ve Prevotella takip etmektedir.
Metagnomik analiz sonucunda tüm örneklerde toplam 272 tür tespit edilmiştir. En yüksek oranda görülen ilk 30 tür Tablo 12’de belirtilmiştir.
Tablo 12.Tür dağılımı
6A örneğinde en fazla Lactobacillus iners izlenirken, 7A’da Lactobacillus crispatus; 10A’da Lactobacillus johnsonii ve 11A’da Lactobacillus jensenii izole edilmiştir.
7. TARTIŞMA
İnfertilite devam eden bir küresel üreme sağlığı sorunu olup dünya çapında 186 milyon insanı etkilediği tahmin edilmektedir. Günümüze kadar infertiliteye neden olabilecek birçok neden tanımlanmıştır. Bunlar arasında kısıtlı oosit kalitesi, kısıtlı sperm kalitesi, parental kromozal bozukluklar, konjenital uterin anomaliler, endokrin nedenler, akkiz anatomik anomaliler, madde kullanımı ve ilaçlar sayılabilir.
Tüm bunların dışında mikrobiyota çok yeni ve güncel bir kavram olup tıp dünyası için halen araştırma konusudur. Paralel sekanslamadaki teknik gelişmeler tüm üreme yolunun mikrobiyomunun tanımlanmasına yardımcı olmaktadır.
Kadın reproduktif sisteminin çalışması uzun süredir vulvaya odaklı iken, bu süreçte üst genital trakttaki mikroorganizmaların varlığı enfeksiyöz durumlarla ilişkilendirilmiştir; ancak yapılan yeni çalışmalarla uterin kavite steril kabul edilmekten çıkmış olup vajendeki mikrobiyotanın devamlılığı gibi görünmektedir. Bakteriyel vajinozu olan kadınlarda, endometrium ve tubalar üzerinde G.vaginalis içeren polimikrobiyal biyofilmler izlenmesi bunu doğrular niteliktedir (48); ancak farklı çalışmalar, vajinal ve endometrial mikrobiyota arasında önemli farklı sonuçlar bildirmiştir. Embriyo implantasyonu, gebeliğin devamı ve jinekolojik hastalıklar dahil olmak üzere uterin kavitede gerçekleşen fizyolojik ve patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması için üst genital sistemin mikrobiyotasının
değerlendirilmesinin önemini vurgulamaktadır.
Endometriumda faydalı mikroorganizmaların olduğuna dair ilk ipucu, 1989 yılında Hemsell ve arkadaşlarının çift lümen kateter ile transservikal yolla endometrial örnek aldıklarında Lactobacilli ile birlikte Enterobacter, Mycoplasma hominis ve Gardnerella vaginalis izole etmesi olmuştur. 1995 yılında Moller ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada, benign nedenlerle yapılan histerektomi materyalleri üzerinde kontaminasyon olmadan endometrial mikrobiyom çalışarak Gardnerella vaginalis, Enterobacter ve S.agaliactiae izole etmişlerdir (47).
Yeni nesil sekanslama gibi oldukça sensitif moleküler tekniklerin ortaya çıkması ile üst genital sistemin sterilitesine ait görüşler değişmeye başlamıştır. 2017 yılında Chen ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada 16S rRNA gen sekanslama yöntemi ile, benign ve non– enfeksiyöz nedenlerle opere edilen kadınlarda, vajen, posterior forniks, servikal
bu anatomik bölgelerin mikrobiyotası raporlanmıştır (51). Bu çalışmada vajen, posterior forniks ve endoservikal kanalda Lactobasillus dominansı izlenmiş olup, endometrial kavitede lactobasilllere ek olarak Pseudomonas, Acinetobacter, Vagococcus gibi mikroorganizmalar da görülmüştür. Fallop tüplerinde, çoğunlukla Acinetobacter ve Comamonas izole edilmiş ve ek olarak Pseudomonas, Vagococcus, Dysgonomonas, Pseudomonadacea’lardan sınıflandırılamayan mikroorganizmalar izlenmiştir. Dougles boşunda ise sınıflandırılamayan mikroorganizmalar büyük çoğunluğu oluşturmakta olup bunların yanında Pseudomonas, Vagococcus, Scinetobacter, Sphingobium ve
Comamonadacea görülmüştür.
ART ile ilgili sağlık cemiyetleri, implantasyon endometriumda gerçekleştiği için, yukarıda bahsedilenler içerisinde en çok endometrial mikrobiyotayla ilgilenmişlerdir. 16s rRNA hedefli polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) ile yapılan, ednometriumda
inflamasyon bulgusu olmayan ve bakteriel vaginozu olmayan hastalardan alınan
histerektomi materyallerinde vajende görülmeyen birtakım mikroorganizmalar izlenmiştir (45). Asemptomatik ve fertil hastalarda bu mikroorganizmalar analiz edilip birbiri ile kıyaslanmıştır. Beklendiği gibi bu örnklerde Lactobasillus dominat olarak izole edilmiş olup buna ek olarak Atopobium, Bifidobacterium, Gardnerella, Megasphaera, Prevotella, Streptococcus tespit edilmiştir (4). Tüm bunlara dayanarak endometrial ve vajinal
miktobiyotanın benzer ve Lactobasil spp. dominant (>%90) olduğu ve kişi bazında birtakım farklılıklar olduğu kabul görmüştür.
Uterin enfeksiyon, bilindiği gibi infertilite için risk faktörüdür. Meydana gelen immun reaksiyon embriyo implantasyonu için olumsuz bir ortam oluşturmaktadır. 1990 ve 2000’lerde, embriyo transfer kateter ucu, klasik kültür bazlı çalışmalar yapılarak
değerlendirilmiş ve endometrial enfeksiyonun IVF başarısını düşürdüğü izlenmiştir (65). Endometrial kültüründe üreme olmayan kadınlara göre kültürde Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia ve gram negatif bakteriler bakteriler üreyen kadınlar kötü repoduktif sonuçlara sahiptir. Diğer yandan Lactobacillus spp izolasyonu, artmış implantasyon başarısı ve azalmış abortus oranı ile ilişkilendirilmiştir (66). 1999 yılında Egbase ve arkadaşlarıın yaptığı endometrial kültüre dayanan implantasyon pencerisini inceledikleri çalışmada, negatif kültüre sahip ya da antibiyoterapiye cevap vermiş olan kadınlarda, artmış klinik gebelik oranları
Tekrarlayan ART başarısızlığı veya habituel abortusu olan kadınlarda, 16s rRNA PCR ile yapılan başka bir çalışmada uterin mikrobiyotanın Firmicutes, Bacteroidetes ve Proteobacteria filumları tarafından domine edildiği izlenmiştir (8). Firmicutes filumu Lactobacilli, Streptococci, Staphylococci’yi içerirken; Bacteroidetes filumu Prevotella’yı kapsamaktadır. Proteobacteria filumu ise E.coli gibi Enterobacteria ve K.pneumoniae’yi içermektedir.
Endometrial mikrobiyotanın fertilite sonuçlarını etkilediğine yönelik ilk rapor, 2016 yılında Franasiak ve arkadaşlarından gelmiştir. Bu çalışmada, öploid embriyoya sahip 33 kadından alınan transfer kateterinin ucu 16s rRNA PCR ile çalışılmıştır. Bu yaklaşım ile örneklerden en fazla Lactobavillus ve Flavobacterium cinsleri izole edilmiştir. Diğer izolasyonlar önceki çalışmalar ile benzerdir; ancak bu çalışmada endometrial mikrobiyom ile fertilite arasında istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar bulunamamıştır (7).
2016 yılında yayınlanan Moreno ve arkadaşlarının çalışmasında, tekrarlayan gebelik kaybı olan kadınların endometriumunda Lactobacillus dominansının olmaması kötü fertilite sonuçları ile ilişkili bulunmuştur (5). Önceki çalışmalarla uyumlu olarak bu çalışmada da Lactobacillus spp, endometrial örneklerde en çok izlenen cins olmuştur ve bunu Gardnerella, Streptococcus ve Bifidobacterium izlemiştir; ancak sadece Lactobacillus oranı IVF’in başarısında prediktif olmuştur. Non-Lactobacillus dominant grupta daha çok Gardnerella ve Streptococcus tanımlanmıştır. Buna dayanarak Lactobacillus-dominant mikrobiyoma (>%90 Lactobacillus) sahip hastalar, non Lactobacillus-dominant (<%90 Lactobacillus) hastalara göre, anlamlı olarak artmış implantasyon, klinik gebelik, devam eden gebelik ve canlı doğum oranlarına sahip olmuşlardır (60.7% vs. 23.1%, P=.02; 70.6% vs. 33.3%, P=.03; 58.8% vs. 13.3%, P=.02; and 58.8% vs. 6.7%, P=.002). Endometrial mikroorganizmaların fertilite üzerindeki etkilerini anlamak için daha fazla sayıda çalışma gerekmekte olup bu sonuçlar, embriyo implantasyonu ve gebelikte mikrobiyal oluşumların önemli bir rolü olduğunu önermektedir.
Kyono ve arkadaşlarının 2018 yılında 117 infertil kadın üzerinde yaptıkları bir
çalışmada, fertil gönüllülere kıyasla IVF programına giren hastalarda lactobacillus oranını anlamlı olarak düşük bulmuşlardır. Gebe kalan kadınlarda, gebelik öncesi bakılan
endometrial mikrobiyotada Lactobacillus median değerini %90’ın üstünde bulmuşlardır. Buna dayanarak Lactobacillusun implantasyon üzerinde etkisi olabileceğini
düşünmüşlerdir. Non-Lactobacillus dominat endometriuma sahip 45 kadının 9’una, standart bir disbiyoz tedavisi henüz olmadığından, antibiyotik, prebiyotik ve/veya
probiyotik vermişlerdir. Tedavi alan hastalarda Lactobacillus dominant endometrial mikrpbiyota elde edilmiş olup bu hastaların 5’inde klinik gebelik sağlanmış olup 3’ü gebeliğin devamı ve 2’si abortus ile sonuçlanmıştır (67).
Bizim çalışmamızda sonuç alınan dört numunenin sonucunda Lactobacillus en yüksek oranda izole edilen cins olmuştur. Bunu Prevotella ve Gardnerella izlemiştir.
Hastalarımızdan sadece biri Lactobacillus dominant endometrial mikrobiyotaya sahip olup diğer üçü non Lactobacillus dominanttır. Lactobacillusun alt sınıfı olan birçok tür, örneklerimizde tespit edilmiştir. Literatürde, endometriumda Lactobacillus türleri ile sınıflandırılma yapılmamış olup vajen florasında L.crispatus, L.iners, L.gasseri ve L.jensenii olmak üzere tespit edilmiştir. Üç örneğimizde L.crispatus ve L.iners ve L.jensenii dominant olarak tespit edilmiştir. Bir örnekte ise L.johnsonii tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda Lactobacillus dominansında tür bazında farklılıklar olduğu
belirtilmiştir.
Endometriyoz, endometrit, endometrial hiperplazi ve preeklempsi, koryoamniyonit gibi gebelik komplikasyonları üzerine de 16s rRNA PCR kullanılarak endometrial mikrobiyota izolasyonu yapılan çalışmalar bulunmaktadır (68) (69) (70).
Endometrial mikrobiyotanın çalışılmasının birtakım zorlukları mevcuttur. Diğer düşük biyokütleli mikrobiyotalarda olduğu gibi, az bir başlangıç materyali sunmakta ve ekzojen bakteriyel DNA ile kolayca kontamine olabilmektedir. Bu sebeple mikrobiyotanın uygun şekilde çalışılması uterin disbiyozun saptanmasında önem taşımaktadır. Düşük kütleli mikrobiyomların (endometrial, üriner, kandaki gibi), mikrobiyal homeostazda ve fizyolojide önemli rolleri olabilir; ancak bunların çalışılması sırasında, havada bulunan mevcut bakteri ve bakteriyel DNA partikülleri, labratuvar ekipmanları, izolasyon sırasında kullanılan kimyasal maddeler, örneklerin toplanma aşamalarındaki basamaklar ve analiz yöntemleri ile kontamine edilme ihtimali yadsınamayacak kadar fazladır. DNA
ekstraksiyon kitleri steril olsalar dahi kontaminasyona sebebiyet verebilmekte ve DNA analizlerinin yanlış yorumlanmasına sebep olabilmektedir. Bu nedenle, düşük biyokütle numuneleri ile yapılan çalışmalarda, sekanslama sonuçlarının yanıltıcı sonuçları olmaması adına katı protokoller uygulanması gerekmektedir (71).
Gastrointestinal sistem florası, kompleks ve dinamik bir mikroorganizma
popülasyonundan oluşmaktadır. Bağırsak mikrobiyotasının şekillenmesinde doğum şekli,
doğumdan sonraki beslenme şekli rol oynamaktadır. İmmun ve metabolik homeostazda, bağırsak mikrobiyotası kritik bir önem taşımaktadır. Bağırsak disbiyozu birçok inflamatuar
ve enfeksiyöz süreçle ilişkilendirilmiştir (11).
İnsan gastrointestinal sistemi yaklaşık 200 ile 400 m2 arasında bir alana sahiptir. Ortalama bir hayatta, yaklaşık 60 ton yemek gastrointestinal traktüsten geçmektedir. Bakteriler, archaea ve eukaryalar ile kolonizasyon sonucunda bağırsak mikrobiyotası oluşmaktadır ve yaklaşık 1014 civarında, insan genomunun yaklaşık 100 katı ve insan hücreleri sayısının yaklaşık 10 katı, olduğu tahmin edilmektedir (72) .
Bağırsak mikrobiyotası, intestinal epitellin şekillenmesinde, enerji üretiminde, patojenlere karşı korunmada ve immunitede görev almaktadır (73).
16s rRNA’yı hedefleme yöntemleriyle yapılan çalışmalarla birlikte, gastrointestinal sistem mikrobiyotası da ortaya konmaya başlanmıştır. Yakın zamanda, 16s rRNA gen sekanslaması, daha küçük sub-bölgelerin analiz edilmesine doğru kaymıştır ancak bu durum, küçük materyaler nedeni ile hatalara sebebiyet verebilmektedir (74).
MetaHit ve İnsan Mikrobiyom Projesi’ndeki veriler kombine edildiğinde, insanlarda, bağırsaklardan 2172 çeşit mikroorganizma izole edildiği görülmüştür; 12 filum (%93,5’i Proteobacteria, Firmicutes, Actinbacteria ve Bacteroidetes (75).
Literatürde, bugüne kadarki çalışmalarda bağırsak mikrobiyotası birçok hastalık ile ilişkilendirilmiş olup vajinal veya endometrial mikrobiyota ile kıyaslamasını yapan bir çalışma bulunmamaktadır. Ayrı olarak bağırsak mikrobiyotasının ya da rektal
mikrobiyotanın infertilite üzerine etkisini araştıran bir çalışma yoktur. Anatomik olarak reproduktif sistem ve alt gastrointestinal sistem ortak lenfatik kanallara drene
olmaktadırlar; bununla birlikte vajen ve rektum yadsınamaz bir komşuluk ilişkisi içindedir. Özellikle disbiyoza uğrayan endometriumlarda, rektal benzerliğin varlığını kanıtlamak için yapılan bu çalışmada gönderilen 12 hastadan, DNA izolasyonu yapılabilmesi adına dört kez eküvyon çubuğu ile örnek alınmış ancak 16S rRNA gen sekanslamalarından, üç kez çalışılmasına rağmen kalite kontrol basamaklarını geçememiş ve sonuç alınamamıştır. Buna neden olarak izolasyon yöntemimizin alınan materyale uygun olmaması, 12
basamaklı DNA izolasyonu esnasında örneklerin kontamine olması ihtimalleri göz önünde bulundurulabilir. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda farklı bir DNA izolasyon yöntemi ve kiti kullanılmasını önermekteyiz.
8. SONUÇ
İmplantasyon, hücresel ve moleküler düzeyde birçok biyolojik fonksiyonun düzenlenmesine ihtiyaç duyan karmaşık bir süreçtir. Mikroorganizma izolasyonu
vererek fertilite üzerine mikrobiyota kavramını oluşturmuştur. Gamet formasyonundan implantasyona ve doğuma kadar sağlıklı bir mikrobiyomun mevcudiyeti birçok çalışmada vurgulanmaktadır. Bu mikrobiyomdaki patolojik kaymalar sonucu disbiyozun
gelişmesinin, kadının sağlığındaki değişimlerin nedeni ya da sonucu olabileceği düşünülmektedir. Bazı araştırmacıların bildirdiği gibi vajen/serviks ve endometrium mikrobiyotasının birbirleri ile korelasyonu bildirilmiştir (76). %20 çalışmada ise endometiral ve vajinal mikrobiyotada kayda değer farklılık izlenmiş olup, endometrial mikrobiyota implantasyon açısından çok daha kıymetli hale gelmiştir (5).
Endometrial mikrobiyom, embriyo implantasyonu ve gebeliğin devamı üzerinde önemli bir role sahip görünmektedir. Lactobacillus dominansının kaybolduğu durumlar,
implantasyon başarısızlığı ve gebelik kaybı ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, sadece fertilite başarısı ya da başarısızlığına yol açan mikroorganizmalar araştırılmamakta, aynı zamanda mikroorganizmaların birbirleri ve konak arasındaki fonksiyonel etkileşimleri üzerinde durulmaktadır. Ne yazık ki endometrial mikrobiyotanın çalışılması, düşük kütleli mikrobiyom içermesinden dolayı, bir takım teknik problemlere yol açmakta ve yanlış yönlendirmelere sebep olabilmektedir; bu nedenle bu örneklerle çalışılırken çok dikkatli olunmalıdır.
Klinik olarak bakılacak olduğunda, endometrial disbiyozun tespiti, infertilite için
endometrial faktörün dışlanması açısından gerekli olan büyük ve yeni bir çalışma alanıdır. Bu çalışmalar, disbiyoza uğramış endometriumun saptanması ve fertilite için uygun endometrial mikrobiyotanın tekrar oluşturulması ve bunun için kişiselleştirilecek tedavi seçeneklerinin sunulmasına kapı açacağı düşünülmektedir. Rektal mikrobiyota ile endometrial mikrobiyotanın birbiri ile ilişkisi hala belirsizliğini korumakla birlikte daha fazla hasta sayısına sahip yeni çalışmaların yapılmasının bu belirsizliği aydınlatacağını düşünmekteyiz.
9. KAYNAKLAR
1. Polanski, L.T., et al., What exactly do we mean by 'recurrent implantation failure'? A systematic review and opinion. Reprod Biomed Online, 2014. 28(4): p. 409-23. .
2. Nelson SM, Klein BM, Arce JC. Comparison of antimüllerian hormone levels and antral follicle count as predictor of ovarian response to controlled ovarian stimulation in good-prognosis patients at individual fertility clinics in two multicenter trials. Fertil Steril 2015; 103:923. .
