T.C.
NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BAZI KURT ÖRÜMCEKLERİN (ARANEAE: LYCOSIDAE) KARYOTİP ANALİZLERİNİN ARAŞTIRILMASI HÜSEYİN TÜRKER Ocak 2016 YÜ KSEK L İSAN S TE Z İ H.TÜRKE R , 2016 NİĞD E ÜN İVER SİTES İ FEN BİLİMLERİ ENS T İTÜSÜ
T. C.
NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI
BAZI KURT ÖRÜMCEKLERİN (ARANEAE: LYCOSIDAE) KARYOTİP ANALİZLERİNİN ARAŞTIRILMASI
HÜSEYİN TÜRKER
Yüksek Lisans Tezi
Danışman
Doç. Dr. Hakan DEMİR
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin bilimsel ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
iv ÖZET
BAZI KURT ÖRÜMCEKLERİN (ARANEAE: LYCOSIDAE) KARYOTİP ANALİZLERİNİN ARAŞTIRILMASI
TÜRKER, Hüseyin Niğde Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Ana Bilim Dalı
Danışman : Doç. Dr. Hakan DEMİR
Ocak 2016, 56 sayfa
Bu çalışmada, Lycosidae familyasına ait Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) ve A. accentuata (Latreille, 1817) türlerinin karyolojik analizleri yapılmıştır. A. accentuata (Latreille, 1817) ile ilgili literatürde herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. A. accentuata (Latreille, 1817) türünün diploid sayısı ve kromozom morfolojisi ilk kez tanımlanmıştır. Türün diploid sayının 2n♂ = 28 (26+X1X2) olduğu belirlenmiştir. Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) ve A. accentuata (Latreille, 1817) türlerinin karyotipik özelliklerinin diğer Alopecosa Simon, 1885 türleriyle aynı olduğu görülmüştür.
v SUMMARY
KARYOTYPE ANALYSIS OF SOME WOLF SPIDERS (ARANEAE: LYCOSIDAE) INVESTIGATION
TÜRKER, Hüseyin Nigde University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor : Assoc. Prof. Hakan DEMİR
Ocak 2016, 56 pages
In this study the analysis of the caryology of Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) and A. accentuata (Latreille, 1817) belonging to family of Lycosidae have been made. About the information of the species A. accentuata (Latreille, 1817) has not found any studies in the literature. Diploid number and chromosome morphology of the species A. accentuata (Latreille, 1817) has been identified for the first time. Diploid number of this species has been determined 2n♂ = 28 (26 + X1X2). Character of the karyotypes of the species of Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) and A. accentuata (Latreille, 1817) were observed the same as other congener of the Alopecosa Simon, 1885 species.
vi ÖNSÖZ
İnsanların en çok karşılaştıkları ve ne işe yaradığı konusunda uzmanlar dışında pek bilgi sahibi olmadıkları örümcekler; eklembacaklıların (Arthropoda) arachnida sınıfında yer almakta olup bilinmeyen özellikleri bilinen özelliklerinden çok fazladır. Dünyada daha çok karalarda bazen de tatlı sularda yaşarlar. En önemli özellikleri böceklerle beslenerek biyolojik dengenin korunmasında görev almalarıdır. Anatomileri, ağ yapımında kullandıkları ipeğin yapısı, dayanıklılığı, ağ şekilleri ve sitogenetik yapısı gibi sahip oldukları birçok karakteristik özelliklerin biyoteknolojik çalışmalara yön göstermesi, yaşam alanlarının çok geniş olması gibi nedenlerden dolayı birçok bilim adamının ilgisini çekmeyi başarmıştır.
Ülkemizin Palearktik bölgedeki konumu son derece önemlidir. Türkiye, kıtalar arasında köprü niteliğinde olmasından dolayı diğer canlı gruplarında olduğu gibi örümcek faunası bakımından da zenginlik arz etmektedir. Amerika ve Avrupa ülkelerinde örümcek karyotip analizlerinin çok uzun yıllar önce tespit edilmiş olmasına karşın bu konu hakkında ülkemizde halen çok az bilgi mevcuttur.
Bu çalışma ile zengin bir biyolojik çeşitliliğe sahip ülkemizin bazı bölgelerinden temin edilen Kurt örümceklerin karyotip analizlerinin belirlenmesi amaçlanmış olup, bu çalışma ileride yapılacak sitogenetik ve sitotaksonomik araştırmalara ışık tutacaktır. Yüksek lisans tez çalışmamın yürütülmesi esnasında, yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren bana her türlü desteği sağlayan Hocam Doç. Dr. Hakan DEMİR’e yine kıymetli tecrübelerinden faydalandığım Doç. Dr. Osman SEYYAR’a ve Yrd. Doç. Dr. Zübeyde KUMBIÇAK’a arazi ve laboratuvar çalışmaları esnasında yardımlarını gördüğüm, uzman biyolog Hakkı Onur KOÇYİĞİT’e ve Esra AZGIN’a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Maddi ve manevi desteğini benden esirgemeyen aileme de çok teşekkür ediyorum.
Bu çalışmaya, FEB 2013/38 BAGEP numaralı proje ile finansal destek sağlayan Niğde Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine ve çalışanlarına katkılarından dolayı teşekkür ederim.
vii İÇİNDEKİLER ÖZET………....iv SUMMARY………...v ÖNSÖZ……….vi İÇİNDEKİLER DİZİNİ………...vii ŞEKİLLER DİZİNİ...ix ÇİZELGELER DİZİNİ………..x FOTOĞRAFLAR DİZİNİ………....xi
SİMGE VE KISALTMALAR ………xii
BÖLÜM I GİRİŞ ... ….……….……..1
1.1 Hücrenin Yapısı ... 2
1.1.1 Hücre Zarı… ... .2
1.1.2 Sitoplazma ... 3
1.1.3 Çekirdek (nükleus) ... 3
1.1.3.1 Çekirdeğin genel yapısı ... 4
1.1.3.2 Çekirdekçik (Nükleolus)... 5
1.2 Kromozomlar ... 5
1.3 Kromozom Morfolojisi ... 7
1.4 Karyotip ... 8
1.5 Mitoz Bölünme ... 8
1.6 Sistematik ile İlgili Bilgiler ... 10
1.6.1 Örümceklerin genel özellikleri ... 10
1.6.2 Lycosidae familyasının genel özellikleri ... 14
1.6.2.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türünün genel özellikleri ... 16
1.6.2.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türünün genel özellikleri ... 17
1.7 Örümcekler Üzerine Yapılan Sitogenetik Çalışmalar ... 18
viii
2.1. Örümceklerdeki Sitogenetik Çalışmalarda Kullanılan Materyal ve Yöntemler ... 27
2.1.1 Araştırma alanı ve örneklerin toplanması ... 27
2.1.2 Testislerin çıkarılması ... 28
2.1.3 Hipotonik çözelti ile muamele ... 28
2.1.4 Materyalin fiksasyonu ... 29
2.1.5 Kullanılan lamların temizlenmesi ... 29
2.1.6 Materyalin lam üzerine alınması ... 29
2.1.7 Kromozomların görünür hale getirilmesi ... 31
2.1.8 Mikroskop ile inceleme ... 32
BÖLÜM III BULGULAR ... 34
3.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) Türüne ait Sitogenetik Bulgular ... 34
3.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) Türüne ait Sitogenetik Bulgular ... 37
BÖLÜM IV SONUÇ VE ÖNERİLER ... 40
KAYNAKLAR ... 47
ÖZ GEÇMİŞ………....55 TEZ ÇALIŞMASINDA ÜRETİLEN ESERLER (MAKALE,BİLDİRİ,POSTER VB.)56
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1. Çekirdeğin genel yapısı ………4
Şekil 1.2. DNA molekülünden metafaz kromozomu oluşumuna kadar organizasyon aşamaları………..……....6
Şekil 1.3. Kromozomların sentromer yerlerine göre sınıflandırılması …………..……...8
Şekil 1.4 Mitoz bölünme döngüsü...………..9
Şekil 1.5 Bir örümceğin dorsal ve ventralden görünüşü...………..………12
Şekil 1.6 Genel bir örümceğin anatomisi ………14
Şekil 1.7 Lycosidae örümceğinin genel vücut yapısı ………..15
Şekil 2.1 Arazi Çalışmasının yapıldığı alanlar……….27
Şekil 3.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türüne ait Metafaz I’deki kromozomlar………..35
Şekil 3.2 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türüne ait Metafaz I’deki kromozomlar ve pixel olarak uzunlukları………35
Şekil 3.3 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türüne ait karyogram………36
Şekil 3.4. Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türüne ait Metafaz I’deki kromozomlar………...38
Şekil 3.5 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817)türüne ait Metafaz I’deki kromozomlar ve pixel olarak uzunlukları………..……….38
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge1.1 Örümceklerde eşey kromozom bazı familyalara göre dağılımı ………..20 Çizelge 3.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türüne ait kromozomların relatif
uzunlukları (RCF) ve kromozom morfolojileri (CM)………. 36 Çizelge 3.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817)türüne ait kromozomların relatif
uzunlukları (RCF) ve kromozom morfolojileri (CM)……….. 39 Çizelge 4.1 Alopecosa cinsine ait diploid kromozom sayıları belirlenmiş türlerin listesi .40 Çizelge 4.2 Lycosidae türlerine ait diploid sayıları belirlenmiş türlerin listesi…………. 41
xi
FOTOĞRAFLAR DİZİNİ
Fotoğraf 1.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türünün genel görünüşü…………...17
Fotoğraf 1.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türünün genel görünüşü …………..18
Fotoğraf 2.1 Testislerin çıkarılmasında opistosoma ve testisin görünüşü………..28
Fotoğraf 2.2 Materyalin lam üzerine alınması………....30
Fotoğraf 2.3 Preparat hazırlanması……….31
Fotoğraf 2.4 Giemsa boyama takımı………...……….…………..32
xii SİMGE VE KISALTMALAR Simgeler Açıklama º C Derece ♀ Dişi ♂ Erkek % Yüzde Kısaltmalar Açıklama K Karyotip S Sentez Fazi MT Mikro Tübül
P Kromozomun Kısa Kolu q Kromozomun Uzun Kolu dk Dakika
DNA Deoksiribo Nükleik Asit A Akrosentrik
T Telosentrik RNA Ribo Nükleik Asit cm Santimetre
RCF Kromozomların Relatif Uzunlukları CM Kromozom Morfolojileri
1 BÖLÜM I
GİRİŞ
Dünyada genetikle ilgili ilk çalışmaların bitki ve hayvan ıslahı ile başladığı kabul edilmektedir. Sonraki çalışmalarda sinekler, bakteriler, virüsler, mayalar, küf mantarları, bir hücreliler, solucanlar, fareler ve insanlar gibi organizmalardan yararlanılarak araştırma alanı genişletilmiştir. Diğer bilim dallarında olduğu gibi sitogenetik konusunda da ilk bilimsel çalışmalara Hipokrat ve Aristo dönemlerinde rastlanılmaktadır. Bu dönemdeki bilim adamları dikkatlerini maddenin fiziksel yapısını ve bu maddenin bir organizmayı nasıl meydana getirdiğini anlamaya yöneltmişlerdir. Başlangıçta, ilkel organizasyonlu canlıların kokuşmakta olan organik maddelerden kendiliğinden meydana geldiği savunulmuştur. Daha sonra F. Redi, L. Spallazani, L. Pasteur ve J.Tundall tarafından yapılan deneylerle bu fikir çürütülmüş ve bu gün bir canlının mutlaka kendine benzer bir canlıdan meydana geldiği kanıtlanmıştır (Kuru ve Ergene, 2011).
Yirminci yüzyıla girerken, maddenin atomlardan meydana geldiği, canlı organizmaların gerek yapı ve gerekse işlevsel olarak en küçük biriminin hücre olduğu, hücrelerin çekirdeklerinde iplik benzeri yapı olan kromozomların bulunduğu ve bu kromozomların sayı ve taşıdıkları özellikler bakımından her bir tür için sabit olduğu bilgilerine ulaşılmıştır (Kuru ve Ergene, 2011).
Günümüze kadar örümcekler üzerine fauna, sistematik ve ekolojik alanlarda bir çok çalışma yapılmıştır. Özellikle avlanma, beslenme, ağ örme, ağların şekli ve sistematikteki önemi, morfolojik ve taksonomik özellikleri, ekolojileri, coğrafik dağılışları, ışık ve elektron mikroskobu ile anatomik, histolojik ve sitolojik yapıları hakkında önemli veriler elde edilmiştir (Obalı, 2005). Ancak örümceklerle ilgili sitogenetik araştırmaların sınırlı sayıda olması nedeniyle elde edilen kromozomal verilerin örümcek sistematiğinde kullanışlı olup olmadığı kesin olarak bilinmemektedir. Bu nedenle ülkemizin bulunduğu coğrafik konum itibariyle zengin bir faunaya sahip olması bu alanlara yönelik çalışmaların hız kazanması önemli olacaktır (Kuru ve Ergene, 2011). Örümcekler, üyesi olduğu şube içerisinde sitogenetik açıdan en fazla çalışılmış grup olmasına rağmen sadece %1,7’sinin genetik özellikleri bilinmektedir (Araujo, 2013).
2
Bu çalışmada Lycosidae familyasına ait Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) ve Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türlerine ait sitogenetik özelliklerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda taksona ait diploid kromozom sayısı, eşey belirleme sistemi elde edilmiştir. Ayrıca, bu verilerin Lycosidae familyası için ayırt edici karakterler olup olmadığı da tartışılmıştır.
1.1 Hücrenin Yapısı
Tüm organizmalar hücrelerden oluşur (Reece, 2013). Biyolojik organizasyon hiyerarşisinde hücre, canlının canlılık özellikleri taşıyan, yapı ve görev bakımından en küçük parçasıdır. Hücreler, dokular ve organlar halinde daha üst organizasyon düzeylerinde bir araya gelmiş olsalar da, hücre, organizmanın yapısal ve işlevsel olarak temel birimi olarak kalır (Reece, 2013). Canlı organizmalar bu birim veya birimlerin birleşmesiyle oluşur (Dilsiz, 2009).
Hücrelerin hepsi çeşitli temel özellikleri paylaşırlar. Bütün hücreler hücre zarı adı verilen seçici geçirgen bir zarla çevrilidir. Hücrelerin iç kısmında hücre altı elemanlarının asılı olduğu sitoplazma adı verilen kolloidal özellikte bir madde bulunmaktadır. Bütün hücreler yönetici moleküllere ve bu yönetici moleküllerin verdiği talimatlara uygun olarak protein sentezleyen küçük kompleksler olan ribozomlara sahiptir (Reece, 2013). Ökaryot hücreler, hücre zarı, sitoplazma ve çekirdek olmak üzere üç bölümde incelenebilir.
1.1.1 Hücre Zarı
Hücre zarı, hücreyi dış ortamdan ayıran, seçici geçirgen yapıdır. Hücre zarı hücreye şekil vermekle birlikte aynı zamanda hem hücrelerin birbirleriyle iletişimini hem de besin maddelerinin, artık maddelerin hücreye giriş ve çıkışını düzenlemektedir. Protein, yağ ve az miktarda da karbonhidrat molekülünden meydana gelmiştir (Erensayın ve Konuk, 2004).
Bütün hücrelerde bulunan bu yapı hücreyi dış etkilerden korur (Kuru, 2001). Hücre zarı hücreyi sınırlandırarak iç ve dış ortamların birbirinden ayrılmasını sağlar. Hücre zarı seçici geçirgen bir yapı olarak görev alır. Hücre dışı ortamdan istenmeyen materyallerin girişi ve ihtiyaç duyulmayan metabolitlerin çıkışı bu bariyer aracılığıyla önlenir
3
(Lodish, 2011). Böylece, hücrenin iç ve dış ortamı arasındaki su, besin ve atıkların hareketleri plazma zarı ile düzenlenir (Kuru, 2001).
1.1.2 Sitoplazma
Sitoplazma, hücre zarı ile çekirdek zarı arasında kalan hücre bölümünü kaplayan, homojen nitelikte, kolloidal ve devamlı değişim halinde bulunan bir eriyiktir. Sitoplazma inorganik maddeler, organik maddeler ve % 60-95 arasında değişen sudan oluşur. Sitoplazmanın içerisinde çeşitli canlı yapılar ve cansız yapılar bulunur (Reece, 2013).
1.1.3 Çekirdek (nükleus)
Hücrelerin bölünme halinde olmadıkları zamana interfaz evresi denir. İnterfaz halindeki her hücrenin çekirdeği hücre tipine ve kullanılan fiksatife göre değişik olabilen bir komplekslik gösterir. Genellikle çekirdek hemen hemen hücrenin ortasında yer alır. Canlı hücrelerde çekirdek ışık mikroskobunda, ışığı daha çok kırıp aksettirdiği için parlak renkte, homojen ve oldukça yuvarlak bir yapı halinde görülür (Karol vd., 2000). Faz kontrast mikroskobu ile canlı hücre çekirdeğinde ipliksi bir yapı görmek mümkündür. Kromatin denen bu ipliksi yapı, çekirdek içinde düzgün bir şekilde dağılmış olabileceği gibi küçük topluluklar halinde de bulunabilir. Çekirdekte hücre döngüsü esnasında kromatin yoğunluğu değişmektedir. İnterfazda, hücre kromatininin büyük bir kısmı yoğunlaşmamıştır ve çekirdek içine dağılmıştır. Bu durumda olan kromatin iplikçiklerine ökromatin adı verilir. Hücre döngüsünün bu periyodunda genler kopyalanmış ve DNA hücre bölünmesi için iki kat çoğaltılmıştır. İnterfaz çekirdeklerinde ökromatinin çoğu 30 nm’lik yaklaşık 50 ile 100 kb’lık DNA içeren geniş ilmikler içinde organize olmuş iplikçik seklinde görülmektedir. Ökromatinin tersine interfaz esnasında, kromatinin yaklaşık % 10’u yüksek oranda yoğunlaşmıştır ve kopyalanma için inaktif durumdadır. Bu durumdaki kromatin iplikçiğine heterokromatin adı verilir. Bunlar sentromer ve telomerlerde bulunurlar. Hücreler iki tip heterokromatine sahiptir. Yapısal heterokromatin, asla kopyası çıkarılmayan, sentromerde satellit (uydu) diziler görünümünde DNA dizilerini içerir. Zorunlu olmayan heterokromatin, incelenen hücrelerde kopyalanamayan dizileri içerir. Bundan dolayı, zorunlu olmayan heterokromatinin miktarı hücrenin kopyalama aktivitesine bağlı olarak değişir (Cooper, 1997).
4
Kromatinler, çoğunlukla çekirdeğin çevresine doğru, çekirdek kılıfı altına yerleşmiştir. Bu ipliksi yapı arasında bir veya birkaç çekirdekçik (nükleolus) yer alır (Karol vd., 2000).
1.1.3.1 Çekirdeğin genel yapısı
Bir çekirdeğin varlığı ökaryotik hücreleri prokaryotlardan ayıran temel özelliktir. Genom bulundurmasıyla, hem genetik bilgiye ulaşım yeri ve hem de hücrenin kontrol merkezi görevini üstlenir. DNA’nın kendini eşlemesi, transkripsiyonu ve RNA işlenmesi çekirdekte gerçekleşir. (Şekil 1.1)
Şekil 1.1 Çekirdeğin genel yapısı (Alberts vd., 2002)
Çekirdek zarfı genomu sitoplazmadan ayırarak, sadece ökaryotlarda görülen bir sistem ile gen ekspresyonunun düzenlenmesini sağlar. Prokaryotlarda mRNA proteine çevrilirken transkripsiyonu da devam etmektedir, ökaryotlarda ise mRNA çekirdekten sitoplazmaya aktarılmadan önce transkripsiyon sonrası birçok işlemden geçmektedir. Çekirdeğin varlığı, gen ekspresyonunun alternatif kesip-ekleme gibi transkripsiyon sonrası mekanizmalarla düzenlenmesine imkan sağlar. Çekirdek zarfı seçilmiş proteinlerin genetik materyale ulaşmalarını kısıtlayarak, gen ekspresyonunun trankripsiyon düzeyinde kontrolünde yeni bir olanak sağlamaktadır. Örneğin, bazı ökaryot genlerin ekspresyonları, ilgili transkripsiyon faktörlerinin sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasının düzenlenmesiyle kontrol edilir. Prokaryotlarda bu şekilde
5
transkripsiyon düzenlenmesi olanaksızdır. Genomun mRNA translasyon bölgesinden ayrılmasıyla, ökaryot gen ekspresyonunda merkezi bir rol gerçekleşir (Cooper, 1997). 1.1.3.2 Çekirdekçik (Nükleolus)
rRNA’nın kopyalandığı, isleme tabi tutulduğu ve ayrıca ribozomun toplandığı bölge olması nedeniyle çekirdekte en önemli alt yapı çekirdekçiktir. Hücreler protein sentezi için ihtiyaçlarını karşıladıkları sayısız ribozoma gereksinim duyarlar. Örneğin, aktif olarak büyüyen memeli hücreleri, hücre bölünmesinin her bir evresinde sentezlenmesi gereken 5 ile 10 milyon arasında değişen ribozoma sahiptirler. Çekirdekçik, rRNA’lardan bu büyük çaptaki üretim ihtiyacını karşılayacak ve ribozomal alt ünitelerinin bir araya toplanmasını sağlayacak özellklere sahip bir ribozom fabrikasıdır. Bir zar tarafından çevrelenmeyen çekirdekçik 5,8S, 18S ve 28S rRNA genlerini içeren kromozomal bölgelerin civarında organize edilmiştir. Ökaryotik ribozomlar 4 tip RNA (5S, 5,8S, 18S ve 28S)’dan meydana gelir. 5,8S, 18S ve 28S rRNA’lar 45S ribozomal haberci RNA’lardan oluşan RNA polimeraz I enzimiyle çekirdekte tek bir ünite olarak kopyalanmıştır. 45S haberci rRNA 40S (küçük) ribozomal alt ünitesinden 18S rRNA’ya ve 60S (büyük) ribozomal alt ünitesinden 5,8S ve 28S rRNA’larına doğru özel isleme tabi tutulur. 60S ribozomal alt ünitesinde bulunan 5S rRNA’nın kopyası çekirdekçiğin dışına doğru hareket eder ve RNA polimeraz II tarafından katalize edilir (Saygun, 2005).
1.2 Kromozomlar
Kromozomlar ilk defa 1840 yılında botanikçi Hofmeister tarafından Tradescantia cinsi bitkisinin polen hücrelerinde görülmüş ve ilk kromozom çizimleri ise Flemming tarafından 1882’de yayımlanmıştır (Bozcuk, 2011). Waldeyer tarafından da 1888 yılında hücre bölünmesi sırasında çekirdek içinde iplik şeklinde beliren yapılar ışık mikroskobunda gözlenerek kromozom olarak adlandırılmıştır (Kumbıçak, 2010).
Kromozom kelime anlamı olarak renkli yapılar manasına gelmektedir (Bozcuk, 2011). Hücre bölünmesi olayı esnasında özel boyalarla boyanınca ışık mikroskobu altında ipsi yapılar olarak görüldüğü için böyle isimlendirilmiştir (Bozcuk, 2011).
Yaşamın sürekliliği, kromozomların devamlılığına dayanır (Demirsoy, 1993). Kromozomların şekli, sayısı ve uzunluğu tür içinde sabit, akraba türler arasında benzerdir. Bununla birlikte, bazı nadir durumlarda aynı türün populasyonu içinde ve
6
akraba türler arasında kromozomların sayısı ve yapısında farklılıklar bulunur (Lodish, 2011). Farklı türlerin kromozom sayıları eşit olabilir ama bu durumda da şekil ve yapıları arasında fark vardır (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010).
Kromozomlar normal bir hücrede kromatin ağ şeklindedir ve belirgin değildir (Şekil 1.2). Profazdan başlayarak gittikçe kıvrılan ve kalınlaşan kromatin ağ sonunda ait olduğu canlıya özgü bir sayı ve şekle ulaşır (Kuru ve Ergene, 2011). Bir canlının kromozomları en iyi şekilde mitozun metafaz evresinde incelenebilmektedir.
Çünkü kromozomlar bu evrede en kısa boya ve en fazla kalınlığa erişmiştir. Her bir kromozomun bu görünüşü sabittir ve hücre bölünmesinde aynen korunurlar (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2011).
Şekil 1.2 DNA molekülünden metafaz kromozomu oluşumuna kadar organizasyon aşamaları (Reece, 2005)
7
Eşeyli üreme gösteren canlılarda bir bireyin hücrelerindeki kromozom sayısı, bulunduğu hücre çeşidine göre değişmektedir. Örneğin yüksek yapılı bitki ve hayvanların eşey hücrelerinde her bir kromozom çeşidinden sadece bir tane bulunur. Buna göre eşey hücrelerindeki kromozomlar o canlının haploit kromozom sayısını oluşturur. Eşey hücrelerindeki kromozom sayısına takım ya da genom adı verilir. Kısaca n harfiyle gösterilir. Somatik hücrelerde (vücut hücrelerinde) eşey hücrelerinden farklı olarak her bir kromozom çeşidinden iki tane bulunur, bunlara homolog kromozom denir. Döllenme sırasında, homolog kromozomlardan biri anneden diğeri ise babadan gelir (Saygun, 2005). Bu hücrelerde taşınan kromozom sayısına diploit kromozom sayısı denir. İki kromozom takımı bulunduğunu ifade etmek için de kısaca 2n olarak gösterilir.
Diploit bir organizmanın somatik hücrelerdeki kromozomlar bir başka açıdan da şu şekilde adlandırılabilir; diploitlerde daima birer çift bulunan ve biçimleri aynı olanlara otozom kromozom; canlının eşeyine göre biçimleri aynı veya farklı olabilir, bunlara da eşey kromozomları (gonozom) adı verilir. Otozomlar sayı ile belirtilirken gonozomlar X ve Y harfleriyle gösterilirler (Saygun, 2005).
1.3 Kromozom Morfolojisi
Kromozom morfolojisinin araştırılması için hücre bölünmesinde en uygun evreler metafaz ve anafazdır. Kromozomlar genel olarak aralarında açı bulunan iki koldan oluşur. Kollar primer boğumla birbirinden ayrılmıştır. Her kromozom p ve q koluna sahip olup, p (petit=küçük) kısa ve q uzun kolu ifade eder. Bir karyotip yapıldığında daima q kolu altta ve p kolu da üsttedir (Shaw, 2000). Kromozomların genel morfolojik şekilleri sentromerlerin bulunuş yerlerine bağlıdır. Sentromerin yeri kromozomun ortasında, ucunda, daha içeride veya arada bir yerde bulunabilir. Böylece kromozomun kolları oluşur. Sentromerin yerine göre kromozomlar V,I,İ veya L harfi biçiminde görülebilir. Buna göre sekil bakımından dört tip kromozom meydana gelir. Sentromer kromozomun bir ucunda olursa telosentrik, biraz daha içerde olup “i” harfine benzerse akrosentrik kromozomlar oluşur. Sentromer kromozomun tam orta noktasında olup uzun ve kısa kolu eşit parçaya ayırırsa metasentrik ve sentromer ortalarda olup eşit olmayan kollar meydana getiriyorsa submetasentrik kromozomlar meydana gelir (Elçi, 1994)
8
Şekil 1.3 Kromozomların sentromer yerlerine göre sınıflandırılması (Kumbıçak, 2010)
1.4 Karyotip
Mitotik kromozom şekillerinin belirlenmesi için standart sınıflandırma sistemi ilk defa Levan vd. (1964) tarafından bulunmuştur. Bir bireyin kromozomlarının sayısına, şekline ve büyüklüğüne o bireyin karyotipi denir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010). Yani karyotip tek bir hücrenin boyutlarına göre sıralanmış ve dizilmiş metafaz kromozomlarını gösterir. Örneğin yaklaşık olarak 30 bin geni içeren insan DNA’sının tamamının resimleri olarak nitelendirilebilir (Saygun, 2005). Kromozomun uzunluğu ve sentromer pozisyonu metafazdaki bir kromozomun iki ayırıcı özelliğidir.
Eşey kromozomları, uzunluklarına bakılmaksızın otozomal çiftlerden sonra yerleştirilir. Bir türe ait karyotip hazırlanmasıyla, türün diploid sayısı, kromozomlarının morfolojileri, eşey kromozom sistemlerinin belirlenmesi tamamlanmış olur (Karataş, 2014). Rutin olarak boyanmış kromozom preparatlar karyotip hakkında genel bir bilgi verirken, daha ayrıntılı analizler için çeşitli boyama ve C, R ve G bantları gibi bantlama teknikleri geliştirilmiştir (Lodish, 2011).
1.5 Mitoz Bölünme
Organizmaların kendilerine benzer yapıda bireyler oluşturma yeteneği, onları cansız maddelerden ayırt eden en belirgin özelliklerden birisidir. Bütün biyolojik işlevler gibi, sadece canlılara özgü bu yetenek de hücresel bir temele dayanır. Canlılığın devamlılığı hücre bölünmesine bağlıdır (Reece, 2013).
Bir organizma için gerek sayı, gerek şekil bakımından kendine özgü olan kromozom takımının değişmeden devamını sağlayan hücre bölünmesi mitoz bölünmedir. Çok
9
hücreli organizmalarda vücut hücreleri mitoz bölünme ile çoğaldığından mitoz bölünmeye somatik bölünme de denilmektedir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010). Ökaryot hücrelerde hücre bölünmesi çekirdek ve sitoplazma bölünmeleri şeklinde meydana gelir. Çekirdeğin ebeveynlerdeki kromozom sayısı kadar kromozom içeren yavru çekirdekler oluşturacak şekilde ikiye bölünmesinden sonra, sitoplazma da ikiye bölünür (Kumbıçak, 2010). Mitoz bölünme sırasında gerçekleşen çekirdek bölünmesine karyokinez ve karyokinezi izleyen sitoplazmanın ikiye bölünmesi olayına da sitokinez denir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010). Mitoz, hücre döngüsünün sadece bir kısmını kapsar. Mitotik (M) evre, hem mitozu hem de sitokinezi kapsar ve genellikle hücre döngüsünün en kısa parçasıdır. Mitotik hücre bölünmesini, çok daha uzun bir evre olan interfaz izler. Bu evre döngünün yaklaşık %90’nını kapsar. İnterfaz sırasında hücre büyür ve bölünme için kromozomlarını kopyalar. İnterfaz, G1, S ve G2 evrelerinden oluşur (Reece, 2013). Mitoz evresinin sonu ile hücredeki DNA’nın kendini eşlemeye başlaması arasında geçen büyüme gelişme evresine G1 evresi, G1 evresinin sonundan kromozomların kendini eşlemesine kadar geçen süreye S evresi ve kromozomların eşlenmesinden bölünmenin başlayacağı süreye kadar olan hazırlık evresine G2 evresi denir (Demirsoy, 1983).
Şekil 1.4 Mitoz bölünme döngüsü (Kuru ve Ergene, 2011)
Bölünme geçirmeyen hücreler interfaz safhasındadır. Bu safhada çekirdek ve çekirdekçik belirgin bir şekilde görülür. Kromozomlar düzensiz ve ince kromatin iplikleri yığını şeklindedir. Bu kromozomlara mikroskopta bakıldığında veya herhangi
10
bir boyama tekniği uygulandığında kalın iplikler şeklinde görülmezler (Kuru ve Ergene, 2011).
Mitoz bölünmenin başlangıcını saptamak olanaksızdır. Fakat hücre çekirdeğinin jel haline geçmesi, metabolizmanın durması ve çekirdeğin hacminin hızla büyümesi gibi hücrede bazı değişiklikler olur. Kromatin iplikleri belirginleşir ve boyanmaya başlar. G2 evresinin tamamlanması, kromozomların türe özgü şekil ve sayıyı kazanmasıyla mitoz bölünmeye geçilir. Işık mikroskobunda kromozomlar artık rahatlıkla görülebilir (Demirsoy, 1983).
1.6 Sistematik ile İlgili Bilgiler
1.6.1 Örümceklerin genel özellikleri
Eklembacaklılar (Arthropoda) şubesinde yer alan Araknidler, yaklaşık 60.000 kadar türle temsil edilmektedir. Araknidler; bazı üyelerinin zehirli olmaları, av-avcı ilişkisine dayalı olarak biyolojik mücadelede kullanılmaları, sahip oldukları birçok karakteristik özelliklerin biyoteknolojik çalışmalara yön göstermesi, yaşam alanlarının çok geniş olması gibi nedenlerden dolayı birçok bilim adamının ilgisini çekmeyi başarmıştır (Kumbıçak, 2010). Dünyada özellikle tarımsal ekosistemlerde yapılan faunistik ve ekolojik çalışmalarda örümceklerin önemli predatörler olduğu bilinmektedir. Bu nedenle örümcekler, ekolojik dengenin sağlanmasında ve biyolojik kontrolde büyük rol oynamaktadır.
Günümüze kadar örümcek türleri hakkında pek çok çalışma yapılmıştır. Özellikle son 50 yıl içerisinde yoğun araştırmalara konu olan örümcekler üzerinde avlanma, beslenme, ağ örme, ağların şekli ve sistematikteki önemi, morfolojik ve taksonomik özellikleri, ekolojileri, coğrafik dağılışları, ışık ve elektron mikroskobu ile anatomik, histolojik ve sitolojik yapıları gibi değişik araştırmalar yapılmıştır. Çalışmalar özellikle fauna, sistematik ve ekoloji alanlarında yoğunlaşmıştır (Demir ve Seyyar, 2008; Topçu ve Demir, 2004; Demir vd., 2006, Demir vd., 2007, Demir vd., 2008a, Demir vd., 2008b, Demir vd., 2008c, Demir vd., 2008d, Demir vd., 2008e, Demir vd., 2008f, Demir vd., 2008g, Demir vd., 2009a, Demir vd., 2009b, Demir vd., 2010a, Demir vd., 2010b, Demir vd., 2012a, Demir, 2012b, Demir, 2015, Demir vd., 2015, Demir, 2016, Tanasievitch vd., 2004, Seyyar vd., 2006, Seyyar vd., 2008a, Seyyar vd., 2008b, Topçu vd., 2007).
11
Canlıların genel özelliklerinden birisi, belli bir eşeye sahip olmalarıdır. En basit hücrelilerden, en yüksek organizasyonlu çok hücrelilere kadar birçok canlıda bu tür bir özelliği görmek mümkündür. Böyle bir özellik nedeniyle döller arasında gen alış verişi ve buna bağlı olarak da biyolojik çeşitlilik sağlanmaktadır (Kuru ve Ergene, 2005). Örümceklerde vücut sefalotoraks ve abdomenden (prosoma ve opistosoma) oluşmaktadır. Bu iki kısım birbirine pedisel adı verilen bir yapı ile birleşmiştir. Sefalotoraks sert kitinli bir kalkanla örtülmüştür. Baş üzerinde gözler ve keliser bulunur. Basit gözlere sahiptirler.
Sekiz gözleri bulunur, fakat bu göz sayısı altı, dört veya iki de olabilir. Hatta bazı mağara türlerinde gözler tamamen yok olmuştur. Gözler baş üzerinde “göz alanı” denilen bölgede yer alır ve her örümcek ailesinin özelliklerini bu göz dizilişleri belirler. Örümceklerin bazılarında medial gözler koyudur. Bunlara “gece gözleri” denir. Bazılarında ise açık renklidir. Bunlara “gündüz” gözleri denir (Babaşoğlu, 1999).
Örümceklerde sefalotoraks altı çift üyeye sahiptir. Birinci çift üyeye keliser denir. Keliserler, bazal eklem ve tırnak eklemlerinden oluşmuştur. Keliserler besini tutmaya, parçalamaya ve avın vücudunu delmeye yararlar. Keliserler membranın yardımı ile hareketli sefalotoraksa birleşirler. Bu eklemin içinde gelişmiş kaslar ve zehir bezleri bulunur. Zehir bezleri tam anlamıyla keliserin bazal eklemine yerleşmiştir. Tırnaklar ise hareketlerine yardımcı olur. İkinci çift üyelere pedipalp denir. Pedipalpler 5-6 eklemden oluşmuşlardır. Bunlar koksa, trochanter, femur, patella, tibia, tarsus ve tırnaktır. Pedipalpler erkek bireylerde çiftleşme organına dönüşmüşlerdir. Pedipalpin sterniti genellikle serbest yerleşir ve alt dudağı oluşturur. Alt dudak ön ağız boşluğunda girişi kapatır. Ön ağız boşluğu, ön tarafından keliserlerde sınırlandırılmış, yan taraflarında ise alt çenelerle örtülmüştür (Babaşoğlu, 1999). Cinsi olgunluğa ulaşmış erkek ferdin tarsusu gelişmiş ve kaşık şeklini almıştır. Bu yapıya “simbium” denir. Çiftleşme organının proksimal kısmına “hematodaka”, distal kısmına ise “bulbus” denir. Erkeklerde palpin son ekleminin bulbusu, embolus ile biter. Bu örümceklerde penis görevini yapar. Embolus çok sayıda bezlerle donatılmıştır. Bu bezler sayesinde erkek ferdin cinsiyet organının dişi ferdin cinsiyet organında kalması kolaylaşır (Babaşoğlu, 1999).
12 ŞE KİL 1.5 Bir ör üm ceğ in dor sa l ve ventr alde n g örünüş ü (Griggs, 2006)
13
Bu tüylerin yerleşmesi, ölçüleri ve sayıları örümcek cinslerinin sistematiğinde önemli bir yer tutar. Sefalotoraks pedisel ile abdomene birleşir. Abdomen yumuşak olduğu için genişleyebilir. Kutikula ile sınırlanmış bütün bir torba halindedir. Abdomen küçük anal kabarcıkla son bulur. Abdomenin ventral yüzeyi daha karmaşık bir yapıya sahip olup burada cinsiyet açıklığı, dişinin çiftleşme organları, stigmalar ve örü memeleri bulunur (Babaşoğlu, 1999).
Birçok örümcek türünün dişi fertlerinde, cinsiyet açıklığının yakınında, bağımsız, erkek ferdin sperminin bırakıldığı bir çift delik bulunur. Çiftleşme zamanı spermler erkeğin embolusundan, dişinin sperm kabul edicilerine (Reseptacula seminis) veya sperm kanallarına bırakılır. Spermler burada uzun süre kalabilir. Bu delikler örümceklerde epigastrial yarıklar üzerinde yerleşen “epijin” sahasında bulunur. Epijinin morfolojik özellikleri (çıkıntılarının bulunması, medial levhaların şekli, çukurların yerleşmesi gibi) erkek ferdin karmaşık yapıdaki çiftleşme organına kolay ve zamanında yerleştirme imkânı verir (Babaşoğlu, 1999).
Örü memeleri, opisthosoma eklemlerinin 4-5. bacaklarının şekil değiştirmesi sonucu oluşarak abdomenin ventral tarafında yerleşir. Çoğu kez abdomenin en ucundadırlar. Bunların sayısı farklı familyalarda değişebilmektedir. Evrimleşmeye bağlı olarak sayıları zamanla azalmıştır. Örü memelerin de ağ boruları mevcuttur. Bu borulardan bez salgısı çıkar ve hava ile temas ettiğinde sertleşerek iplikçik şeklini alır (Babaşoğlu, 1999).
Örümceklerin dişileri çoğunlukla erkeklerinden daha iridir. Örümceklerde sosyalite yoktur. Çünkü iri yapılı dişiler, erkekleri ile de beslenirler. Bu yüzden örümceklerin çiftleşmeleri esnasında erkek için ölüm tehlikesi vardır. Bazı erkekler önce dişilerin açlığını gidermeyi düşünür. Erkek dişiye bir böcek sunar. Böylece açlığı giden dişiye yaklaşmak daha kolay olur. Buna düğün dansı denir. Uzun bir dans evresinden sonra dişi örümcek uygun görürse erkek yaklaşır. Dişi örümcek açlığını hatırlayınca yeniden erkeği yemeyi düşünür. Bu yüzden erkekler çiftleşmeden hemen sonra kaçarlar. Dişi örümcekler yumurtalarını ağ ipi ile yaptıkları kozalara bırakırlar. Bazen bir kozada yüzlerce yumurta bulunur. Sonbaharda döllenen yumurtalardan ancak ilkbaharda yavru
14
çıkar. Yaz başlarında döllenen yumurtalarda 20-60 gün içinde yavru çıkar (Babaşoğlu, 1999).
Şekil 1.6 Genel bir örümceğin anatomisi (Campbell ve Reece, 2010)
1.6.2 Lycosidae familyasının genel özellikleri
Dünyada geniş bir yayılım gösteren örümceklerin 114 familyası vardır. Bunlardan Lycosidae familyası cins ve tür bakımından örümceklerin en zengin gruplarından biridir. Lycosidae familyası 120 cins ve 2399 tür ile Linyphiidae, Salticidae, Araneidae familyalarından sonra dünyanın dördüncü büyük örümcek familyasını oluşturmaktadır (Platnick, 2015). Lycosidae familyası, Araneomorphae (Labidognatha) alttakımı içerisinde yer almakta olup, karakteristik göz dizilişleriyle diğer familyalardan kolaylıkla ayırt edilmektedir (Foelix, 1996).
Diğer örümcek familyalarında olduğu gibi Lycosidae familyası üyelerinde de vücut prosoma (sefalotoraks) ve opistosoma (abdomen) olmak üzere iki kısımdan oluşur. Bu iki kısım birbirine pedisel adı verilen bir yapı ile bağlanır (Foelix, 1996). Prosoma, dorsalde karapaks adı verilen sert ve kalkan şeklinde sklerize olmuş bir yapı ile kaplı olup; dört çift yürüme bacağı, bir çift keliser ve bir çift pedipalp ihtiva eder. Prosomanın ön kısmında ise gözler bulunur (Foelix, 1996). Opistosoma genellikle ince ve sık kıllarla kaplı olup, torba şeklinde bir yapıya sahiptir. Opistosomanın uç kısmında ise örü memeleri bulunur (Foelix, 1996).
15
Şekil 1.7 Lycosidae örümceğinin genel vücut yapısı (Barrion, 1995)
Lycosidae familyasında prosomada iki sıra halinde dizili sekiz basit göz bulunur. İlk sırada, ancak önden bakıldığında görülebilen eşit büyüklükte dört küçük anterior göz; ikinci sırada ise ortada çok büyük iki posterior median göz ve arka yanlarda orta büyüklükte iki posterior lateral göz bulunur. Üstten bakıldığında bu göz dizisi çok kuvvetli iç bükey bir sıra oluşturur. İkinci sıradaki gözler aynı zamanda ön tarafı dar olan bir yamuk meydana getirir. Gözler ve görüş alanları çok iyi gelişmiştir (Roberts, 1995).
Prosomada bulunan bacaklar oldukça kuvvetli olup, vücuda bağlandığı yerden itibaren koksa, trokanter, femur, patella, tibia, metatarsus ve tarsus segmentlerinden oluşur. Hemen her segmenti diken ve bazen de uzun bir trikobotrium bulundurur. Bacak uçlarında kitinsi, taraklı iki tırnak ve bunların alt orta yerinde taraksız küçük bir tırnak yer alır (Roberts, 1995).
16
Keliseri şişkince olup, oluğun iç kenarında 2 veya 3 diş bulundurur. Prosomada bulunan pedipalpler, erkeklerde çiftleşme organı olarak görev yapar. Türler arasında büyük çeşitlilik gösteren pedipalpler; koksa, trokanter, femur, patella, tibia ve tarsus olmak üzere altı segmentten oluşur (Roberts, 1995).
Lycosidae familyasının bir kısmı nokturnal, bir kısmı diurnal, çok azı ise nokturnaldiurnaldır. Oldukça hızlı hareket etmelerine rağmen avlarını yakalarken aktif bir şekilde hareket etmez ve avının ortaya çıkmasını bekler (Roberts, 1995).
Lycosidae familyası görüş alanlarının iyi olması nedeniyle avının kanat çırpıntısına ya da karakteristik yürüme biçimlerine karşı tepki gösterir. Fakat gözleri yalnızca basit şekilleri idrak edebilir. Bu yüzden sadece yakın olan nesneleri uyarıcı olarak algılar (Roberts, 1995).
Lycosidae familyasının (kurt örümcekleri) çoğu ilkbahar aylarında erginleşir. Erkek örümcek bir dişi bulur ve eşleşir. Döllenen dişi örümcekler, mayıs-haziran döneminde ipeksi ağlarıyla bir kokon örer ve içine yumurtlar. Ancak dişiler, yaz aylarında bazen ikinci bir kokon, hatta güze doğru üçüncü bir kokon daha örebilir (Roberts, 1995). Lycosidae familyası, tarımsal ekosistemlerin önemli predatörleri arasında yer alır. Bu örümceklerin, tarımsal alanlarda çalışan entomolog ve zoologların karşısına böcekler ile birlikte sıkça çıkması, araştırmacıları bu hayvan grubunun hayat çevrimi, habitat tercihleri, beslenme, üreme ve sitogenetik yapıları gibi birçok konunun araştırılmasına yöneltmiştir (Bayram, 1993).
1.6.2.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türünün genel özellikleri
Erkeklerde vücut uzunluğu 5-8 mm’dir. Tibia hafif şekilde koyudur fakat şişkin veya uzun kıllarla kaplı değildir. Birinci bacak tibiasında şişkinlik veya uzun koyu tüyler olmamasıyla diğer lycosidae türlerinden ayrılır (Roberts, 1995).
Fundalık, çayır ve tarımsal alanlarda yaşar. İlkbahardan sonbahara kadar görülür. Erkeklerine yaz ortasına kadar az da olsa rastlamak mümkündür (Roberts, 1995).
17
Fotoğraf 1.1 Alopecosa pulverulenta (Clerck, 1757) türünün genel görünüşü (Demircan, 2011)
1.6.2.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türünün genel özellikleri
Dişilerde vücut uzunluğu 12 mm’dir. Prosoma koyu kahverengi olup, göz kenarları düzensiz median beyaz şeritlere sahiptir. Opistosoma ise koyu bir şeritle kesintiye uğrayan açık median bir çizgiye sahiptir. Bacağın femur kısmı beyaz şeritli, diğer kısımları ise koyudur. Epijin alta doğru genişleyerek üçgen şeklini almıştır (Roberts, 1995).
Açık, kurak ve güneşli alanlarda yaşar. İlkbahardan sonbahara kadar ergindir (Roberts, 1995).
18
Fotoğraf 1.2 Alopecosa accentuata (Latreille, 1817) türünün genel görünüşü (Demircan, 2011)
1.7 Örümcekler Üzerine Yapılan Sitogenetik Çalışmalar
Örümcekler, üç filogenetik gruba ayrılır. Bunlar; Mesothelae, Mygalomorphae ve Araneomorphae’dir (Kral, 1994; Araujo vd., 2005). Mesothelae yaklaşık 130 tür ile temsil edilirken Mygalomorphae 15 familyaya ait 2500 türe sahiptir. Araneomorphae ise 114 familya, 3933 cins ve 45143 tür ile temsil edilmektedir (Platnick, 2015). Bu gruplar arasında araneomorf örümcekler kromozom morfolojilerinin genellikle akrosentrik tipte olması ve kromozom sayılarının az olması nedeniyle daha fazla araştırılmıştır.
Örümceklerde diploid kromozom sayısı büyük çeşitlilik göstermektedir. Araneomorf örümceklerde diploid sayı (2n) 7 ile 94 arasında değişiklik göstermektedir (Kumbıçak 2010). Ayrıca ilkel araneomorf örümceklerde Dysderidae ve Segestriidae gibi familyalara ait bazı türlerde holokinetik kromozomlar işaret edilmiştir (Gil vd., 2002). Örümcekler multipl eşey kromozom sistemine sahiptir (X1X2 ♂/ X1X1X2X2 ♀). Bu mekanizma, karyolojik bilgileri hazırlanmış örümceklerin % 80’ninde gösterilmiştir (Araujo vd., 2005). Bununla beraber; bazı örümcek gruplarında X1X2X30, X1X2X3X40 ve X0 şeklinde eşey kromozom sistemlerine de rastlanmıştır
19
Örümceklerle ilgili kromozomal çalışmalar dünyada ilk kez Wallace (1900) tarafından gerçekleştirilmiş ve daha sonraki yıllarda Wallace (1905), Bosenberg (1905), Montgomery (1905), Berry (1906), Painter (1914), Sokolska (1925), Hard (1939), Revell (1947) ve Patau (1948)’nın yapmış olduğu çalışmalarla önemli sonuçlar elde edilmiştir (Bole-Gowda, 1952). Hackman (1948), Suzuki (1949, 1950, 1951, 1952 ve 1954) ve Bole-Gowda (1952, 1959) tarafından yaklaşık 160 türün kromozom sayı ve davranışlarının belirlenmesiyle örümcek sitogenetiğinin temeli güçlendirilmiştir (Bole-Gowda, 1959). Bole-Gowda (1952)’nın Sparassidae familyası üzerinde yaptığı çalışmada Spariolenus tigris, Heteropoda venotoria, H. sexpunctata ve Olios lamarcki (Sparassidae) türlerinin diploid kromozom sayıları sırasıyla 2n=41, 41, 21 ve 42 şeklinde ve eşey kromozom sistemleri de XXX, XXX, X ve XX olarak bulunmuştur. H. sexpunctata’nın bir otozomal kromozom çifti hariç diğer kromozomlarının metasentrik tipte olduğu ve S. tigris, H. venotoria ile O. lamarcki’ nin akrosentrik kromozomlara sahip oldukları tespit edilmiştir.
Mittal (1962)’nin Gnaphosidae familyasından Gnaphosa kailana ve Scotophaeus blackwallii türleri üzerinde yaptığı sitogenetik çalışmada, G. kailana’nın erkek bireylerinde 2n=22 (20+XX) ve S. blackwallii’de 2n=24 (22+XX) diploid kromozom sayısını bulmuştur. Çalışmada S. blackwallii türüne ait diploid sayının 24 olarak elde edilmesi, Gnaphosidae familyası için ilk kez rapor edilmiştir. Mittal (1963) Gnaphosidae familyasından 20 türün diploid kromozom sayısı 2n= 22♂ ve eşey belirleme sistemi XX olarak belirtilmiştir. Spermatogonial metafazda otozomal kromozom çiftlerinin relatif uzunluklarının kademeli olarak azaldığı gösterilmiştir. Profaz I’de 10 bivalent ve iki eşey kromozomu tespit edilmiş ve diploten ile diyakinezde kiyazma frekansları 1,080 ve 1,030 olarak hesaplanmıştır. Lycosidae familyası üzerinde gerçekleştirilen çalışmada beş örümceğin mitoz ve mayoz bölünmedeki kromozom davranışları incelenmiştir. Atsunori vd. (1978) mitoz bölünmeye ait kromozomların elde edilmesi için embriyonik hücreleri, mayoz bölünme ile ilgili bilgileri değerlendirmek amacıyla da gonadları kullanmışlardır. Türler, Japonya’da yayılış gösteren Lycosa pseudoannulata, Pardosa astrigera, Pardosa laura, Pirata procurvus ve Pirata subpiraticus olarak seçilmiştir. Çalışmada P. procurvus ve P. subpiraticus’un erkek bireylerinde diploid sayı 2n=26, dişi bireylerinde 2n=28; L. pseudoannulata, P. astrigera, P. laura’nın erkek bireylerde diploid sayı 2n=28, dişi bireylerinde ise 2n=30 olarak bulunmuştur. Ayrıca, bütün türlerin kromozomlarının
20
telosentrik tipte ve eşey kromozom sistemlerinin X1X2 ♂/X1X1X2X2 ♀ seklinde olduğu sonucuna ulaşılmıştır (Çizelge 1.1).
Çizelge1.1 Örümceklerde eşey kromozom bazı familyalara göre dağılımı (Kumbıçak, 2010)
FAMİLYALAR EŞEY KROMOZOM
SİSTEMLERİ ALTTAKIM: Mesothelae Liphistiidae X1X2O ALTTAKIM: Mygalomorphae Atypidae X1X2O Dipluridae X1X2O Theraphosidae X1X2O ALTTAKIM: Araneomorphae
Agelenidae X1X2O, X1X2X3O
Amaurobiidae X1X2O
Anypaenidae X1X2O
Araneidae XO, X1X2O, X1X2O, X1X2X3O
Clubionidae X1X2O
Corinnidae X1X2O
Cybaeidae X1X2O
Dictynidae XO
Dysderidae X1X2O
Eresidae XO, X1X2O
Gnaphosidae X1X2O Hahniidae X1X2O Hersiliidae X1X2O Linyphiidae X1X2O Lycosidae X1X2O Mimetidae X1X2O
Miturgidae X1X2O, X1X2X3O
21
Çizelge1.1 (devam) Örümceklerde eşey kromozom bazı familyalara göre dağılımı (Kumbıçak, 2010)
Oecobiidae XO, X1X2O
Oxyopidae XO, X1X2O
Philodromidae X1X2O
Pholcidae XO, X1X2O, X1X2X3O
Pisauridae X1X2O
Salticidae X1X2X3O
Segestriidae X1X2O
Selenopidae XO, X1X2O, X1X2X3O, X1X2X3X4O
Sicariidae X1X2O, XO
Tetragnathidae X1X2O
Theridiidae X1X2O
Thomisidae XO, X1X2O, X1X2X3O
Trochanteriidae X1X2O
Uloboridae X1X2O
Zodaridae X1X2O
Benavente ve Wettstein (1980) çalışmalarında, Lycosa malitiosa (Arachnida)’nın spermatogenez boyunca eşey kromozomlarının değişimini araştırmıştır. Çalışmada, profaz I boyunca homologlar arasında sinaptonemal komplekslerin oluşup oluşmadığı ve eşey kromozomlarının birbirleriyle olan ilişkileri elektron mikroskobunda ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir. Postiglioni ve Zorrilla (1981), çalışmalarında Lycosa (Araneae:Lycosidae) cinsine ait üç türün karyolojik bilgilerini hazırlamışlardır. Lycosa malitiosa (L.sp1), L.thorelli (L.sp2) ve L.sp3 türlerinde eşey kalıtım mekanizmasının (♂ X0, X1X2O, X1X2X3O) saptanması amaçlanmıştır. Buna göre; L.sp1’de tek bir metasentrik X kromozomu, L.sp3’de X1X2O ve L.sp2’ de ise X1X2X3O olarak eşey kromozomlarının varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca; eşey kromozomlarının, mayoz bölünmenin profaz I evresindeki durumları incelenerek uzunluklarının istatistiksel olarak karsılaştırılması gerçekleştirilmiştir. Araştırma sonunda X0 eşey sisteminin sentik füzyon ile oluştuğu gösterilirken istatistiksel değerlendirmenin null hipotezini doğruladığı ortaya konmuştur. Wise (1983) Lycosidae familyasına ait Lycosa georgicola ve Lycosa rabida türlerinin karyolojik bilgilerini elektron mikroskobik
22
çalışmalarla göstermiştir. Türlerin I. mayotik bölünmede 13 bivalent ve iki eşey kromozomuna sahip olduğu ve spermatogonial metafazda telosentrik tipte 28 kromozomun varlığı ortaya konmuştur. Otozomal çiftlerin uzunluk bakımından % 5,6’dan 9,9’a kademeli bir artış gösterdiği kaydedilirken eşey kromozomları arasında önemli bir fark bulunamamıştır. ProfazI evresinde gevsek bir şekilde yan yana dizilen X kromozomlarının sinaptonemal kompleks oluşturmamaları eşey kromozomlarının birbirinin homologu olmadığı fikrini ortaya çıkarmıştır. Srivastava ve Shukla (1986)’nın 47 tür ile yapmış oldukları çalışmada diploid kromozom sayılarının 8 ile 41 arasında değiştiği ve eşey belirleme sistemlerinin XO, X1X2 ve X1X2X3 seklinde olduğu bulunmuştur. Parida ve Sharma (1987) tarafından Lycosidae familyasına ait üç örümcek türünün spermatogenezisleri araştırılmıştır. Çalışmada, Lycosa sp., Hippasa oliracea ve Pardosa birmanica türleri kullanılmıştır. Sonuçta; diploid kromozom sayılarının sırasıyla 2n=22, 26 ve 28 olduğu; bütün kromozomların akrosentrik ve eşey kromozom sistemlerinin X1X20 şeklinde olduğu saptanmıştır. Ayrıca, eşey kromozomlarının mayotik profaz boyunca heteropiknotik karakterde olduğu belirtilmiştir. Uloboridae familyasına ait üç örümcek türünün sitolojik olarak araştırılması Datta ve Chatterjee (1988) tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, Uloborus danolius, U. khasiensis ve U. krishnae türlerinde diploid kromozom sayısı sırasıyla 2n= 17, 18 ve 19 olarak belirlenmiştir. Uloborus danolius’da XO, U. khasiensis’de X1X2O ve U. krishnae’de X1X2X3O seklinde eşey kromozomların varlığı ortaya konmuştur. Türlerdeki kromozomal değişimler, perisentrik inversiyonlarla devam eden otonomlardaki füzyon sonucu oluşan kademeli eksilme ile açıklanmıştır. Chatterjee ve Datta (1988)’nın Araneidae familyasından 13 tür ile yapmış oldukları sitogenetik çalışmada diploid kromozom sayılarının 16-25 arasında değiştiği ve eşey belirleme sistemlerinin X1X2O, X1X2X3O ve X1X2X3X40 ♂ seklinde olduğu belirtilmiştir. Erkek bireylerde dört X kromozomunun varlığı ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir. Bütün türlerde kromozomların akrosentrik tipte olduğu belirlenmiştir. Eşey kromozom sistemlerinin çok farklı olması, ayrılmama ve duplikasyon yoluyla oluşabileceğini düşündürmüştür. Pholcidae familyasından Physocylus cinsine ait üç türün karyotipleri Cokendolpher (1989) tarafından çıkarılmıştır. Çalışma, standard Giemsa boyama metodu uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Her üç türde de kromozomların metasentrik tipte olduğu gösterilmiştir. Diploid sayılar; P. californicus, P. enaulus ve P. sp.’de 2n=15♂ (14+XO), 2n=15♂ (14+XO) ve 2n=16♀ (14+XX) olarak bulunmuştur. Araneidae,
23
Gnaphosidae, Loxoscelidae, Lycosidae, Oxyopidae, Philodromidae, Salticidae ve Theridiidae familyalarına ait 17 örümcek türünün karyotipleri Tugmon vd. (1990) tarafından yapılmıştır. Türlere ait diploid sayılar; Loxoscelidae- Loxosceles reclusa, 18 ve 20; Lycosidae-Lycosa rabida, 28 ve 30; Oxyopidae- Oxypes scalaris, 21; Philodromidae-Tibellus duttoni, 29; Salticidae-Maevia inclemens, 27 ve 28; Marpissa pikei, 28; Metaphidippus galathea, 27 ve 28; Peckhamia americana, 22 ve 24; Phidippus audax, 28 ve 30; Phiddipus texanus, 28 ve 30; Platycryptus undatus, 28 ve 30; Salticus austinesis, 28 ve 30; Tutelina elegans, 27 ve 28; Theridiidae-Steatoda triangulosa, 22 ve 24 şeklinde açıklanmıştır. Araneidae familyasından iki örümcek türünün spermatogenezisi Manna ve Sinha tarafından 1992 yılında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada Cyclosa spirifera ve C. bifida’nın erkek bireylerinde diploid kromozom sayıları 2n=24 ve kromozomların akrosentrik morfolojide olduğu bulunmuştur. Her iki türde de X1X2 (♂) / X1X1X2X2 (♀) seklinde eşey kromozom sisteminin varlığı ve eşey kromozomlarının I. Mayotik bölünmede pozitif heteropiknotik özellik göstermesiyle birlikte X1 ve X2 kromozomları arasında belirgin bir büyüklük farkı olmadığı gösterilmiştir. Diplotende oluşmaya başlayan bivalentlerin genellikle bir kiyazmaya sahip olmasına karşılık X kromozomları arasında univalentin bulunması ve anafaz I’de eşey kromozomlarının tek bir yapıymış gibi bir kutba taşınması; çalışmanın diğer önemli sonuçları arasındadır.
Tsurusaki vd. (1993) Agelena limbata türünde diploid kromozom sayısını bulmuşlardır. Erkek bireylerde 2n= 42 (40 + X1X2), dişi bireylerde ise 2n= 44 (42 + X1X1X2X2) olarak belirlenmiştir. Elde edilen bilgiler Suzuki (1954) ile karşılaştırılmış ve erkek bireyler diploid sayı bakımından farklı bulunmuştur. Bu farklılığın kromozom sayımındaki hatalardan kaynaklanabileceği bildirilmiştir. A. limbata’nın karyotipte metasentrik ve submetasentrik tipte kromozomlara sahip olduğu tespit edilmiştir.
Altı familyaya ait 17 türü sitogenetik açıdan incelendiği çalışmada, erkek bireylere ait diploid kromozom sayılarının sırasıyla, Salticidae-Philaeus chrysops, Euophrys pseudogambosa, Evarcha patagiata, Menemerus semilimbatus, 28; Menemerus illigeri,14; Aelurillus politiventis, 21; Lycosidae-Alopecosa albofasciata, 28; Evippa praelongipes, 26; Lycosa nordmanni, 22; Gnaphosidae-Nomisia ripariensis, Pterotricha dalmasi, P.procera, Haplodrassus signifer, 22; Miturgidae-Prochora lycosiformis, 24; Philodromidae-Thanatus meronensis, 24, Philodromus aureolus, 28;
Thomisidae-24
Heriaeus setiger, 23 olduğu bulunmustur. Menemerus illigeri ve Evippa praelongipes’de metasentrik kromozomların varlığı ilk kez rapor edilmiştir. Gorlova vd. (1997). Chen (1999), Theridiidae, Psechridae, Uloboridae, Oxyopidae ve Ctenidae familyalarından altı türün mayoz bölünme sırasında kromozomların davranışlarını araştırmıştır. Çalışma sonunda, diploid sayının Octonoba spinosa’da (Uloboridae) 2n=18♂/20♀, Achaearanea tepidariorum’da (Theridiidae) 2n=10♂, Psechrus sinensis (Psechridae) 2n=24♂, Oxyopes macilentus’da (Oxyopidae) 2n=21♂/22♀,
Oxyopes sertatus’da (Oxyopidae) 2n = 21♂/22♀, Anahita fauna’da (Ctenidae) 2n=29♂ olduğu bulunmuştur.
Silva vd. (2002) Loxoscelus cinsine ait L. rufipes ve L. rufescens turlerinde diploid kromozom sayısını 2n=20 şeklinde ve L. laeta ve L. gaucha’nın karyolojik yapı bakımından benzerlik gösterdiğini tespit etmişlerdir. L. reclusa’nın erkek ve dişilerinde diploid kromozom sayısının sırasıyla 2n=18 ve 20 olduğu gösterilmiştir.
Gil vd. (2002) tarafından Arjantin’de yayılış gösteren dört haplojin örümcek turunun spermatogenezisleri araştırılmıştır. Dysdera crocota (Dysderidae)’da (2n=10+X0), holokinetik kromozomlar ve akiyazmatik mayoz; Ariadna boesenbergii (Segestriidae)’de (2n=8+X0), holokinetik kromozomlar ve kiyazmatik mayoz; Kukulcania hibernalis (Filistatidae) (2n=10+X1X20) ve Scytodes globula (Scytodidae) (2n=10+X0)’da metasentrik ve submetasentrik kromozomlar ile kiyazmatik mayozun varlığı belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, haplojin örümceklerde sitogenetik özelliklerin farklılıklarını göstermiştir. Ephilengys cruentata’da diploid kromozom sayısının ve mayozda kromozom davranışlarının araştırılması Araujo vd. (2005) tarafından gerçekleştirilmiştir. Önemli bir kromozomal belirteç olarak kullanılan NOR bölgelerinin sayısı ve kromozomlar üzerindeki konumu araştırılmış, C bantlama ve in situ hibridizasyon teknikleri uygulanmıştır. Giemsa boyama sonucunda kromozomların akrosentrik tipte olduğu ve 1. 2. 3. çift kromozomların uzun kollarının negatif heteropiknotik oldukları belirlenmiştir. Diploid kromozom sayısı erkeklerde 2n=24 (22+X1X2), dişilerde 2n=26 (22+X1X1X2X2) olduğu belirlenmiştir. C bantlama ile kromozomların perisentromerik bölgelerinde heterokromatin bloklar gösterilmiştir. DAPI/DA, DAPI/MM ve CMA3/DA kullanılarak kromozomların telomerik ve sentromerikbölgelerinde fluoresan işaretlerin tespiti sağlanmıştır.
25
Araujo vd. (2005) tarafından Pholcidae familyasından iki türün mayoz bölünmeye ilişkin araştırmaları sonunda iki yeni diploid sayı ve ilk sitogenetik kayıt rapor edilmiştir. Çalışmada Mesabolivar luteus ve Micropholcus fauroti türlerinde diploid sayı sırasıyla 2n♂=15 (14+X) ve 2n♀=16 (14+XX); 2n♂=17 (16+X) olarak bulunmuştur. M. luteus’un diploten hücrelerinde 7II+X, geç profazda tüm bivalentlerin iki kiyazma oluşturduğu; M. fauroti’de ise 8II + X ve her bivalentin bir kiyazma meydana getirdiği bildirilmiştir. Her iki türe ait kromozomların metasentrik tipte olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışma ile Mesabolivar ve Micropholcus cinslerine ait kromozomal bilgiler ilk kez hazırlanmıştır.
Avrupa’da yayılış gösteren Atypus (Araneae:Atypidae) cinsine ait mygalomorf örümceklerle yapılan çalışmada A. muralis ve A. piceus’un erkek bireylerinde 2n=41, dişilerde 2n=42 sayısına ve metasentrik kromozom morfolojisine sahip oldukları bulunmuştur (Rezac vd., 2006). Diğer yandan, A. affinis’in erkek ve dişilerinde toplam 14 kromozomun bulunmasıyla mygalomorf örümceklerde ilk kez farklı bir diploid sayı elde edilmiş; erkek ve disi bireylerde aynı sayıda eşey kromozomların varlığıyla da neo-XY eşey sisteminin varlığı ilk defa ortaya konulmuştur.
Gil vd. (2007) Polybetes cinsine ait üç tür için kromozom preparatları hazırladıktan sonra C bantlama ile gümüş nitrat boyama yapmışlardır. P. pythagoricus, P. Rapidus ve P. ounctularus’de diploid kromozom sayısı 2n=44 seklinde bulunmuş ve tüm kromozomların telosentrik tipte olduğu saptanmıştır. P. pythagoricus’un erkek bireylerinde eşey kromozomlarının farklı uzunlukta olduğu belirlenmiştir. Üç türde de C bantlama ile perisentromerik pozitif bantlar işaret edilmiştir. Sonuç olarak Polybetes cinsinin Sparassidae familyası için atasal özellikler taşıdığı bildirilmiştir. Oliveira vd. (2007) yapmıs oldukları çalışmada Pholcidae familyasına ait Physocyclus globosus ve Crossopriza lyoni’nın kromozom sayılarının sırasıyla erkeklerde 2n=23 (22+X), 2n=15 (14+X) ve dişilerde 2n=24 (22 +XX), 2n=16 (14+XX) olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, metasentrik ve submetasentrik kromozomların varlığı ile eşey kromozom sistemlerinin X, X1X2Y seklinde olması, türlerin haplojin örümceklere ait genel sitogenetik özellikleri taşıdığı belirtilmiştir. Gümüş nitrat boyama çalışmaları sonucunda C. lyoni’de 3, P. globosus’da 1 NOR içeren kromozom bölgesinin genetik olarak aktif olduğu sonucuna ulaşılmıştır.
26
Rezac vd. (2008) Orta Avrupa’da yayılış gösteren Dysdera cinsinin revizyonunu hazırlamışlardır. Calısmada, Dysdera cinsine ait 7 türün erkek bireylerinde kromozom sayılarının 9-40 arasında değişiklik gösterdiği ve kromozomların holosentrik morfolojiye sahip oldukları vurgulanmıştır.
Lycosidae familyasından üç tür Chemisquy vd. (2008) tarafından sitogenetik açıdan araştırılmıştır. Lycosa erythrognatha, L. pampeana ve Schizocosa malitiosa da erkek bireylerin 2n=22 (20+XX) kromozom sayısına ve telosentrik tipte kromozomlara sahip oldukları belirlenmiştir. Çalışmaya C bantlama, DAPI/ CMA3 boyama dahil edildiğinde L. erythrognatha’nın bütün kromozomlarında perisentromerik heterokomatin bölgelerin varlığı tespit edilmiştir.
Haplojin örümcekler arasında geniş yayılış gösteren Pholcidae familyasından Mesabolivar brasiliensis ve M. cyaneotaeniatus’un mitotik ve mayotik kromozom ozellikleri Ramalho vd. (2008) tarafından araştırılmıştır. Çalışmada her iki türün 2n♂= 17 (16 + X) ve 2n♀= 18 (16 + XX) kromozom sayısına sahip olduğu bulunmuştur. Ayrıca, CMA3/ DA/ DAPI uygulanarak her otozomun GC çifti bakımından zengin terminal bölgeleri gösterilmiştir. Yapılan moleküler çalışma ile M. brasiliensis ve M. cyaneotaeniatus arasında yakın bir genetik ilişki olduğu sonucuna varılmıştır.
27 BÖLÜM II
MATERYAL VE METOD
2.1. Örümceklerdeki Sitogenetik Çalışmalarda Kullanılan Materyal ve Yöntemler
2.1.1 Araştırma alanı ve örneklerin toplanması
Bu çalışmada Lycosidae familyasına ait bazı örümcek türleri 20 Mart - 25 Mayıs 2014 tarihleri arasında Niğde ve Mersin illerinden toplanmıştır (Şekil 2.1). Erkek bireyler fazla sayıda sperm üretmelerinden dolayı tercih edilmiştir. Örneklerin toplanması sırasında farklı habitatlardan örnekleme yapılmasına dikkat edilmiş ve arazi çalışması sırasında örneklere herhangi bir işleme tabi tutulmamıştır. Örnekler elle ve aspiratör yardımıyla doğrudan yakalama tüplerine alınmış ve laboratuvar ortamına taşınmıştır. Çalışmada kullanılan örnekler Niğde Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Araştırma Laboratuvarında muhafaza edilmektedir. Her bir örnek 5cm x 10cm ebatlarındaki kapaklı plastik kaplara aktarılarak deney yapılıncaya kadar canlı olarak bekletilmiştir.
28 2.1.2 Testislerin çıkarılması
Her bir deneme için erkek bireylerden deneyleri gerçekleştirecek sayıda seçilir. Alınan örnekler petri kabına konulur ve distile su içinde bisturi yardımıyla testisleri çıkarılır (Bedo, 1984). Çıkarılan testisler bisturi ve ince uçlu iğne yardımıyla disekte edilir.
Fotoğraf 2.1 Testislerin çıkarılmasında opistosoma ve testisin görünüşü
2.1.3 Hipotonik çözelti ile muamele
Dissekte edilen testisler tüpe alınarak 2000 rpm de 5 dk. Santrifüj edilir. Süpernatat kısmı atıldıktan sonra 2-3 ml hipotonik çözelti ile muamele edilir. Hipotonik çözelti olarak 0,075 mol/l KCl çözeltisi kullanılır. Hipotonik çözeltinin etkisi dokulara göre değişeceği için optimum seviyesini bulmak için testisler 30-35-40-50-60 dakikalık sürelerle KCl çözeltisi içinde oda sıcaklığında bekletilir. Kromozom analiz yöntemlerinde hipotonik çözelti ile muamele en önemli aşamadır. Hipotonik çözeltisinin etkisi dokulara göre değişeceği için muamele sırasında optimum süreyi iyi ayarlamak gerekmektedir. Çünkü hücreler kendilerinden daha düşük yoğunluğa sahip olan hipotonik çözeltisi içinde şişmekte ve metafaz kromozomları hücre içinde birbirinden ayrılmaktadır. Hücre patladığı zaman kromozomlar etrafa dağılmakta ve kolayca inceleme yapılabilmektedir. Eğer muamele süresi o doku hücresi için fazla ise hücre lama aktarılmadan çözelti içinde patlamakta ve kromozomlar dağılmaktadır. Eğer muamele süresi az gelirse bu sefer hücre şişmemekte ve lama aktarılırken patlama meydana gelmemekte, kromozomlar dağılmamaktadır. Kısaca materyalin hipotonik çözelti ile muamele edilmesindeki amaç hücrelerin şişmesini ve bu sayede patlayarak kromozomların dağılmasını sağlamaktır (Bedo,1984).
29 2.1.4 Materyalin fiksasyonu
Materyal+KCl çözeltisinden oluşan süspansiyon 40-50 dk lık süreler sonunda 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Santrifüj edilirken santrifüj tüplerinin dengeli yerleştirilmesine dikkat edilir. Santrifüj sonunda süpernatant atılır, kalan kısma taze olarak hazırlanmış metanol-asetik asit (3:1) fiksatifinden 7 ml eklenir ve vortexte 10 sn. karıştırılır, 2000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir ve daha sonra bu işlem 2 defa daha tekrar edilir. Daha önce bu alanda yapılmış olan çalışmalar dikkate alınarak bu çalışmada Carnoy fiksatifi kullanılır. Bu fiksatif 3:1 oranında metanol veya etanol ve glisial asetik asit karışımından oluşur. Bu fiksatifte asetik asit hücre yüzeyini genişleterek kromozomların hücreye yayılmasını sağlar. Aynı zamanda kromozomlardaki histon proteinlerini yok ederek, kromozomların büzüşmesini sağlamaktadır. Alkol ise dokunun fazla suyunu almakta ve doku üzerindeki mikroorganizmaları öldürerek dokunun korunmasını sağlamaktadır. Bununla beraber alkol, asitin büzüştürdüğü kromozomları tekrar şişirerek görünür hale getirmektedir. Çalışmada alkol olarak metanol tercih edilmiştir. Her iki alkol çeşidi ile deneme yapılmıştır. Ancak metanolun kromozomları daha fazla şişirdiği tespit edilmiştir ve çalışmaların devamında metanol tercih sebebi olmuştur. Fiksasyon işleminin amacı, hücrenin bileşenlerini bozmaksızın hücreyi öldürmek ve sabitleştirmektir. Asit fiksatifleri nükleohistonları fikse edip, hücre nükleusundan diğer maddeleri uzaklaştırmaktadır (Bedo, 1984).
2.1.5 Kullanılan lamların temizlenmesi
Karyolojik çalışmalarda iyi bir preparat elde etmek için yayma yapılacak lamların çok temiz olması gerekmektedir. Bu amaçla, çalışmada kullanılacak lamlar önce distile suda yıkanmış ve gazlı bezle silinmiştir. Daha sonra lamlar, içerisinde % 70’lik etanol bulunan dik şalelere yerleştirme işlemi yapılarak en az yarım saat bekletilerek kullanılmıştır.
2.1.6 Materyalin lam üzerine alınması
Son santrifüj işleminden sonra tüpün üst kısmındaki süpernatant atılır.1ml.lik fiksatif materyal karışımı cam pipetle karıştırılır ve 1 gün boyunca -20°C ye kaldırılır. Cam pipet yardımıyla materyal 60 cm. mesafeden fiksatif ile iyice yıkanmış lam üzerine 3-4
30
damla damlatılır. Bu aşamada damlaların üst üste düşmemesine özen gösterilir. Preparatlar bir gün süre ile oda sıcaklığında eskitmeye bırakılır.
31
Fotoğraf 2.3 Preparat hazırlanması
2.1.7 Kromozomların görünür hale getirilmesi
Hazırlanan preparatların boyanması %1’lik Giemsa boyası ile yapılır. Giemsa pH 6,8 olan PBS ( 0,008 M KH2PO4 ve 0,006 M Na2HPO4) tamponu ile hazırlanır. Ölçekli beherin içine 1 ml giemsa boyası konulur ve üzeri 99 ml distile su ile tamamlanır. Boya şaleye alınır ve preparatların boyandıktan sonra yıkanması için 2 kap distile su hazırlanır. Preparatlar boya içinde 10-15 dk bekletilir. Ardından distile su kaplarının her birinde yaklaşık 10’ar saniye preparatların yıkanması sağlanır. Böylelikle kromozomların boyanması gerçekleştirilmiş olur.
32
Fotoğraf 2.4 Giemsa boyama takımı
2.1.8 Mikroskop ile inceleme
Boyaması ve kurutulması tamamlanan preparatlar mikroskop ile incelenir. Preparatlardaki metafaz haldeki kromozomlar 10’luk objektifte bulunur. İmmersiyon yağı damlatılarak 100’lük objektifte görüntünün büyümesi ve daha iyi incelenmesi sağlanır. Görüntü kamera aracılığıyla bilgisayar ekranına aktarılır. Kromozomlar özel kromozom analiz yazılımıyla karyotip şemasına yerleştirilir. Uygun düşmeyen kromozomların yerleri elle değiştirilir.
Karyotip hazırlanması amacıyla her örneğe ait en az 10 metafaz ya da metafaz II tespit edilerek fotoğrafları alınmıştır. Kromozom fotoğrafları, Olympus CX31 Microscope ile fotoğrafları ise bu mikroskoba bağlı Olympus DP 25 digital kamera ile çekilmiştir. ve ölçümleri DP2-BSW programı ile yapılmıştır. Kromozomların relatif uzunlukları (toplam uzunluk, kısa kol-p ve uzun kol-q) DP2-BSW programı ile ölçülmüştür.
Piksel olarak ölçülen kromozomların boyları Kumbıçak (2010) yöntemiyle mikrona dönüştürülmüştür. Kromozom morfolojileri Levan vd. (1964)’e göre belirlenmiştir
