Mikrosatalit belirleyicileri kullanılarak tokak yerel arpa çeşidindeki genetik varyasyon düzeyinin belirlenmesi ve safhatların seçimi

(1)

i

MİKROSATELİT BELİRLEYİCİLERİ KULLANILARAK TOKAK YEREL ARPA ÇEŞİDİNDEKİ

GENETİK VARYASYON DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ ve SAFHATLARIN SEÇİMİ

Rahime Gündüz Yüksek Lisans Tezi Tarla Bitkileri Anabilim Dalı

Doç. Dr. Nejdet Kandemir 2008

(2)

ii

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TARLA BİTKİLERİ ANABİLİM DALI

Y.LİSANS TEZİ

MİKROSATELİT BELİRLEYİCİLERİ KULLANILARAK TOKAK

YEREL ARPA ÇEŞİDİNDEKİ GENETİK VARYASYON

DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ ve SAFHATLARIN SEÇİMİ

RAHİME GÜNDÜZ

(3)

iii

Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

Başkan : Doç. Dr. Nejdet KANDEMİR

Üye : Doç. Dr. Ahmet YILDIRIM

Üye : Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

(4)

iv

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

(5)

i

MİKROSATELİT BELİRLEYİCİLERİ KULLANILARAK TOKAK YEREL ARPA ÇEŞİDİNDEKİ GENETİK VARYASYON DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ ve

SAFHATLARIN SEÇİMİ Rahime Gündüz Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Nejdet KANDEMİR

Genetik varyasyonlar bitki ıslahının ham maddeleridir ve çeşitli nedenlerle gittikçe daralmaktadır. Bitki ıslahında genetik varyasyonu artırmanın en ümit var yollarından biri yerel çeşitlerin kullanımıdır. Yerel çeşitlerin ıslah çalışmalarında daha etkin kullanılabilmeleri için tanımlanmaları gerekmektedir. Bu çalışma Tokak adıyla bilinen biri safhat ikisi yerel çeşit üç arpa materyalinin (Tokak 157/37 çeşidi, PI 470281 ve CIHO 10093) akrabalıklarını ve bu materyaller içerisinde mevcut olan genetik varyasyon düzeylerinin belirlenmesi için yürütülmüştür. Tokak 157/37 Türkiye’nin önemli ekilişe sahip bir yerel arpa çeşididir. PI 470281 Amerika gen bankasında yerel çeşit olarak Tokak ismi ile muhafaza edilen materyaldir. CIHO 10093 yine Amerika gen bankasında bulunan Tokak isimli saf hattır.CIHO 10093 saf hattından 10 bitki, Tokak 157/37 çeşidinden 60 ve PI 470281 materyalinden 52 bitki incelenmiştir. Bu materyallerdeki genetik çeşitliliği belirlemek için polimorfizm düzeyi yüksek, kodominant nitelikte 30 SSR belirleyicisi kullanılmıştır. Aynı zamanda bazı morfolojik belirleyiciler ve bitkisel özellikler de çalışılmıştır. İncelenen 10 CIHO 10093 bitkisi çalışılan 30 SSR belirleyici bakımından hiçbir polimorfizm göstermemiştir. Yani CIHO 10093 bitkilerinin tamamı genetik olarak aynıdır. Çalışılan 30 SSR belirleyicisinden sadece beş tanesi Tokak 157/37 içinde polimorfizm belirlemiştir. Bu belirleyiciler incelenen 60 Tokak 157/37 hattında toplam 35 allel üretmiş ve sadece iki tip genotip bulunduğunu ortaya koymuştur. Bunlardan yaygın olanı 58 hatta, nadir olanı ise iki hatta gözlenmiştir. Bu sonuç Tokak 157/37’nin varyasyonunu büyük ölçüde kaybettiğinin ve artık bir yerel çeşit olmadığını göstermektedir. Kullanılan 30 SSR belirleyicisinden 23 tanesi PI 470281 materyalinde polimorfizm göstermiştir. Bu otuz belirleyici PI 470281’de toplam 70 allel meydana getirmiştir. Çalışılan 52 PI 470281 hattı arasında 46 farklı genotip belirlenmiştir ki bu genetik çeşitlilik seviyesinin çok yüksek olduğu anlamına gelmektedir. PI 470281 içinde morfolojik belirleyiciler bakımından polimorfizm gözlenmemiştir. Aynı zamanda bitkisel özellikler arasındaki varyasyon da yüksek değildir. Bu durum yerel çeşidi kullanan çiftçilerin geçmişte fenotipe dayalı toplu seleksiyonlar yapmış olabileceğini göstermektedir. PI 470281 materyaline ait 52 hat, Tokak 157/37 çeşidinin yaygın genotipi, iki nadir genotipi ve CIHO 10093 (toplam 56 genotip) ile dendogram oluşturulmuştur. Bu çalışma sonunda PI 470281 materyalinde DNA düzeyinde gözlenen fakat morfolojik olarak gözlenmeyen varyasyonlar önemli tarımsal karakterleri etkileyen genlerin yeni allellerinin bulunabileceğini ortaya koyabilir.

2008, 61

(6)

ii

DETERMINING THE GENETIC VARIATION LEVEL AND SELECTING PURELINES

IN TOKAK BARLEY LANDRACE USING MICROSATELLITE MARKERS

Rahime Gündüz Gaziosmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Field Crops

Supervisor: Associate Professor Nejdet KANDEMİR

Genetic variations are the raw materials of plant breeding and have been increasingly narrowed due to various reasons. One of the most promising ways of increasing the genetic variation level in plant breeding programs is to use landraces. Genetic identification of landraces is necessary in order to make better use of them. This study was conducted to determine the genetic variation level in three Turkey-originated barley materials all known as Tokak. One of them, Tokak 157/37, is a major cultivar of Turkey and considered to be a landrace. It has a considerable acreage in Turkey. The second one is a landrace, PI 470281, maintained by the US National Plant Germplasm System. The third one is a pure line named Tokak, CIHO 10093, also maintained by the US National Plant Germplasm System. Sixty plants were studied from Tokak 157/37, fifty-two from PI 470281 and 10 from CIHO10093. In order to detect the polymorphism level within and among these materials, 30 co-dominant SSR markers were used. Some morphological markers and plant characteristics were also studied. Ten CIHO 10093 plants did not show any polymorphism for 30 SSR markers. In other words, all 10 plants were genetically identical. Only five SSR markers out of ten yielded polymorphism within cv. Tokak 157/37. These 30 markers produced a total of 35 alleles among 60 Tokak 157/37 lines and showed that there were only two types of genotypes. The common genotype was found in 58 lines and the rare one in two lines. This finding means that Tokak 157/37, an alleged land race, has lost its variation greatly and is not a landrace anymore. Twenty-three of 30 SSR markers were polymorphic in PI 470281. Thirty SSR markers used to screen PI 470281 produced 70 alleles. Among the 52 plants studied, 46 different genotypes were detected, which means very high level of polymorphism. No polymorphism was observed for morphological markers. Also, variation for plant characteristics was not very high. These facts mean that farmers who have been using this landrace for a long time might have done mass selections based on phenotype within the cultivar. A dendogram was made using 52 PI 470281 lines, common type of Tokak 157/37, two rare lines of Tokak 157/37 and CIHO 10093 (a total of 56 genotypes). Genetic variation observed at DNA level, but not at morphological level, might indicate the presence of novel alleles of the loci that affect the major agronomical traits.

2008, 61

(7)

iii

Yüksek lisans eğitimim boyunca çalışmalarımın planlanmasından sonuçlandırılmasına kadar her aşamasında bilgi, öneri, yardım ve desteğini esirgemeyen, çalışmalarım süresince gerekli her türlü ortamı sağlayan ve her zaman yanımda olan değerli danışman hocam Doç. Dr. Nejdet KANDEMİR’e sonsuz teşekkür ederim. Bilgisi ve anlayışıyla zor anlarımda desteğini esirgemeyen Doç. Dr. Ahmet YILDIRIM’a, yüksek lisans öğrenimime katkıda bulunan Tarla Bitkileri Bölüm Başkanı ve tüm öğretim üyelerine, laboratuvar ve tarla çalışmalarımda, yardımlarını aldığım arkadaşlarım Özlem Ateş Sönmezoğlu, Tuğba Eserkaya ve Serap Karaman’a teşekkürü bir borç bilirim.

Hayatım boyunca her zaman yanımda olup beni destekleyen ve yardımcı olan değerli aileme minnettarım.

Rahime GÜNDÜZ 21/08/2008

(8)

iv Simgeler Açıklama M : Molar ml : Mililitre mM : Milimolar ng : Nanogram µg : Mikrogram µl : Mikrolitre KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BME : Beta Mercapto Etanol

CTAB : Cetyhrimetilamoniumbromide dH2O : Distile Su

DNA : Deoksiribonükleik asit EDTA : Etilendiamintetraasetik asit MgCl2 : Magnezyum klorür

NaCl : Sodyum klorür

PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PIC : Polimorfizm Bilgi İçeriği QTL : Kantitatif özellik lokusu

RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNase : Ribonuclease A

SDS : Sodyum dodesil sülfat SSR : Simple Sequence Repeat

Taq : Thermus aquaticus

(9)

v

UPGMA : Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average

(10)

vi

Şekil Sayfa

Şekil 3.1. Çalışmada kullanılan thermocyle……… 19

Şekil 3.2. Çalışmada kullanılan yatay elektroforez………. 22

Şekil 4.1. BMAG120 (%3’lük metaphore jel)……… 25

Şekil 4.3. Şekil 4.1. BMAG321 (%3’lük metaphore jel)……… 26

Şekil 4.4. BMAG507 (%3’lük metaphore jel)………. 26

Şekil 4.5. BMAG606 (%3’lük metaphore jel)………. 27

Şekil 4.6. GBMS35 (%3’lük metaphore jel)……….. 27

Şekil 4.7. GBMS50 ve GBMS137(%3’lük metaphore jel).………... 28

Şekil 4.8. GBMS66 (%3’lük metaphore jel)………. 28

Şekil 4.12. GBM1055 (%3’lük metaphore jel)………. 30

Şekil 4.14. HVM40 (%3’lük metaphore jel)………. 31

Şekil 4.23. GBMS35 (%3’lük metaphore jel)………... 40

(11)

vii

Şekil 4.26. GBMS114 (%3’lük metaphore jel).………... 41

Şekil 4.35. HVM40 (%3’lük metaphore jel)………. 46

Şekil 4.38. HVPAZXG (%3’lük metaphore jel)………... 47

Şekil 4.39. EBMac691 (%3’lük metaphore jel)……… 48

Şekil 4.40. SSR analizleri sonucunda oluşan ağaç dendogramı……… 51 Şekil 4.41. SSR analizleri sonucunda oluşan radyal dendogram

dendogram……….

(12)

viii

Çizelge Sayfa

Çizelge 3.1. 1995-2005 uzun yıllar, 2005-2006 ve 2006-2007 yetiştirme yılı

Tokat ili iklim değerleri………... 14

Çizelge 3.2. Deneme alanına ait toprak analiz sonuçları………. ₁₆

Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan primerler………... ₂₀

Çizelge 4.1. SSR belirleyicilerinin kromozom konumları ve sahip oldukları

allel sayıları………... 24

Çizelge 4.2. Tokak 157/37 çeşidinin bazı bitkisel özelliklerine ait veriler……... 33 Çizelge 4.3. SSR belirleyicilerinin kromozom konumları ve sahip oldukları

allel sayıları………... 35

(13)

ix ÖZET………..….. i ABSTRACT……….…… ii TEŞEKKÜR………. iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ………... iv ŞEKİLLER DİZİNİ……….……….….. vi ÇİZELGELER DİZİNİ……….……….… viii İÇİNDEKİLER………... ix 1. GİRİŞ………... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ………... 3 3. MATERYAL ve YÖNTEM……… 13 3.1. Materyal………. 13 3.1.1. Deneme Materyali……….. 13

3.1.2. Deneme Yılı ve Yeri………... 13

3.1.3. Deneme Yerinin İklim Özellikleri……….. 13

3.1.4. Deneme Alanının Toprak Özellikleri……….. 15

3.2. Yöntem………... 16

3.2.1. Ekim, Bakım ve Hasat İşleri………... 16

3.2.2. İncelenen Özellikler……… 16

3.2.3. Moleküler Analizler……… 17

3.2.3.1. DNA İzolasyonu………... 17

3.2.3.2. DNA Miktarının Belirlenmesi……….. 19

3.2.3.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu………... 19

3.2.3.4. Çalışmada Kullanılan Primerler………... 20

3.2.3.5. Jel Sistemi……… 22

3.2.3.6. Verilerin Değerlendirilmesi………. 22

4. TARTIŞMA ve SONUÇ………. 23

4.1. CIHO 10093 materyali……….. 23

4.1.1. SSR Belirteçleri ile Genetik Akrabalık Analizleri……….. 23

4.1.2. Morfolojik Özellikler………. 23

(14)

x

4.2.2. Morfolojik Özellikler……….. 32

4.2.3. Bitkisel Özellikler………... 33

4.3. PI 470281 Materyali……….. 34

4.3.1. SSR Belirteçleri ile Genetik Akrabalık Analizleri……….. 34

4.3.2. Morfolojik Özellikler……….. 53

4.3.3. Bitkisel Özellikler………... 53

KAYNAKLAR……… 57

(15)

1 1.GİRİŞ

Arpa Dünya tahıl ekilişinde buğday, çeltik ve mısırdan sonra dördüncü sırada yer alan bir serin iklim tahılıdır. Asıl olarak yem amaçlı olarak kullanılmasının yanı sıra bünyesinde taşıdığı yüksek oranda nişasta ve malt enzimleri ile süzme işlemi için filtre fonksiyonuna sahip olan kavuzu nedeniyle malt üretimi için yetiştirilmektedir. Ayrıca tuza karşı dayanıklı olması nedeniyle de sulu tarım alanlarında çoraklaşan toprakların ıslahında kullanılmaktadır.

Türkiye’de yaklaşık 3,6 milyon hektar alanda yetiştirilen arpadan 9,6 milyon ton tane ürünü elde edilmektedir (FAO, 2006). Bu haliyle arpa Türkiye tarımında önemli bir yere sahiptir. Türkiye’de üretilen arpanın % 90’ı hayvan beslenmesinde, % 10’u da malt endüstrisinde kullanılmaktadır. Ancak ülkemiz malt üretiminin başta maltlık arpa çeşitlerinin durumu olmak üzere ciddi sorunları mevcuttur. Sanayimizin istediği hammaddeyi temin edebilmek için kalitenin arttırılması gerekmektedir. Verimi ve kaliteyi arttırmanın en önemli yollarından biri, yörenin kendi ekolojik koşullarına uygun, yüksek verim potansiyeline sahip çeşitlerin geliştirilmesi ve üretime alınmasıdır.

Tarımsal üretimde kullanılan çeşitlerin verim ve kaliteleri bitki ıslahı çalışmalarıyla geliştirilmektedir. Bitki ıslahının ham maddesi genetik varyasyonlardır. Ancak son yıllarda dünyada yapılan ıslah çalışmalarında belli gen kaynakları üzerinde yoğun şekilde durulmuş ve bu nedenle önemli kültür bitkilerinde genetik tabanlar ciddi şekilde daralmıştır. Yabani türler ve yerel çeşitler daralan genetik tabanların genişletilmesinde ciddi avantajlar sunar, fakat bu konuda yerel çeşitler kalite özelliklerinin geliştirilmesi açısından yabani türlerden daha avantajlıdırlar. Çünkü istenen genlerin transferi esnasında gelen, istenmeyen bağlı genlerin etkileri yabani türlerin kullanıldığı ıslah programlarında olumsuz etkilere yol açabilmektedir. Yerel çeşitlerin ıslah çalışmalarında kullanabilmeleri için öncelikle genetik varyasyon derecelerinin belirlenmesinde fayda vardır. Arpanın gen merkezlerinden biri olarak kabul edilen Türkiye yerel çeşitlerinin araştırılması ile verim ve kalite açısından önemli genlerin yeni allellerinin ortaya çıkarılması söz konusu olabilir.

(16)

2

Bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araştırılmasında genetik belirleyiciler (markör) kullanılmaktadır. Genetik belirleyicilerin üç ana tipi mevcuttur. İlki fenotipik özellikler olan morfolojik belirleyiciler, ikincisi izoenzim olarak adlandırılan enzimlerin allelik değişimlerini içeren biyokimyasal belirleyiciler, üçüncüsü ise DNA’nın kendisinin doğrudan kullanıldığı DNA belirleyicileridir. DNA belirleyicileri; diğer tekniklere oranla daha güvenilir olmaları, çevreden etkilenmeyişleri, bitkilerin gelişmelerinin her aşamasında kullanılabilmeleri gibi avantajları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. DNA belirleyicileri içinde mikrosatellit (SSR) belirleyicileri, yüksek oranda polimorfik olduklarından oldukça fazla bilgi verici bir özellik göstermektedirler. Ayrıca Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) kolaylığına sahip olmaları ve bitki genomlarında oldukça bol olmaları nedeniyle de tercih edilmektedirler.

Türkiye’de Tokak 157/37 çeşidi malt üretimi amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak Tokak ismi farklı arpa materyalleri için de kullanılabilmektedir. Bu çalışmada Tokak adıyla bilinen biri saf hat ikisi yerel çeşit üç arpa genetik materyali kullanılmıştır. Bunlardan bir tanesi Amerika gen bankasında Tokak çeşidi adı ile korunan ve bir saf hat olan CIHO 10093, diğeri yine Amerika gen bankasında bulunan ve yine Tokak isimli bir yerel çeşit olduğu düşünülen PI 470281’dir. Amacımız, başlangıçta aynı olduğunu düşündüğümüz CIHO 10093, Tokak 157/37 çeşidi ile PI 470281 materyali içinde mevcut olan genetik varyasyon düzeylerini SSR belirleyicileri kullanarak ortaya koymak ve bu materyallerin genetik olarak akraba olup olmadığını belirlemektir.

(17)

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Dünyada üretilen başlıca tahıl ürünlerinden biri olan arpa tüm ılıman alanlarda yetiştirilmektedir. Türkiye’de yaklaşık 3,5 milyon ha alanda üretim yapılmakta ve 7,5 milyon ton tane ürünü alınmaktadır (FAO, 2007). Bu üretimin % 90’ı yemlik, % 10’u ise malt üretimi amacıyla kullanılmaktadır (Akar ve ark. 1999). Arpanın taşıdığı yüksek oranda nişasta, malt enzimleri ve kavuzu bira sanayinin vazgeçilmez hammaddesi olmasını sağlamıştır (Özkara, 1994).

Türkiye’de arpa yaygın olarak yemlik amaçlı kullanılmasına rağmen, önemli bir malt üretim kapasitesi de vardır. Ancak malt üretiminde kullanılan çeşitlerin özellikleri bakımından ciddi sorunlar bulunmaktadır. Maltlık arpalarımızdaki en önemli problemlerden biri malt ekstrakt oranının düşük olmasıdır (Özkara, 1994). Sanayimizin istediği hammaddeyi temin edebilmek için kalitenin arttırılması gerekmektedir.

Verimi ve kaliteyi arttırmanın en önemli yollarından biri, yörenin kendi ekolojik koşullarına uygun, yüksek verim potansiyeline sahip çeşitlerin geliştirilmesi ve üretime alınmasıdır. Tarımsal üretimde kullanılan çeşitlerin verim ve kaliteleri bitki ıslahı çalışmalarıyla geliştirilmektedir. Yeni çeşit geliştirme ancak bitki ıslahının ham maddesi olan genetik varyasyona sahip bir başlangıç materyali ile mümkün olabilir. Ancak son yıllarda yapılan ıslah çalışmalarında belli gen kaynakları üzerinde yoğun şekilde durulmuş ve bu nedenle önemli kültür bitkilerinde genetik tabanlar ciddi şekilde daralmıştır (Frankel, 1972). Islah çalışmalarının genetik tabanının geliştirilmesinde ıslahçının en büyük yardımcısı ‘Bitkisel Gen Kaynakları’dır (Şehirali ve Özgen, 1987). Bitkisel gen kaynakları; yerel çeşitler, türlerin yabani akrabaları, üretimi yapılmayan eski çeşitler, kullanılmakta olan modern çeşitler, özel genetik stoklar ve mutantlardan oluşmaktadır.

Yabani türler ve yerel çeşitler yetiştikleri bölgelerin sıcaklık, yağış, kuraklık, tuzluluk, hastalık ve zararlılar gibi çeşitli çevre koşullarına yüzyıllardan beri doğal seleksiyonlar sonucu uyum sağlamış materyallerdir (Hart, 2001). Ancak yerel çeşitler çoğu kalite özelliklerinin geliştirilmesi açısından yabani türlerden daha avantajlıdırlar. Çünkü

(18)

istenen genler yanında gelen istenmeyen genlerin etkilerinin yabani türlerin kullanıldığı ıslah programlarında daha olumsuz olması beklenmektedir.

Yerel çeşitler morfolojik olarak birbirinin benzeri ancak genetik olarak birbirinden farklı populasyonlardır (Harlan, 1975). Brown ve Munday, (1982); Jana ve Pietrzak, (1988)’ın bildirdiğine göre gen bankalarında yerel çeşitlerde görülen genetik varyasyonun yaklaşık % 50-60’ı yerel çeşitlerin kendi içinde bulunmaktadır (Parzies ve ark., 2000). Diğer çeşitler ile kendi içindeki bu varyasyonların belirlenmesi, herhangi bir türün genetik kaynaklarının korunması açısından oldukça önemlidir. Ayrıca yerel çeşitler kendi içinde barındırdığı varyasyondan dolayı beklenmedik dış olaylara karşı üstünlüğe sahip olmaktadır. Bu üstünlüğün yerel çeşitte yer alan genotiplerin birbirlerinin eksikliklerini tamamlaması ve etkileşimleri sonucu ortaya çıktığı belirtilmektedir (Allard ve Bradshaw, 1964).

Eski çalışmalar kültür arpaların iki orijin merkezinin Tibet ve Mezopotamya olduğunu bildirmiştir. Kültürü yapılan arpalar sınıflandırıldığında iki sıralı (Hordeum distinchum L.) ve altı sıralı (Hordeum vulgare L.) formları olduğu görülmektedir. İki ile altı sıralı arpalar bu bölgelerden yayılmıştır. Yetiştirilen altı sıralı arpa (Hordeum vulgare ssp. hexastichon var. nudum) Çin’de kültüre alınan en eski kültür bitkisidir (Feng ve ark., 2006).

Islah çalışmalarında yerel çeşitlerin kullanabilmeleri için öncelikle genetik varyasyon derecelerinin belirlenmesi gerekir. Eskiden çeşitler arasındaki genetik akrabalıklar çeşitlerin pedigrilerinde bulunan ortak ataların yüzdesi olarak hesaplanmaktaydı. Ancak seleksiyon, tesadüfi genetik değişim (genetic drift) ve diğer sebeplerden dolayı bu tahminler her zaman genotipler arasındaki akrabalık derecesini ortaya koymamaktaydı (Graner ve ark., 1994). Bugün bu akrabalığı doğrudan belirlemek için genetik belirleyiciler kullanılmaktadır.

Türler ve bireysel organizmalar arasındaki genetik farklılıkları göstermek için geliştirilen genetik belirleyicilerin üç ana tipi mevcuttur. İlki fenotipik özellikler olan morfolojik belirleyiciler, ikincisi izoenzim olarak adlandırılan enzimlerin allelik değişimlerini içeren biyokimyasal belirleyiciler, üçüncüsü ise DNA’nın kendisinin belirleyici olarak kullanıldığı moleküler belirleyicilerdir (Yıldrım ve Kandemir, 2001).

(19)

Yerel çeşitleri de içine alan gen kaynaklarının tanımlanmasında başlangıçta morfolojik belirleyiciler kullanılmıştır. Morfolojik belirleyiciler; çiçek rengi ve tohum şekli gibi görsel olarak karakterize edilebilen fenotipik karakterlerdir (Yıldrım ve Kandemir, 2001). Analizlerinin kolay olması ve çok uzun zamandır bilinmelerine rağmen sayılarının az oluşu yanında çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmeleri nedeniyle fazlaca kullanılmamaktadır. Ayrıca bu karakterler birbirine oldukça yakın genotipler arasında sınırlı düzeyde polimorfizm gösterirler. Dominant özellikte olduğundan dolayı da sadece dominant fenotipi (AA ve Aa) resesif fenotipten (aa) ayırmada kullanılabilirler (Mohan ve ark., 1997).

Biyokimyasal belirleyicileri, depo proteinleri ve enzim proteinleri olarak iki ana gruba ayrılırlar. Depo proteinleri bir jel üzerinde hareket ettirilip boyandıklarında, farklı genotiplerde ortaya çıkan yapı farklılıkları genetik belirleyici olarak kullanılabilir. En önemli avantajları analizlerinin çabuk, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. Ancak sayıca çok azdırlar. Enzim markörleri ise kendi içinde iki ana grup altında incelenebilir. Alloenzim, birbirinden ayırt edilebilen allelleri bulunan enzimleri ifade etmektedir. Alloenzimler aynı genin farklı allelleri tarafından meydana getirilmektedirler. İzoenzim, farklı genler tarafından üretilen, ancak birbirine çok benzeyen enzimleri ifade etmektedir. Enzim markörlerinin temel avantajları analizlerinin çabuk, ucuz ve güvenilir olmasıdır. Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler. En büyük dezavantajları sayılarının çok az olmasıdır. Diğer bir dezavantajı ise özel dokularda ve belli bir gelişme döneminde gözlenebilir olmasıdır (Yıldırım ve Kandemir, 2001)

Diğer belirleyicilere göre daha güvenilir olmaları, çevreden etkilenmeyişleri, bitkilerin gelişmelerinin her aşamasında kullanılabilmeleri gibi avantajları nedeniyle DNA belirleyicileri yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. DNA belirleyicileri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyarlar. Bunlar DNA melezleme belirleyicileri ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA çoğaltım belirleyicileri olmak üzere iki gruba ayrılır. Polimeraz Zincir Reaksiyonuna (PZR) dayalı olan belirleyicileri rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) (Welsh ve McClelland, 1990), çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi

(20)

(AFLP) (Vos ve ark., 1995), dizilim etiketli alan (STS) ve basit dizilim DNA tekrarları (mikrosatelitler veya SSR) (Hamada ve ark., 1982) gibi belirleyiciler oluşturmaktadır.

Charcosset ve Gallais (2002) moleküler belirleyicilerin yeni ıslah programlarında kullanılacak olan ebeveyn materyallerin genetik çeşitliliğinin belirlenmesinde, üstün alleleri bir arada tutan bireylerin geliştirilmesinin hızlandırılmasında, melez performansının belirlenmesinde ve geliştirilen çeşitlerin tescilden önce farklılığının ortaya konmasında kullanılabileceğini belirtmiştir.

Genomun ilgilenilen bölgeleri dışındaki belirleyiciler ile taramanın yapıldığı background seleksiyonu geri melezleme ıslahında tekrarlanan ebeveyn genomunun hızla kazanılmasını sağlayabilir. Bu yolla iki veya üç geri melezleme generasyonunda tekrarlanan ebeveyn genomunun % 97,5 veya daha fazlasını geri kazanmak mümkündür (Hospital ve ark. 1992). Yine belirleyicilerin kullanımı ile transfer edilen gen bölgesinin etrafında gelen ve “linkage drag” denen istenmeyen bölgenin uzunluğu sınırlandırılabilir (Hospital, 2001).

Belirleyiciler genetik çeşitliliği ve akrabalık ilişkilerinin saptanması yanında genetik haritaların hazırlanmasını da sağlamaktadır. Ayrıca DNA belirleyicileri detaylı QTL haritalamasında kullanılan yakın izogenik hatların geliştirilmesinde de kullanılmaktadır (Kandemir ve ark., 2000).

Bahrman ve ark., (1999) RFLP, AFLP, STS ve SSR gibi DNA belirleyicileri ile farklı çeşitlerin karakterizasyonunun, filogenetik ilişkilerin anlaşılmasının ve genetik haritaların yapılmasının sağlandığını bildirmektedir.

PZR’ye dayalı bir belirleyici sistemi olan mikrosatelitler genetik çeşitliliğin belirlenmesinde önemli kullanım alanı bulmuşlardır. Mikrosatelitler (SSR) her biri 1-10 bp uzunluktaki (TG)n veya (AAT)n gibi arka arkaya gelen belirli tekrar ünitelerinden oluşur (Bruford and Wayne, 1993). Mikrosatelitler diğer PZR’ye dayalı belirleyicilere kıyasla yüksek derecede polimorfizm göstermeleri, genomun her tarafında bulunmaları, kodomimant özelikte olmaları, düşük miktarda genomik DNA gerektirmeleri ve çok allelli olmalarından dolayı da diğer moleküler belirleyicilerden daha çok bilgi verebilmektedir (Akkaya ve ark., 1992). Ardışık SSR tekrarlarının sayısındaki farklılık

(21)

PZR sonucu farklı uzunlukta parça çoğaltımı ile sonuçlanmaktadır (Yıldırım ve Kandemir, 2001). Ayrıca RFLP klonlarının aksine, polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edildiklerinden, her lokus için primer setleri araştırıcılar arasında fiziksel DNA olarak değil bilgi olarak iletilebilmektedir.

Avantajları yanında SSR belirleyicileri bazı dezavantajlara da sahiptir. En önemli dezavantajı yeni belirleyici geliştirilmesinin güçlüğüdür. Yeni markör geliştirilmesi için genomik DNA klonlarının tekrarlanan oligonükleotid içeren problarla hibridizasyon yolu ile bulunması, nükleotid dizilerinin belirlenmesi ve yan yana tekrarlanan yapıların başlangıç ve bitiş yerlerinden özel başlatıcı DNA’lar geliştirilmesi gerekmektedir. Bu da oldukça fazla iş gücü gerektiren pahalı bir işlemdir (Gao ve ark., 2004).

Mikrosatelitler genom içinde bol olmaları yanında, farklı bireylerin tekrar sayılarında yüksek derecede bir değişkenliğe de sahiptirler. Genellikle memelilerde her altı kb uzunlukta, bitki genomlarında ise her 33 kb uzunlukta, 20 bp’den daha az bir dinükleotid tekrarı tespit edilmiştir (Wang ve ark., 1994).

Trinükleotid tekrarları içeren mikrosatelitlerin yüksek derecede polimorfik olduğu belirlenmiştir (Gastier ve ark., 1995). Trinükleotid mikrosatelitleri az miktarda “titrek bantlar” verdiğinden dolayı dinükleotid mikrosatelit belirleyicilerinden daha kullanışlıdırlar. En yaygın titrek bantlar ana allel bandından iki baz daha kısa olan bantlardır (Vals ve ark., 1996). Her bir alleldeki çoklu bant kalıbından dolayı özellikle iki veya daha fazla DNA örneği karıştığında ve tek bir bireyden büyüklükleri birbirine yakın iki allel geldiği zaman iki nükleotidli tekrar ünitelerini yorumlamak kompleks bir işlemdir. Tetranükleotid tekrarları içeren mikrosatelit PZR amplifikasyon sonuçlarını yorumlamak, tek bir titrek bant elde edildiğinden ve gerçek band büyüklüğü ile aynı olduğundan daha kolaydır.

SSR belirleyicileri bitki genetik çalışmalarında yaygın kullanım alanı bulmuş ve soya fasulyesi (Akkaya ve ark., 1992), mısır (Senior ve Heun, 1993), çeltik (Wu ve Tanksley, 1993), arpa (Becker ve Heun, 1995), domates (Broun ve Tanksley, 1996) ve buğday (Röder ve ark., 1998) gibi bitki türlerinde genetik haritalamada ve polimorfizm belirlemede kullanılan faydalı ve etkili birer araç olduğunu bildirmişlerdir. SSR

(22)

belirleyicilerinin diğer kültür bitkilerinde de genotipleri ayırt etmede faydalı olduğu bilinmektedir (Sun ve ark., 1999; Virk ve ark., 1999).

Bu güne kadar çok farklı arpa materyallerinin genetik çeşitliliklerinin kullanılmasında RAPD (Yu ve ark., 2002), RFLP (Casas ve ark., 2003), AFLP (Hayes ve ark., 1997) belirleyicileri kullanılmıştır. Ancak literatürde arpa genetik çeşitliliğinin belirlenmesinde SSR belirleyicilerinin kullanımına dair çok sayıda çalışma vardır.

SSR belirleyicileri yüksek polimorfizm düzeylerine sahiptirler. Milbourne ve ark, (1998), arpa ve patateste yaptıkları çalışmada SSR’ların en yüksek (arpada % 100, patateste % 90.8), AFLP’lerin en düşük (arpada % 46, patateste % 41.7), RAPD’lerin ise orta seviyede polimorfizm gösterdiğini (arpada % 66.3, patateste % 65.8) saptamışlardır.

Buğdayın A ve B genomuna ait bir seri mikrosatelit, Türkiye’de geliştirilen 16 kışlık ve altı yazlık makarnalık buğday çeşidi ile 135 arpa çeşidini birbirinden ayırmak için kullanılmıştır (Donini ve ark., 1998). Ayrıca aynı mikrosatelitler kullanılarak 15 populasyonun çeşit içi polimorfizm araştırmaları yapılmıştır. Araştırma sonuçlarına göre, mikrosatelit (SSR) belirleyicilerinin buğday ve arpadaki genetik çeşitlilik çalışmalarında rahatlıkla kullanılabilecek ve yüksek derecede bilgi verici sistemler oldukları saptanmıştır.

Mikrosatellit belirleyicileri akraba genomlar arasında transfer edilebilme avantajına sahiptirler. Holton ve ark. (2002) türler arası transfer edilebilirliğini test etmek amacıyla yaptıkları çalışmada 41 arpa SSR belirleyicilerini 11 arpa ve 15 buğday varyetesinde kullanmışlardır. Arpa SSR’larının 16’sının arpada, beşinin ise buğdayda polimorfik olduğu tespit edilmiştir. İlave olarak buğday EST’lerinden 56 SSR aynı arpa ve buğday çeşitlerinde test edilmiş ve buğdayda dört, arpada bir polimorfizm saptanmıştır. Bu arpa ve buğdaylar arasında belirlenen transfer edilebilirlilik seviyesinin Röder ve ark., (1995)’ın bildirdiği seviyeden çok daha fazla olduğu gözlenmiştir.

Mahmood ve ark., (2004), 3A kromozomunda meydana gelen varyasyona bağlı olarak buğday hatları arasında genetik benzerliği incelemek amacıyla 12 arpa basit dizi tekrarı (SSR) primer çiftini kullanarak yaptıkları çalışmada 106 polimorfik bant elde

(23)

etmişlerdir. Çalışma sonunda, arpa mikrosatelit belirleyicilerinin buğdaya transfer edilebilirliliğini % 73 olarak bulmuşlardır.

Struss ve Plieske (1998) yabani formları, yerel ve kültür çeşitlerini içeren 163 arpa genotipinde genetik farklılığı hesaplamak, genotipleri ayırmak, genom analizi yapmak, genetik varyasyonu saptamak amacıyla mikrosatelit belirleyicilerini kullanmışlardır. Her iki çalışmada da araştırıcılar farklı arpa ve buğday genotiplerini ayırıp teşhis etmede mikrosatelit belirleyicilerinin hızlı ve etkin olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca mikrosatelitler ile elde edilen yüksek polimorfizmin yeni çeşitlerin yetiştirilmesi için ebeveyn seleksiyonlarına yardımcı olabileceğini ve mikrosatelit belirleyicilerinin genotip analizi ile DNA parmak izi analizi için çok yararlı olacağını ispat etmişlerdir.

Feng ve ark., (2006) Çin’in Qinghai-Tibet Platosundan toplanan 65 Hordeum vulgare ssp.hexastichon yerel çeşidinin aksesyonlarında 35 SSR belirleyicisi ile genetik çeşitlilik ve evrimsel akrabalık için yapılan çalışmada 248 allel tespit etmişlerdir. Elde edilen verilere göre Tibet aksesyonlarının genetik çeşitliliğinin Qinghai ve Ganzi aksesyonlarından çok daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Bu haliyle kültürü yapılan arpaların genetik çeşitliliğinin merkezinin Tibet olabileceği bildirilmiştir.

Struss ve Plieske (1998) IPK Almanya Gen Bankasında bulunan yabani formları, yerel ve kültür çeşitlerini içeren 163 arpa genotipinde genetik farklılığı hesaplamak, genotipleri ayırmak, genom analizi yapmak, genetik varyabiliteyi saptamak amacıyla mikrosatelit belirleyicilerini kullanmışlardır. Her iki çalışmada da araştırıcılar farklı arpa ve buğday genotiplerini ayırıp teşhis etmede mikrosatelit belirleyicilerinin hızlı ve etkin olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca mikrosatelitler ile elde edilen yüksek polimorfizmin yeni çeşitlerin yetiştirilmesi için ebeveyn seleksiyonlarına yardımcı olabileceğini ve mikrosatelit belirleyicilerinin genotip analizi ile DNA parmak izi analizi için çok yararlı olacağını ispat etmişlerdir. Seçilmiş mikrosatelit belirleyicilerini kullandıkları çalışmada 15 belirleyicinin toplam 130 allel belirlediği bildirilmiştir. Allel sayısı 5-15 arasında değişim göstermiş, ortalama değer ise 8,6 olmuştur.

Hamza ve ark., (2004) 17 mikrosatelit belirleyicisi kullanarak, 26 adet yerel arpa çeşidinin genetik akrabalıklarını belirlemişlerdir. 17 mikrosatelit belirleyicisinin 15 adedi polimorfizm gösterirken, iki adedi tek allele sahip olmuştur. Polimorfizm gösteren

(24)

primerler ile toplam 55 adet allel elde etmişlerdir. Ortalama allel sayısı 3,6 olup, bu alleller lokus başına 2 ile 7 allel olmak üzere değişim göstermektedir. Mikrosatelit belirleyicilerinin PIC değerleri ise 0,068 ile 0,78 arasında değişirken, ortalama PIC değerinin ise 0,45 olduğu gözlenmiştir.

Kolodinska Brantestam ve ark., (2007) çeşitler ve yerel çeşitlerden oluşan 197 İskandinav ve Baltık orijinli yazlık arpa genetik materyalini 21 SSR belirleyicisi ile taramıştır. Her bir genetik materyalden ıslah edilme tarihine göre değişerek iki, dört veya sekiz bitki incelenmiştir. Toplam 22 lokusa ait 197 allel belirlemişlerdir. Lokus başına allel sayısı iki ile 23 arasında değişmiş, ortalama 8,63 olmuştur.

Hernandez ve ark., (2002) 36 buğday ve 35 arpa basit dizi tekrarı (SSR) belirleyicilerini kullanarak Hordeum chilense ve H. tritordeum’un genetik analizini yaptıkları çalışmanın sonuçları buğday ve arpa SSR belirleyicilerinin Hordeum chilense, H. tritordeum ve türetilen introgression hatlarının genetik karakterizasyonu için çok değerli kaynak sağladığını göstermiştir.

Matus ve Hayes (2002) 22 Hordeum vulgare ssp. spontaneum, 32’si Hordeum vulgare ssp. vulgare ve 96 elit arpa hat ve çeşidinde 42 haritalanmış SSR lokusunu incelemişler ve toplam 687 allel belirlemişlerdir. Lokus başına allel sayısı 4-31 arasında değişmiş ortalama 10,3 olmuştur. H. spontaneum genotiplerinde ortalama allel sayısı 10,3, H. vulgare genotiplerinde ise 8,3 olarak belirlenmiştir. Her bir belirleyici için PIC değeri 0,08-0,94 arasında değişmiştir. Ortalama PIC değeri H. spontaneum için 0,79, H. vulgare için ise 0,75 olmuştur.

Turpeinen ve ark., (2001) 10 Hordeum vulgare ssp. spontaneum popülasyonuna ait 94 bitkiyi 18 SSR belirleyicisi kullanarak incelemişlerdir. Toplam varyasyonun % 64’ü popülasyon içinde, % 36’sı popülasyonlar arasında olduğu bildirilmiştir. İncelenen belirleyicilerin 2-17 arasında allele sahip olduğu saptanmıştır. Toplam 173 allel bulunmuştur.

Davila ve ark., (1999) 27 H. vulgare ssp. spontaneum materyalini 16 SSR belirleyicisi ile incelemiştir. Araştırmacılar SSR belirleyicilerinin polimorfizm değerlerinin yüksek olduğunu, ortalama 0,85’lik PIC değeri bulunduğunu, belirleyici başına ortalama 12,2 allel bulunduğunu bildirmiştir.

(25)

Pandey ve ark., (2006) 107 Himalaya kavuzsuz arpa yerel çeşidini kapsayan 44 SSR belirleyicisi ile taramışlardır. Her yerel çeşitten beş bitki incelemişlerdir. Araştırıcılar yerel çeşitler arasında SSR belirleyicileri bakımından yüksek bir genetik çeşitlilik bulunduğunu belirlemişlerdir (ortalama diversity indeks = 0,536). İncelenen 44 belirleyiciden 41 tanesi polimorfik olmuştur. Belirleyiciler 1-17 (ortalama 5,54) allele sahip olmuşlardır. Araştırıcılar 0 ile 0,88 arasında (ortalama 0,50) PIC değerleri bulmuşlardır. Allel sayısı ve PIC değerleri sırasıyla HVM40 belirleyicisi için 4 ve 0,40, BMAG222 belirleyicileri için 3 ve 0,60, BMAG120 belirleyicileri için ise 4 ve 0,53 olarak bulunmuştur.

Maestri ve ark., (2002) 22 arpa çeşidi arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek için üç moleküler belirleyicinin karşılaştırıldığı çalışmada, 15 SSR belirleyicisi kullanmışlardır. Çalışılan 15 primerin 13 adedinin polimorfik olduğunu iki adedinin ise tek allel meydana getirdiğini saptamışlardır. İncelenen 22 arpa çeşidinde toplam 51 allel belirlenmiş ve lokus başına allel sayılarının 2 ile 7 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Li ve ark., (2003) 127 SSR belirleyicisini altı arpa çeşidi ve iki H. vulgare ssp. spontaneum materyalinde incelemişlerdir. Toplam 133 allel elde etmişler, lokus başına 1-9 (ortalama 3,9) allel belirlemişlerdir. PIC değerlerinin 0,05 ile 0,94 arasında yer aldığını ve ortalamanın 0,60 olduğunu saptamışlardır.

Varshney ve ark., (2006) 185 EST orijinli SSR belirleyicisini beş arpa çeşidi ve iki arpa genetik materyalinde incelemişlerdir. Araştırmacılar 0,24-0,78 (ortalama 0,48) arasında PIC değerleri belirlemişlerdir. Belirleyici başına elde edilen allel iki ile beş arasında (ortalama 2,7) değişmiştir. Araştırmacılar genomik DNA orijinli SSR’larla karşılaştırıldığında EST orijinli SSR’ların daha düşük polimorfizm oranına sahip olduğunu bildirmiştir.

Pillen ve ark., (2000) 22 SSR belirleyicisinin çoğunluğu Alman çeşitleri, ikisi H. vulgare ssp. spontaneum olmak üzere 30 arpa materyalinde incelemişlerdir. Araştırmacılar belirleyici başına ortalama 3,2 polimorfik bant belirlemişlerdir. PIC değerlerinin 0,14 ile 0,78 arasında değiştiğini ortalama değerin ise 0,38 olduğunu saptamışlardır.

(26)

Smith ve ark., (2000)’ e göre her SSR’ın polimorfizm oranlarının ölçülmesi için polimorfizm bilgi içeriği (PIC) PIC = 1- ∑ P2i formülünden yararlanılmaktadır. Formüldeki Pi i. SSR allelinin frekansıdır (Matus ve Hayes, 2002).

(27)

3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal

3.1.1. Deneme Materyali

Araştırmada üç farklı genetik materyal kullanılmıştır. Bunlardan birincisi Amerika gen bankasında bulunan Tokak isimli bir saf hattır (CIHO 10093). On adet CIHO 10093 bitkisi incelenmiştir. İkinci materyal yerel çeşit olduğu ifade edilen ve Türkiye’de önemli bir ekilişe Tokak 157/37’dir (Akar ve ark., 1999). Bu materyalden Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı tarafından üretimi yapılan tohumluk içinden 60 adet bitki incelenmiştir. Üçüncü materyal ise, yine Amerika gen bankasında Tokak yerel çeşidi olarak kayıtlı bulunan ve Kars Sarıkamış civarındaki bir bölgeden toplanmış olan PI 470281’dir. Bu materyale ait 52 adet bitki incelenmiştir.

3.1.2. Deneme Yılı ve Yeri

Üç materyale ait tek tohumlardan elde edilen hatların DNA analizleri Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Moleküler Biyoteknoloji Laboratuvarında yürütülmüştür. Bu hatlar 2005-2006 ve 2006-2007 yetiştirme yıllarında Tarla Bitkileri Bölüm arazisinde tarla gözlemlerine tabi tutulmuştur.

3.1.3. Deneme Yerinin İklim Özellikleri

Tarla gözlemlerinin yapıldığı Tokat ili, İç Anadolu, Doğu Anadolu ve Karadeniz Bölgelerinin geçiş noktasında bulunmaktadır. Deneme yeri yarı karasal bir iklime sahiptir. Denemelerin tarla şartlarındaki iklim değerleri, Çizelge 3.1’de ve aylık yağış grafiği ise Şekil 3.2’de gösterilmiştir.

(28)

Çizelge 3.1. 1995-2005 uzun yıllar, 2005-2006 ve 2006-2007 yetiştirme yılı Tokat ili iklim değerleri Aylar Meteorolojik Elemanlar 11 12 01 02 03 04 05 06 Toplam veya ortalama 95- 7,0 3,2 1,3 2,8 7,0 12,5 16,1 19,5 9,0 05- 5,9 2,7 -0,6 2,3 9,3 12,6 15,3 21,7 9,0 Ortalama Sıcaklık _06- _5,9 _0,3 _3,5 _2,9 _7,9 _9,4 _20,4 _21,7 _9,0 95- 41,2 47,5 43,7 37,7 39,8 56,4 59,2 41,5 368,0 05- 35,4 14,2 34,4 25,2 46,1 48,5 91,4 5,8 304,0 Aylık Yağış(m) _06- _35,4 _14,2 _33,7 _20,4 _39,6 _43,2 _31,7 _33,8 _252,0 95- 70,9 72,6 69,9 64,9 60,7 60,3 61,6 58,7 65,0 05- 89,4 90,7 85,5 83,6 69,7 74,1 80,7 54,6 79,0 Nispi nem 06- 69,7 69,9 61,5 64,1 58,5 54,7 50,9 53,5 60,3

2005-2006 yetiştirme yılında vejetasyon dönemindeki ortalama sıcaklık, uzun yıllar ortalamasıyla aynı, nispi nem açısından ise uzun yıllar ve 2006-2007 vejetasyon dönemine göre genel olarak daha yüksektir. 2006-2007 yetiştirme yılı değerlendirildiğinde ortalama sıcaklık bakımından 2005-2006 dönemi ile aynı dereceye sahip olduğu görülmektedir. Nispi nem açısından ise, uzun yıllar ortalamasının bir miktar altında olduğu, 2005-2006 döneminin değerlerinden de hayli düşük olduğu tespit edilmiştir.

(29)

Şekil 3.1. Tokat ili uzun yıllar, 2005-2006 ve 2006-2007 yetiştirme yılları aylık yağış grafiği

2005-2006 yetiştirme yılında vejetasyon dönemindeki toplam yağış (304 mm) uzun yıllar ortalamasının (368 mm) bir miktar altında olmuştur. Bu dönemde Aralık, Ocak, Şubat ve Nisan aylarında düşen yağışın uzun yıllar ortalamasının altında olduğu, Kasım, Mart ve Mayıs aylarında, düşen yağışın ise uzun yıllar ortalamasının üzerinde olduğu görülmüştür. Çiçeklenme döneminin gerçekleştiği Mayıs ayında yağış uzun yıllar ortalamasına göre oldukça iyi iken, tane dolumunun gerçekleştiği Haziran ayında yağış uzun yıllar ortalamasının oldukça altında gerçekleşmiştir. 2006-2007 döneminde toplam yağış (252 mm) uzun yıllar ortalamasının altında seyretmiştir. Bu dönemde hem Mayıs ve hem de Haziran ayı yağışları uzun yıllar ortalamasının altındadır.

3.1.4. Deneme Alanının Toprak Özellikleri

Çalışma alanından alınan toprak örnekleri, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Toprak Bölümü’nde analiz edilmiştir.

(30)

Çizelge 3.2. Deneme alanına ait toprak analiz sonuçları Tekstür pH EC Organik Madde (%) Toplam Azot (%) Fosfor (P2O5) (kg/da) K2O (kg/da) CaCO3 (%) Ca (meq/ 100 g) Kumlu killi tın 6,89 183,30 2,45 0,11 29,58 96,00 17,00 66,71

Çizelge 3.2’de verilen analiz sonuçlarına göre; taban koşullardaki deneme alanından alınan toprak kumlu killi tın yapıdadır. pH nötr-hafif alkali reaksiyonlu olup, organik maddece orta zenginlikte ve tuz sorunu olmayan topraklardır.

3.2. Yöntem

3.2.1. Ekim, Bakım ve Hasat İşleri

Üç materyale ait hatlar 17 Kasım 2005 ve 20 Kasım 2006 tarihlerinde olmak üzere iki yetiştirme döneminde, sıra arası 40 cm, sıra üzeri ise 10 cm olan 2 m uzunluğunda ve iki sıradan oluşan mini parsellere elle ekilmiştir.

Araştırmada; ekimle birlikte 7,5 kg/da P2O5 (triple süper fosfat formunda) ve 15 kg/da azot (amonyum nitrat formunda) verilmiştir. Fosforun tamamı ve azotun yarısı ekimle birlikte, azotun kalan yarısı ise ilkbaharda sapa kalkma döneminde elle serpme şeklinde uygulanmıştır.

Bitkilerin gelişmeleri sırasında sıra aralarında görülen yabancı otlar elle alınmıştır. Bitkilerin olgunlaşması tamamlandıktan sonra elle hasat edilmiştir.

3.2.2. İncelenen Özellikler

Çalışmada her bir hatta ait tohumlardaki rachilla uzunluğu, rachilla tüylülüğü, kısır başakçık durumu, kılçık kabalığı, yapraklarda antosiyanin pigmenti gibi morfolojik belirleyiciler incelenmiştir. Ayrıca çiçeklenme süresi ve her hatta ait 10 adet bitkide

(31)

bitki boyu belirlenmiş bu bitkilerden elde edilen 20 başakta başak uzunluğu, başak ağırlığı, başakta tane sayısı ve 1000-tane ağırlığı belirlenmiştir.

1) Bitki boyu (cm): Bitkinin toprak yüzeyinden çıktığı yer ile başağın en üst başakçığının ucu arasındaki mesafenin ölçülmesiyle bulunmuştur.

2) Başaklanma süresi: Parseldeki bitkilerin % 50’sinde ilk başağın görüldüğü zamana kadar geçen süre toplam gün olarak bulunmuştur.

3) Başak uzunluğu (cm): Başağın üst sapa bağlandığı yer ile en üst tanenin ucu arasındaki mesafenin ölçülmesiyle bulunmuştur.

4) Başakta tane sayısı (adet): Başaktaki tanelerin sayılmasıyla bulunmuştur.

5) Başak yoğunluğu (tane/cm): Başaktaki tane sayısının başak uzunluğuna oranı şeklinde elde edilmiştir.

6) Başak ağırlığı (gr): İncelenen 20 başağın ağırlıklarının tartılmasıyla elde edilmiştir. 7) 1000-tane ağırlığı: İncelenen 20 başakta belirlenen ortalama başakta tane ağırlığı değerlerinin ortalama başakta tane sayısına oranının bin ile çarpımı şeklinde bulunmuştur.

3.2.3. Moleküler Analizler 3.2.3.1. DNA İzolasyonu

DNA eldesi Doyle ve Doyle (1990)’ın bildirdiği yönteme göre yapılmıştır. Çalışmamızda kullandığımız DNA ekstraksiyon metodu aşağıdaki şekildedir:

1) 1,5 cm boyunda bir yaprak önce ependorf tüpte sıvı azot kullanarak öğütülmüş ve daha sonra her tüpe 500 µl ekstraksiyon buffer’ı ilave edilmiştir.

• 100 ml ekstraksiyon buffer hazırlamak için

•

• 65 ml dH2O

• 10 ml 1 M Tris (pH: 7,5) • 14 ml 5 M NaCl ve

• 10 ml 0,5 M EDTA (pH: 8,0) karıştırılarak 65 ºC’de ısıtılmış daha sonra; • 1 gr CTAB ile

(32)

2) Bir ünite Proteinaz K eklendikten sonra vortekslenerek karıştırılmıştır.

3) 80 µl % 10 SDS eklenmiş, alt üst ederek dikkatlice karıştırılmıştır. 65 0C’deki su banyosunda 90 dakika tutulduktan sonra her 15 dakikada bir alt üst ederek

karıştırılmıştır.

4) Su banyosundan çıkarılan tüpler 5 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. 2/3 hacim (400 µl) kloroform: isoamil alkol (24:1) eklenmiş ve 10-15 dakika yavaşça alt üst edilerek iyice karıştırılmıştır.

5) 10,000 g’de 15 dakika santrifüj edilmiştir.

6) Süpernatant’a 2/3 hacim (400 µl) 2-propanol eklendikten sonra 1-2 dakika alt üst edilerek DNA gözle görülür hale getirilmiştir.

7) 15 dakika 10,000 g’de santrifüj edilmiştir.

8) Sıvı dikkatli bir şekilde dökülmüştür Pelet kuruduktan sonra 400 µl 1 X TE eklenmiş ve +4 0C’de bir gece bekletilmiştir.

9) DNA 60° C’deki su banyosunda 15 dakikada bir karıştırılarak üç saat eritilmiştir.

10) 10 mg/ml RNase çözeltisinden 1 µl eklenip ve su banyosunda bir saat bekletilmiştir.

11) 400 µl kloroform: isoamil alkol (24:1) eklenip tüpler 10-15 dakika alt-üst edilerek ekstraksiyon yapılmıştır.

12) 15 dakika 10,000 g’de santrifüj edilmiştir.

13) Süpernatant 100 µl 1,2 NaCl içeren yeni bir tüpe alınmış ve hafifçe karıştırılmıştır.

14) 800 µl % 96 soğuk etil alkol ilave edildikten sonra alt üst edip karıştırılarak DNA çökeltilmiştir.

15) 10,000 g’de 20 dakika santrifüj edilmiş ve sıvı dikkatli bir şekilde dökülmüştür. 16) Pelet % 70 soğuk etil alkol ile dikkatlice yıkanır. Ters çevrilmiş halde iki saat

kurutulmuştur.

17) Kuruyan pelet 100 µl 1 X TE’de çözülmüş bir gece +4 0C’de tutulduktan sonra su banyosunda 65 0C’de 3-4 saat eritilmiştir. Sonuçta toplam 20 µg civarında DNA elde edilebilmektedir.

(33)

3.2.3.2. DNA Miktarının Belirlenmesi

DNA miktarının ve kalitesinin gözlenmesi için 2 µl DNA, 1.5 µl 10 X loading buffer ve 11.5 µl dH20 içeren karışım % 1’lik agaroz jele yüklenmiştir. Hazırlanan örnekler, elektroforezde 90 voltta 1 saat koşulmuştur. UV transilluminatör yardımıyla örnek DNA’ları gözlenmiştir. Yoğunluğu çok az olan ya da kalitesi düşük olan DNA’lar tekrar örnek alınarak izolasyon işlemi tekrarlanmış, DNA konsantrasyonu yetersiz görülenler etüve konularak suyu uçurulmuş, fazla olanlar ise 1X TE eklenerek her örnekteki DNA miktarı ayarlanmıştır.

3.2.3.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

DNA izolasyonu tamamlandıktan sonra PZR işlemine başlanmıştır. İzole edilen her bir DNA’nın spesifik bölgeleri, kullanılan primerlerin özelliklerine bağlı olarak [Röder ve ark. (2002) ile Hayden ve ark. (2006)] PZR ile çoğaltılmıştır. Her bir reaksiyon karışımı 40 µl reaksiyon hacminde 250 nM primer, 0,2 mM deoksinükleotidlerin her birinden, 1,5 mM MgCl2, 0,5 Ünite Taq-polimeraz enzimi ve 50–100 ng kalıp DNA içermektedir. Her bir PZR işlemi 94 °C’ de beş dakika tutma sonrasında 32 döngülük 94 °C’ de bir dakika denatürasyon, primer yapışma sıcaklığına göre bir dakika yapışma, 72 °C’ de bir dakika uzatma sirkülâsyonundan oluşmaktadır. Son olarak 72 °C’ de beş dakika son uzatma uygulanmıştır.

(34)

3.2.3.3. Çalışmada Kullanılan Primerler

Çalışmamızda kullanılan mikrosatelitler Çizelge 3.3’de verilmiştir. Arpa genotiplerini birbirinden ayırmada, GrainGenes veri tabanındaki bilgiler kullanılarak az bant veren yüksek kaliteli SSR primerleri seçilmiştir (http://www.visualgenomics.ca/graingenes /cgibin/graingenes/browse.cgi?class=marker)

Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan mikrosatellit DNA belirleyicilerinin özellikleri

Belirteç Adı Primer Dizisi Yapışma _{sıcaklığı (}0_C) Ürün bant _{uzunluğu (bp)}

GBMS35 GBMS120 GBMS129 GBM1464 BMAG217 BMAG321 BMAG369 GBM1323 BMAG120 BMAG507 HVM40 GBM1055 GBMS2 SCSSR7759 ****** ****** ****** ****** ****** ****** Forward ATAGCCGTGCTCTTGCTCAT Reverse CAAGACCACCATTTGCATTG Forward AATGCTCAAATATCTATCATGAA Reverse GGGGCTGTCACAAGTATATAG Forward ATTATCTCCTGCAACAACCT Reverse CTCCGGAACTACGACAAG Forward CACTAGGCACCAATGACTG Reverse ATCGAAAATCTTAGCTTTGG Forward GCTCTCCAGGGTTCGTTTC Reverse CACCGTCTTGCAGTTGAGAC Forward ATTTCATCCCAAAGGAGAC Reverse CACATAGACAGTTGTCTTCC Forward CACTAGGCACCAATGACTG Reverse ATCGAAAATCTTAGCTTTGG Forward CGATTCCCCTTTTCCCAC Reverse ATTCTCCGCCGTCCACTC ******* ******* ******* ******* Forward GCAACTCCTCATCATCTCAGG Reverse CAACAGCCAGAAGGTCTACG 60 60 55 55 58 58 58 55 58 53 55 55 60 58 145 230 153 ? 196 218 191 ? 200 147 160 ? 110 228

(35)

Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan mikrosatellit DNA belirleyicilerinin özellikleri (devam)

Belirleyici adı Primer dizisi Yapışma _{sıcaklığı (°C)} Ürün bant _{uzunluğu (bp)}

EBMac691 GBMS114 EBMac906 GBMS66 GBMS137 GBMS229 GBMS235 BMAG518 GBMS50 GBMS166 BMAG222 BMAG606 HVPAZXG GBMS247 GBMS77 GBMS117 Forward TTAACAGAGGGCATTGGT Reverse TCCTTTTCTCCATTTGAGTT ******* ******* Forward CAAATCAATCAAGAGGCC Reverse TTTGAAGTGAGACATTTCCA ******* ******* ******* ******* ******* ******* ******* ******* Forward AATGCCATGATGTTATTGG Reverse AAGAAGATTACATCGAATAGATCA ******* ******* ******* ******* Forward ATGCTACTCTGGAGTGGAGTA Reverse GACCTTCAACTTTGCCTTATA Forward CTATTTGTAATGTATGTATGTCCC Reverse TCATTGGTCCAGATAATACAA Forward TTTCCGGGTCCTTTCGTGC Reverse TTTAATGGGCATCACACCATC ******* ******* ******* ******* ******* ******* 55 60 60 60 60 55 55 58 55 60 58 55 55 60 60 60 111 117 153 113 156 156 142 168 133 156 179 140 177 228 182 149

(36)

3.2.3.4. Jel Sistemi

PZR ürünleri % 3’lük bir Metaphore Agarose jelde, %1’lik TBE bufferde 90 Volt’luk gerilimde koşulmuştur. DNA’yı gözlemek için kullanılan ethidium bromid, jel hazırlanırken 7 µl eklenmiştir.

Şekil3.2. Çalışmada kullanılan yatay elektroforez

3.2.3.5. Verilerin değerlendirilmesi

Her bir örnekten elde edilen DNA bant profilleri bir jel imaj sistemi aracılığı ile (Vilber Lourmat CN–08) belirlenmiş ve bir jel analiz bilgisayar programı (Biocapt Version: 11.02) kullanılarak veriler alınmıştır. Hatların genel olarak akrabalık dereceleri Sneath ve Sokal (1973) tarafından belirtilen UPGMA algoritması kullanılarak oluşturulan dendogramlar ile belirlenmiştir. Genetik ilişkileri göstermek için Principal Component analizi kullanılmıştır (Gower, 1966).

(37)

4. TARTIŞMA ve SONUÇ 4.1. CIHO 10093 materyali

4.1.1. SSR belirleyicileri ile genetik akrabalık analizleri

ABD gen bankasında Tokak çeşidi adı ile korunan bir safhat olan CIHO 10093 materyaline ait 10 bitki DNA analizine tabi tutulmuş (sonuçlar gösterilmemiştir), bu bitkilerin tümünün aynı belirleyici paterni vermesi nedeniyle tek bir genotip olarak tarla testlerinde ve dendogram analizinde Tokak 157/37 çeşidi hatları ile birlikte değerlendirmeye alınmıştır.

4.1.2. Morfolojik Özellikler

Genotipler aynı olduğu için sadece bir hat olarak Tokak 157/37 ile birlikte değerlendirmeye alınmıştır.

4.1.3. Bitkisel Özellikler

Genotipler aynı olduğu için sadece bir hat olarak Tokak 157/37 ile birlikte değerlendirmeye alınmıştır.

4.2. Tokak 157/37 materyali

4.2.1. SSR belirleyicileri ile genetik akrabalık analizleri

Tokak 157/37 yerel çeşidine ait toplam 60 bitki incelenmiştir. Bu bitkiler 30 SSR primeri ile taranmıştır. Kullanılan SSR belirleyicilerinin tekrar sayıları, kromozom konumları ve sahip oldukları allel sayıları GrainGenes veri tabanındaki bilgilerden yararlanılarak Çizelge 4.1’de verilmiştir.

(38)

Çizelge 4.2. SSR primerlerinin kromozom konumları, sahip oldukları allel sayıları ve polimorfizm oranları

Belirleyici adı Tekrar Kromozom Allel sayısı Polimorfik bilgi seviyesi GBMS35 (GA) 1 1 0 GBMS120 (AT) 1 1 0 GBMS129 (CA) 1 1 0 GBM1464 (CAG) 1 1 0 BMAG120 (AG) 1 2 0,04 BMAG217 (AG) 1 1 0 BMAG321 (AG)(AC) 1 1 0 BMAG369 (CT) 1 1 0 BMAG507 (AG) 1 1 0 GBMS66 (CA) 2 1 0 GBMS137 (GA) 2 2 0,04 GBMS229 (GT) 2 1 0 GBMS235 (TC)T(TC) 2 1 0 GBMS247 (GT) 2 2 0,04 BMAG518 (TC) 2 1 0 SCSSR7759 (CAG) 2 1 0 GBMS2 (GA) 2 1 0 GBMS50 (AC)(AG) 3 2 0,04 GBMS117 (CT) 3 1 0 GBMS166 (CA)TCGCT(CA) 3 1 0 BMAG606 (CT) 3 2 0,04 HVM40 (GA)(GT)(GA) 4 1 0 GBM1055 (TCC)(TGC) 4 1 0 EBMac691 (CA)CG(CA) 4 1 0 GBMS114 (CT) 4 1 0 EBMac906 (GC)GGG(GT) 4 1 0 GBM1323 (GCC) 4 1 0 HVPAZXG (C)(A) 4 1 0 BMAG222 (AC)(AG) 7 1 0 GBMS77 (GT) 7 1 0 Toplam 35 0,2 Ortalama 1,16 0,008

(39)

Yapılan analizler sonucunda, kullanılan 30 SSR primerine ait bant profilleri bir jel imaj sistemi (Biocapt Version: 11.02) aracılığı ile belirlenmiş, bunlardan 25 tanesi polimorfizm göstermemiş, yani sadece bir allele sahip olmuştur. Görüntülenen jellerin bazıları Şekil 4.1.-4.14’de gösterilmiştir. (Kaynakları etkin kullanmak amacıyla her jele birden fazla yükleme yapılmıştır).

Şekil 4.1. BMAG120 (%3’lük metaphore jel)

(40)

(41)

(42)

Şekil 4.7. GBMS50 ve GBMS137 (%3’lük metaphore jel)

(43)

Şekil 4.9. GBMS120 (%3’lük metaphore jel)

(44)

(45)

Şekil 4.13. GBM1464 (%3’lük metaphore jel)

(46)

Elde edilen verilere göre çalışılan primerlerin toplam 35 adet allel meydana getirdiği, sadece beş primerin birden fazla allel oluşturduğu yani polimorfik olduğu gözlenmiştir. Ortalama allel sayısı 1,16’dir. PIC değerleri incelendiğinde ise değerlerin oldukça düşük olduğu gözlenmektedir. Toplam PIC değeri 0,20, ortalaması ise 0,008 olarak kaydedilmiştir.

Polimorfik primerlerin BMAG606, BMAG120, GBMS50, GBMS137 ve GBMS247 olduğu gözlenmiştir. Bu primerlere ait bant profilleri incelendiğinde 7 ve 58 no’lu hatlarda polimorfizm saptanmıştır. 7 ve 58 no’lu hatlar polimorfizm gözlenen beş primer bakımından da aynı bant paternleri göstermiştir. Buna göre incelenen 60 bitkiden 58 tanesi tamamen aynı, sadece 7 ve 58 numaralı hatlar farklıdır. Bu kadar düşük düzeydeki bir genetik varyasyon bir yerel çeşit için çok düşüktür. Bu nedenle bir yerel çeşit olarak kabul edilen Tokak 157/37’nin bu özelliğini kaybetmiş olduğu görülmektedir. Farklı olan iki hat basitçe tohum karışımının bir sonucu olabilir.

İncelenen hatlardan hiçbirinde heterozigot yapı gözlenmemiştir. Bu durum tohumluk üretimi esnasında herhangi bir açık tozlanmanın olmadığını göstermektedir.

CIHO 10093 materyali incelenen tüm belirleyiciler bakımından Tokak 157/37’nin 58 hatta belirlenen yaygın genotipi ile aynı bulunmuştur. Buna göre Tokak 157/37 ile CIHO 10093 aynıdır.

4.2.2. Morfolojik Özellikler

Tokak 157/37 çeşidinin, tohumlarındaki rachilla uzunluğu, rachilla tüylülüğü, kısır başakçık durumu, kılçık kabalığı, yapraklarda antosiyanin pigmenti gibi morfolojik belirleyiciler ile incelenmiştir. İncelenen 60 hat çalışılan morfolojik belirleyiciler bakımından polimorfizm göstermemiştir. İncelenen hatlar uzun ve çok tüylü rachillaya, iyi gelişmiş kısır başakçığa, kaba kılçıklara ve antosiyaninli yapraklara sahiptir.

Morfolojik belirleyiciler bakımından da CIHO 10093 Tokak 157/37 hatları ile tamamen aynı özellik göstermiştir. Bu veri de CIHO 10093 ile Tokak 157/37’nin aynı olduğunu ortaya koymaktadır.

(47)

4.2.3. Bitkisel Özellikler

2005-2006 yetiştirme döneminde deneme alanı yetersizliğinden dolayı Tokak 157/37 materyaline ait sadece 36 hattın ekimi yapılmış ve gözlem alınmıştır. Bu hatlara ait bazı bitkisel özelliklerin ölçümlerine ve standart hatalarına ait veriler Çizelge 4.1’de verilmiştir.

Çizelge 4.2. Tokak 157/37 çeşidine ait hatlar ve CIHO 10093’ün bazı bitkisel özelliklerine ait veriler

Bitki no Çiçeklen me zamanı (gün) Bitki boyu (cm) Başak uzunluğu (cm) Başakta tane sayısı (adet) Başak yoğunluğu (tane/cm) Başak ağırlığı (gr) 1000-tane ağırlığı (gr/adet) CIHO1009 175 80,75 7,98 19,90 2,52 1,08 54,27 1 175 69,00 9,00 22,20 2,47 0,98 44,14 2 174 80,50 10,03 23,57 2,35 1,34 56,85 3 174 82,50 9,15 22,60 2,47 1,24 54,86 4 177 93,75 9,95 24,40 2,45 1,72 70,49 5 178 68,60 8,55 21,60 2,53 1,21 56,01 6 176 85,83 9,48 24,60 2,60 1,70 69,10 7 176 82,60 9,55 25,10 2,63 1,55 61,75 8 175 85,25 10,08 25,70 2,55 1,39 54,08 9 176 63,66 8,60 20,90 2,43 0,72 34,44 10 177 69,00 7,55 19,80 2,62 0,68 34,34 11 177 68,83 8,78 21,60 2,46 1,24 57,40 12 178 72,00 8,75 21,00 2,40 1,02 48,57 13 178 79,66 8,75 21,20 2,42 1,16 54,71 14 177 88,66 9,43 22,50 2,39 1,25 55,55 15 176 85,40 8,88 21,90 2,47 1,15 52,51 16 174 95,40 10,73 26,80 2,50 2,10 78,35 17 176 74,00 7,95 19,70 2,48 0,96 48,73 18 174 85,50 8,39 20,22 2,41 0,96 47,47 19 177 85,00 8,68 21,80 2,51 1,11 50,91 20 177 78,75 9,70 24,70 2,55 1,62 65,18 21 176 90,83 8,05 20,90 2,60 1,21 57,89 22 176 84,80 9,90 26,50 2,68 1,69 63,77 23 175 81,40 9,18 22,30 2,43 1,37 61,43 24 176 75,00 8,63 21,10 2,45 1,32 62,55 25 175 94,00 10,63 26,50 2,49 1,65 62,26 26 176 99,00 9,15 22,40 2,45 1,31 58,48 27 176 82,60 8,83 20,00 2,27 1,21 60,50 28 177 69,00 9,68 25,70 2,66 1,56 60,70

(48)

Çizelge 4.2. Tokak 157/37 çeşidine ait hatlar ve CIHO 10093’ün bazı bitkisel özelliklerine ait veriler (devam)

29 176 73,00 9,05 24,70 2,60 1,44 58,29 30 174 91,16 10,45 25,37 2,43 1,58 62,27 31 175 98,66 8,80 22,90 2,60 1,35 58,95 33 176 87,60 10,10 25,90 2,56 1,54 59,45 34 177 85,25 8,05 20,00 2,49 1,00 50,00 35 177 86,20 9,78 25,10 2,57 1,36 54,18 36 176 91,60 10,43 25,20 2,42 1,51 59,92 Ort. 176 82,35 9,18 22,95 2,49 1,31 56,67 Std. Ht. 1,46 2,30 0,79 2,18 0,09 0,29 0,50

Tokak 157/37 hatları ve CIHO 10093 materyalinde, çiçeklenme süresinin 174-178 gün, bitki boyunun 69,66 ile 99,00 cm, başak uzunluğunun 7,55 ile 10,73 cm, başakta tane sayısının 19,7 ile 26,8 tane, başak ağırlığının 0,68 ile 2,10 gr, 1000-tane ağırlığının 33,0 ile 74,0, başak yoğunluğunun ise 2,27 ile 2,72 arasında değiştiği gözlenmiştir. Çiçeklenme süresi ve başak yoğunluğu gibi çevreden nispeten az etkilenen özelliklerde varyasyon düşüktür. Diğer özelliklerde gözlenen farklılıklar çevreden kaynaklanmakta ve çalışmamızda tekrarlamanın olmaması gerçeğinden dolayı yüksek görünmektedir.

4.3. PI 470281 Materyali

4.3.1. SSR Belirleyicileri ile Genetik Akrabalık Analizleri

PI 470281 yerel çeşidine ait toplam 52 bitki incelenmiştir. Bu bitkiler 30 SSR primeri ile taranmış ve bunlardan 23 tanesi polimorfizm göstermiştir. GrainGenes veri tabanındaki bilgilerden yararlanılarak kullanılan SSR belirleyicilerinin, tekrar sayıları, kromozom konumları ve sahip oldukları allel sayıları Çizelge 4.3’de verilmiştir.

(49)

Çizelge 4.3. SSR belirleyicilerinin kromozom konumları ve sahip oldukları allel sayıları

Belirleyici adı Mikrosatelit

tekrar türü Kromozom Allel sayısı PIC

BMAG369 (CT) 1 2 0,23 BMAG321 (AG)(AC) 1 3 0,60 GBMS120 (AT) 1 6 0,73 GBMS129 (CA) 1 2 0,33 GBMS35 (GA) 1 2 0,36 GBM1464 (CAG) 1 3 0,37 BMAG217 (AG) 1 2 0,36 BMAG507 (AG) 1 3 0,18 BMAG120 (AG) 1 3 0,25 GBMS66 (CA) 2 2 0,20 GBMS229 (GT) 2 2 0,04 GBMS247 (GT) 2 2 0,20 GBMS235 (TC)T(TC) 2 2 0,04 GBMS137 (GA) 2 4 0,73 BMAG518 (TC) 2 2 0,44 SCSSR7759 (CAG) 2 1 0 GBMS2 (GA) 2 1 0 GBMS50 (AC)(AG) 3 3 0,47 GBMS117 (CT) 3 6 0,63 GBMS166 (CA)TCGCT(C 3 2 0,49 BMAG606 (CT) 3 3 0,75 HVM40 (GA)(GT)(GA) 4 2 0,44 GBM1055 (TCC)(TCG) 4 3 0,53 EBMac691 (CA)CG(CA) 4 1 0 GBMS114 (CT) 4 1 0 EBMac906 (GC)GGG(GT) 4 2 0,04 GBM1323 (GCC) 4 1 0 HVPAZXG (C)(A) 4 1 0 BMAG222 (AC)(AG) 7 2 0,18 GBMS77 (GT) 7 1 0 Toplam 70 8,59 Ortalama 2.4 2,28

Çizelge 4.3’te kullanılan 30 SSR primerinden yedi tanesi polimorfizm göstermemiş, yani sadece bir allele sahip olmuştur. Görüntülenen jellerin bazıları Şekil 4.15 - 4.39’de gösterilmiştir.

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

Şekil 4.25.GBMS66 (%3’lük metaphore jel)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

Şekil 4.35. HVM40 (%3’lük metaphore jel)

(61)

Şekil 4.37. GBM1464 (%3’lük metaphore jel)