1
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2011/59 Projenin Başlığı
Yaşlanmanın Göz ve Beyin Dokuları Üzerine Olan Etkisinin Stereolojik ve Histokimyasal Yöntemler Kullanılarak Araştırılması
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ORTAK Tıp Fakültesi Göz Hastalıkları ABD
Proje Araştırmacıları
Yrd. Doç. Dr. Ufuk TAŞ Anatomi AD
Uzman Zafer İsmail KARACA Histoloji ve Embriyoloji AD
ii
ÖZET
Yaşlanmanın Göz ve Beyin Dokuları Üzerine Olan Etkisinin Stereolojik ve Histokimyasal Yöntemler Kullanılarak Araştırılması (*)
Biz bu çalışmada rat retinası postnatal gelişimi süresince ubikütin ve p97/VCP’nin dağılım paternlerini araştırmayı amaçladık. 1-, 4-, 10-,36- ve 72 haftalık ratların retinaları immünohistokimyasal olarak değerlendirildi ve protein kolokalizasyonu immünfloresan mikroskobu ile tesbit edildi. 1.haftalık rat retinasında p97/VCP güçlü şekilde eksprese edildi fakat hiçbir ubikütin reaktivitesi gözlemlenmedi. p97/VCP immünoreaktivitesi 10 haftalık rat retinalarında önemli şekilde artmıştı. 36 ve 72 haftalık rat retinalarında ubikütin belirgin şekilde artarken, p97/VCP immünoreaktivitesi önemli şekilde azalmıştı. Bizim sonuçlarımız gösterdi ki p97/VCP reaktivitesi 10. haftadan sonra önemli şekilde azalırken yaşlanma ile ubikütin reaktivitesi artmaktadır. Bu sonuçlara dayanarak biz ileri sürdük ki, değişen p97/VCP ve ubikütin ekspresyon paternleri yaşa bağlı makula dejenerasyonu ile ilişkili olabilir.
Biz aynı zamanda postnatal rat retinasında aquaporinlerin(AQPs) ekspresyon paternlerini değerlendirdik. AQP1–4, 6 ve 9’un 1, 4, 12 ve 40 haftalardaki ekspresyon paternlerindeki değişiklikleri değerlendirdik. AQP1, 3, 4, 6 ve 9, 12.haftalığa kadar belirgin şekilde arttı ancak 40. Haftalıkratlarda azalmıştı. AQP2 ekspresyonu nadiren1.haftada görüldü ve 4.haftadan sonra önemli bir değişiklik gözlemlenmedi. Yaşlanmış rat retinalarındaki aquaporinlerin azalmış ekspresyonları yaşa bağlı retinal hastalıkların patogenezi ile ilişkili olabilir.
Anahtar Kelimeler: Ubikütin, p97/VCP, Aquaporin, Rat, Retinal dejenerasyon
(*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No: 2011/59)
ııı
ABSTRACT
In this study, we aimed to investigate the distribution pattern of ubiquitin and p97/VCP in the rat retina during postnatal development. Eyeballs from 1-, 4-, 10-,36- and 72-week-old rats were examined by immunohistochemistry, and protein colocalization was determined by immunofluorescence microscopy. In the 1-week-old rat retina, p97/VCP was strongly expressed in the neuroblast layer, however no ubiquitin immunoreactivity was observed. p97/VCP immunoreactivity increased significantly in the 10-week-old rat retinas. Ubiquitin was barely seen in the 4-week-old rat retinas, and ubiquitin expression was weak in the GCL and the IPL of the 10-week-old rat retinas. In the 36- and 72-week-old rats, the presence of ubiquitin was remarkable in the IS, INL, IPL and GCL, however, p97/VCP immunoreactivity was significantly decreased. Our results indicate that p97/VCP immunoreactivity in the retina significantly decreases after rats reach 10 weeks of age, whereas ubiquitin immunoreactivity increases with aging. These results suggest that an altered expression pattern of p97/ VCP and ubiquitin in the developing rat retina may associate with age-related retinal degeneration.
We also examined to aquaporins (AQP) expression paterns in the postnatal rat retina.. we investigated the immunolocalization of AQP1–4, 6 and 9 during postnatal development in the rat retina and examined the effect of age on the tissue distribution of these channels. AQP1, 3, 4, 6 and 9 showed gradually increased expression in rat retinas from postnatal week 1 to week 12, and decreased in the 40-week-old rat retinas. AQP2 expression was barely seen in the first week in rat retinas and displayed a significant increase from week 1 to week 4, however no significant alteration of AQP2 was observed after 4 weeks of development. The reduced expression of AQPs in aged rat retinas may indicate the involvement of AQPs in the pathogenesis of age-related retinal diseases.
v
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR)
Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder.
Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP yöneticilerine ve tüm çalışanlarına,
Göz Hastalıkları ve Histoloji- Embriyoloji Anabilim Dalı’nın tüm çalışanlarına, teşekkür ederim.
vi
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
Sayfa
ÖZET Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
ABSTRACT Hata! Yer işareti tanımlanmamış. ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
İÇİNDEKİLER DİZİNİ Hata! Yer işareti tanımlanmamış.i
SİMGELER VE KISALTMALAR Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
ŞEKİLLER DİZİNİ viii
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLERHata! Yer işareti tanımlanmamış.
1.1. Übikütin Protazom Sistemi (UPS) Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
1.2. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 1
1.3. Aquaporinler 2
MATERYAL VE METOD 3 2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar 4 2.2. Antikorlar 5 2.3. Deney Aletleri Ve Markaları 5 2.4. Kromojenler 5 2.5. Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi 6 2.6. İmmunohistokimya 6 2.7. İmmunofloresan 7 2.8. Çiftli boyama 7 İSTATİKSEL ANALİZ 7 3.1. Semiquantitative HSCORE analizi 7 BULGULAR 8 4.1. Postnatal rat retinasında p97/VCP ekspresyon paterni 8 4.2. Postnatal rat retinasında ubikütin ekspresyon paterni 8
4.3. postnatal rat retinasında aquaporin ekspresyon paterni 9
-aquaporin 1 9 -aquaporin 2 9 -aquaporin 3 10 -aquaporin 4 10 -aquaporin 6 10 -aquaporin 9 10 TARTIŞMA 18 SONUÇ 21 KAYNAKLAR 22
vii
SİMGELER VE KISALTMALAR
Tris : Tris (hidroksimetil)-amino-methan
UPS : Ubikütin protazom sistem
UV : Ultraviolet V : Volt VCP : Valosin-içeren protein µ : Mikro AQPs : Aquaporinler AQP1 : Aquaporin 1 AQP2 : Aquaporin 2 AQP3 : Aquaporin 3 AQP4 : Aquaporin 4 AQP6 : Aquaporin 6 AQP9 : Aquaporin 9
GCL : Ganglion hücre tabakası ILM : İç limitan membran INL : İç nukleer tabaka IPL : İç pleksiform tabaka IS : İç segment
NBL : Nöroblast tabaka OLM : Dış limitan membran ONL : Dış nukleer tabaka OPL : Dış pleksiform tabaka OS : Dış segment
PRL : Fotoreseptör tabaka RPE : Retina pigment epiteli
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1:Postnatal rat retinalarında p97/VCP immünohistokimyasal boyanma paternlerinin
sunumu.
Şekil 2:Postnatal rat retinalarında Ubikütin immünohistokimyasal boyanma paternlerinin
sunumu.
Şekil 3: Ubikütin ve p97/VCP ekspresyonunun H-SCORE analizi
Şekil 4: Farklı postnatal yaşlardaki rat retinalarında Ubikütin ve p97/VCP kolokalizasyonu (a–c). Şekil 5: Postnatal 1 haftalık ratlarda aquaporin immünolokalizasyonlarının sunumu
Şekil 6: Postnatal 4, 12 ve 40 haftalık rat retinalarında aquaporin immunohistokimyasal dağılım
paterni.
Şekil 7: 12 haftalık rat retinalarının AQP1 (A ve B), AQP3 (C), AQP4 (D), AQP6 (E) ve AQP9
(F) immünoreaktivitelerinin daha detaylı sunumu.
1
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ GENEL BİLGİLER
.
1.1. Ubikütin Protazom Sistemi (UPS)
UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS’in ubikütinleme ve ubikütinlenmiş proteinlerin yıkımı olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk ubikütinleme fazında, ubikütin (Ub) ATP yardımıyla ubikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra ubikütin bağlayıcı enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, ubikütin, protein ligaz (E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub’nin son aminoasidinin (G76) karboksil grubunda gerçekleşir (Pickart, 2001b, a). UPS siklusunun ikinci fazında, protazom poliubikütin zincirleri sayesinde, substratı tanır. Substrat, küçük peptidlerine yıkılır ve Ub’nin özgün deubikütinleyici enzimi sayesinde geri eldesi sağlanır. Ub’nin substrata konjugasyonu gibi, proteazomal yıkım da, ATP bağımlıdır. 26S proteazomun, hem ubikütinlenmiş proteinlerin ubikütinden ayrılması hem de onların yıkımlarının katalizlenmesinde önemli bir görevi vardır (Schwechheimer ve Deng, 2001; Pickart ve Cohen, 2004).
1.2. VCP Bağımlı Protein Yıkımı
97-kDa’luk Valosin-içeren protein (p97 veya VCP), ubikütin-protazom sistemine bağlı proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP’nin, ubikütin ve kofaktörleri ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS’de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir. VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliubikütin zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri, VCP’nin şaperon aktivitesinden sorumludur(Wang ve arkd., 2003).
VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, ubikütinlenmiş proteinlere özgün olarak bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak onlara yol gösterir. Substrat ubikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini birbirinden ayırmak için ATP’yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar. (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro ve arkd., 2003)
2
1.3. Aquaporinler
Aquaporinler (AQPs) osmotik gradientlere yanıtta hücre membranları arasında su geçisinde rol alan integral membran proteinleridir. Aquaporin su kanalları oküler ve ekstraoküler dokularda hücre fonksiyonu gibi önemli görevlere sahip yapılardır (Verkman ve ark. 2008). Oküler yapılardan pek çok AQP eksprese edilir. Bunlardan AQP1 and AQP4; intraoküler basınç regülasyonunda, AQP0, AQP1 and AQP5; kornea ve lens geçirgenliğinde, AQP4; visuel sinyal iletiminde, AQP3; konjuktival bariyer fonksiyonunda ve AQP5; lakrimal gland gözyaşı oluşumunda görevlidir (Nielsen ve ark. 1993; Hasegawa ve ark. 1994; Stamer ve ark. 2001;Patil ve ark. 1997; Hamann ve ark. 1998; Nagelhus ve ark. 1998). İç retinadaki su müller hücreleri tarafından transport edilirken, subretinal alandaki su RPE hücreleri tarafından transport edilir. (Hamann ve ark. 1998; Reichenbach ve ark. 2007;Goodyear ve ark. 2009). Normal görme fonksiyonu için oküler kompartmanlar arasındaki sıvı regülasyonu gereklidir. Retinal iskemi, oküler inflamasyon, retina dekolmanı ve diabet gibi pekçok oküler hastalıkta sıvı transportu bozulmuştur. Dahası diabet ve iskemi sonucu rat retinasında AQP1 ve AQP4 immünopozitif glial hücreler artışı gözlemlenmiştir. (Iandiev ve ark. 2007a,b; Qin ve ark. 2009).
Giriş:
Yaşlanma görme keskinliği ve görme alanı kayıpları ile sonuçlanabilen pek çok oküler yapının hasarlandığı biyolojik bir süreçtir (Salvi ve ark. 2006). Yaşlanma ile fotoreseptörlerde belirgin azalma ile birlikte retina pigment epitelinde belirgin değişiklikler görülebilmektedir. (Marshall 1987; Feeney–Burns ve ark. 1984; Gao and Hollyfield 1992; Curcio ve ark. 1993). Bu değişikler yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve diabetik retinopati gibi hastalıkların fizyopatolojisinde karşılaştığımız sorunlardır (Grunwald ve ark. 2005;Reddy ve ark. 2009; Ramkumar ve ark. 2010). Bu hastalıklarda, proteinler posttranslasyonel modifikasyona uğrar ve sonunda protein yapıdaki materyealin agregasyonuna ile sonuçlanır (Martinez-Vicente ve ark. 2005). Protein yapım ve yıkımındaki bozulmaya bağlı olarak retinada protein birikimi oluşur (Harding 2002). Ubikütin protazom sistem (UPS), bu süreçte hücresel homeostazis, protein kalite kontrolu ve hasarlanmış proteinlerin uzaklaştırılmasında rol alır (Ciechanover 2007; Lord ve ark. 2005). Bu yüzden UPS son dönemlerde yaşlılıkla ilişkili hastalıkların patogenezinde önemli bir biyolojik süreç olması yönüyle önemli bir araştırma konusu haline geldi. Protein yapım ve yıkımında rol alan iki protelitik sistem mevcuttur. Bunlar; lizozomal
3
sistem veUPS’dir (Riederer ve ark. 2011). Ubikütin, UPS’de protein yıkımı için gerekli olan küçük bir proteindir (Wilkinson 2000).
Ubikütin aktive edici enzim (E1), ubikütin konjuge edici enzim (E2) ve ubikütin ligaz (E3) ubikütin bağlanmasından sorumludur (Hochstrasser 1995). Ubikütin konjuge edici enzimlerin (UbcM3, UBE2E2, and UbcM2) ekspresyon paternleri ve fonksiyonları retinada son dönemlerde çalışıldı (Mirza ve ark. 2010). Dahası retinadaki protein agregasyonu yaşlanma ile korele idi (Leger ve ark. 2011). Bununla birlikte bizim bilgilerimize göre ubikütinin gelişimsel ekspresyonu ile ilgili herhangi bir çalışma mevcut değildi. Ubikütinlenmiş proteinler protazom sisteme hem direk, hem de indirek olarak olarak p97/Valosincontaining protein (VCP) ile taşınabilir. p97/VCP; membran füzyonu, proğramlanmış hücre ölümü, B ve T hücre aktivasyonu, endoplazmik retikulm ilişkili degragasyon, hücre siklusu regülasyonu gibi biyolojik olaylarda rol alan şaperonlardır (Kondo ve ark. 1997; Hirabayashi ve ark. 2001; Rabinovich ve ark. 2002; Meyer ve ark. 2000; Hetzer ve ark. 2001; Ficarro ve ark. 2003; Krick ve ark. 2010;Tresse ve ark. 2010; Dai and Li 2001). Ayrıca Alzheimer’s and Parkinson’s hastalığı gibi pek çok nörödejeneratif hastalıkta anormal protein agregasyonu gösterilmiştir (Sowell ve ark. 2009). Dahası yaşlanma ile mice beyninde p97/ VCP ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir (Yang ve ark. 2008).
Aquaporinler (AQPs) osmotik gradientlere yanıtta hücre membranları arasında su geçisinde rol alan integral membran proteinleridir. Aquaporin su kanalları oküler ve ekstraoküler dokularda hücre fonksiyonu gibi önemli görevlere sahip yapılardır (Verkman ve ark. 2008) Oküler yapılardan pek çok AQP eksprese edilir. Bunlardan AQP1 and AQP4; intraoküler basınç regülasyonunda, AQP0, AQP1 and AQP5; kornea ve lens geçirgenliğinde, AQP4; visuel sinyal iletiminde, AQP3; konjuktival bariyer fonksiyonunda ve AQP5; lakrimal gland gözyaşı oluşumunda görevlidir (Nielsen ve ark. 1993; Hasegawa ve ark. 1994; Stamer ve ark. 2001;Patil ve ark. 1997; Hamann ve ark. 1998; Nagelhus ve ark. 1998). AQP0, AQP1, AQP4, AQP6 and AQP9 immünoreaktivitesi farklı türlerin retinalarında gözlemlendi. Örneğin AQP0 mürin retinasının bipolar ve amakrin hücrelerinde, AQP1 amakrin hücrelerde (Kim ve ark. 2002; Kang ve ark. 2005) AQP4; müler glial hücrelerde tesbit edildi. (Hamann ve ark. 1998; Nagelhus ve ark. 1998; Bosco ve ark. 2005; Qin ve ark. 200);Hombrebueno ve ark. 2012; Derouiche ve ark. 2012). AQP6 glial membranlarda (Iandiev ve ark. 2011) ve AQP9 tirozin hidroksilaz pozitif amakrin hücrelerde (Iandiev ve ark. 2006a) bulundu. Retina pigment epitelyum hücrerinde, AQP1 ve AQP9’un pozitif olduğu bulundu. (Stamer ve ark. 2003; Hollborn ve ark. 2012). RPE, vizüel siklus ve normal fotoreseptör fonksiyonu için
4
önemli role sahiptir. (Strauss, 2005). İç retinadaki su müller hücreleri tarafından transport edilirken, subretinal alandaki su RPE hücreleri tarafından transport edilir. (Hamann ve ark. 1998; Reichenbach ve ark. 2007;Goodyear ve ark. 2009). Normal görme fonksiyonu için oküler kompartmanlar arasındaki sıvı regülasyonu gereklidir. Retinal iskemi, oküler inflamasyon, retina dekolmanı ve diabet gibi pekçok oküler hastalıkta sıvı transportu bozulmuştur. Dahası diabet ve iskemi sonucu rat retinasında AQP1 ve AQP4 immünopozitif glial hücreler artışı gözlemlenmiştir. (Iandiev ve ark. 2007a,b; Qin ve ark. 2009). Farklı patolojilerdeki AQP’lerin rolleri retinada çalışıldı ve farklı modulatörlerin potansiyel terapötik ajan olabileceği çeşitli çalışmalarda sunuldu. (Papadopoulos and Verkman, 2008), Bununla birlikte aquaporilerin biyolojik önemi pek çok oküler dokuda iyi bilinse de yaşa bağlı değişimi çalışılmadı.
MATERYAL VE METOD
Projemizin bu bölümünde, deneyler boyunca kullanılan sarf malzemeler ve ait oldukları kaynaklar ayrı başlıklar halinde verildi.
2.1. Kimyasallar ve Ait Oldukları Kaynaklar
Asetik asit Etanol Methanol Formaldehit Potasyum klorit Sodyum klorid Mayers hematoksilen Antibody diluent Hidrojen peroksit blok Poly- L lysine
Ultramount kapatma solusyonu Ultra V block
5
2.2. Antikorlar
Primer antikorlar
VCP primer antikoru (Monoklonal ubiquitin primer antikoru (Monoklonal Anti-Aquaporin 2
Anti-Aquaporin 4 Anti-Aquaporin 6 Anti-Aquaporin 9
Sekonder antikorlar
Biotinylated anti-mouse sekonder antikoru Biotinylated anti-rabbit sekonder antikoru Streptavidin–peroxidase complex
2.3. Deney Aletleri ve Markaları
Hassas terazi Korn ABJ, Turkiye
Microdalga fırını Arcelik, Turkiye
Mini santrifüj Biosan, Turkiye
Floresan mikroskobu Nikon, Almanya
Shaker Velp Scientifica
Mikrotom Leica, Almanya
6
2.4. Kromojenler
DAB (Diaminobenzidine) Sigma, Germany
AEC Syctek Lab
2.5. Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi
Bu çalışmada 30 adet Wistar albino erkek sıçanlar kullanıldı. Bütün gruptaki sıçanlar yüksek doz intraperitonal pentobarbital (100mg/kg) ile sakrifiye edilip, retinal dokuları immunohistokimyasal çalışmalar için bouin fiksatifine konuldu.
2.6. İmmunohistokimya
Sıçanlardan elde edilen retina dokuları bouin çözeltisinde tespit edilip parafine gömme uygulandı. Uzerinde rutin histolojik doku takipleri yapıldıktan sonra, bir gece 56°C’ da inkübe edildi. Mikrotomla 5 mikronluk kesitler, poli-L-lizin kaplı lamlarda (Sigma, St. Louis, MO, USA) toplandı ve alınan kesitler ksilol ve dereceli alkol serilerinden geçirilip dehidrate edildi. Suya kadar indirilen dokular, 0.1M sitrik asit solusyonu (pH: 6) içerisinde 5 er dakika 2 kez mikrodalgada kaynatıldı. PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, endojen peroksidaz aktivitesi %3’lük hidrojen peroksidazla baskılandı. Tekrar PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, oda ısısında kesitler spesifik olmayan reaksiyonu engellemek için 10 dk. bloklama serumla (ScyTek Laboratorları, USA) bloklandı. 10 dk/ lik inkübasyon sonrası, PBS ile oda sıcaklığında yıkamadan sonra sırayla biotinlenmiş sekonder antikorlar (ScyTek Laboratories, USA) ve peroksidaz-işaretli streptavidin (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile toplam 50 dakika inkübe edildi. Peroksidaz aktivitesi, 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) (ScyTek Laboratories, USA) kromojeni ile inkübasyon sonucu görünür hale getirilip, Mayer’in hematoksileni (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile zıt boyama yapıldı. Sonrasında, slaytlar su bazlı kapatma solusyonu (Fisher Chemicals, Springfield, NJ, USA) ile kapatıldı. Boyanan kesitler Leica mikroskop (Leica DM2500, Nussloch, Almanya) altında fotoğraflandırıldı. Sekonder antikorun horseradish peroxidase
7
(HRP) ya da alkaline fosfotaz (AP) ile konjuge olma durumuna göre, AEC nin yanında, DAB veya Fast red gibi kromojenler de kullanılarak immunopositif bölgeler görünür hale getirildi.
2.7. İmmunofloresan
Bir önceki bölümde anlatılan immunohistokimya yönteminin temel basamakları aynı olmak şartıyla, kullanılan sekonder antikorların rhodamine ve FITC gibi belli dalga boylarında floresan renk vermesi nedeniyle özellikle çiftli boyamalarda immunofloresan işaretleme yöntemi tercih edilir. Kısaca bizim çalışmamızda, primer antikorlarla inkubasyondan sonra, rhodamine ile işaretli anti mouse ve FITC ile işaretli anti rabbit sekonder antikorları ile 1 saat oda ısısında inkübasyon gerçekleştirildi. Floresana uygun kapatma medyumu ile slaytlar kapatılarak, Nikon microscope (Nikon E600, Germany) altında fotoğraflar çekildi.
2.8. Çiftli boyama
Çalışmamızda iki farklı proteinin aynı bölgede lokalizasyonunu göstermek amacıyla retinal dokular üzerinde çiftli boyamalar yapıldı. Her iki primer antikor (p97/VCP ile Ub) belirlenen dilusyon oranlarında aynı zamanda uygulanıp, geceboyu 4oC’de inkübe edildi. Ertesi gün,
yıkama işleminden sonra, rhodamine-konjuge anti-mouse-Ig ile 1 saat oda ısısında inkübe edilip, ardından ikinci yıkamaya geçildi ve sonrasında, FITC-konjuge anti-rabbit-Ig ile 1 saat inkübe edildi. Yıkama işlemlerinden sonra kapatma solüsyonuyla kapatılıp, floresan mikroskobu altında incelendi.
İSTATİKSEL ANALİZ
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi
Herbir kesit için ışık mikroskobu altında 40X büyütmede birbirinden habersiz iki araştırmacı tarafından rastgele beş alan seçildi ve bu alanlar içinde hücrelerin boyanma yoğunluğuna göre [0 (boyanma yok), +1 (zayıf, fakat tespit edilebilir boyanma), +2 ( orta şiddetli boyanma) ve +3 (yoğun boyanma)] hücre sayımı yapıldı. Hesaplama için HSCORE formulü kullanıldı
8
[∑Pi(i+ l): i boyanma yoğunluğu skorunu, Pi boyanan hücrelerin yüzdesini gösterir]. İki gözlemcinin hesapladığı skorların ortalaması alındı ve HSCORE değerleri grafikle gösterildi. İstatiksel değerlendirmeler SigmaStat versiyon 3.5 (Jandel Scientific Corp., San Rafael, CA) kullanılarak ve anlamlılık p< 0.05 olarak değerlendirilmiştir. Farklı postnatal günlerde elde edilen dokularda ortaya çıkabilecek muhtemel farklılıklar karşılaştırmalı testler (ANOVA, t-test) ve korelasyon regresyon analizleri (Pearson, Spearman) ile değerlendirildi.
BULGULAR
Biz çalışmamızda farklı haftalardaki postnatal rat retinasında p97/VCP, Ubikütin ve Aquaporinlerin ekspresyon paternlerini araştırdık.
4.1 Postnatal rat retinasında p97/VCP ekspresyon paterni:
p97/VCP paterni 1 haftadan 72 haftaya kadar olan ratların retinalarında incelenmiştir. Her bir proteinin ekspresyon paternleri farklı yaş gruplarında şekil 1 ve 2 de gösterilmiştir. Bir haftalık ratlarda p97/VCP NBL’de güçlü bir şekilde eksprese edildi (şekil 1a). p97/VCP ekspresyonunun RPE, OS, IS, ONL, INL ve GCL tabakalarında 4 haftalık rat retinalarında olduğu gözlemlendi (şekil 1b). Özellikle IS, INL ve GCL tabakalarında bu paternin güçlü bir şekilde eksprese edildiği görüldü. Fakat ONL tabakası zayıf bir immünoreaktivite gösterdi. Bu ekspresyon profili 10 haftalık adult ratlara kadar devam etti (şekil 1c-e). 4 ve 10 haftalık ratlar p97/VCP boyanma paterni açısından karşılaştırıldığında bir fark gözlemlenmedi. 36 haftalık ratlarda ise p97/VCP immünoreaktivitesinin önemli bir şekilde azaldığı gözlendi. OS, IS, RPE ve INL de immünoreaktivite kalıcı idi, fakat boyanma paterni azalmıştı (şekil 1f). 72 haftalık ratlarda retinal mimari önemli bir şekilde değişmiş ve bozulmuştu (şekil 1g). Şekil 1 ve 3 de p97/VCP’nin farklı haftalardaki farklı ekspresyon paternleri detaylıca sunulmuştur.
4.2 Postnatal rat retinasında Ubikütin ekspresyon paterni:
Postnatal ilk haftada NBL, IPL ve GCL de hiçbir Ubikütin immünoreaktivitesi gözlemlenmedi (Şekil 2a). 4 haftalık ratlarda INL ve GCL de Ubikütin immünoreaktivitesi nadir olarak gözlemlendi (Şekil 2b). 10 haftalık ratların bir kısmında GCL tabakasında zayıf
9
boyanma paterni gözlendi (şekil 2 d). İlaveten, IPL deki ubikütin agregasyonu dikkat çekici idi. 10 haftadan 72 haftaya doğru ubikütin pozitifliği önemli ölçüde artmıştı. 36 haftalık ratlarda 4 ve 10 haftalık ratlar ile karşılaştırıldığında ubikütin ekspresyonunun önemli bir şekilde arttığı görüldü. Özellikle INL ve GCL tabakasında bu boyanma paterni güçlü idi (şekil 2e ve 2f). ONL ve IPL tabakasında ise boyanma paterninin orta derecede olduğu fark edildi (şekil 2f ve 2g). GCL, IPL, ONL ve IS tabakasında ubikütin agregatları bulundu (şekil 2e-g). 72 haftalık ratlarda ubikütin IS, ONL, IPL ve GCL de güçlü şekilde lokalize idi. Şekil 2 ve 3 Ubikütinin farklı haftalardaki farklı ekspresyon paternleri sunulmuştur.
4.3 Postnatal rat retinasında Aquaporin ekspresyon paterni:
Doğumdan sonraki yaşları 1, 4, 12 ve 40 haftalık olan ratların retinalarında aquaporin immünoreaktivitesi incelendi. Pozitif kontrol grubu olarak böbrek toplayıcı tüpleri kullanıldı (şekil 5h-l). 1 haftalık rat retinası BNL, IPL ve GCL tabakalarından oluşmuştu (şekil 5a-f). 4, 12 ve 40 haftalık rat retinaları RPE, OS, IS, OLM, ONL, OPL, INL, IPL, GCL ve ILM den oluşmakta idi (şekil 6a-r).
Aquaporin 1:
Postnatal 1 haftalık ratların NBL, IPL ve GCL tabakalarında AQP1 immünoreaktivitesi gözlenmezken NBL dış tabakasında çok zayıf bir AQP1 ekspresyonu olduğu görüldü (şekil 5a). 4 haftalık ratlarda ise RPE, IS, OLM, INL ve GCL tabakalarında orta derecede AQP1 ekspresyonu olduğu gözlemlendi (şekil 6a). Bu boyanma paterni 12 haftalık rat retinalarında da 4 haftalık ratlar ile benzer idi (şekil 6b). 40 hftalık ratlarda ise AQP1 ekspresyonu RPE, IS, INL ve GCL tabakasında önemli derecede azalmıştı. (şekil 6c ve 8).
Aquaporin 2:
AQP2, bir haftalık rat retinalarında NBL tabakasında nadiren gözlemlendi (şekil 5b). 4 haftalık rat retinalarında artmıştı ve RPE, IS, INL ve ILM tabakasında AQP2 ekspresyonu olduğu tespit edildi (şekil 6d ve 8). 4-12 ve 12-40 haftalık ratlar karşılaştırıldığında AQP2 ekspresyonunun istatistiksel farklı olmadığı gözlendi (şekil 6e-f ve 8).
10
Aquaporin 3:
Bir haftalık rat retinasında NBL tabakasında AQP3 ekspresyonunun olduğu gözlemlendi (şekil 5c). 4 haftalık rat retinasında ILM, ONL ve INL tabakasında orta derecede AQP3 immün reaktivitesi gözlemlendi (şekil 6g). Halbuki RPE tabakası güçlü bir AQP3 immünoreaktivitesi göstermekteydi. 12 haftalık rat retinasında AQP3 ekspresyonunun pik düzeye ulaştığı görüldü (şekil 6h). 40 haftalık rat retinasında AQP3 boyanması RPE tabakasında kuvvetli iken OLM ve ILM tabakasında zayıf idi (şekil 6ı).
Aquaporin 4:
Bir haftalık rat retinasında AQP4 boyanmasının NBL, OPL ve GCL tabakasında olmadığı görüldü (şekil 5d). 4 haftalık rat retinasında RPE, OLM, ILM, INL ve GCL tabakasında AQP4 immünoreaktivitesi olduğu gözlemlendi (şekil 6j). 12 haftalık rat retinalarında INL ve GCL tabakasında AQP4 boyanmasının en güçlü olduğu görüldü (şekil 6k). 40 haftalık rat retinasında ise özellikle OLM, ILM ve INL tabakasında AQP4 ekspresyonunun önemli bir şekilde azaldığı gözlendi (şekil 6l ve 8).
Aquaporin 6:
1 haftalık rat retinalarında NBL tabakasında zayıf bir AQP6 boyanması tespit edildi (şekil 5e). 4 haftalık rat retinalarında IS, INL, GCL ve ILM tabakasında orta derecesinde boyanma olduğu gözlendi (şekil 6m). İlginç bir şekilde 4 haftalık rat retinalarının GCL tabakasındaki glial hücrelerinde AQP6 ekspresyonunun olduğu gözlendi (şekil 6m). En yüksek ekspresyon 4 ve 12 haftalarda RPE, ONL, OPL, INL, GCL ve ILM tabakalarında orta dereceden yüksek dereceye değişen oranlarda olduğu görüldü (şekil 6m-n). Müller hücrelerinde AQP6 ekspresyonu olduğu görüldü (şekil 7e). 40 haftalık rat retinalarında belirgin azalma göstererek immünopozitiflik RPE ve ILM tabakasında görüldü (şekil 6o ve 8).
Aquaporin 9:
1 haftalık ratlarda NBL, IPL ve GCL tabakalarında AQP9 boyanma paterni görülmedi (şekil 5f). 4 haftalık rat retinasında IS, GCL ve ILM orta derecede immünopozitif idi (şekil 6p).
11
Sürpriz bir şekilde diğer retina tabakalarında boyanma paterninin olmadığı fark edildi. 12 haftalık ratlarda ise AQP9 boyanması INL ve GCL tabakalarında zayıf-orta derecede iken RPE tabakasında güçlü idi (şekil 6q). En yüksek AQP9 ekspresyonunun 12 haftalık rat retinasında olduğu görüldü, fakat 40 haftalık ratlarda bu boyanma paterni önemli bir şekilde azalma gösterdi (şekil 6r ve 8).
Şekil 1: Postnatal rat retinalarında p97/VCP immünohistokimyasal boyanma paternlerinin
12
Şekil 2: Postnatal rat retinalarında Ubikütin immünohistokimyasal boyanma paternlerinin
sunumu. 1 hafta (a), 4 hafta (b), 10 hafta (d), 36 hafta (e-g) ve 72 hafta (h-j). Negatif kontrol örneklerinde belirgin bir boyanma gözlenmedi (c).
13
Şekil 3: Ubikütin ve p97/VCP ekspresyonunun H-SCORE analizi. (a) 10 hafta ile 1, 4, 36 ve
72. hafta değerlerinin, (b) 72. hafta değerleri ile 4, 10, 36. hafta değerlerinin istatistiksel karşılaştırılması.
14
Şekil 4. Farklı postnatal yaşlardaki rat retinalarında Ubikütin ve p97/VCP kolokalizasyonu
15
Şekil 5. Postnatal 1 haftalık ratlarda aquaporin immünolokalizasyonlarının sunumu (A-F).
16
Şekil 6. Postnatal 4, 12 ve 40 haftalık rat retinalarında aquaporin immunohistokimyasal
dağılım paterni: AQP1 (A–C), AQP2 (D–F), AQP3 (G–I), AQP4 (J–L), AQP6 (M–O) ve AQP9 (P–R).
17
Şekil 7. 12 haftalık rat retinalarının AQP1 (A ve B), AQP3 (C), AQP4 (D), AQP6 (E) ve
18
Şekil 8. Aquaporin ekspresyonunun H-SCORE analizi. 12. hafta ile 1, 4 ve 40. haftaların
karşılaştırılması.
TARTIŞMA
Bu çalışma ubikütin ve p97/VCP’nin farklı yaş gruplarındaki rat retinasında immununohistokimyasal olarak gösteren ilk çalışmadır. Bu çalışma sonucunda ubikütin daha yaşlı olan rat retinalarında artarken, p97/VCP ekspresyonu önemli şekilde azalmış olarak bulduk. Postnatal retinal gelişimin çeşitli fazları öncelikli olarak pek çok araştırıcı tarafından tanımlanmıştır (Fletcher and Kalloniatis 1997; Rapaport ve ark. 2004). p97/VCP ekspresyonu ilk haftada NBL, IPL ve GCL tabakalarında görüldü. Fakat hiçbir ubikütin ümmünoreaktivitesi gözlenmedi. 4 haftadan başlayarak ubikütin reaktivitesi hafta sayısı ile uyumlu olarak artış gösterirken, p97/VCP immünoreaktvitesi 36 ve 72. haftalarda azalmıştı.
Literatürden iyi bilinir ki ubikütin ve p97/VCP, UPS’de protein yıkımı için gereklidir (Ciechanover 2007). p97/VCP proteozomal yıkımı kolaylaştıran bir şaperondur. p97/VCP’ deki genetik varyasyon hücrelerde ubikütinlenmiş proteinlerin birikimine neden olur (Kobayashi ve ark. 2007). Son dönemlerde yapılan bir çalışmada Drosophila retinalarında VCP’ nin inaktivasyonu misfolded Rhodopsinin artışına neden olduğu gösterilmiştir (Griciuc ve ark. 2011a, b). Otörler aynı zamanda VCP aktivitesinin retinada nörodejenerasyonu tetiklediğini göstermişlerdir. Bir diğer çalışmada ise inflamasyon sırasında rodopsinin proteozom-bağımlı yıkımı ele alındı (Reme´ ve ark. 1999; Ozawa ve ark. 2008). Bu sonuçlarla uyumlu olarak bizim sonuçlarımızdaki p97/VCP’deki azalma sonucunda özellikle yaşlanmış retinalarda ubikütinlenmiş proteinlerin birikimine neden olabilir. Aynı zamanda
19
kültüre hücrelerde ubikütin pozitif protein agregatları, p97/VCP ile kolokalize idi. (Kobayashi ve ark. 2007). Dahası biz çalışmamızda rat retinasının IPL, INL ve GCL tabakalarında ubikütin and p97/VCP’nin kolokalize olduğunu bulduk. 36. ve 72. haftalardaki artmış ubikütin ekspresyonu azalmış p97/VCP ekspresyonunun bir sonucu olabilir. Muhtemeldir ki, p97/VCP rat retinasında hem ubikütinlenmiş agregat formasyonunu, hem de bu agregatların temizlenmesini katalizleyebilir. Daha sonraki moleküler çalışmalar daha yüksek ubikütin ekspresyonunun arkasındaki mekanizmayı ortaya çıkaracaktır. Bizim çalışmamızda, p97/VCP ekspresyonu 10.haftadan 72. haftaya doğru gidildikçe azalma gösterdiği görüldü. Bununla korele olarak yaşlanan rat beyin proteomik analizleri, daha yaşlı ratlarda p97/VCP ekspresyonunun azaldığı görüldü. (Yang ve ark. 2008). Aynı zamanda çeşitli çalışmalarda gösterildi ki Alzheimer’s ve Parkinson’s hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarda protein agregasyonu artmıştır. (Riederer ve ark. 2011). Bu bulgular ortaya çıkarmıştır ki UPS yaşa bağlı makula dejenerasyonunun oluşumunda olası mekanizmalardan biri olabilir.
Bu çalışmada postnatal rat retinasında çeşitli aquaporinlerin yaşlanma ile ekspresyon paternleri araştırıldı. AQP1, 3, 4, 6 ve 9 ekspresyonu 1.haftadan 12. haftaya tedrici olarak artış gösterdi fakat 40. haftalık rat retinalarında önemli bir azalma tesbit edildi. Bizim sonuçlarımız erken, genç, adult ve yaşlanmış retinalarda aquaporin ekspresyonunun farklı olduğunu gösterdi. Yapılan çalışmalarda aquaporinlerin ekspresyon paternlerindeki değişiklikler diabet ve retinal iskemi gibi çeşitli oküler hastalıklarla ilişkilendirilmiştir (Iandiev ve ark. 2006c,2007a,b). Bununla beraber aquaporin ekspresyonundaki değişimin retinal dejenerasyonla ilişkisi bilinmemektedir. Önceden gösterildiği gibi AQP1 amakrin hücreler ve fotoreseptör hücrelerinde ekprese edilir (Kim ve ark. 2002; Iandiev ve ark. 2005). Bununla uyumlu olarak biz AQP1 ekspresyonunu dış retinada, RPE, ONL, INL, GCL, ve ILM da gösterdik. AQP1ekspresyonu adult ve daha yaşlı retinalarında önemli şekilde değişikti.
AQP1 immünoreaktivitesi 12. haftada en yüksek seviyeye ulaşırken 40. haftalık ratlarda önemli şekilde azalmıştı. Biz gösterdik ki yaşlanma 40 haftalık ratların AQP1 ekpresyonunu değiştirebilir. Bu sonuçlara dayalı olarak biz ileri sürdük ki, yaşlanan retinada AQP1aracılı su transportu azalabilir. Son dönemde yayınlanan bir çalışmada rat RPE ve nöralretinada geçici ve kalıcı iskeminin AQPs1, 3, 4, 6 ekspresyonunu azalttığı gösterilmiştir. (Hollborn ve ark. 2012). Rat retinalarında fotoreseptör hücrelerinin dejenerasyonu ile birlikte AQP1immünoreaktivitesi kaybolur (Iandiev ve ark. 2005). Biz daha yaşlı rat retinalarında AQP1 immünoreaktivitesini kaybolduğunu gözlemlemesek de, bizim sonuçlarımız 40 haftalık
20
ratlarda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Sadece AQP2 ekspresyonunda adult ve daha yaşlı ratlar arasında fark gözlemlenmedi.
AQP3 gliserol gibi küçük solütleri transpot edebilen aquaporindir. (Verkman ve ark. 2008). Hollborn ve arkadaşları AQP3 ekspresyonunun iskemik rat retinasında azaldığını bulmuşlardır. Bizim çalışmamızda da daha yaşlı rat retinalarında azalmış AQP3 ekspresyonunu tesbit ettik. Bu sonuç AQP3’ ün yaşlanma proçesi ile ilgili olabileceğini göstermektedir.
Rat retinasında AQP4 müller hücreleri ve astrositler tarafından eksprese edilir (Nagelhus ve ark. 1998; Derouiche ve ark. 2012). Biz aynı zamanda INL’de çoğunlukla AQP4 eksprese edildiğini gözlemledik. Çeşitli çalışmalarda ileri sürüldü ki, AQP4 müller hücrelerinde, iç retinadan su çıkışında rol alır (Nagelhus ve ark. 1998; Bringmann ve ark. 2005). AQP4 boyanma paternleri 40 haftalık rat retinalarında farklı idi. Daha yaşlı rat retinalarında boyanma yoğunluğu ve sayısı önemli şekilde azalmıştı. Azalmış AQP4ekspresyonu yaşlanmış ratlardaki dejeneratif sürece katkı sağlayabilir. Bir çalışmada aynı zamanda gösterildi ki AQP4 ekspresyonu oksidatif stres ve hipoksi tarafından etkilenir. (Kaur ve ark. 2007). Otörler aynı zamanda oksidatif stres ve hipoksinin müllere hücrelerinde şişmeye yol açtığını göstermişlerdir. Oksidatif stres sadece yaşlanma proçesinde değil aynı zamanda Alzheimer’s hastalığı, kanser, diabet ve inflamasyonda da rol aldığı gösterilen bir faktördür. (Massudi ve ark. 2012). Biz çalışmamızda oksidatif stres parametrelerini ölçemesek de, muhtemeldir ki oksidatif stres değişen AQP ekspresyonuna katkı sağlayabilir.
AQP6’nın glia bağımlı osmolarite ve iyon regülasyonda fonksiyon gösterdiği iyi bilinmektedir. Bizim çalışmamızda 40. haftaya doğru belirgin bir AQP6 ekspresyonunda azalma görüldü.
AQP9’un optik sinir dejenerasyonunda rol alabileceği çeşitli çalışmalarda sunuldu. (Dibas ve ark. 2007; Naka ve ark. 2010). Bu çalışmamızda AQP9 sadece RPE, GCL, OLM ve ILM’ de gözlemlendi. Bununla birlikte 40 haftalık ratlarda, daha genç ratlarla karşılaştırılda önemli bir azalma gördük. Daha yaşlı hayvanlarda değişen ekspresyonu retinal ganglion hücre dejenerasyonunna katkı sağlayabilir.
21
SONUÇLAR
Sonuç olarak, bu çalışma ile;
1- p97/VCP’nin postnatal gelişmekte olan sıçan retinasındaki lokalizasyonları 2- Ubikütinin postnatal gelişmekte olan sıçan retinasındaki lokalizasyonları
3- p97/VCP’nin, ubikütin ile postnatal gelişmekte olan sıçan retinasında birlikte ekspresyonu 4- Aquaporin1, 2, 3, 4, 6 ve 9 un postnatal gelişmekte olan sıçanların retinasındaki lokalizasyonları
Tüm bu sonuçlar ışığında, protein yıkımı ve übikütin protazom sisteminin ile integral membran proteini olan aquaporinlerin, farklı yaş gruplarındaki rat retinasında ekspresyon paternlerinin değişmesi ile yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi bazı hastalıkların patogenezinde rol alabileceği sonucuna ulaştık.
22
KAYNAKLAR
Bosco A, Cusato K, Nicchia GP, Frigeri A, Spray DC (2005) A developmental switch in the expression of aquaporin-4 and Kir4.1 from horizontal to Müller cells in mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 46:3869–75.
Bringmann A, Uckermann O, Pannicke T, Iandiev I, ReichenbachA, Wiedemann P (2005) Neuronal versus glial cell swelling in the ischaemic retina. Acta Ophthalmol Scand 83:528–38.
Ciechanover A (2007) Intracellular protein degradation from a vagueidea through the lysosome and the ubiquitin-proteasome systemand on to human diseases and drug targeting: Nobel Lecture, December 8, 2004. Ann N Y Acad Sci 1116:1–28.
Curcio CA, Millican CL, Allen KA, Kalina RE (1993) Aging of thehuman photoreceptor mosaic: evidence for selective vulnerabilityof rods in central retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 34(12):3278– 3296.
Dai RM, Li CC (2001) Valosin-containing protein is a multi-ubiquitinchain-targeting factor required in ubiquitin-proteasome degradation. Nat Cell Biol 3(8):740–744.
Derouiche A, Pannicke T, Haseleu J, Blaess S, Grosche J, Reichenbach A. (2012) Beyond polarity: functional membrane domains in astrocytes and Müller cells. Neurochem Res 37(11):2513-23.
Dibas A, Yang MH, Bobich J, Yorio T (2007) Stress-induced changes in neuronal aquaporin-9 (AQP9) in a retinal ganglion cell-line. Pharmacol Res 55:378–84.
Feeney-Burns L, Hilderbrand ES, Eldridge S (1984) Aging humanRPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheralcells. Invest Ophthalmol Vis Sci 25(2):195–200
Ficarro S, Chertihin O, Westbrook VA, White F, Jayes F, Kalab P,Marto JA, Shabanowitz J, Herr JC, Hunt DF, Visconti PE (2003) Phosphoproteome analysis of capacitated human sperm. Evidenceof tyrosine phosphorylation of a kinase-anchoring protein3 and valosin-containing protein/p97 during capacitation. J BiolChem 278(13):11579–11589.
Finnegan S, Robson J, Hocking PM, Ali M, Inglehearn CF, Stitt A,Curry WJ (2010) Proteomic profiling of the retinal dysplasia anddegeneration chick retina. Mol Vis 16:7–17.
23
Fletcher EL, Kalloniatis M (1997) Localisation of amino acidneurotransmitters during postnatal development of the rat retina. J Comp Neurol 380(4):449–471.
Franze K, Grosche J, Skatchkov SN, Schinkinger S, Foja C, Schild D, et al (2007) Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci USA 104:8287–92.
Gao H, Hollyfield JG (1992) Aging of the human retina. Differentialloss of neurons and retinal pigment epithelial cells. InvestOphthalmol Vis Sci 33(1):1–17
Goodyear MJ, Crewther SG, Junghans BM (2009) A role for aquaporin-4 in fluid regulation in the inner retina. Vis Neurosci 26:159–65.
Griciuc A, Aron L, Piccoli G, Ueffing M (2011a) Clearance ofRhodopsin(P23H) aggregates requires the ERAD effector VCP. Biochim Biophys Acta 1803(3):424–434.
Griciuc A, Aron L, Roux MJ, Klein R, Giangrande A, Ueffing M (2011b) Inactivation of VCP/ter94 suppresses retinal pathologycaused by misfolded rhodopsin in Drosophila. PLoS Genet 6(8).doi:10.1371/journal.pgen.1001075
Grillari J, Katinger H, Voglauer R (2006) Aging and the ubiquitinome: traditional and non-traditional functions of ubiquitin inaging cells and tissues. Exp Gerontol 41(11):1067–1079.
Grunwald JE, Metelitsina TI, Dupont JC, Ying GS, Maguire MG (2005) Reduced foveolar choroidal blood flow in eyes withincreasing AMD severity. Invest Ophthalmol Vis Sci 46(3): 1033–1038.
Hamann S, Zeuthen T, La Cour M, Nagelhus EA, Ottersen OP, Agre P, et al (1998) Aquaporins in complex tissues: distribution of aquaporins 1-5 in human and rat eye. Am J Physiol 274:C1332–45.
Harding JJ (2002) Viewing molecular mechanisms of ageing througha lens. Ageing Res Rev 1(3):465–479.
Hasegawa H, Lian SC, Finkbeiner WE, Verkman AS (1994) Extrarenal tissue distribution of CHIP28 water channels by in situ hybridization and antibody staining. Am J Physiol 266:C893–903.
Hetzer M, Meyer HH, Walther TC, Bilbao-Cortes D, Warren G,Mattaj IW (2001) Distinct AAA-ATPase p97 complexes functionin discrete steps of nuclear assembly. Nat Cell Biol 3(12):1086-91.
24
Hirabayashi M, Inoue K, Tanaka K, Nakadate K, Ohsawa Y, KameiY, Popiel AH, Sinohara A, Iwamatsu A, Kimura Y, Uchiyama Y,Hori S, Kakizuka A (2001) VCP/p97 in abnormal protein aggregates, cytoplasmic vacuoles, and cell death, phenotypesrelevant to neurodegeneration. Cell Death Differ 8(10):977–984.
Hochstrasser M (1995) Ubiquitin, proteasomes, and the regulation ofintracellular protein degradation. Curr Opin Cell Biol 7(2):215–223.
Hollborn M, Rehak M, Iandiev I, Pannicke T, Ulbricht E, Reichenbach A, et al. (2012) Transcriptional regulation of aquaporins in the ischemic rat retina: upregulation of aquaporin-9. Curr Eye Res 37:524– 31.
Hombrebueno JR, Lee EJ, Martínez-Ruiz N, García-Alcázar A,Grzywacz NM, De Juan J. (2012) Aquaporin-4 immunoreactivity in Müller and amacrine cells of marine teleost fish retina. Brain Res 1432:46–55.
Iandiev I, Biedermann B, Reichenbach A, Wiedemann P, Bringmann A (2006c) Expression of aquaporin-9 immunoreactivity by catecholaminergic amacrine cells in the rat retina. Nano Lett 398:264–7.
Iandiev I, Dukic-Stefanovic S, Hollborn M, Pannicke T, Hartig W, Wiedemann P, et al. (2011) Immunolocalization of aquaporin-6 in the rat retina. Neurosci Lett 490:130–4.
Iandiev I, Pannicke T, Biedermann B, Wiedemann P, Reichenbach A, Bringmann A. (2006a) Ischemia-reperfusion alters the immunolocalization of glial aquaporins in rat retina. Neurosci Lett 408:108–12.
Iandiev I, Pannicke T, Härtig W, Grosche J, Wiedemann P, Reichenbach A, et al.(2007b) Localization of aquaporin-0 immunoreactivity in the rat retina. Neurosci Lett 426:81–6.
Iandiev I, Pannicke T, Reichel MB, Wiedemann P, Reichenbach A, Bringmann A. (2005) Expression of aquaporin-1 immunoreactivity by photoreceptor cells in the mouse retina. Neurosci Lett 388:96–9. Iandiev I, Pannicke T, Reichenbach A, Wiedemann P, Bringmann A (2007a) Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina. Neurosci Lett 421:132–6.
25
Iandiev I, Tenckhoff S, Pannicke T, Biedermann B, Hollborn M, Wiedemann P, et al. (2006b) Differential regulation of Kir4.1 and Kir2.1 expression in the ischemic rat retina. Neurosci Lett 396:97–101.
Kang TH, Choi YK, Kim IB, Oh SJ, Chun MH. (2005) Identification and characterization of an aquaporin 1 immunoreactive amacrinetype cell of the mouse retina. J Comp Neurol 488: 352–67. Karin M, Ben-Neriah Y (2000) Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol 18, 621-663.
Kaur C, Sivakumar V, Yong Z, Lu J, Foulds WS, Ling EA(2007) Blood–retinal barrier disruption and ultrastructural changes in the hypoxic retina in adult rats: the beneficial effect of melatonin administration. J Pathol 212:429–39.
Kim IB, Lee EJ, Oh SJ, Park CB, Pow DV, Chun MH(2002) Light and electron microscopic analysis of aquaporin 1-likeimmunoreactive amacrine cells in the rat retina. J Comp Neurol 452:178–91. Kobayashi T, Manno A, Kakizuka A (2007) Involvement of valosincontainingprotein (VCP)/p97 in the formation and clearance of abnormal protein aggregates. Genes Cells 12(7):889–901.
Kondo H, Rabouille C, Newman R, Levine TP, Pappin D, FreemontP, Warren G (1997) p47 is a cofactor for p97-mediatedmembrane fusion. Nature 388(6637):75–78.
Krick R, Bremer S, Welter E, Schlotterhose P, Muehe Y, EskelinenEL, Thumm M (2010) Cdc48/p97 and Shp1/p47 regulateautophagosome biogenesis in concert with ubiquitin-like Atg8.J Cell Biol 190(6):965–973.
Leger F, Fernagut PO, Canron MH, Leoni S, Vital C, Tison F, BezardE, Vital A (2011) Protein aggregation in the aging retina. J Neuropathol Exp Neurol 70(1):63–68.
Lord JM, Roberts LM, Stirling CJ (2005) Quality control: anotherplayer joins the ERAD cast. Curr Biol 15(23):R963–R964.
Marshall J (1987) The ageing retina: physiology or pathology. EyeLond 1(Pt 2):282–295.
Martinez-Vicente M, Sovak G, Cuervo AM (2005) Protein degradationand aging. Exp Gerontol 40 (8– 9):622–633.
26
Massudi H, Grant R, Braidy N, Guest J, Farnsworth B, Guillemin GJ (2012) Age-associated changes in oxidative stress and NAD(+) metabolism in human tissue. PLoS One 7:e42357.
Meyer HH, Shorter JG, Seemann J, Pappin D, Warren G (2000) Acomplex of mammalian ufd1 and npl4 links the AAA-ATPase,p97, to ubiquitin and nuclear transport pathways. EMBO J 19(10):2181– 2192.
Mirza S, Plafker KS, Aston C, Plafker SM (2010) Expression anddistribution of the class III ubiquitin-conjugating enzymes in theretina. Mol Vis 16:2425–2437.
Nagelhus EA, Veruki ML, Torp R, Haug FM, Laake JH, Nielsen S, et al. (1998) Aquaporin-4 water channel protein in the rat retina and optic nerve: polarized expression in Muller cells and fibrous astrocytes. J Neurosci 18:2506–19.
Naka M, Kanamori A, Negi A, Nakamura M (2010) Reduced expression of aquaporin-9 in rat optic nerve head and retina following elevated intraocular pressure. Invest Ophthalmol Vis Sci 51:4618–26.
Nielsen S, Smith BL, Christensen EI, Agre P (1993) Distribution of the aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia. Proc Natl Acad Sci USA 90:7275–9.
Ozawa Y, Nakao K, Kurihara T, Shimazaki T, Shimmura S, Ishida S,Yoshimura A, Tsubota K, Okano H (2008) Roles of STAT3/ SOCS3 pathway in regulating the visual function and ubiquitinproteasome-dependent degradation of rhodopsin during retinalinflammation. J Biol Chem 283(36):24561–24570.
Papadopoulos MC, Verkman AS (2008) Potential utility of aquaporin modulators for therapy of brain disorders. Prog Brain Res 170:589–601.
Patil RV, Saito I, Yang X, Wax MB (1997) Expression of aquaporins in therat ocular tissue. Exp Eye Res 1997;64:203–9.
Pickart CM (2001) Ubiquitin enters the new millennium. Mol Cell8(3):499–504.
Pickart CM (2001a) Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70, 503-533. Pickart CM (2001b) Ubiquitin enters the new millennium. Mol Cell 8, 499-504.
Pickart CM, Cohen RE (2004) Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 177-187
27
Qin Y, Fan J, Ye X, Xu G, Liu W, Da C(2009) High salt loading alters the expression and localization of glial aquaporins in rat retina. Exp Eye Res 89:88–94.
Rabinovich E, Kerem A, Frohlich KU, Diamant N, Bar-Nun S (2002) AAA-ATPase p97/Cdc48p, a cytosolic chaperone required forendoplasmic reticulum-associated protein degradation. Mol CellBiol 22(2):626–634.
Ramkumar HL, Zhang J, Chan CC (2010) Retinal ultrastructure ofmurine models of dry age-related macular degeneration (AMD).Prog Retin Eye Res 29(3):169–190.
Rapaport DH, Wong LL, Wood ED, Yasumura D, LaVail MM (2004)Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J CompNeurol 474(2):304–324.
Reddy GB, Vasireddy V, Mandal MN, Tiruvalluru M, Wang XF, Jablonski MM, Nappanveettil G, Ayyagari R (2009) A novel ratmodel with obesity-associated retinal degeneration. Invest OphthalmolVis Sci 50(7):3456–3463.
Reichenbach A, Wurm A, Pannicke T, Iandiev I, Wiedemann P,Bringmann A (2007) Muller cells as players in retinal degeneration and edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 245: 627–36.
Reme´ CE, Wolfrum U, Imsand C, Hafezi F, Williams TP (1999) Photoreceptor autophagy: effects of light history on number andopsin content of degradative vacuoles. Invest Ophthalmol VisSci 40(10):2398–2404.
Riederer BM, Leuba G, Vernay A, Riederer IM (2011) The role of theubiquitin proteasome system in Alzheimer’s disease. Exp BiolMed Maywood 236(3):268–276.
Salvi SM, Akhtar S, Currie Z (2006) Ageing changes in the eye. Postgrad Med J 82(971):581–587. Santoro MG, Rossi A, Amici C (2003) NF-kappaB and virus infection: who controls whom. Embo J 22, 2552-2560.
Sati L, Seval-Celik Y, Demir R (2010) Lung surfactant proteins in theearly human placenta. Histochem Cell Biol 133 (1):85–93. doi:10.1007/s00418-009-0642-9.
Schwechheimer C, Deng XW (2001) COP9 signalosome revisited: a novel mediator of protein degradation. Trends Cell Biol 11, 420-426.
28
Sowell RA, Owen JB, Butterfield DA (2009) Proteomics in animalmodels of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Ageing ResRev 8(1):1–17.
Stamer WD, Bok D, Hu J, Jaffe GJ, McKay BS(2003) Aquaporin-1 channels in human retinal pigment epithelium: role in transepithelial water movement. Invest Ophthalmol Vis Sci 44:2803–8.
Stamer WD, Peppel K, O’Donnell ME, Roberts BC, Wu F, Epstein DL (2001) Expression of aquaporin-1 in human trabecular meshwork cells: role in resting cell volume. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:1803–11.
Strauss O(2005)The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 85:845–81.
Tresse E, Salomons FA, Vesa J, Bott LC, Kimonis V, Yao TP, Dantuma NP, Taylor JP (2010) CP/p97 is essential formaturation of ubiquitin-containing autophagosomes and this function is impaired by mutations that cause IBMPFD. Autophag y6(2):217–227.
Verkman AS, Ruiz-Ederra J, Levin MH (2008) Functions of aquaporins in the eye. Prog Retin Eye Res 27:420–33.
Wang Q, Song C, Li CC (2004) Molecular perspectives on p97-VCP: progress in understanding its structure and diverse biological functions. J Struct Biol 146, 44-57.
Wilkinson KD (2000) Ubiquitination and deubiquitination: targetingof proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell DevBiol 11(3):141–148.
Yang S, Liu T, Li S, Zhang X, Ding Q, Que H, Yan X, Wei K, Liu S. (2008) Comparative proteomic analysis of brains of naturallyaging mice. Neuroscience 154(3):1107–1120.
Zhao M, Valamanesh F, Celerier I, Savoldelli M, Jonet L, Jeanny JC, et al.(2010) The neuroretina is a novel mineralocorticoid target: aldosterone up-regulates ion and water channels in Müller glial cells. FASEB J 24:3405–15.
