Veı. Bil. Dt:rg. (1998), 14,2: 131·138
ASETiLSALisiLiK AsiT
veViTAMiN C KOMBiNASYONUNUN SIGIR
NÖTROFiL FONKSiYONLARINA ETKiLERiNiN iN ViTRO ŞARTLARDA
iNCELENMESi
Ahmet Levent Baş
1Nuri Başpınar2 Muammer Elmas 1
Seyfullah
Ha
liloğ
lu2
EnverYazar1
Investigation of The EfTects of Combination of Acetylsalicylic Acid and Vitamin C On Functions of Bovine Neutrophils in Vitro Conditions
Summary: In Ihis study, the effects ol combination of acetylsalicylic acid (ASA) and vitamin C at dilferenl doses on lunctions of bovine neuırophils (polymorphonuclear leucocytelPMNl), and the elfacts of dillerent ASA concenırations on accumulation of vitamin C in neutrophils were investigated. Neutrophils were obtained from six heatthy Holstein· heifers in University Dairy Herd. Phagocytic and microbicidal activity of PMNl were measured with fluorescent mic· roscopic technlque and intracellular vitamin C levels were detenııined by spectrophotometer. Inlracellular vitamin C le· vels were incerased by combination of ASA and vitamin C al different corıcentrations, bul this increase was not sta· tistically significanl. Furthenııore, phagocytic and microbicidal activity of PMNl were not statistically changed by these combinations.
Key Words: acetylsa1icylic acid, vitamin C, neutrophil functions, bovine
Özet: Bu araştırmada farl<lı dozlarda kombine edilen asetilsalisilik asit (ASA) ve vitamin C (Vit.C)'nin, nötrofil (po limorinükleer lökosit, PMNl) fonksiyonlarina etkileri ve ASA'nın hücre içi Vit.C düzeylerine elkileri incelendi. Nötrofiller, S.U. Veteriner Fakültesi Deneme Unitelerinde bulunan 6 adet sağlıklı holşlayn düveden elde edildi. Nötrofil eı· kinliklerinin belirlenmesinde floresans mikroskopik yöntem kullanıldı. Hücre içi Vit.C düzeyleri ise spektrofotometrik metot ile belirlendi. Farklı dozlarda uygulanan ASA·Vit.C karışımlarının Kullanılımı sonucunda hücre içi Vit.C mik tarlarında artışlar görülmesine karşın elde edilen değenerin istatistiksel açıdan önemli olmadığı görüldü. Ayrıca ASA ve Vit.C'nin kullanılan farklı dozlarının nötrolillerin la9Ositoz ve mikrobisidal aktivitelerinde isıatistiksel olarak herhangi bir değişikliğe yol açmadığı belirlendi.
Anahtar Kelimeler: aselilsalisilik asit, vitamin C, nötrofil fonksiyonları, sığır
Gırış
Vitamin C (askorbik asit) yapısal yönden altı karbonlu monosakkaritlere benzeyen bir·· ke tolaktondur. Insanlarda ve di!)er primatlarda sen tezlenmediQi halde, yüksek bitkilerde ve diğer hay vanlarda O·glukozdan sentezleniL Vitamin C (Vit.C) gelişmiş canlıların tüm dokularında bu lunmasına karşın, konsantrasyonları oldu�ça farklıdır. Kan plazmasmda ııM düzeyinde iken, lökoslllerde mM düzeyindedir. Bu sebeble Vit.C yetmezliQinin belirlenmesinde, lökosit Vit.C içeliQi
önemli bir kriter olarak kabul edilir (McCurtoch ve Vandongen,
1992).
Bir siklooksijenaz inhibitörü olan asetilsallsilik asit (ASA) ise ağrı kesici, pıhtılaşmayı önleyici ve yangı önleyici özellikleri nedeni ile başeri heklmlikte yaygın bir şekilde kuJlanılmaktadır. Ancak pa· renteral !armasötik formu bulunmadlQı için veteriner hekimlikte kullanımı oldukça sınırlıdır.'
Vil.C ve ASA'nın bu genel özelliklerine ek ola rak immun sistem üzerindeki etkileli pek çok çalışmada incelenmiştir. Gerçekleştirilen araştırmalard.a Vit.C'nin. hücresel immunitenin
Geht Tarihi: 02.10.1997
I. S.O. Veıeriner Fakütıesi. Fannakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı. KONYA. 2. S.O. Veıeriner Fakültesi. Biyokimya An8bilim Dalı. KONYA.
BAŞ. BAŞPINAR, aMAS. HALILOCLU, YAZAR
oluşmasında görev alan monositlerde ve mak
rofailarda önemli ölçüde birikti�i (De Chatelet ve
ark. 1974) ve buna ba�lı olarak bu hücrelerin mig
rasyon (Stankava, 1975) ve mi�robisidal et
kinliklerinin (Oberriter ve ark. 1986) modifiye edil
diği belirtilmektedir. Benzer şekilde eksojen olarak
uygulanan Vit.C'nin, tekrarlayan furunkulosis ol
gularının sa�ıtımına önemli katkılar sa�ladığı ve
zayıflayan nötrofil fonksiyonlarını da güçlendirdiği
(Levy ve Schlaeffer, 1993; Levy ve ark. 1996)
ifade edilmiştir. Prinz ve ark. (1977), 75 gün süre
ile günde bir gram Vit.C uygulaması sonucunda in
sanlarda serum IgA ve IgM seviyelerinin arttığını,
Helgestat ve ark. (1986) ise koloni stimüle edici
faktörler tarafından kontrol edilen hemopoietik
hücre proliferasyonunun Vit.C tarafından et
kilendiğini bildirmişlerdir. Başpınar ve ark. (1998),
in vitro şartlarda farklı dozlarda kullanılan Vit.C'nin
nötrofillerde önemli oranlarda birikim yaptığı ve
buna bağlı olarak fagositoz yeteneği ve mik
robisidal aktivitenin arttığını tespit eımişlerdir.
Vil.C'nin
eksojen
kullanımı
sonucunda
lökositlerdeki birikimi ve özellikle ASA'nın bu nok
tadaki etkisi hakkında mevcut bilgiler oldukça
çelişkilidir. Wilson (1977), Vil.C'nin lökositlere
girişinde; cinsiyet, yaş ve stres faktönerinin önemli
oranda rol aynadı�ını ve sağlıklı canlılarda Vit.C'nin
lökositlere girişinin ASA tarafından engellenirken;
romatoid artrit, sOOuk algınllğı ve atopik solunum
sistemi hastalıkları gibi durumlarda bu girişin ASA
tarafından arttırıldığını bildirmiştir. Aloe ve Padh
(1985), enfeksiyon hastalıkları sırasında serum
komplement faktörlerinin aktive olması sonucu,
normal düzeyde alınsa bile dokuların yeterli Vit.C'yi
elde
edemeyeceğini
bildirmektedirler.
Bazı
araştırmacılar ise, ASA'nın Vit.C ile lökosit· memb
ran reseplöneri düzeyinde yarıştığını ve kompatitif
inhibisyon yolu ile Vil.C'nin lökosiııere girişini en·
gellendiğini ifade etmektedirler (Basu, 1982; Loh
ve Wilson, 1970; 1973).
ASA'nın
immunolojik
etkileri
de
bazı
araştırmalara konu olmuştur. Rodriguez ve ark.
(i 989) ASA kullanımı ile insan nötrofillerinin; ke
molaksis ve fagositoz yeteneklerinin yükseldiğini;
Hsia ve ark. (1989) ise, lenfositlerin IL-2 ve TNF
üretiminin arttırıldı�ını bildirmi
ş
tir. Paape ve ark.
132
(1991), ASA'nın sığır süt nötrofillerinin fagositoz et
kinliklerini arttırdığını belirtmişlerdir. Laboratuvar
larımızda g�rçekleşlirilen bir araştırmada ise (Baş
ve ark. 1998) sığır perifer kan nötrofillerinde fa
gositik ve mikrobisidal aktivitenin ASA tarafından
önemli oranda çoğaltıldığı görülmüştür.
Bu çalışma ile fandı dozlarda kombine edilen
Vil.C ve ASA'nın sığır perifer kan nötrofil fon
kiyonları ve Vil.C'nin nötrofillerde akümülasyonu
üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Materyal ve Met
ot
Bu çalışmada, S.Ü.Veıeriner Fakültesi Deneme
Ünitesinde bulunan 8-12 aylık altı adet Holstein
Fresian ırkı düve kullanıldı. EDTA'lı vakumlu tüpler
kullanılarak V. jugularis'ten 150 ml kan örneği alındı.
Örnekler kullanılıncaya kadar 4 °C'de saklandI.
Nötrofil izolasyonu: ızolasyon, Canson ve Ka
neko (1973rnun önerdikleri yöntem esas alınarak
yapıldı. Steril koşullar sağlanarak ahnan kanlar (10
ml),
2000 g'de 4 °C'de 15 dk. süre ile santrifüj
edildi. Plazma ve eritrosit kitlenin üst 1/4'ü uzak
laştırıldıktan sonra, dipteki eritrosit küniesinin
üzerine 20 ml steril distile su eklenerek 40 sn süre
ile hafilçe sallandı ve hemoliz oluşumu sağlandı.
Ortamın ozmatik basıncının dengelenmesi için
%2.8'lik NaCl çözeltisinden 10 mi ilave edilerek 200
g'de 4 °C'de 10 dakika süre ile santrifüj edildi. Üst
kısım atıldıktan sonra 0.0132 M fosfat tamponlu (pH
6.8) % 0.09'luk NaCl çözeltisinden (PBSS)
35ml
eklenerek, oluşan süspansiyon santrifüj edildi.
Hücreler iki kez
passile yıkandıktan sonra Medium
199 (M 4530. Sigma) içerisinde homojenizasyonu
sağlandı. Elde edilen hücrelerin canhlık kontrolleri
Tripan mavisi (T 8154, Sigma) ile, sallık derecesi
ise Giemsa boyarnası ile belirlendi. Böylece hücre
süspansiyonlarında % 97 canhlık sağlanırken; bu
hücrelerin % 93'ünün PMNL, geri kalanlarının ise
eozinofil, lenlosit ve monosit olduğu belinendi. He
mositometre ile sayım yapıldıktan sonra, elde edilen
hücre süspansiyonunun konsantrasyonu
3x107
hücre/ml olacak şekilde ayarlandı.
Aselilsıalisi1ik asit ve vitamin C Kombinasyonunun Sıtır Nötrom ... mikroorganizması olarak C.albicans kullanıldı. Katı besi yerinde üretiten C.albicans M 51, günlOk ola rak ihtiyaç oranında sıvı besj yerlerine ekilip 3rC'de 18 saat süre ile inkObe edildikten sonra; PBSS Içerisinde süspanse edilerek 200 g'de 5 da kika santrifüj edildi. 2xıO'1 mmollL oranında me· Wen mavisi ile yapılan teslte (Olkowski ve ark. 1990), canlılık oranları
%
99 olarak bulundu. He mosiıometre ile sayım yapılarak, Medim ı 99 içerisinde yapılan süspansiyonun konsantrasyonu 6xl07 hücre/ml olacak şekilde ayarlandı.Asetilsalisilik asit ve Vitamin C: Vit.C (Merck) ve ASA (Bayer) 0.0132 M PBSS Içerisinde çôzdürüldü. Çalışma solüsyonları, stok solüsyonlardan taze olarak PBSS kullanılarak hazırlandı.
Deneme gruplarının oluşturulması:
Bileşimlerine katılan vitamin C konsatrasyonları dikkate alınarak üç deneme grubu (kontrol, 50).lM ve 100 ).lM) oluşturuldu. 50 ve ıoo).lM Vit.C içeren gruplar ise ASA'nın SO, 100 ve 150 ).lg/ml dozları ile kombine edilerek altı adet alt grub oluşturuldu.
lnkObasyon ortamları: Total inkübasyon ortamı 2 mVtOp olacak şekilde ayarlandı. Buna gOre her bir tOpa; 0.5 ml nötrofil süspansiyonu, 0.5 ml C.albicans süspansiyonu, 0.2 ml inaktif slQır se rumu (56 °Cde 30 dk.), 0.4 ml Vil.C solüsyonu ve 0.4 ml ASA soiOsyonu ilave edildi. Bütün inkübasyon ortamları 37 °C'de 2 saat süre ile 4rpm'de çalkalanarak su banyosunda tutuldu.
PMNL fonksiyonlarının d�erlendirilmesi: PMNl'lerin fagositoz ve mikrobisidal etkinlikleri, tlo rokrem boyama yöntemi ile belirlendi (Bertalanffy ve Nagy, 1962; Unther ve Ebernart, 1990a). Buna göre, inkübasyondan sonra 0.1 ml inkObasyon içeriQI üzerine, 0.025 ml acridine orange (A 6529, Sigma) solüsyonu ilave edilerek 60 saniye bek lendı. Floresans mikroskobunda; polimorlik çekirdekleri yeşil-sarı floresans veren PMNl'ler ile sitoplazmaları yeşil-sarı tloresans veren C.albicanslar canlı kabul edilirken, kırmızı tlo resans verenler ise ölü olarak deQerlendirildi (Unt her ve Ebernart, 199Ob). Her ömekten hazırlanan ikişer preparanan tesadüfi seçilen bölgelerdeki 200 nötrofilin fagosite eltiQi toplam C.aJbicans'lar ile
PMNL'lerin fagosilik aktivitesi (FA), sayılan 200 nötrofilden fagositoz yapanların yüzdesi olarak ifade edildi ve aşaOıdaki formül ile hesaplandı (Hogan ve .rJ<. 1990).
FA
(%)
:: (Fagositoz yapan nötrofil sayısı/ Sayılan toplam nötrofil sayısı) x 100Mikrobisida] aktivite (MA) ise, fagosite edilmiş tOm C.aJbicans miktarının, ÖLO C.afbicanslara oranı dikkate alınarak belirlendi (Hogan ve ark. 1990).
MA
(%)
:: (ÖIO C.albk:ans sayısı/Toplam fa gosite edilen C.albicans sayısı) x 100Vit.C düzeyinin belirlenmesi: Nötrofil Vit.C düzeyleri Denson ve Bower (1961) ve Haag (1985)'ln belirtikleri metotlar esas alınarak, spekt rofolometrik yöntem ile belirlendi.
Istatistiksel analiz: Ozellikler arası farklılıldar, eşler arası farkın önem kontrolO (t testi) metodu ile SPSS 6.0 bilgisayar proQraml kullanılarak incelendi.
Bulgular
Floresans mikroskobik incelemelerde; nötrofillerin çekirdekleri yeşil-san floresans verirken, hücre içi ortamda bulunan C.albicans'1ar kınnızı (ölü) veya yeşil (canlı) renklerde izlendi (Aesim 1).
Vit.C ve ASA'nın farklı dozlarda kullanımları s0-nucunda elde edilen hücre içi Vit.C deOerleri ve nötrofil fonksiyonları na ait bulgular Tablo 1'de görülmektedir.
VLt.C 50 ve 100 ).I.MIL. dozlarında tek başına kullanlldlOında hücre içi Vit.C dOzeyi kontrole göre önemlj oranda arttı (P<O.05). Her iki dozda elde edi· len hücre içi Vit.C konsantrasyonları ise kendi ara larında istatistiksel olarak önemli deQildi (P>O.05).
Vlt.C'nin 50 IJMIl dozuna eklenen SO, 100 ve 150 ).lg/ml dozlarında ASA'nın kutlanılması ile elde edilen hOcre içi Vit.C dOzeylerinin kontrole göre farklı oldukları ancak Vit.C'nin 5O).I.MIL kon santrasYQnuna göre Ise artışlar olmasına karşın an lamlı Istatistiksel deQişimin olmadıQı görüldü. Grup içi de{ıerlendinnede en yüksek hücre içi Vit.C düzeyi 50 ).lMIL Vit.C + 100 IJg/ml ASA
kom-BAŞ, BAŞPINAR, fLMAS, HAUL.OCLU, YAZAR
düzeyi
50
JlMll Vit.C +100
Ilgımı ASA kom binasyonunda elde edildi.Vit.C'nin
100
ilMIL dozuna eklenen üç farklı dozda ASA'nın inkübasyon ortamlarına ilave edil mesi ile elde edilen hücre içi Viı.C düzeyleri in celendiQinde; her üç deneme grubunda elde edilen deQerlerin kontrole göre farklı olduğu (P<O.OS) lakat kendi aralarında ve Vit.C'nin100
ilMlL do zuna göre istatistiksel açıdan bir değişimin bu lunmadığı gözlendI. Grup içi en yüksek değer100
JlM/l Vit.C + 50 Jlg/mr ASA kombinasyonunda elde edildi.Diğer taraftan
50
ve100
ilMil.. düzeylerinde Vit.C uygulanan gruplara ait alt gruplarda elde edi len hücre içi Vit.C düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan faı1ı1lklar gözlendi.Nötrofiilere ait fagositoz ve mikrobisidal aktivite fonksiyonlarına ait deQerler incelendiğinde; gerek kontrole göre gerekse kendi aralarında
50
ve100
IlMIL'Iik Vit.C dozlarının ve bunlara ait alt grupların istatistiksel olarak farksız (P>O.OS) oldukları görüldü.Tartışma
veSonuç
Tablo 1: Vitamin C ve aselilsalisilik asitin farklı dozlarda kombine edilmeleri sonucunda elde edilen PMNL fonksiyonları ve hücre Içi vitamin C konsantrasyonları (n", 6).
Deneme Gruplan
Kontrol 50 JlM viı C
50 iLM viI C + 50
119
ASA50 iLM vit C + 100 Ilg ASA
50 iLM viI C + 150
119
ASA 100 JlM vit C100 iLM vil C + 50
119
ASA 100 iLM vit C + 100 I1g ASA 100 iLM vii C + 150 I1g ASAPMNL Fonksiyonları
Fagositoz
(%)
Mik. Akt.(%)
76.6 ± 1.40 ab 87.2t1.90a 77.2±0.80 b 87.2±2.10a 77.6 ± 1.20 ab 89.5 ± 1.00a 8O.0± l.tOab 87.0 ± 1.90 a 79.2 ± 0.58 ab 66.2t 1.50a 79.6t 0.60 a 91.7 ± 1.00 a 78.4 ± 0.75 91.3 ± 1.90 a ab 78.6 t 1.00 ab 93.0± 2.70 a n.6±1.50ab 87.7±0.94a
Hücre içi vitamin
C
konsantrasyonları (PWhücre ) 0.03360 ± 0.0029 c 0.09690 ± 0.0017 b 0.10720 ± 0.0017 ab 0.13420 t 0.0350 ab 0.11400 ± 0.0028 ab 0.13840 ± 0.0020 ab 0.16520 ± 0.0031 ab 0.14800 ± 0.0015 ab 0.16040 t 0.0017 a
Aynı sulunda farklı harf taşıyan gruplar arası fark istaırstiksel açıdan önemlidir (p< 0.05).
ŞekiiI: Sığır kan polimorfnOklear lökositlerinin (PMNL) floresans mikroskopik görünOmleri tAcridina orang e . , x 750).
Asetilsıı.lisilik asit v� vitamin C Kombinasyonunun Sığır Nölrofii."
Vit.C, lökositler tarafından aklif transport ile alınır ve plazma konsantrasyonlarından 10-80 kat daha fazla oranda bu hücrelerde bulunur (Moser, 1987; Oberriner ve ark. 1986). Vit,C'nin hücre içine girişinde; ekstrasellOler ortamdaki Vit.C miktarı, pH, ortam ısısı, Ca+2 ve Mg+2 iyonlarının var1I�1 gibi faktMer önemli rol oynar (Washko ve ark. 1990).
Wilson (19n), so{ıuk algınh�ı olan bireylerden elde edilen lökositlerin bulunduQu ortama Vit.C ve ASA'nın birlikte eklenmesi sonucu lökositlere Vit.C girişinin arttı�ını, sa�lıklı bireylerden elde edilen lökositlerde ise ASA'nın Vit.C girişini engelledi�lni öne sOnnOştur. Loh ve Wilson (1975), benzer şekilde insanlarda 1000·2000 mg Vit.C'nin 600 mg ASA ile birlikte kullanılması sonucunda lökositlere Vit.C girişinin ASA tarafından engellendi�ini bil dirmişlerdir. Oaş ve Nebio{ılu (1992) kobaylarda in vivo şartlarda gerçekleştirdikleri çalışmalarında, 25 mg ve daha yuksek ASA dozlarının 25, 50 ve 100 mg Vit.C ile birlikte kullanımı sonrasında; lökositlere Vit.C girişinin önlendialni ve buna ba�1ı olarak plazma ve idrar Vit.C dOzeyinin ASA do zuna ba�1ı olarak arttı�ını bildinnişlerdir,
Bu araştırmada inkubasyon ortamlartna 50 ve 100 �MIL Vit.C'nin uygulanması ile nötrofillerde Vit.C duzeylerinin sırası ile 0.0969 ve 0.1384 pg! hücre oldu�u ve bu de�erlerin kontrole (0.0336 pg! hücre) gOre istatisliksel olarak farklı (P< 0.05) 01-dukları göreıldü. Vit.C'nln 50 }LMIL dozuna ilave edi len 50, 100 ve 150 ı.ıg/ml'lik ASA kom binasyonlarında ise hücre Içi Vit.C düzeylerinin sırasıyla 0.1072, 0.1342 ve 0.1140 pg!hOcre oldu�u belirlendI. Vif,C'nin 100 }LMIL dozuna ilave edilen uç farklı konsantrasyonda ASA'nın uy gulanması sonucunda hücre içi Vit.C duzeylerinin 0.1652, 0.1480 ve 0.1604 pghlucre oldu�u tespit edildi. Vit.e'nin 50 ve 100 �M/l.'lik dozlartna ait alt gruplarda elde edilen de�erler kontrol grubu ile karşılaştırıldı�ında, farkın istatistiksel olarak (P<O.OS) önemli olduQu ancak sayısal artışlar olmasına karşın kendi aralarında ve Vit C'nin tek başına uygulanması ile elde edilen deQerler dik· kate alındlQında bu sayısal deQlşimlerin istatistiksel açıdan önemli olmadlOI (P>0.05) belirlendi. Vit.C'nin hücre içi konsantrasyonlarına ilişkin
bul-gular gözönüne alındı Oı nda, ASA'nın nötrofillere Vit.C taşınmasını engellemediOi gözlendi. Bu sonuçlar, Vil.C'nln lökositlere girişinin ASA tarafından kompetitif inhibIsyon ile bloke edildiQini önesüren araştırıcılann bulguları ile çelişmaktedlr. Bu durumun, araştınnalarda kullanılan hücrelerin deQişik canlılardan elde edilmiş olmasından kay naklanabilece{ıi kanısındayız. Ayrıca, bu araştınnada % 93 sallıkta PMNL suspansiyonu kul lanılırken diQer araştınnalarda total lökosit süspansiyonları kullanılmış ve bunların fraksiyonel bileşim oranları belir1ilmemiştir. BilindiQI gibi mononüklaer lökositlerin hücre içi Viı.C duzeyleri nötrofil lökositlere göre oldukça fazladır (Omaye ve ark. 1987). Belirtilen bu son durumda, gözlenen farldılı�ın oluşmasında katkı saOlamış olabilir.
OiQer taraftan, elde eniQimiz hücre içi Vil.C duzeylerine ilişkin deQerler Başpınar ve ark. (1998)'ln bildirdiQI deOerlere büyük bır paralellik göstennektedir. Bu çalışmada konirol grubunda ve 50 }lMll Vit.C'nin tek başına kullanılması ile hücre içi Vit.C duzeyleri 0.03360 ve 0.09690 pglhOcre iken, Başpınar ve ark. (1998)'ın elde ettiği Vit.C deQerleri kontrol grubunda 0.03083 pg/tlOcre, 50 }lMIL Vil.C dozunda ise 0.09030 pglhücre duzeyindedir, Ayrıca bu çalışmada 50 }lMll Vit.C + 100 ).lg/ml ASA kombinasyonunda (0.13420 pg! hücre) ve 100 }LMIL. Vit.C + 50 }lg/ml ASA kom binasyonunda (0.165220 pg/tlücre) elde edilen hücre içi Vit.C duzeylerine, Başpınar ve ark. (1998) ancak Vit.C'nin 150 �MIL (0.12070 pg/hOcre) ve 300 ).lMIL (0.19370 pg/hücre) dozlarının kullanımı sonucunda ulaşabilmlşlerdir. Bu deQerlerde Vit.C'nin PMNL'lere girişinin ASA tarafından bloke edilmediQinl hatta belirli kombinasyonlarda is tatistiksel önem arzetmeyen artışlara neden olduOunu göstermektedir.
Vit.C ve ASA'nın özellikle hücresel immun sis ıem uzerindeki immunomodulatör etkileri birçok araştırmada incelenmiştir. Itze (1983), Vit.C'nin so lunum ve sindirim sistemi enfeksiyonlarında vücut direncinin arttırılmasında rol oynadığını, ye tersizti{ıinde Ise morbldite ve mortalitenin arttlOını bildinniştir. Pardeu ve Thaxton (1986); interferon üretimi, T·lenfosit aktivasyonu, nötrofil fonk siyonlarının gOçlendirilmesi ve sürekliliğınin
BAŞ, BAŞPINAR. ELMAS, HALlLOGLU, YAlAR
sağlanmasında Vit.C'nin önemli oranda etkili olduğunu belirtmiştir. Goldschmit (1991), skorbutik bireylerden elde edilen PMNL'lerdeki Vit.C mik tarının, sağlıklı olanlara göre 16 kez düşük olduğunu ve bu yetersizliğin lökosit morfolojisinde ve fonksiyonlarında bozukluktara yol açtığını öne sürmüştür. Aynı araştıncı (1988), skorbutik ko baylarda PMNL'ler tarafından lagosite edilen mik roorganizmaların %13'nün öldürülebildiğini, nonnal lökosillerde ise bu değerin % 87 olduğunu bii dirmektedir. Kolb ve ark. (1985) eksojen Vil.C uy gulamaları ile nötrofil ve makrofajlarda; migrasyon, kemotaksis, f8gosi10z ve mikrobisidal aktivite gibi fonksiyonlann arttığını ortaya koymuşlardır. Başpınar ve ark. (1998), in vitro şartlarda Vit.C'nin sığır PMNL fonksiyonları üzerindeki etkilerini In celedikleri araşıırmalarında 300 ).lMIL düzeyinde Vit.C kullanımı ile fagositoz ve mikrobisidal ak tivitede önemli artışlar elde edildiğini bildinnişlerdir.
Nötrofil fonksiyonlan üzerinde ASA'nın et kinliğini ortaya koymaya yönelik araştırmalarda elde edilen sonuçlar çelişkilidir. Rodriguez ve ark (1989), 100 mg/t dozundaki ASA'nın PMNL'lerde kemotaksis ve fagositozu önemli dOzeyde artırdığını ancak mikrobisidal aktiviten!n denenen hiç bir dozda değişmediğini bildirmişlerdir. Paape ve ark (1991), ASA kullanımı ile süt nötrofillerinde fagosilik aktivitenin arttığını ancak bu durumun SOO ve 1000 ).lg/ml gibi çok yüksek dozlarda gerçekleştiğini iddia etmektedirler. Uhlenbruck ve ark (1983) Ise in vitro koşullarda kullanılan hiç bir dozda ASA'nın nötrofil fonksiyonlarında herhangi bir değişikliğe yol açmadığını ifade etmişlerdir.
Laboratuvartarımızda gerçekleştirilen bir araştırmada ise in vitro koşullarda 50, !OO v� 150 ).lg/ml dozlarında ASA'nın sı�w perifer kan nötrofillerinde lagositozu, sadece 50 ).lg/ml düzeyinde ise mikrobisidal aktiviteyi arttırdığı tespit edilmiştir (Baş ve ark, 1998).
Literatür incelemelerinde ASA ve Vit.C'nln bir likte kullanımının hücresel immun sistem üzerindeki etkileri ile ilgili herhangi bir veriye rast lanılmamıştır. Ancak, bir araştırmada (Hockertz ve ark. 1982) Vit.C-ASA kombinasyonunun mak rofajlarda IL-6 üretimini arttırdığı ile "ri sOrulmektedir.
136
Bu araştırmada elde edilen PMNL fonk· siyonlarına ilişkin bulgular; eksojen Vit.C kullanımı açısından özellikle Başpınar ve ark. (1998)'nın bil dirdikleri sonuçlar ile çelişmektedir. Bu durumun, elde ettiğimiz hücre içi Vit.C düzeyinin, fonksiyonel artış için gerekli olan eşik düzeyin altında kal masından kaynaklanmış olabileceği kanısındayız. Başpınar ve ark. (1998), nötrofil fonksiyonlarında izlenen pozitif değişimin 300 ).lMIl düzeyindeki Vit.C kullanımı ile elde edildiğini ve bu dozda hücre ıçı Vil.C konsantrasyonunun Ise 0.19370 pglhOcre olduQu bildirilmektedir. Diğer taraftan, tek başına kullanıldığında farklı nötrofil fonksiyonlarında artış yaplı�ı belirtilen (Paape ve ark. 1991; Rodriguez ve ark. ı 989; Baş ve ark. 1998) ASA'nın, Vil.C Ile bir likte kullanıldığı zaman nötrofil fonksiyonlarında her hangi bir değişim oluşturmamasının sebebi tam ola rak anlaşılamamışur.
Sonuç olarak,
• ASA ve Vil.C'nin farklı dozlardaki kom
binasyonlarının, sığır perifer kan nötrofillerinin fa· gositoz ve mikrobisidal aktiviteleri üzerinde is· tatistiksel açıdan herhangi bir değişime yol açmadığı,
• Vit.C'nin nötrofil lökositlerdeki birikim düzeyleri üzerinde ASA'nın engelleyici bir etkisinin bulunmadı�ı,
• ASA-Vit.C kombinasyonunun immun sistem üzerindeki etkilerinin tam olarak anlaşılabilmesi için in vitro ve özellikle in vivo araştırmaların gerçekleştirilmesi ve bu maddeler ile yangı me diatörlerinin etkileşmesinin ayrıntılı bir şekilde in celenmesi gerektiği, kanaatindeyiz.
Kaynaklar
Aloe, J.J., Padh, H. (1985). Inhibiıion of Ascorbic Acid Upıake By Endotoxin, Evidence Of Mediatin By Serum Faclor (S). Proc Soc Exp Biol Med, (179),126·31. Basu, T.K.(1982). Vitamin C Aspirin Inıeractions. ını J Nulr Aes, 23 (Suppl), 83·90.
Baş, A.L, Traş, B., Elmas, M., Keskin, E .. Yazar, E. (1998). The Et/acls of Acetylsa1icylic Acid On The Pha· 9ocy1ic Function OL Bovine Neuırophiles In Vitro. Aevue
Aseıilsalisilik asit ve vitamin C Kombinasyonunun Sığır-Notrorıı... De Medecine Veterinaire149 (8·9), 857-862.
Başpınar, N., Baş, A.L. Halilo$)lu, S .. E/mas, M., Yazar E. (1998). The Ertacts Of Intracellular Vitamin C Con centraıions On Bovine Neuırophils Functions In Vilro. Revue De Medecine Veıerinaire149 (10), 931-938. Bertalanffy, F.D., Nagy,K.P. (1962). Florence Mic· roscopy And Phoıography With Acridine Orange. Me dical Radiography And Phoıography, 38, (3), 82-91. Carison. G.P., Kaneko, J.J. (1973). Isolation ol le ucocytes From Bovine Peripheral BIood. Proceedings of The Society For Experimenıal Biology And Medicine, (142), 853-856.
Daş, N., Nebioğlu, S. (1992). Vilamin C Aspirin Inıeractlons In laboraıory Animals. J CUn Phann The· rap, (17), 343-46.
De Chalelel, I.R., Mccall, C.E., Cooper, M., Shirley, P.S. (1974). Ascofbic Acid Levels In Phagocytic Gells. Proc Soc Exp BiOI Med, 145 (4), 1170-1173.
Denson, K.W., Bower, E.F. (1961). The Determination of Ascorbic Acid In White Blood Cells. A Comparison of W.B.C. Ascofbic Acid Phenolic Acid Exlraction In Elderly Paıienls. Clln Sei, (21),157-162.
Goldschm!d1, M.C. (1991). Reduced Bacıencidal Activity In Neuırophils From Scorbutic Animals And The Etfect of AscOfbic Acid on These Target Bacterla In Vivo And In Vitro. Am J Clin Nutr, (54),1214-1220.
GoIdschmidt, M.C., Masın, W.J., Brown, ıOR.,Wyde, P.R. (1988). The Effect of Ascorbic Acid Deficiency On Leucocyte Phagocytosls And Kining of Actinomyces Viscosus. ını J Vit Nutr Res, 58, (3), 326-334.
Haag. W. (1965). Zur Methodik Und Praktisehen Be dauıung Der Vitamin C-Bestimmung Belm Rind In Ver gangenheil Und Gegenwart. Inaugural Dtssertation. JU$luS � Universitaı, Giessen.
Helgestad, J . • Stonn-Mathisen, 1., lie, S.O. (1986). V ... tamin C And Thio/ Reagents Promote The In Vitro Growth of MUrVıe GranulocyteIMatrophage Progenitor Cells By Neutrolizing Endogenous Inhibitor(S). Bıut, 52
(1).1·8.
Hockertz, S., Sehattler, T., Rogalla, K. (1992). Effect OL' Aceıylsalicylic Acid, Ascofbale And Ibuprolen On The Macrophage System. Orug Res, 42 (8), 1062·68.
Hogan. J.S., Sm�h, KL. Weiss, W.P" Todhunter, DA, Sehoct<.ey. W.L (1990). Relationships, Among Vitamin
E, Selenium, And Bovine Blood Neutrophils_ Journal of
Oaıry Science, (73), 2372-2378.
Hsia, J., Sarin, N., Oliver, J.H., Goktstein, A.lo (1989).
Aspirin And Tymosin lnerease Inter1eukin-2 And In terferon-Gamma Production By Human Peripheral Blood leucocytes. lmmunophannacology. (17), 167-173. 112e, lo (1984). Ascorbic Acid Metabolism In Ruminanıs, In "Ascorbic Acid In Domestic Animals Proceedings". Ed. ı. Wegger, F.Tagwerker, J. Mousıgaard. P. l�o-l30, The Royal Danish Agncuhural Society, Copenhagen.
Ko/b, E. (1985). Neuere Erkenntntsse Zur Bedeuıurıg Und Zum Stoffwechsel Der Askorbinsaure Bei Haustieren (Übersichts�eferat). Vet Med, (40),489-494
le\')'. R. Seh/aelfer F. (1993). Succesfull Treatment Of A Patlent With Recurrent Furunculosis By Vitamin C, Imp rovement OL Clinical Course And Of Impaired Neuırophil Functions. International Journal Of Dennatology, 32, (11), 832-34.
levy, R, Shriker, O., Poralh, A., Reisenbarg, K, Schla· erter, F. (1996). Vıtamin C For The Treatment of Re current Furunculosis In Patient With Impalred Neutropha Functlons. J Infact DIs., (173), 1502-1505,
lInther. P.J., Eberhart. R.J. (l990a). Effect Of Bovine Mammary Sacretion During Earty Nonlactaling Perlod And Antiblolics On Polymorphonuciear Neutrophil Furıc tion And Morphology. Am J Vet Res, 51, (4), 524-4532. lInther, T.J.,Eberhart, R.J. (199Ob). Effect of Antibiotics On Phagocyte Recruilment, Function And Morphology in The Bovine Mammary Gland During The Earty Non lacıating Period. American Journal of Veterinary Re search, S1, (4), 533-542.
loh, H.S, Wilson, C.W.M. (1970). The Ongin of Ascorbic Acid Stored In The Leucocytes. British J Phann, 40, 169P.
LOh, H,S, Wilson. C. W.M. (1973). The Effacts of Acety salicytic Acid On The Metabolic Availibflity of Ascofbic Acid In Human Belngs. J Clin Pharm, (13), 480-86.
loh, H.S, Wilson, C.W.M. (1975). The Inleraction ol Acetysalicylic Acid on The Metabolic Availibilify of As cofbic Acid In Normal Man. J elin Phann, (15), 36-45.
Mc CUlloch, R K., Vendongen, R (1992). Measurement Of Ascofbic Acid In Platetets And Its Relati�hip To POlymorphonucıear leucocyte levels. Clin Chem Acta, (213).15-22.
Moser, U. (1987). Upiake of Ascorblc Acid By le
ucocytes. Ann NY Acad $ci, 496, 200-215.
Obemtter, H., Glanhaar, B., Mosser, U., Schmidt, K.H. (1986). Effect of Ft.nCtionaJ Slimuiation on Ascorbate
BAŞ. BAŞPINAR, ELMAS, HAL1L.OG
�L::
U
�
'
':Y�A
ZA
�R�
____________________ _
Conlenl In Phagocytes Under Physiological And Pat· hological Condilions. ini Arch AJlergy Appl Immunol, (81 ),46-50.
Olkowski, AA, Gooneratne, S.R., Chrislensen, D.A. (1990). EHecls of Diels Of High Sulphur Concenl And Varıed Coneentrations of Copper, Molybdenum And Thi· amin On In Vitro Phagocytic And Candidacidal Activity of Neulrophils In Sheep. Research In Veterinary Sc;" enee, (48), 82-86.
Omaye. S.T., Schaus, E.E., Kutnink, M.A., Hawkes, W.C. (1987). Measurement OL Vitamin C BIood Com ponents By High Performanee Uquid Chromaıography. Implication In Assessing Vilamin C Slatus. Ann NY Acad Sci., (498), 389-401.
Paape, M.J., Miller, R.H., Ziv, G. (1991). Pharmacologic Enhaneement Or Suppression of Phagocytosis By Bo vine Neutrophils. American Journal of Velerinary Re search, (52), 363-366.
PanuSh, R.S., Delaluente, J.J., Katı, P., Jhonson. J. (1982). Modulalion of Certain Immunologic Responses By Vitamin C III. Potentiation OL In Vitro And In Vivo Lymphocyte. Int J Vii Nutr Res, (23), 35-39.
Pardeu, S.L. And Thaxton, J.P. (1986). Ascorbic Acid In Poultry. Wonds Poullry Sci J, 42, (2), 10-123.
Prinz, W., Bortz, R., Bregin, B .. Hersch, M. (1977). The Eifecı Of Ascorbic Acid Supplemantation Of Some Pa· ramelers Of The Human Immunological Defence
138
Sysıem. Int J Vii Nulr Res, (47), 248-257.
Raghoebar, M., Huisman, J.A.M., Van Den Berf, W.B., Van Ginneken, C.A.M. (1987). Characteristics Of The Transport Of Ascorbic Acid In To Leucocytes. Life Sei. (40), 499-51 O.
Rodriguez, A.B., Barriga, C., De La Fuenle, M. (1989). Effecls OL Acetylsalicylic Acid On The Phagocytic Fune tion Human Polymorphonuclear Leucocytes In Vitro. Ge neral Pharmacology, (20),151.155.
Samuk, B., Eratalay, K., Şengün, D., Ciliv, G. (1987). Ju venil Ve Hızlı Ileneyen Periodonıilisli Plazma Ve Lökosit C Vilamini Düzeyleri Ile Nötrofillerin Fagosilik Et· kinliklerinin Incelenmesi. Hacettepe Üniversitesi Diş He· kimliği Fakültesi Dergisi, II, (2), 119-129.
Stankova, L, Gerhard, H.B., Napeı, L., Bigley, R.H. (1975). Ascorbate And Phagocyte Funcıion. Infect Immun, (12), 252·256.
Uhlenbruck, G., Lötzerich, H., Bemhardt, J., Rogalla. K. (1983). Acety1salicylic Acid Has No Effects On Various Isolated Immuno Cells In Vitro. Europan Journal Of App lied Physiology, (66), 473·476.
Washko, P., ROlfosen, D., Levine, M. (1990). Ascorbic Acid Accumulalion In Ptated Human Neuırophils. Febs Let, 260, (1), 101-109.
Wilson, C.W.M. (1977). Pharmacologlcal Aspects Of Vi tamin C In Health And Disease In "Re·Evaluation OL Vi· tamin C". Ed. Hanck, A. and Ritzel, G. 267-85, Verlag
