Kültür Balıklarındaki Vibrio anguillarum’un İmmunohistokimyasal Yöntemle Teşhisi* Tülay AKAYLI, Buket AYDIN
İstanbul Üniversitesi, Su Bilimleri Fakültesi, Balık Hastalıkları Anabilim Dalı, İstanbul-TÜRKİYE Özet: Bu çalışma ile yurdumuzda kültürü yapılan levrek (Dicentrarchus labrax) ve çipura (Sparus aurata) balıklarında görülen Vibrio (Listonella) anguillarum kaynaklı enfeksiyonların bakteriyolojik, histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemler kullanılarak teşhisinin yapılması amaçlanmıştır. Hastalık belirtisi gösteren ağırlıkları 150-220 gr arasında değişen toplam 10 adet levrek balığı ve ağırlıkları 150-200 gr arasında değişen toplam sekiz adet çipura balığı örneği bakteriyolojik ve histopatolojik yöntemler kullanılarak incelenmiştir. Etkenin dokulardaki varlığı ve lokalizasyonu ise immunohistokimyasal yöntem (streptavidin-biotin boyama) kullanılarak tespit edilmiştir. Gerçekleştirilen bakteriyolojik, histolojik ve immunohistokimyasal çalışmalar sonucunda, hastalığın klinik semptomlarını gösteren levrek ve çipura balıklarında vibriosis hastalığının teşhisi yapılmış ve etkenin dokulardaki varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada bakterinin enfekte balık dokularındaki varlığının tespiti amacıyla kullanılan ve indirekt immunoenzimatik yöntemlerden olan streptavidin-biotin boyama yöntemi (StrepABC–IHC) Listonella anguillarum’un teşhisinde ilk kez kullanılmış ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Balık, immunohistokimya, V. anguillarum, vibriosis
Diagnosis of Vibrio anguillarum by Using Immunohistochemical Method in Cultured Fish
Summary: In this study, diagnosis of Vibrio (Listonella) anguillarum infections in cultured European sea bass (Dicentrarchus labrax) and gilt-head sea bream (Sparus aurata) in Turkey by using bacteriological, histopathological and immunohistochemical methods was aimed. In total, 10 European sea bass samples weighing between 150-220 g and eight gilt-head sea bream samples weighing between 150-200 g showing disease signs were investigated by using bacteriological and histopathological methods. The presence and the distribution of the agent in the tissues were de-tected by using immunohistochemical method (streptavidin-biotin staining). As a result of the bacteriological, histologi-cal and immunohistochemihistologi-cal studies, the diagnosis of vibriosis was made and the presence of V. anguillarum was detected in the tissues of affected European sea bass and gilt-head sea bream samples showing clinical symptoms. Also an immunoenzimatic method, streptavidin-biotin staining method (StrepABC–IHC) was used for the first time in this study for the detection of the presence of this bacterium in the infected fish tissues.
Key words: Fish, immunohistochemistry, V. anguillarum, vibriosis
Giriş
Levrek (Dicentrarchus labrax) ve çipura balıkları (Sparus aurata) yetiştiricilik koşullarında hızlı büyüyen önemli deniz balığı türlerindendir. Bu nedenle bu iki balık türünün Akdeniz ülkelerinde olduğu gibi yurdumuzda da yetiştiriciliği başarılı bir şekilde yapılmaktadır (2). Vibrio türü bakteri-lerin neden olduğu vibriosis bakteriyel ve bulaşı-cı bir hastalıktır. Hastalık dünya genelinde kültür balıkçılığı yapan tatlı su ve deniz işletmelerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır (3,17). Kültürü yapılan levrek ve çipura gibi
de-niz balıklarında (10,16) vibriosise neden olan en önemli patojen Vibrio (Listonella) anguilla-rum’dur (3,12,13,20). Araştırmacılar daha çok adı geçen patojen bakterinin virülans mekaniz-masını aydınlatılması, hızlı tespiti ve neden ol-duğu hastalığın önlemesi üzerinde yoğunlaş-maştır. Günümüzde etkenin teşhisinde mikrobi-yolojik, serolojik, moleküler, histopatolojik ve immunohistokimyasal teknikler farklı araştırıcılar tarafından kullanılmıştır (3,4,11,12,19).
L. anguillarum ile ilgili yapılan
immunohistokim-yasal çalışmalar; enfekte balık ve su canlılarının dokularındaki bakteri varlığının teyit edilmesi, dokulardaki lokalizasyonunun belirlenmesi, anti-jenin dokulardaki yoğunluğunun tespit edilmesi ve patojenin patogenezisinin belirlenmesi üzeri-ne yoğunlaşmıştır (5,6,8,11). Ayrıca L.
anguilla-rum’a karşı probiyotik etkisi olan bakterilerin
Geliş Tarihi/Submission Date : 04.04.2017 Kabul Tarihi/Accepted Date : 17.10.2017
*Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Birimi tarafından 41630 no’lu proje ile desteklenmiş ve World Aquaculture Adelaide- Australia 2014’te sunulmuştur.
Araştırma Makalesi / Research Article 15(2), 131-136, 2018
tespit edilmesi ve aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik araştırmalarda da immunohistokimyasal yöntemlerden yararlanılmıştır (1,17). Ülkemizde ise L. anguillarum serotip O1 ile deneysel olarak enfekte edilen gökkuşağı alabalıklarının doku ve organlarındaki antijenlerin varlığını ve dokudaki dağılımının belirlenmesi amacıyla immunohisto-kimyasal teknikler kullanılmıştır (4).
Bu çalışmada; ülkemizde kültürü yapılan levrek ve çipura balıklarında görülen V. anguillarum kaynaklı enfeksiyonların bakteriyolojik, histopa-tolojik ve immunohistokimyasal yöntemler kulla-nılarak teşhisinin yapılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem
Çalışmada kullanılan balık materyali
Bu çalışmada incelenen balık materyalleri Ege Bölgesi’nde bulunan farklı deniz işletmelerinden temin edilmiştir. Hastalık belirtisi gösteren ve ağırlıkları 150-220 g arasında değişen toplam on adet levrek balığı ve ağırlıkları 150-200 g arasında değişen toplam sekiz adet çipura balı-ğı incelenmiştir. İşletme sahiplerinden alınan bilgeye göre en yüksek ölüm oranı hasta levrek balıklarında görülürken (%70), çipuralarda ise ölüm oranının oldukça düşük olduğu (%10) be-lirtilmiştir.
Bakteriyolojik örnekleme
Hastalık belirtisi gösteren balıkların iç organla-rından (dalak, böbrek ve karaciğer) %1.5 NaCl içeren Trypticase Soy Agar (TSA) (Merck 1.05458, Almanya) besiyerine ekimler yapılmış-tır. Ekim yapılan petriler 22-23 °C’de 48-72 saat boyunca inkübe edilmiş ve izole edilen bakteri-lerin morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özel-liklerinin tespiti için rutin bakteriyolojik metotlar kullanılmıştır (3,7,18). Bu çalışmada referans bakteri (R) olarak İspanyadaki çipura balığından izole edilmiş olan bir adet V. anguillarum suşu kullanılmıştır.
Histopatolojik muayene
Histopatolojik inceleme için hasta balık örnekle-rine ventral, lateral ve operkular insizyon teknik-leri uygulanarak iç organları ortaya çıkartılmıştır. Daha sonra balıkların dalak, karaciğer ve böb-rek gibi iç organları yanı sıra solungaç ve kas dokularından da makas yardımı ile 0.5-1cm3 büyüklüğünde örnekler alınarak %10’luk formal-dehit içerisinde 72 saat fikse edilmiştir. Tespit edilen doku örneklerinden rutin doku işleme pro-sedürü uygulanarak 5 µm kalınlığında kesitler alınmıştır. Bu kesitler Hematoksilen-Eosin boya-ma yöntemi ile boyanarak histolojik olarak ince-lenmiştir (9,18).
İmmunohistokimyasal boyama (streptavidin-biotin yöntemi)
Araştırmada immunohistokimyasal metot olarak immunoenzimatik yöntemlerden streptavidin-biotin boyama yöntemi (StrepABC–IHC) kulla-nılmıştır. Hasta balıkların iç organlarından alı-nan doku örnekleri formalin ile fikse edildikten sonra rutin doku işleme basamağının ardından parafine gömülmüş ve bu parafin bloklardan 4µm kalınlığında kesitler poly-L-lysin kaplı lam üzerine alınmıştır. Daha sonra kesitler %3’lük hidrojen peroksit solüsyonunda 30 dakika bekle-tilmiş ve sonrasında PBS ile yıkanmıştır. Lamla-rın üzerine 1:1000 oranında sulandırılmış anti-V. anguillarum monoklonal antikorundan (İbt FM -040AX-5) 30µL ilave edilmiş ve oda sıcaklığın-da 2 saat inkübe edilmiştir. Kesitlere biotin ile işaretli sekonder antikor eklenmiş, 15 dakika inkübe edilmiş ve inkübasyon sonrasında PBS ile yıkanan kesitlere streptavidin peroksidaz ek-lenmiş ve 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Yıkamadan sonra doku kesitleri üzerine 30µL AEC (Three-amino-9-ethylcarbazole) solüsyonu damlatılarak 15-20 dakika nemli ortamda bekle-tildikten sonra yıkanmıştır. İmmun boyamanın ardından preparatlar Mayer’s hematoxylin ile boyanmış, entellan ile kapatılarak ışıklı mikros-kop altında incelenmiştir. Antijen-antikor birleş-mesinin gerçekleştiği immün pozitif odaklar, nor-mal doku hücrelerinden farklı olarak kahverengi-ye boyanmaları ile tespit edilmiştir (5,16,18). Bulgular
Klinik ve nekropsi bulguları
Hasta balıklarda dış bakıda genel olarak hare-ketlerde durgunluk, iştahsızlık, solungaçlarda solgunluk ve vücut yüzeyinde az miktarda pul kaybı gibi benzer klinik bulgular dikkati çekmiş
Şekil 1. (a) Hasta çipura balıklarının yüzgeç diplerinde ka-nama (b) solungaç filamentlerinde erozyon ve karaciğerde solgunluk
tir. Çipura balıklarının pelvik, anal ve pektoral yüzgeç diplerinde hemoraji görülürken (Şekil 1a.) hasta levrek balıklarında ise bu bölgeler yanı sıra baş ve karın bölgesinde yoğun hemo-rajik alanlar dikkati çekmiştir (Şekil 2a). Çipura balıklarının iç bakısında solungaç filamentlerin-de erozyon yanı sıra karaciğerin anemik görün-tüsü dikkati çekmiştir (Şekil 1b). Levrek balıkla-rında aşırı solgun karaciğer üzerinde hemorajik odaklar, dalakta büyüme, bağırsakta sarı renkli ve kokulu sıvı birikimi ve iç organlarda yağlan-manın olduğu gözlenmiştir (Şekil 2b).
Şekil 2. (a) Levrek balıklarının baş bölgesindeki hemorajik odaklar ve (b) karaciğer üzerinde peteşiyel kanama odakla-rı, iç organlarda aşırı yağlanma ve iç organların genel görü-nümü
Tablo 1. Örneklemeler sonucu izole edilen bakteri izolatlarının biyokimyasal özellikleri
Karakterler 1 2 3 4 5 6 7 8 R Hareket + + + + + + + + + Gram Boyama - - - - O/F F F F F F F F F F Sitokrom Oksidaz + + + + + + + + + Katalaz + + + + + + + + + TCBS’de üreme S S S S S S S S S VAM’da üreme S S S S S S S S S Sitrat kullanımı + + + + + + + + + β-galaktosidaz (ONPG) + + + + + + + + + Voges-Proskauer + + + + + + + + + Metil Red - - - - İndol + + + + + + + + + Arjinin dihidrolaz + + + + + + + + + Lizin dekarboksilaz - - - - Ornitin dekarboksilaz - - - - Nitrat indirgeme + + + + + + + + + Üreaz üretimi - - - - Jelatinaz üretimi + + + + + + + + + Nişasta + + + + + + + + + H₂S - - - - D-Glukoz, gaz - - - - D-Glukoz, asit + + + + + + + + + L-Arabinoz, asit - + + + + + + + - myo-İnositol, asit - - - - Laktoz,asit - - - - D-Mannitol, asit + + + + + + + + + D-Mannoz, asit + + + + + + + + + D-Maltoz,asit + + + + + + + + + Sukroz, asit + + + + + + + + + İnositol - - - - Salisin - - - - % 0 NaCl’de üreme - - - - % 3 NaCl’de üreme + + + + + + + + + % 8 NaCl’de üreme - - - - % 10NaCl’de üreme - - - - 37 ̊C’de büyüme + + + + + + + + + O/129’a duyarlılık + + + + + + + + +
(+): Pozitif reaksiyon, (-): Negatif reaksiyon, S: Sarı, F: Fermantatif, VAM: Vibrio anguillarum Medium, TCBS: Tiyosülfat sitrat safra tuzu, O/F: oksidatif/fermentatif
Bakteriyolojik bulgular
%1.5 NaCl içeren TSA besiyerine yapılan ekim-lerin inkübasyonu sonucu yuvarlak, konveks, hafif kabarık, parlak ve krem renkli 20 adet bak-teri izolatı elde edilmiştir. Bu izolatların 8 tanesi referans suşa benzer şekilde, Gram-negatif ka-rakterli, hareketli bakteriler olmaları, O/F glukoz testinde fermantatif özellik göstermeleri, O/129 vibriostat testine duyarlı olmaları ile genus dü-zeyinde Listonella genusuna mensup olduğu tespit edimiştir. Ayrıca izolatlar sitokrom oksi-daz, katalaz, indol, β-galaktosidaz (ONPG) gibi testlere pozitif reaksiyon vermeleri yanı sıra ya-pılan diğer biyokimyasal özellikleri nedeniyle L. anguillarum olarak teşhis edilmiştir (Tablo 1).
Histolojik bulgular
L. anguillarum ile enfekte çipura balıklarının ka-raciğer hücrelerinde vakuoler dejenerasyon, ve nekroz (Şekil 3a), böbrek dokusunda interstisi-yel alanda hücre ve matriks kaybı, böbrek tübül-lerinde dejenerasyon (Şekil 3b), dalak dokusun-da nekroz (Şekil 3c) ve solungaç lamellalarının
epitel hücrelerinde nekroz dikkati çekmiştir (Şekil 3d).
Hasta levrek balıklarının iç organlarının ve so-lungaçlarının histopatolojik incelemesinde kara-ciğerde küçük hemorajik odaklar (Şekil 4a), böbrek dokusunda interstisiyel alanda hücre ve matriks kaybı, böbrek tübüllerinde dejeneras-yon, melanomakrofaj merkezlerinde hemoside-rin depozitleri (Şekil 4b), dalak dokusunda nek-roz (Şekil 4c) ve solungaç filamentlerinin yanı sıra solungaç lamellalarının epitel hücrelerinde nekroz tespit edilmiştir (Şekil 4d).
İmmunohistokimyasal bulgular
Çalışmada incelenen V. anguillarum ile enfekte çipura balıklarının solungaç ve iç organlarının immunohistokimyasal incelemesi sonucunda; karaciğerde bir arterin etrafındaki karaciğer hüc-relerinde koyu kahverengi renkte boyanmış im-mun pozitif odaklar (Şekil 5a), böbrek tübüllerin-de (Şekil 5b), dalak dokusunda sinuslarda (Şekil 5c) ve solungaç filamentlerinde ve özellikle fila-ment diplerinde immun pozitif alanlar görülmüş-tür (Şekil 5d).
Hasta levrek balıklarının iç organlarının immu-nohistokimyasal incelemesi sonucunda; karaci-ğerde sinuzoidlerde, nekrotik alanlar içinde ve Şekil 3. (a) Hasta çipura balığının karaciğer hücrelerinde
vakuoler dejenerasyon, (b) böbrek dokusunda interstisiyel alanda hücre ve matriks kaybı (oklar), böbrek tübüllerinde dejenerasyon (c) dalak dokusunda nekroz (d) solungaç lamellalarının epitel hücrelerinde nekroz (oklar).
Şekil 4. (a) Levrek balıklarının karaciğerinde küçük hemora-jik odaklar (okla gösterilmiştir) (b) böbrek dokusunda inters-tisiyel alanda hücre ve matriks kaybı, periglomeruler ödem (oklar), böbrek tübüllerinde dejenerasyon (okla gösterilmiş-tir), melanomakrofaj merkezlerinde hemosiderin depozitleri (c) dalak dokusunda nekroz (d) solungaç lamellalarında nekroz (oklar).
Şekil 5. (a) Enfekte çipura balığının karaciğerinde arterin etrafındaki karaciğer hücrelerinde, (b) böbrek tübülllerinde, (c) dalak dokusunda ve (d) solungaçlarda kahverengi renk-te boyanmış immun pozitif odakların görünümü (oklar)
damar etrafında (Şekil 6a), böbrekte tübüllerde (Şekil 6b), dalakta sinuslarda, damar kenarların-da ve nekrotik alanlarkenarların-da (Şekil 6c), solungaç ve solungaç filamentlerinde antijen antikor birleş-mesi sonucu oluşan kahverengi renkteki immun pozitif odaklar gözlenmiştir (Şekil 6d).
Tartışma ve Sonuç
Vibrio anguillarum’ un neden olduğu klasik vibri-osis, deniz ve tatlı sularda yetiştiriciliği yapılan balıklarda yüksek mortalitelere neden olmakta-dır (4,7,13,19). Bu çalışma ile Türkiye’de kültürü yapılan levrek ve çipura balığı işletmelerindeki vibriosisin klinik belirtilerini gösteren hasta balık örneklerinden V. anguillarum izole ve identifiye edilmiş ve bu patojenin balık dokularında sebep olduğu hasar histopatolojik olarak tespit edilmiş ve streptavidin-biotin boyama yöntemi kullanıla-rak etkenin immunohistokimyasal olakullanıla-rak teşhisi yapılmıştır.
Hasta levrek ve çipura balıklarının iç organları-nın ve solungaçlarıorganları-nın histopatolojik yönden incelenmesi sonucunda diğer araştırmacılara benzer olarak karaciğerde küçük hemorajik odaklar, böbrek tübüllerinde dejenerasyon gibi bulgularda benzerlik gözlenmiştir (14,18). En-fekte çipura balık dokularının histopatolojik ola-rak incelenmesi sonucunda ise Korun ve Timur (14)’un bildirdiği gibi böbrek dokusunda intersti-siyel alanda hücre ve matriks kaybı, böbrek tü-büllerinde dejenerasyon, dalakta doku kaybı, yanı sıra solungaç lamellalarının yapısal düze-ninde bozulma tespit edilirken incelediğimiz L. anguillarum ile yapılan çalışmalarda daha çok
immunokimyasal yöntemlerden olan peroksidaz antiperoksidaz (4,8) ve avidine-biotin-alkaline fosfataz metodu kullanırken (11), Planas ve ark. (17) probiyotik özelliği olan Roseobacter sp.’nin kalkan balıklarında görülen V. anguillarum en-feksiyonunda enfekte balık dokuları üzerindeki etkisinin belirlenmesinde streptavidin-biotin tek-niğini tercih etmişlerdir. Balıkların solungaçların-da yoğun antijen antikor birleşmesine bağlı ola-rak kahverengi renkte immun pozitif alanların görülmesi diğer araştırıcıların verileri ile benzer-lik gösterirken (4,11), Laurencin ve Germon (15) tarafından belirtildiği gibi L. anguillarum’un so-lungaçları birincil giriş yolu olarak kullandığının göstergesi olabileceği düşünülmektedir.
Karaciğer dokularında immun pozitif alanların sinuzoidlerde, nekrotik alanlarda gözlenmesi diğer araştırıcıların hasta gökkuşağı alabalığı (4) ve kalkan balıklarındaki (12) bulgularına benzerlik göstermesine rağmen bu çalışmada incelenen balıkların karaciğer dokularında özel-likle arter etrafındaki hücrelerde yaygın immun pozitif alanlara rastlanılmıştır. Balıkların böbrek dokularında ise immun pozitif alanların daha önce yapılan araştırmaların sonuçlarına benzer şekilde sadece böbrek tübüllerinde yoğun oldu-ğu tespit edilmiştir (4).
Dalak dokularında immunohistokimyasal incele-meler sonucunda levrek ve çipura balıklarının dalak kesitlerinde immun pozitif alanlar Avcı ve ark. (4)’ nın yaptığı çalışmanın sonucuna ben-zer şekilde sinus ve nekrotik alanlarda tespit edilmiştir. Bu çalışmada daha önce yapılan ça-lışmalardan farklı olarak levrek balıklarına ait dalak dokularında damara yakın bölgelerde im-mun pozitif reaksiyonlara rastlanılırken çipura balığına ait balık dokularında gözlenmemiştir. İki balık türüne ait dalak ve karaciğer dokularında damara yakın bölgelerde de immun pozitif alan-lara rastlanılması Grisez ve ark. (12)’nin belirttiği gibi bu bakterilerin bağırsağın lamina propria-sından kan yolu ile karaciğer ve diğer iç organ-lara taşındığının bir göstergesidir.
Sonuç olarak; bu çalışma ile L. anguillarum’un streptavidin-biotin yöntemi ile teşhisi levrek ve çipura balıklarının dokularında ilk kez yapılmış olup elde edilen verilerin bu yöntemin immun hassasiyetinin yüksek olması nedeniyle bu bak-terinin tanısında güvenilirliğinin de yüksek olabi-leceğini göstermiştir. Dolayısı ile çalışmanın sonuçları V. anguillarum kaynaklı enfeksiyonla-rın teşhisinde diğer immun yöntemlere göre da-ha yaygın kullanımının önünü açacaktır.
Şekil 6. (a) Hasta levrek balığının karaciğer dokusunun nekrotik alanlarında, sinuzoidlerinde ve damar etrafında, (b) böbrek dokusundaki tübüllerde, (c) dalak dokusunun sinuslarında ve (d) solungaçlarda kırmızı renge boyanmış immun pozitif alanlar (oklar)
Kaynaklar
1. Afonso A, Gomes S, Silva J, Marques F, Henique M. Side effects in sea bass (Dicentrarchus labrax L.) due to intraperito-neal vaccination against vibriosis and pas-teurellosis. Fish Shellfish Immunol 2005; 19 (1): 1-16.
2. Alpbaz A ed. Su Ürünleri Yetiştiriciliği. İkinci Baskı. Bornova-İzmir: Alp Yayınları, 2005; s. 576.
3. Austin B, Austin A. Vibrionaceae represent-atives. Austin B. Austin A. eds. In: Bacterial Fish Pathogens: Diseased of Farmed and Wild Fish. Third Edition. Chichester: Praxis Publ, 1999; pp. 369-89.
4. Avcı H, Birincioğlu S, Çağırgan H. Patholog-ical and immunohistochemPatholog-ical investigations in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Wal-baum, 1792) experimentally infected with Vibrio anguillarum. Rev Med Vet 2012; 163 (1): 31-9.
5. Bancroft JD ed. Theory and Practice of His-tological Techniques. Seventh Edition. Not-thingham: Elsvier, 2008; p. 654.
6. Bergh O. Bacteria associated with early life stages of halibut, Hippoglossus hippoglos-sus L., inhibit growth of a pathogen-ic Vibrio sp. Fish Dis 1995; 18(1): 31-9. 7. Buller NB, ed. Bacteria from Fish and other
Aquatic Animals: A practical Identification Manual. UK: CABI Publishing, 2004; p. 361. 8. Chaves-Pozo E, Pelegrin P, Garcia-Ayala J,
Garcia-Ayala A, Mulero V, Meseguer J. Aci-dophilic granulocytes of the marine fish gilt-head seabream (Sparus aurata L.) produce interleukin-1b following infection with Vibrio anguillarum. Cell Tissue Res 2004; 316(2): 189-95.
9. Culling CFA. Handbook of Histopathological Techniques. Culling CFA ed. Second Edi-tion. London: Butterworth Co Ltd, 1963: p. 683.
10. Çağırgan H. A study on diagnosis and treat-ment of bacterial diseases in cultured sea bass (Sparus aurata L.) and sea bream (Dicentrarchus labrax L.), Doktora tezi, Ege Üniv Fen Bilimleri Enstitüsü, İzmir,1993; s. 117.
11. Engelsen AR, Sandlund N, Fiksdal IU, Bergh O. Immunohistochemistry of atlantic cod larvae Gadus morhua expermentially challenged with Vibrio anguillarum. Dis Aq-ua Org 2008; 80(1): 13-20.
12. Grisez L, Chair M, Sorgeloos P, Ollevier F. Mode of infection and spread of Vibrio an-guillarum in turbot Scophthalmus maximus larvae after oral challenge through live feed. Dis Aqua Org 1996; 26(3): 181-87.
13. Knappskog DH, Rødseth OM, Slinde E, Endersen C. Immunochemical analyses of Vibrio anguillarum strains isolated from cod, Gadus morhua L., suffering from Vibriosis. Fish Dis 1993; 16(4): 327-38.
14. Korun J, Timur G. Marine vibrios associated with diseases sea bass (Dicentrarchus labrax) in Turkey. J Fishscicom 2008; 2(1), 66-76.
15. Laurencin, FB, Germon E. Experimental infection of rainbow trout, Salmo gairdneri R., by dipping in suspension of Vibrio an-guillarum: Ways of bacterial penetration; influence of temperature and salinity. Aqua-culture 1987; 67 (1-2): 203-72.
16. Öztay F. The functional morphology of the pulmonary neuroendocrine cells in the lung of larval and adult Rana ridibunda (Amphibia-Anura). IUFS J Biol 2008; 67(2): 145-51.
17. Planas M, Perez-Lorenzo M, Hjelm M, Gram L, Fiksdal IU, Bergh O, Pintado J. Probiotic effect in vivo of Roseobacter strain 27-4 against Vibrio (Listonella) anguillarum infec-tions in Turbot (Scophthalmus maximus L.) larvae. Aquaculture 2006; 255(1-4): 323-33. 18. Timur G, Timur M. eds. Balık Hastalıkları.
İstanbul: İstanbul Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yayını, 2003: s. 519.
19. Toranzo AE, Barj JL. A review of the taxono-my and seroepizootiology of Vibrio anguilla-rum, with special reference to aquaculture in the nortwest of Spain. Dis Aqua Org 1990; 9 (1): 73-82.
20. Toranzo AE, Magarinos B, Romalde JL. A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture 2005; 246 (1-4): 31-67.
Sorumlu Yazar: Prof. Dr. Tülay Akaylı
İstanbul Üniversitesi, Su Bilimleri Fakültesi, Balık Hastalıkları Anabilim Dalı.
İstanbul-TÜRKİYE
Tel: +90 212 4555700 (Dahili: 16473) Fax: 0212-5140369
