Ankara Oniv Vet Fak Derg
42: 373 - 379, 1995
DENİZLİ HOROZU SPERMALARININ FARKLI
SULANDIRıCı VE KRYOPROTEKTANLARLA
DONDURULMASı
Ongun KESKİN. Necmettin TEKİN •• Naflz YURDAYDıN ••• Murat SELÇUK ••••
Freezing of DenizIİ Cock's Semen With Different Diluents and Cryoprotectans
Summary: The aim of this research was to investigate the freezabi/ity of DenizIi cock' s semen using different diluents.
In this experiment, 5Denizli cocks were treated. During the research, se-men was collectedfrom cocks by manual massage method ıwice in a week. The spermatological characteristics of ejaculates which were collected from cocks are as follows: (1) Ejaculate volume averaged 0.8:tO.0 ml., (2) sperm moti/ity 69.0:t4.8 (3) sperm concentration 4.2xJ09Iml:tO.3 (4) percentage of abnormal sperm 7.9:1::1.3%and (5)pH 7.5:tO.I.
Semen from cocks was diluıed by skim milk, BPSV and Ringer. Post-equilibration sperm moti/ity (%)was averaged 50.0:1::5.2,58.0i:4,9, 50.0:t8.2 re-spectivelyfor semen diluıed with skim milk-I, BPSV-I, Ringer-I, 59.0:1::5.0, 60.0£3.0,57.0:1::6.7 respectively with skim milk-2, BPSV-2 and Ringer-2.
Post-thawing sperm motUity (%) was recorded as 29.0i:4.3, 26.0i:4.0, 34.5:£6.1 respectively for semen di/uted with skim milk-I (Glycerol 5%, DMSO 5%), BPSV-I, Ringer-I, 32.0:1::3.6,36.0:1::3.0,4I.0i:4.6 respectively with skim milk-2 (Glycerol5%, DMSO 10%), BPSV-2, Ringer-2.
Post-equi/ibration percentage of abnormal sperm (%) was averaged 39.5:t2.5, 29.0£3.4, 43.6i:4.4 respectively for semen di/uıed with skim mi/k-I, BPSV-I, Ringer-I, 45.0:t2.8, 34.7:1:2.8, 48.0:1::5.1respectively with skim milk-2, BPSV-2, Ringer-2. Post-thawing percentage of abnormal sperm (%) was re-corded as 45.4i:4.4, 55.0:1:2.2, 62.7:1::3.0,respectively for semen diluıed with skim milk-I, BPSV-I, Ringer-I, 51.4:1::3.8,58.2:1::5.5, 73.0i:4.3 respectively with skim mi/k-2, BPSV-2 and Ringer-2.
Özet: Bu çalışma, Denizli ırkı horoz spermalarının farklı sulandırıcılar kullanarak dondurulabUirliğini araştırmak amacıyla yapılmıştır.
Çalışmada Denizli ırkı 5horoz kullanılmıştır. Araştırma süresince sperma-lar masaj yöntemiyle haftada iki kez alınmıştır. Elde edilen, ejakülatsperma-larda, genel ortalamaları saptanan başlıca spermatolojik özelliklerden ejakülat miktarı 0.8:tO.OI ml., spermatozoa motUitesi %69.0:t4.8, spermatozoa yoğunluğu 4.2xJ09Iml.:tO.3, anormal spermatozoa oranı %7.9:1::1.3ve spermanın pH değeri
7.1:tO.1 olmuştur.
Süt-1, BPSV-1 ve Ringer-1 sulandırıcılarıyla ekilibrasyondan sonra ortala-ma sperortala-matozoa motiIitesi (%) sırasıyla 50.0:t5.2, 58.0i:4.9, 50.0:t8.2 olurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 59.0:1::5.0,60.0:1::3.0ve 57.0:1::6.7değerleri saptan-mıştır.
• Dr. A.O. Dölenne ve Sun'j Tohumlama A.B.D .
•• Prof. Dr. A.O. YeL Fak. Dölenne ve Swı'j Tohumlama A.B.D . ••• Doç. Dr. A.O. YeL Fak. Dölenne ve Sun'j Tohumlama A.B.D . •••• Araş. Gör. A.O. YeL Fak. Dölenne ve Sun'j Tohumlama A.B.D.
374 O. KESKİN - N. TEKlN - N. YURDA YDıN - M SELÇUK
Süt-I, BPSV-l ve Ringer-l sulandırıcılarıyla çözüm sonu ortalama sperma-tozoa matilitesi (%) sırasıyla 29.0:1:4.3, 26.0:1:4.0, 34.5:1:6.1 bulunurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 32.0H.6, 36.0H.0 ve 41.0:1:4.6kaydedilmiştir.
Ekilibrasyondan sonra ortalama anormal spermatozoa oranı (%) Süt-I, BPSV-l ve Ringer-l sulandmcılarıyla 39.5:1::2.5,29.03.4,43.6:1:4.4 olurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 45.0:1::2.8,34.7:1::2.8ve 48.0:1:5.1belirlenmiştir.
çözüm sonu ortalama anormal spermatozoa oranı (%) Süt-I, BPSV-l ve Ringer-l sulandırıcılarıyla 45.4:1:4.4, 55.0:1::2.2,62.7İ.3.0 saptanırken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 5l.4H.8, 58.2:1:5.5 ve 73.0:1:4.3bulunmuştur.
Giriş
Son yıllarda dünyada bilimsel ve teknolo-jik gelişmelere paralelolarak tavukçuluk ala-nında da önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Özellikle, 20. yüzyılın onalannda başlatılan horoz spermasının kısa süreli kryopreservasyo-nu çalışmalan ya da dondurolarak uzun süre saklanabilmesi gibi biyoteknolojik yöntemler tavuklarda sun 'i tohumlamanın başanyla uygu-lanmasını saglamıştır.
Türkiye'de gelişmiş ve modem anlamda bir tavukçuluk sektörünün kurulmasına yönelik ilk çalışmalar, 1930 yılında "Tavukçuluk Araş-tırma Enstitüsü"nün kurulması ilc başlatılmıştır. 1960'lı yıllardan itibaren endüstriyel tavukçulu-gon başlamasıyla devlet çiftliklerine yüksek ve-rimli ırklar getinilmiş, Marmara ve Ege bölge-sinde yetiştiricilere dagttılarak tavukçuluk özendirilmiştir. Türkiye 'de ilk yerli hibrit elde eune çalışmalan 1968'de başlatılarak devlet ku-ruluşlannca sürdürülmüş ve günümüzde tavuk-çuluk karlı bir üretim kolu haline gelmiştir.
Tavukçuluktan bagımsız düşünülemeyecek olan horoz yetiştiriciligi de döllü yumuna elde eune yönüyle ayn bir önem taşımaktadır. Ancak, tavukçuluk alanındaki gelişmelere kar-şın, henüz horozlann reprodüktif özelliklerine ilişkin bilgiler yeterli düzeyde değildir. Hatta ülkemize ait bir ırk olan Denizli horozlannda spermanın dondurulması ve dondurulmuş sper-malarla yapılan tohumlarnalardan elde edilen dölverimleri de ortaya konmamıştır.
Bugüne kadar sun'i tohumlama ya da biyo-teknolojik araştırmalar için deneyselolarak zaman zaman sun'i vajen (LO) ve elektroejakü-lasyon (l6) yöntemiyle sperma alınmışsa da gü-nümüzde masaj yöntemi yaygın biçimde uygu-lanmaktadır (18).
Horoz sperması kısa (41) ya da uzun süreli (22) olarak pellet, payet ve ampul biçiminde ba-~anyla saklanabilmektedir (14). Bugüne kadar horoz spermasının saklanmasında Süt, Ringer, BPSV (Blumberger Puterspermaverdünner),
BPSE (Beltsville Poultry Semen Etender), Serum fizyolojik, Lake gibi sulandıncılar kulla-nılmıştır (28). Spermanın dondurulmasında su-landıncının kapsadıgı biyokimyasal maddeler kadar, sulandıncıya kaulan kryoprotektanlann oranlan da önem taşımaktadır. Horoz spermala-nnın uzun süreli saklanmasında spermatozoon-lan soğuk şokuna karşı koruması amacıyla glyserol, DMSO, OMA, ethylene glycol, di-methylformamide gibi kryoprotektanlar tek ba-şına veya birlikte kullanılmaktadır (9). Ancak, yüksek oranlarda kullanılan kimi koruyucular toksik etki göstererek spermatazoa motilitesini düşürürken, kimileri de hücre mambranlanna olumsuz etki yaparak spermatozoa morfolojisi-nin bozulmasına neden olmaktadır.
Değişik kryoprotektanlarla horoz sperma-lanm donduran Schramm (32), çözüm sonu spermatozoa motilitesini glyserolle %13.2-40.2, ethylene glycolle % 18.7-36.3 olarak bulmuştur. Araştıncı, en yüksek spermatozoa motilitesini (%30-40) % ıo-20 ethylene glycolle elde euniş-tir.
Kimi araşuncılar (17, 34), horoz sperması-nın dondurulmasında sulandıncıdaki gIyserol konsantrasyonunun %7 olması halinde en iyi çözüm sonu spermatalojik özellikleri elde ettik-lerini söylerken, kimileri de daha yüksek ya da daha düşük oranlardaki glyserolün sonuçlan de-ğiştirmediğini bildirmişlerdir (33, 40).
Terada ve ark. (35) farklı oranlarda glyse-rol ve DMSO kullanarak horoz spermalannı dondurmuşlar, %7'yi aşan konsantrasyonlardaki kryoprotektanlann spermatozoa motilitesini dü-şürdüğünü, anormal spermatozoa oranını artır-dığını bildirmişlerdir.
Değişik kryprotektanlarla horoz spermala-nm donduran Westfall ve Harris (40) yüksek konsantrasyonlardaki (% 16) glyserolle en yük-sek çözüm sonu spermatozoa motilitesi (%63) elde ettiklerini söylemişlerdir.
Horoz spermalanm %5. Tlik glukoz
DENlZU HOROZU SPERMALARININ FARKl1 SULNDIRIO VE KRYOPROTEKTANLARLA DONDURULMASı 375
Watanabe ve Terada (38) çözüm sonu anormal spermatozoa oranını %8.4~.0 saptamışlardır.
Beş farldı kryoprotektan bulunduran iki ayn sulandıncıyla horoz spermalannı donduran Hübner (14) çözüm sonu %10.6-89.3 arasında ~e~işen anormal spermatozoa oranı kaydeuniş-tır.
Araştıncılar (19, 23) horoz spermalannın saklanmasında sulandıncının pH'sl ve ozmotik basıncının çözüm sonu spermatolojik özellikler-le spermatozoanın fertilizasyon yeteneğini önemli ölçüde etkiledi~ini vurgulamaktadırlar. Horoz sperması için en uygun sulandıncı pH'sınl Bogdonoff ve Schaffner (5), 7.0, Prad-han ve Tomar (30) 6.7-7.0 olarak birbirlerine yakın de~erler bildirmişlerdir. Masuda ve ark. (26) horoz spermasının dondurulması için opti-mum sulandıncı ozmotik basıncını 300-400 mOsm. söylerken, birçok araştıncının da kendi-lerininkine benzer sonuçlar aldıklannı ifade et-mişlerdir (11, 20. 27).
Materyal ve Metod
Çalışmada 48 haftalık Denizli ırkı 5 horoz kullanılmıştır. Araştırmanın başlangıcında ho-rozlor 2 hafta süreyle sperma vermeye alıştınl-mışlardır. Araştırma süresince spermalar masaj yöntemiyle haftada iki kez alınmıştır. Sperma alma yerinde hazırlanan laboratuvarda başlıca sJ?Crmatolojik özellikler yönüyle incelenen eja-kulatlar aynı sperma toplama kadehinde birleş-tirilerek mix ejakülat elde edilmiştir.
Ejakülat miktan (ml), sperma toplama ka-dehinden direkt okunarak belirlenmiştir. Sper-matozoa motilitesi (%) lam ısıuna tablalı Phase Contrast mikroskopta lOx40 büyüunede mua-yene edilmiştir. Spermatozoa yoğunluğu (x 109) 0.01 mL. sperma öme~i 5 mL. Hayem solusyo-nunda sulandınlarak hemositometrik yöntemle saptanmıştır. Anormal spermatozoa oranının de~erlendirilmesi için yaklaşık 0.5 mL. Hancock solusyonunda fikze edilen sperma, mikrosko-bun inmersiyon bakısında incelenerek, normal form dışında yapı gösterenler saptanmıştır. Spermanın pH'sl, renk skalası bulunduran pH metre kullanılarak ölçülmüştür (lO).
Spermalann dondurulması için Süt, BPSV ve Ringer olmak üzere üç ayn sperma sulandın-cısı kullanılmıştır. Kryoprotektan olarak her su-landıncı için %5 glyserol, %5 DMSO ve %5 glyserol, % 10 DMSO oranlan kullanılarak Süt-i ve Süt-2, BPSV-l ve BPSV-2, Ringer-l ve Ringer-2 olmak üzere altı farklı sulandırma grubu oluşturulmuştur.
Spermatolojik özellikleri saptandıktan sonra altı eşit kısma bölünerek elde edilen
split-ejakülatlar yukanda kryoprotektan oranlan ve-nlen sperma sulandıncılanyla bir tohumlama dozunda (0.25) 300xI()6 moill spermatozoa bu-lunduracak biçimde payetlere çekilerek dozlan-mış, buzdolabında +4 .C'da 1 saat ekilibrasyona (Equilibration-Alışım) bırakılmıştır. Ekilibras-yondan sonra spermalar yaklaşık -I20'C daki sıvı azot buhannda 10 dakika bekletilerek don-durulmuş ve sıvı azot içinde -I96.C'da saklan-mıştır.
Ekilibrasyondan sonra her sulandıncı ve kryoprotektan oranı için spermatozoa motititesi ve anormal spermatozoa oranı saptanmıştır.
Dondurulmuş spermalarda ise her sulandı-n.cı ve kryoprotektan oranı için 40.C da 15 sa-nıye~e çözülen payetlerden aynı spermatolojik özellıkler değerlendirilmiştir.
Bulgular
Çalışmada Denizli horozlanna ait başlıca spcrmatolojik özelliklerin ortalama değerleri toplam 5 horozda sırasıyla ejakülat miktannda (ml) O.~İÜ.O. 1.4İÜ.2, 0.6İÜ.0, 0.7İÜ.O ve 0.6:tO.0, spermatazoa motilitesinde (%) n.8B.2, 85.Clt1.7, n.8:t4.0, S2.2:t5.S ve 52.O:t1O.7, spermatozoa yoğunluğunda (x109)
4.lİÜ.3, 4.0:t0.2, 5.IİÜ.4, 4.9İÜ.4 ve 3.0:t0.3, anormal spermatazoa oranında (%) 5.5İÜ.4, 8.7:tl.S, 6.4:t1.4, 4.9:t1.0 ve 14.4~.3 ve sper-manın pH değerinde 7.0:t0.O, 7.1İÜ.1, 7.1İÜ.O, 7.I:tO.I ve 7.1:tO.l bulunmuştur (Tablo 1).
. .:",raştırma süresince elde edilen toplam 47 eJakulana saptanan spcrmatolojik özelliklerin genelortalamalan ise sırasıyla 0.8:tO.0 mL, %69.O:t4.8, 4.2x109jmI.İÜ.3, %7.9:t1.3 ve
7.1:tO.1 olarak kaydedilmiştir.
Süt-I, BPSV -1 ve Ringer-l sulandıncıla-nyla ekilibrasyondan sonra ortalama spermato-zoa motiletisi (X) sırasıyla 50.0:t5.2, 58.Clt4.9, 50.0I8.2 olurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 59.0:t5.0, 60.0I3.0, 57.0:t6.7 saptanmıştır (Tablo 2).
Süt-I, BPSV -1 ve Ringer-I sulandıncıla-nyla çözüm sonu ortalama spermatozoa motili-tesi (%) sırasıyla 29.0I4.3, 26.O:t4.0, 34.5:t6.1 bulunurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ile 32.0I3.6, 36.0:t0.3, 41.0I4.6 kaydedilmiştir (Tablo 3).
Ekilibrasyondan sonra ortalama anormal spermatozoa oranı (%) Süt-I, BPSV-l ve Rin-ger-l sulandıncılanyla 39.5~.5, 29.Clt3.4, ~3.6:t4.4 olurken, Süt-2, BPSV-2 ve Ringer-2 ıle 45.00.8. 34.7:t2.8, 48.0:t5.1 belirlenmiştir (Tablo 2).
376 O. KESKIN - N. TEKIN - N. YURDA YDıN - M SELÇUK
Tablo!' Denizli ırkı horoz ejakü1at1annda ortalama spermatolojik değerler.
HOROZ i 2 3 4 5 Genelortalama
SPERMA X:tsx X:tsx X:tsx X:tsX'
un
n x:tsi"Ejakülat
0.9H).0 1.4:!:O.2 0.6:!:O.0 0.7:!:O.0 0.6:!:O.0 47 0.8:tO.0 miktan (%) c d a b a Spermatozaa 77.81:2.2 8S.O:t!.7 77.8:t4.0 S2.2:tS.S S2.O:t10.7 47 69.0:!:4.8 motiliıesi (%) a c a b b Spermatozaa
4.I:!:O.3 4.0:l:0.2 S.I:!:O.4 4.9:!:O.4 3.0:l:0.3 47 4.2:l:O.3 yoğunluğu (X i0')
b b a a a
Anormal spermatozoa i
oranı (%) S.S:!:O.4 8.7:tI.5 6.4:t 1.4 4.9:t1.0
i
14.4:1:23 47 7.9:t1.3 !a b a a c i
,
pH 7.0:l:0.0 7.I:!:O.01 7.I:!:O.01
i
7. i:!:o. i 7.1 :!:O.i 47 7.I:tO.1 ii
a, b, c, d: P<O.OI Aynı salırda farklı harfleri taşıyan grup ortalamalan arası fark önemi.
Tablo 2. Sulandınlmış horoz spermalannda ekilibrasyondan sonra oıtalama spermatolojik değerler.
SULANDIRICl SÜT-I BPSV-I RINGER-I Geneloıt. SÜT-2 BPSV-2 RINGER.2 Genelort.
SPERMA X:tsx X:tsx X:tsx n ilsx x:tsx mi mx n
mx
Spermatozoa
SO.0:t5.2 S8.O:t4.9 SO.0:!:8.2
i
S2.7:t6.1 S7.0:t6.7motiliıesi (%) 30 S9.0:t5.0 6O.0:t3.0 30 S8.7:t4.9
i
Anormal spermatozoa
39.S:t2.5 29.00.4 43.6:t4.4
oranı ('10) 30 37.4:t3.4 4S.0:!:2.8 34.7:t2.8 48.0:t5.1 30 42.6:t3.6
P >0.05:Grup ortalamalan arası fark önemsiz.
Tablo 3. Dondurulmuş horoz spermalannda çözüm sonu ortalama spermatolojik değerler.
SULANDIRICl SüT.I . BPSV-I RINGER.I GeneIoıt. SOT-2 BPSV.2 m;GER-2 Geneloıt.
SPERMA x:tsx X:!:sx X:ts;( n X:tsx x:tsx mi mx n
mx
Spermatozoa motiliıesi (%) 29.0:!:4.3 26.O:t4.0 34.5:t6.1 30 29.8:t4.8 32.0:t3.6 36.0:t3.0 41.0:!:4.6 30 36.3:t3.7 a b Anonnal spermatozoa 45.4:t4.4 5S.0:t2.2 62.7:t3.0oranı (%) 30 S4.4:t3.2 SI.4:t3.8 S8.2:t5.S 73.O:t4.4 30 SO.9:t4.5
a b
a. b: Aynı satırda farklı halleri taşıyan grup ortalamalan arası fark önemli (P<0.01).
Tablo 4. Denizli ırkı horoz ejakülatlannda ikilibrasyondan sonra ortalama anormal spermatozaa tipleri ve yüzdeleri ('10).
SULANDIRICl SüT-I BPSV.I RINGER.I Genelort. SüT-2 BPSV-2 R1NGER-2 Genelort.
i
SPERMA
mi
tlsx X:l:sx n X:tsx ini mi U:si n X:t:sx ,Akrozom S.3:t1.6 2.6:!:O.7 3.4:t1.0 30 3.8:t1.l l1.9:t1.6 7. 8:t 1.3 8.1:t2.5 30 9.3:t!.8 Baş S.4i:!.3 3.4i:1.I S.3i:1.4 30 4.7i:!.3 3.0:l:0.7 S.a1.7 4.2:tO.9 30 4.al.l orta Kısun 28.2:I:3A 22.2:t4.4 34.Si:4.4 30 28.3i:4.1 28.7:t3.1 21.0:t3.7 3S.7:t5.9 30 28.4:t4.2 Kuynık 0.6:tO.2 0.8:!:O.4 0.4:!:O.2 30 0.6:tO.3 !.4:l:O.6 O.8:tO.5 0.0:l:0.0 30 0.7:tO.4
Çözüm sonu ortalama anannal spennato-zoa oranı (%) Süt-I, BPSV-I ve Ringer-l su-landıncılanyla 45.41:4.4, 55.00.2, 62.71:3.0 saptarurk.en, Süt-2, BPSV-2 ve 51.41:3.8, 58.2J:5.5, 73.O:t4.3 (Tablo 3). Ringer-2 ile bulurunuştur
DENlZU HOROZU SPERMALARININ FARKU SULNDIRICI VE KRYOPROTEKTANLARLA DONDURULMAsı 377
Tablo S.Denizli ırkı horoz ejakülatlannda çözüm sonu ortalama anormal spennaıozoa tipleri ve yüzdeleri (%). SULANDIRICI SOT-I BPSV-I RlNGER-1 Genelort. SOT-2 BPSV-2 RlNGER-2 Genel ort.
SPERMA mx X:tsx
ııSX
n i:l:sx ilsi ilsi ilsx n iLiXAlemzam S.8:I:2.6 4.2:1:2.3 3.4:tO.5 30 S.5:tI.S S.9:t1.7 2I.S:t6.0 10.a1.2 30 13.5:t3.0 Baş IS.7:t2.~ 39.8:t4.3 4.4:tO.9 30 20.0:t2 7 13.O:t3.7 25.O:t5.1 6.9:t1.2 30 IS.O:t3.3 orta Kısım 20.O:t2.1 9.l:t2.S 47.7:tS.3 30 2S.6:t4.4 28.4:t2.2 i L.3:tL.9 SS.8:t5.l 30 3L.S:t3. i Kuynılc 0.9:tO.4 L.9:tO.9 7.2:t7.2 30 3.3:t2.S l.I:tO.4 0.4:tO.2 0.2:t1.3 30 0.6:tO.6
Toplam 5 horozun mix ejakülatlannda anormal spermatozoa tiplerinden akrozom, baş, orta kısım ve kuyruga ait bozukluklann ortala-ma degerleri Tablo 4 ve 5'de verilmiştir.
Tartışma ve Sonuç
Araştırmada, 48 haftalık Denizli ırkı ho-rozlardan ögleden sonralan alınan ejakülatlarda başlıca spermatolojik özellikler değerlendiril-miştir. Tavuklar öğleden sonra geç saatlerde çiftleşme isteği gösterdiklerinden, horozdan spermarun alınması ve sun'i tohu~!ama için en' uygun zaman bu saatlerdir (29). Ustelik öğle-den sonra horozlarda sperma miktan en yüksek seviyeye ulaşır (2l) ve tavuklar öğleden sonra tohumlandığında fertilite daha yüksektir (I5).
Çalışma süresince toplam 47 ejakülatta de-ğerlendirilen başlıca spermatolojik özellikler-den ejakülat miktan, spermatozaa motilitesi, spermatozoa yogunluğu ve anormal spermato-zoa oranı yönüyle horozlar arasında gözlenen farklılıklar önemli (P<0.01) bulunurken, sper-ma pH'sı yönüyle bireylerarası farklılıklar önemsiz (P>0.05 kaydedilmiştir (Tablo 1).
Bu araştırmada saptanan başlıca spermato-lojik özelliklere ilişkin değerler büyük ölçüde fizyolojik sınırlar içinde kalmıştır. Değişik araş-tıncılann ayn ırktan horozlarda (2), farklı amaçlarla (8) yapuklan araştırmalarda elde edi-len benzer (36) ya da değişik (28) sonuçlar ça-lışma koşullarından ileri gelebilecek ve normal sayılabilecek olgular olarak görülmüştür.
Değişik sperma sulandıncılannın benzer spermatolojik özelliklere farklı etkilerinin büyük ölçüde yapılarında bulundurduklan mad-delerden kaynaklandığı, bir ölçüde de sulandın-cılara katılan kryoprotektanlar ve bunlann oran-lannın önem taşıdığı bilinmektedir (l2). Aynca sulandıncının bileşimindeki biyokimyasal mad-deler ve kryoprotektanlar sulandıncının ozmo-tik basıncını ve pH 'sını değiştirmektedir. Horoz sperması çok az şeker içerdiğinden, horoz sper-masının saklanmasında sulandıncıya fruktoz eklenir (6). Bunun yanında sulandıncıda sülfat
iyonlannın bulunması, sulandıncının ozmotik basıncını kontrol eder ve spermatozoanın özel-likle başında oluşabilecek morfolojik değişik-likleri önler. Aynca sulandırcının albumin kap-saması horoz spermatozonun oksijen alımını artınr. Glutamik asit ozmotik basıncı düzenle-yerek spermatozoanın invitro yaşam süresini uzatır ve fertiliteyi olumlu yönde etkiler (23, 30). Kalsiyum iyonlan ise horoz spermatozoası-nın motilitesini düzenlemektedir (I). Sözü geçen biyokimyasal maddeler çalışmada kulla-nılan sulandıncılann bileşiminde bulunmakta-dır.
Horoz spermatozoası için gerekli bu mad-deler sulandıncıda bulunsa bile pH'sı 6.5'dan düşük hiçbir sulandıncı %50 spermatazoa moti-litesini 36.8 saatten fazla koruyamaz. Horoz spermatozoasının saklanmasında en uygun su-landıncı pH'sı 6.7-7.0 ve ozmatik basıncı 300-400 mOsm. olarak saptanmıştır (22, 30). Sunu-lan çalışmada her suSunu-landıncının pH'sl ayn ayn ölçülmüş ve süt sulandıncısı için 6.5, BPSV için 6.7 ve Ringer için 6.5 değerleri saptanmış-tır. Sulandıncılann pH'sı horoz spermasının dondurulması için istenen ölçüıer içindedir.
Çalışmada farklı konsantrasyonlarda glyse-rol ve DMSO bulunduran Süt, BPSV ve Ringer sulandıncılanyla ekilibrasyondan sonra sulandı-nclann ve kryoprotektanlann spermatozoa mo-tilitesi ve anormal spermatozoa oranı üzerine etkisinde gözlenen farklılıklar önemsiz (P>0.05) kaydedilmiştir. Ancak birinci grup su-landıncılarla (%5 glyserol, %5 DMSO), ekilib-rasyondan sonra ve çözüm sonu spermatozoa motilitesi ve anormal spermatozoa oranının ikinci grup suIandıncılardan (%5 gIyserol, %LO DMSO) daha düşük olduğu gözlenmiştir (Tablo 2,3).
Genelolarak spermatozoa anomalilerinin sulandıncının ozmotik basıncındaki değişiklik-lerden kaynaklandığı bilinmektedir. Bununla beraber spermatozoa morfolojisindeki bozuk-luklar daha çok sulandıncının bileşimi, krypro-tektanlann niteliği ve oranı ile ilgilidir. Sperma-tozoanın değişik kısımlannda gözlenen
378
bozukluklara birbirinden ba~ımsız faktörler neden olmaktadır. Horoz spermatozonunun dondurma ve çözme işlemlerine en duyarlı kısmı plazma membranı ile orta kısmıdır ve başlıca bozukluklar plazmalemmada meydana gelir (4, 13). Plazma membranını koruması yö-nüyle glyseroI, di~er kryprotektanlardan DMSO ve ethylene glycole daha üstün bulunmuştur (24). Horoz spermatozoasında meydana gelebi-lecek akrozom bozukluklan, dondurma işlemle-rinin neden oldu~ hasarın bir göstergesidir (39). Akrozom bozukluklan sulandıncıdaki glyserolden kaynaklanan yüksek ozmatik basın-ca ba~ı olarak artmaktadır (3, 25). Bu çalışma-da glyserole ilişkin bir sonuç verememekle bir-likte, DMSO'nun yüksek konsantrasyonlarda kuııanıldı~ı sulandıncılarla daha düşük kon-santrasyonlara göre sırasıyla ekilibrasyon son-rası (%9.3:t1.8 ve %3.8:t1. i) ve çözüm sonu (% 13.5+3.0 ve %5.5:tL.8) akrozom bozuklukla-nnın oldukça yüksek oldu~u gözlenmiştir. Çözüm sonu başa ait bozukluklar ise BPSV-I ve BPSV-2 sulandıncılanyla (%39.8:t4.4 ve %25.0:t5.1) di~er sulandıncılarla karşılaştınldı-~ında daha yüksek çıkmıştır (Tablo 4, 5).
Spermatozaanın orta kısım bozukluklan da kryoprotektanlann değerlendirilmesi için önem-li bir kriterdir (24). Çünkü horoz spermatozoo-nunda tipik anomali orta kısımda gözlenir ve kıvnk boyun olarak adlandınlır (42). Genel ola-rak kıvnk boyunlu spermatozoa oranının artma-sına
Ye
da saklanan spermalarda klorid iyonla-nnın zararlı etkisi neden olmaktadır (7). Kıvnk boyunlu spermatozaa oranının artması, fertilite-nin düşmesine yol açmaktadır (31). Kimi araşu-ncılar (37) spermada kıvnk boyunlu spermato-zoa oranının % 15li geçmemesi halindefertilitenin etkilenmeyece~ini %37'ye çıkması ile dölveriminin düşece~ini söylemişlerdir. Maeda ve ark.. (24) DMSO'nun spermatozoon-da orta kısmı koruması özelliğinin glyserol, methylformamid ve ethylene glycole göre daha zayıf oldu~nu söylemişler ve farklı kryopro-tektanların spermatozaonun değişik kısımlanna farklı koruyucu etki gösterdiğini iddia eunişler-dir. Bu çalışmada da, DMSO konsantrasyonu yüksek (% 10) sulandıncılarla dondurulup çözü-len spermatozoonlardaki orta kısım bozuklukla-n daha yüksek saptabozuklukla-nmıştır. Her iki kryprotek-tan oranı için Ringer sulandıncısı ile orta kısma ait bozukluklann di~er sulandıncılarla karşılaş-tınldıg-ında yüksek olduğu gözlenmiştir. Rin-ger'in seprmatozoonun orta kısmını koruması yönüyle daha zayıf bir sulandıncı olduğu söyle-nebilir. Aynca, birinci grup sulandıncılarla çözüm sonu orta kısım bozukluklan (%25.6:t4.4) ikinci grup sulandıncılara göre (%31.8:t3.1) daha düşük saptanmıştır (Tablo 5).
O. KESKIN. N. TEKIN - N. YURDA YDıN - M. SELÇUK
Bu araştırma ile optimum koşullar sa~an-makla birlikte, horoz spermasının dondurulma-sındaki başanyı, çalışmada kullanılan sulandın-cılann bir ölçüde etkiledi~ ancak, kryoprotektan konsantrasyonlannın daha önem-li oldu~ ortaya konmuştur. Çözüm sonu sper-matolojik özelliklerin değerlendirilmesiyle düşük oranlarda (%5) kullanılan DMSO'nun yüksek (% 1O) konsantrasyonlanna göre daha üstün oldu~ gözlenmiştir.
Kaynaklar
ı. Ashizawa, K., WIshart, G.J. (1986): Fowl sperm moıi. liıy sıinwlaling facıors /aun from seminal plasma and fema. le periloneal fluid /aun aııhe ıime of ovuJaıion. Dev Growth Differ Spp\. 116.
2. Bakst, M.R. (1980). Ferıilizing capaciıy and morphology of fowl and Turuy spermalozoa in hypolonic extender. J Reprod Fenil60: 121.127.
3. Bakst, M.R., Howarth, B. (1977): The effecıofglycerol and iıs removal on cod spermalozoo cOflCanavalin ferriıin bmding si/es. Poull Sci, 56 pp.131 8.1323.
4. Bakst, M.R., Sexton, T.J. (1979): Ferıilizing capacity and uJırasırucıure of fowl and ıuruy spermaıoıoa before and after freezing. J Reprod Fertil, 55: 1.7.
5. Bogdonorr, P.D., Sharner, C.S. (1954): The effeeı of pH on in vilro survival meıabolic acıiviıy and ferıilizing ca. paciıy of chicun semen. Poulı Sci., 33 pp.665-M9.
6. Bootwalla, S.M., Miles, R.D. (1992): Developmenı of diluenlfor domesıicfowl semen. World's Poull Sci 48, July. 7. Chaudhuri, D., Lake, P.E. (1988): A lleW diluenl and
meıhod of holding fowl semenfor up ıo 7 hour aı high ıempe. raıure. 18 ıh World's Poull Congr, Nagoya, 591.593. 8. Davt)'an, A. (1984): Diluıion, sıorage and IrQ/lSpOrl of
cock semen. Pıiısevodsıvo, 7: 23.
9. Dawe, Y.M., Ansah, G.A., MeNlven, M.A., Buck. ia n d, R. B.N. (1986): N., N-d~I.hylaceıa.rnUk as a cryopreservaıive compound for chic/c.en spermaıozoa. in Res Repor Dep Anim Sci McGilI Univ, Montreal. Canada, 45-47. LO. Fomin, A., Scherbatov, V. (1989): Semen colleCled from cocks using an arıificiaf vagina. Pıitsevodstvo, 7:
26-28.
iı. Graham, E.F., Brown, K.I. (1971): Effecı of osmoıic pressun of semen exlenders on ıhe fertility and haıchability of ıuruy eggs. Poull. Sci. 50: 836-838.
12. Günter, A. (1986): Moıililal und Kopflcappenwegriıaı von Dufgeıauıem Kaninchensperma in Vaıer-Söhne-Vergleich. Ti.
eram Hochshule Diss, Hannover.
ı3. Harris, G.C. Jr., Thurston, RJ., Gundall, i. (1973): Changes in ıhe uJıraslruclure of ıhe fowl spermalo. zon due lO rapid freezeıhaw. J Reprod Feıtil, 34: 389-394. ı4. ~~bner, ~. (1990).: !nvesligalions onıhe assesmenl offer.
lilııy followıng Al wııh /rolen fowl and ıuruy ,fUllen. Reihe Agrar. 39: 335.342.
15. Johns.t~n, N.P., Parker, J.~. (~970): Eff.ecı of ıime of ovıpOSlllOn ın relalıon ıo uısenwıaılOll fUlillly of chiCUn hen.r. Poull Sci. 49: 325.327.
16. Kono, K., Hiura, Y. (1983): Semen coUeclion by recıal elecıroejaculaıion in ıhe domesıic fowl. Jpn. Poull Sci 20:
267.270. •
17. Krivtsova, E.B., Otpushchennlkov, V.F. (1983): The
DENlZLl HOROZU SPERMALARININ FARKU SULNDIRlO VE KRYOPROTEKTANLARLA DONDURULMASı 379
of cod: sefMn. ByuIl. Vses, Nauchno-lsslovatel skogo iııs Fiz Biok Pit Sel skok :nıivat. 17: 57-59.
18. Kunev, K., Manolv, 1. (1988):Age and seasonal dyna. mics of UfMn produdwn iii NewHampshiu cocles. ZhivOl'
nov cbıi Naulci25: 18-24.
19. Kurbatav, A.D., Narublna, L.E., Bublyaeva, G.B. and Ivanov, I. (1976):Fruzillg coc/e sperm in liqWd nil-rogen. in vmth Int Congr Anim Reprod Anif Insem, Kra-kow, July, 12.16.
20. Kurbatov, A.D., Voronlna, M.S. (1982):EJJul of hol. dillg and equilibratwn time on sperm molilily and fertilizing ability of jroıen fowl sefMn. Byull Vses Nauchno-Issledovater skogo is Razvedeniya Gen Ser skok ZhivOl, 57: 17.20.
21. Lake, PoE., Wood.Gush, D.G.M. (1956): Diurna/ rhyıms in sefMn yie/ds and maıing behavior in domesıic coclc. NATUA. 178.853.
22 Lake, P.E., Ravie, O. (1979):Effuı on ferıility of slo. ring fowl sefMn for 24 hr aı 5'C in jluids of differefll pH. J Reprod Fenil 57: 149.155.
23. LI, S.R., Graham, E.Fo (1986):EJJecl ofdiffeunııreaı. fMnls on coclc sefMn slored al 5'C.Sci Agri Sin,3: 83.89. 24. Maeda, To, Terada, T. and Tsutsumi, Yo (1984):
Comparaıive sıudy of ıhe eJJuts of \lQrious cryoproıecıanls in presening ıhe morphology of jroun and ıhawed fowl sper. malozoa. Br Poult Sci 25: 547.553.
25. Marquez, B.J., Ogasawara, FoX. (1977):Effuts of glycerol on ıuruy sperm viabi/iıy and fertilizing capacily. Poolt Sci56: 725-731.
26. Masuda, Ho, Soejlma, A. and Waide, Y. (1974):
Sıudy on ıhe dup jruzing preservaıion of ıhe chicken sper. malozoa. Byull Naı Ins Amm !nd,28: 33.40.
27. Nagae, T., Tanaka, K. (1975):Sıorage of fowl semen under reduced pressure. Jpn. Poulı Sci 12: 259.264. 28. Ohara, M., Ozekl, To Tamura, Co Takahashi, To
and Kusakarl, No (1990):EJJects of inseminaıion dose and re.di/uıwn rale on ıhe ferliliıy of fowl semen jroun in Hiroshima di/uefll. Jpn. Poult Sci27: 403.408.
29. Oltlnger, MoA., Schleidt, W.M. and Russek, E.
(1982): Dai/y pa/lerflS in courtship and maling behavwr in the male Japanese quail. Behav Proces. 7: 223.233.
30. Pradhan, P.K., Tomar, N.S. (1987):Presenalwn ofli. quid pou/ıry semen. Indian Vet J,64: 403-407.
31. Saeki, Y. (1960):Crooud.neck.ed spermalozoa in relalwn ıo law fertilily in ıhe artijıcial inseminatwn of fowl. Poult Sci
39: 1354.1361.
32. Schramm, R. (1975):Studies on long.ıerm presenalion of coclc semen of medium.heııvy bruds iiiliquid nilrogen using
ıhe straw method. Monaısh Veterinaerrned 30: 941.944. 33. Schuster, S., Lalblln, C. (1979):Comparalive iIIvesti.
galiofIS on ıhe jruzing of coclc sefMn. Zuchthygiene, 14: 8ı.
34. Terada, T. (1983):Effects of the addilwn of semen p/asma lo a semen di/uefll on post.ıhawing sperm moıi/ity and abnor. maliıies in cocles. Jpn Poult Sci. 20: 15-20.
35. Terada, T. Hashimola, H. Maeda, T. Watanabe, M. and Tsulsumi, Y. (1988):injluence of cryoprOleClafllS concenlraıion on all volume and moıi/ity of jrozen.ıhawed fowl spermalozaa. Jpn. Poult Sci,25: 268.277.
36. Tereschenko, A.Vo, Llnnik, ToP. and Shyrov, V.L.
(1988): The effecı of cryoproteClants on heal absorptwn bya suspeflSion of coclc spermaıozoa. in Sesto prespec raz biOlek zhivOl, Krakow, 21.22sentyabrya.
37. Van Wambeke, F. (1977):The eJJecl oftoxicily of sıorage media for fowl semen on the occurence of Mclc.bending sper-malozoa and hatchaibiJıy. Br Poult Sci, 18: 163.168. 38. Watanabe, Wo, Terada, T. (1976):A new di/uefll for
deep freezing puservaıion of fowl spermalozoa. in VIII the Inı Congr Anim Reprod Anif Insem, Krakow, July, 12.16. 39. Watson, P.Fo Martin, ı.CoA. (1972): Acomparison of
changes in ıhe acrosomes of dup.forezen ram and bu/I sper-ma/ozoa. J Reprod Fenil 28: 99.101.
40. Weslfall, F.D., Harris, G.Co Jr. (1975):The abi/iıy of cryopresenaıives lo prevenl moıi/iıy less andjreeze.ıhaw da. mage ıo Ihe acrosome of chicun spermaıozoa. Cryobiology,
12: 89.92.
41. Wishart, G.J. (1989):Physwlogica/ changes infowl and Turkey spermalozoa during in ııi/ro sıorage. Br Poult Sci, 30:
443-454.
42. Yamane, J., Tsukunaga, S. and Takahashl, T.
(1966): "Hiroshima" melhod of arliftcial inseminaıion of ıhe domesıic fowl. J Fac Fish Anim Husb. Hiroshima Univ 6 pp.
