T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2011/44 Projenin BaĢlığı
METĠLENTETRAHĠDROFOLAT REDÜKTAZ POLĠMORFĠZMĠ BULUNAN HASTALARDA PARAOKSONAZ ENZĠM POLĠMORFĠZMĠNĠN
ARAġTIRILMASI
Proje Yöneticisi Prof. Dr. Ġsa GÖKÇE
Birimi Kimya Bölümü
AraĢtırmacılar ve Birimleri Dr. Leyla AYDOĞAN/ Kimya Bölümü
T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2011/44 Projenin BaĢlığı
METĠLENTETRAHĠDROFOLAT REDÜKTAZ POLĠMORFĠZMĠ BULUNAN HASTALARDA PARAOKSONAZ ENZĠM POLĠMORFĠZMĠNĠN ARAġTIRILMASI
Proje Yöneticisi Prof. Dr. Ġsa GÖKÇE
Birimi Kimya Bölümü
AraĢtırmacılar ve Birimleri Leyla AYDOĞAN/ Kimya Bölümü
ÖZET (*)
METĠLENTETRAHĠDROFOLAT REDÜKTAZ (MTHFR) POLĠMORFĠZMĠ BULUNAN HASTALARDA PARAOKSONAZ ENZĠM POLĠMORFĠZMĠNĠN ARAġTIRILMASI
Bu çalıĢmada Paraoksonaz 1 (PON 1) geninin 55. konumdaki Metiyonin’in Lösin ile (M55L) ve 192. konumdaki Glutamin’in Arjinin ile (Q192R) yer değiĢtirmesi sonucu oluĢan iki polimorfizmin, MTHFR C677T mutasyonu ile arasındaki iliĢkinin araĢtırılması amaçlanmıĢtır. ÇalıĢmada, GaziosmanpaĢa Üniversitesi AraĢtırma ve Uygulama Hastanesine çeĢitli Ģikayetlerle gelmiĢ olan hastalardan MTHFR polimorfizmi görülenlerde PON1 enzim polimorfizminin RT-PCR (Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemi ile tespit edilmesi amaçlanmıĢtır. Bunun için 200 kiĢi kontrol grubu (MTHFR mutasyonu bakımından normal) ve 300 MTHFR mutasyonu görülen hasta grubu (220 kiĢi MTHFR heterozigot, 80 kiĢi MTHFR homozigot mutant) çalıĢmaya alınmıĢtır. PON 55/192 polimorfizmlerinin dağılımı ve bu polimorfizmlerin MTHFR mutasyonu ile iliĢkisi incelenmiĢtir. Genotip tayini, Multipleks PCR yöntemi ile gerçekleĢtirilmiĢtir. ÇalıĢma sonucunda genotip dağılımlarında PON 55 polimorfizmi açısından kontrol ile hasta grubu arasında önemli bir farklılık görülmemiĢtir (p=0.885). PON 192 polimorfizmi açısından kontrol ile hasta grubu arasındaki farklılık homozigot mutant grupta anlamlı bulunmuĢtur (p=0.037). MTHFR normal olan grupta PON 55 polimorfizmi normal, heterozigot ve homozigot kiĢi yüzde oranları sırasıyla 12, 46 ve 42; MTHFR heterozigot olanlarda, 10, 46 ve 44, MTHFR homozigot mutant olanlarda 8, 50 ve 42 olarak tespit edilmiĢtir. MTHFR normal olan grupta PON 192 polimorfizmi normal, heterozigot ve homozigot mutant yüzde oranları sırasıyla 41, 47 ve 12; çalıĢma grubuna alınan MTHFR heterozigot olan kiĢilerde 35, 44 ve 47; MTHFR homozigot mutant olanlarda 50, 34 ve 16 olarak tespit edilmiĢtir. Cinsiyetler arasında PON1 genotiplerinin dağılımı açısından fark görülmemiĢtir. Sonuç olarak, çalıĢma ve kontrol grubunun her ikisinde de PON 55 polimorfizm oranı yakın değerlerde bulunmuĢtur. PON 192 polimorfizm oranı homozigot mutant olanlarda çalıĢma ve kontrol grupları arasında anlamlı bulunmuĢtur. PON 192 polimorfizmi heterozigotlarda, wild type ve homozigot mutant gruba göre daha yüksek olduğu görülmüĢtür.
2011, 40 sayfa
Anahtar Kelimeler: MTHFR, PON, Polimorfizm, Multipleks PCR, Real-Time PCR (*) Bu çalıĢma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu
ABSTRACT
RESEARCH OF PARAOXONASE ENZYME POLYMORPHISM IN PATIENT WITH METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE (MTHFR) POLYMORPHISM
Aim of the present study was to investigate the association between MTHFR C677T mutation and two polymorphisms involving methionine-leucine substitution in position 55 (M55L) and methionine-arginine substitution in position 192 (Q192R) in Paraoxonase 1 (PON 1) gene. In the present study, patients with MTHFR polymorphism, who applied to GaziosmanpaĢa University Research and Education Hospital with different complaints, were studied for PON1 polymorphism using Real-Time PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction). A control group of 200 people (normal for the MTHFR mutation) and a patient group of 300 people with MTHFR mutation (220 heterozygous and 80 homozygous mutant) were studied. Distribution of PON 55/192 polymorphisms and association of these polymorphisms with MTHFR mutation were studied. Genotype determination was performed by multiplex PCR method. Based on the results, there was no difference (p=0.085) between control and patient groups for PON 55 genotype distributions. On the other hand, there was a significant difference for PON 192 polymorphism between control and patient groups in homozygous mutant group (p=0.037). Percentages of individuals who were normal, heterozygous and homozygous mutant for PON 55 were 12, 46 and 42 in MTHFR normal group, 10, 46 and 44 MTHFR heterozygous group and 8, 50 and 42 in MTHFR homozygous mutant group, respectively. Percentages of normal, heterozygous and homozygous mutant for PON 192 polymorphism were 41, 47 and 12 in MTHFR negative group; 35, 44 and 47 in MTHFR heterozygous group and 50, 34 and 16 in MTHFR homozygous mutant group, respectively. There was no difference between the sexes in terms of the distribution of PON1 genotypes. In conclusion, polymorphism ratio for PON 55 polymorphism was similar in control and study groups. However, PON 192 polymorphism ratios were statistically different between study and control groups in homozygous mutant group. PON 192 polymorphism ratios were higher in heterozygous individuals compared to normal and homozygous mutant ones.
2011, 40 pages
ÖNSÖZ
Bu çalıĢmada, GaziosmanpaĢa Üniversitesi AraĢtırma ve Uygulama Hastanesine çeĢitli Ģikayetlerle gelmiĢ olan hastalardan MTHFR polimorfizmi görülenlerde PON1 enzim polimorfizminin RT-PCR (Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemi ile tespit edilmesi amaçlanmıĢtır. Bunun için 200 kiĢi kontrol ve 300 kiĢi hasta grubu olarak toplam 500 kiĢiden gerekli izinler alınarak çalıĢmaya dahil edilmiĢtir. Paraoksonaz 1 (PON 1) geninin 55. ve 192. konumda oluĢan iki polimorfizmin, MTHFR C677T mutasyonu ile arasındaki iliĢkinin araĢtırılması amaçlanmıĢtır.
Bu çalıĢmaya proje desteği sağlayan GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonuna (Proje No: 2011/44), çalıĢmalarımda yardımlarını esirgemeyen, yönlendiren danıĢman hocam sayın Prof. Dr. Ġsa Gökçe’ye, doktora eğitimimin ve meslek hayatımın her aĢamasında bilgi ve tecrübesiyle her zaman beni destekleyen, yanımda olan ve çalıĢmalarım için gerekli ortamı ve imkanları sağlayan Tıbbi Biyokimya Bölümü değerli öğretim üyeleri, sayın Prof. Dr. ġemsettin ġahin'e ve sayın Doç. Dr. Hüseyin Özyurt'a, teĢekkürlerimi sunarım.
Leyla AYDOĞAN Aralık, 2011
ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ ... iii SĠMGE ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ ... v ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... vi ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... vii 1. GĠRĠġ ... 1 2.2. GENEL BĠLGĠLER ... 3
2.1. Paraoksonaz-1 (PON1) Proteini..…... 3
2.2. Paraoksonazın Yapısı ve Özellikleri ... 4
2.3. PON1’in Yapısı ... 5
2.4. PON1 Gen Polimorfizmi ... 6
2.5. PON1- HDL ĠliĢkisi ... 8
2.6. PON Enzimi ve Hastalıklarla ĠliĢkisi ... 8
2.7. Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) Enzimi ... 9
2.7.1. MTHFR Geni ... 10
2.6.2. MTHFR C677T Gen Polimorfizmi ... 11
2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ... 12
2.8.1. Gerçek Zamanlı PCR (Real-Time PCR) ... 13
2.8.2. Multipleks PCR ... 13
2.8.3. Lightcycler Cihazında Kullanılan Hibridizasyon Probları Ġle PCR’nin Takibi ... 14
2.8.4. Erime Eğrisi (melting curve) Analizi ... 15
3. MATERYAL ve YÖNTEM... 17
3.1. Örneklerin Seçimi ve Tanımı ... 17
3.2. PON1 Enzimine Ait Primer ve Prob Tasarımı ... 17
3.3. PON1 Gen Polimorfizminin Real-Time PCR Hibridizasyon Problu Yöntemi ile LightCycler 480 II Cihazında Saptanması ... 18
3.4. PON1 Enzim Polimorfizmi Ġçin Uygulanan Real-Time PCR Protokolü... 19
3.5. Real-Time PCR Sonuçlarının Değerlendirilmesi ... 19
3.6. Ġstatistiksel Yöntemler 19 4. BULGULAR ... 20
4.1. Kontrol ve ÇalıĢma Grubunun KarĢılaĢtırmalı Analizi ... 27
SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ Simgeler Açıklama µl Mikrolitre bp baz çifti mM Milimolar ng Nanogram U Ünite Kısaltmalar Açıklama PON Paraoksonaz MTHFR Metilentetrahidrofolat redüktaz PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
Real-Time PCR Real time polimeraz zincir reaksiyonu HDL Yüksek dansiteli lipoprotein
LDL DüĢük dansiteli lipoprotein
E.C. Enzim kod numarası
FRET Fluoresance Resonance Energy Transfer dNTP Deoksi nükleosid trifosfat
EDTA Etilendiamin tetraasetik asit
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
Sayfa
ġekil 2.1. Ġnsan Serum Paraoksonaz Enziminin Yapısı ………... 6
ġekil 2.2. PON 1, PON 2 ve PON 3 genlerinin insan 7. kromozomu q21. ve q22. bantları üzerindeki yerlerinin gösterimi ………... 6
ġekil 2.3. PON1 enzimi promoter bölgesi ve polimorfizmleri ……… 7
ġekil 2.4. MTHFR geninin insan 1. kromozomu üzerindeki yerinin gösterimi... 10
ġekil 4.1. PON 55 kodonuna ait erime eğrisi (melting curve) ……… 20
ġekil 4.2. PON 55 kodona ait erime piki (melting peak) ………... 20
ġekil 4.3. PON 192 kodonuna ait erime eğrisi (melting curve) ……….. 21
ġekil 4.4. PON 192 kodonuna ait erime piki (melting peak) ……….. 21
ġekil 4.5. PON 55 polimorfizmine ait genotip dağılımları grafiği ……….. 22
ġekil 4.6. PON 55 polimorfizmine ait grupların genotip dağılımları grafiği... 23
ġekil 4.7. PON 192 polimorfizmine ait genotip dağılımları grafiği ……… 24
ġekil 4.8. PON 192 polimorfizmine ait grupların genotip dağılımları grafiği... 25
ġekil 4.9. PON 55 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılım grafiği ... 26
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Sayfa Çizelge 3.1. LightCycler’da PON1 55 ve 192 genotiplerinin melting point
analizleri için kullanılan PCR Ģartları ... 18
Çizelge 4.1. PON 55 polimorfizmine ait genotip dağılımları ... 21
Çizelge 4.2. PON 55 polimorfizmine ait gruplar arası genotip dağılımları ... 22
Çizelge 4.3. PON 192 polimorfizmine ait genotip dağılımları ... 23
Çizelge 4.4. PON 192 polimorfizmine ait gruplar arası genotip dağılımları ... 24
Çizelge 4.5. PON 55 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılımı ... 25
1. GĠRĠġ
Paraoksonaz/Arilesteraz (PON1) enzimleri karaciğer tarafından sentez edilen glikoprotein yapısında olup, aromatik karboksilik asit esterlerini hidroliz eden ve HDL'ye sıkıca bağlı esterazlardır (Mackness ve ark., 1991a). PON’un fizyolojik fonksiyonlarına yönelik çalıĢmalar, plazma içerisinde yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) yapısında bulunduğunun belirlenmesinden sonra giderek artmaktadır. PON, organofosfat bileĢiklerinin hidrolizini katalizlediğinden; toksikolojik çalıĢmalar için ve invivo ksenobiyotik metabolizması için büyük önem taĢımaktadır. Ayrıca PON’un lipid ve lipoprotein metabolizmasıyla iliĢkisi, peroksidatif hasara karsı antioksidan özellikleri, kardiyovasküler fizyolojideki yeri son dönemlerde yoğun bir Ģekilde araĢtırılmaktadır. LDL’nin oksidasyonunu azalttığı ve lipid peroksitlerinin birikimi sırasında HDL'nin bu enzimatik mekanizmalarla lipid peroksitlerini azalttığı pek çok çalıĢma ile ortaya konulmuĢtur (Mackness ve ark., 1993a; Watson ve ark., 1995; Aviram ve ark., 1998a).
Ġnsan serumundan saflaĢtırılan Paraoksonaz (PON1), minimum 43 kDa moleküler ağırlığı olan bir glikoproteindir (Primo- Parmo ve ark., 1996; Mackness ve ark., 1993b). Paraoksonazın antioksidan özelliği, lipit peroksitlerinin aterojenik etkilerini nötralize eder ve hücre membranlarını koruyucu etki gösterir. ÇalıĢmalar, paraoksonaz enzim aktivitesinin; ailesel hiperkolesterolemi, miyokard enfarktüsü, diyabet ve kronik renal bozukluklarda azaldığını göstermiĢtir (Mackness ve ark., 1993b; Mackness ve ark., 1997; Heijmans ve ark., 2000; Lee ve ark., 2001). Ġnsan serum PON enziminin iki genetik polimorfizmi bulunmaktadır. Bu iki polimorfizm 55. ve 192. pozisyonlardaki aminoasitlerin değiĢimi ile ortaya çıkar.
Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) vücutta birçok metabolik reaksiyonlarda yer almaktadır. Homosisteinin metiyonine dönüĢümü, pürin-primidin sentezi (DNA ve RNA biyosentezi) ve metilasyon reaksiyonlarının içerisinde bulunan MTHFR enzimi, önemli bir kavĢak noktasında görev yapmaktadır (Rozen R., 2003). MTHFR polimorfizminin pozitifliği kardiyovasküler, nörovasküler hastalıklara, kolesterol oluĢum mekanizmasında rol alması nedeniyle hiperkolesterolemi sonucu ateroskleroza, trombozis nedeniyle
düĢüklere neden olmaktadır. Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR), sistein metabolizmasının bir yan ürünü olan homosistein yıkımında önemli rol oynayan bir enzimdir. Yüksek homosistein seviyeleri, miyokardiyal enfarktüs riskinde yükselme ile iliĢkilendirilir. Homozigot sistathionin-B-sentaz (cBS) ya da metilen tetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) eksikliği Ģiddetli hiperhomosisteinemi nedenidir ve mental retardasyon, iskelet anomalileri, prematür vasküler hastalık ya da tromboz ile sonuçlanabilir (Rees ve Rodgers, 1993).
MTHFR gen polimorfizmlerinin hiperhomosisteinemi ile yakın iliĢkili olduğu gösterilmiĢ olup en iyi tanımlanmıĢ polimorfizmler; 677C>T mutasyonu ve 1298A>C mutasyonudur. 677C>T mutasyonu sonucu, MTHFR’ nin katalitik bölgesinde Alanin aminoasidi Valin amino asidine dönüĢür. Bu baĢkalaĢım, enzimi ısıya duyarlı hale getirir ve in vitro koĢullarda MTHFR aktivitesi homozigot mutant ve heterozigotlarda azalır (Frosst ve ark., 1995). C677T alleline homozigot mutant formda sahip olan bireylerde plazma homosistein düzeyi orta Ģiddette artar. Bu özellikle folat yetersizliği dönemlerinde önemlidir (Isotalo ve ark., 2000).
Paraoksonaz ve MTHFR polimorfizmleri ile ilgili literatürde yapılmıĢ çalıĢmalar bulunmaktadır fakat bu iki polimorfizmin bir arada bulunduğu ve birbiriyle ilgisini gösteren çalıĢmalar sınırlı sayıdadır (Zuliani ve ark., 2001; Sass ve ark., 2004). Biz de çalıĢmamızda MTHFR mutasyonu ile paraoksonaz polimorfizmi arasındaki iliĢkinin varlığını ve geliĢen hücre yıkımı nedeniyle görülen bu patolojilerde paraoksonazın koruyucu özelliğinin olup olmadığını araĢtırmayı amaçladık.
Tez çalıĢmasında GaziosmanpaĢa Üniversitesi AraĢtırma ve Uygulama Hastanesine çeĢitli Ģikayetler ile gelmiĢ olan hastalardan MTHFR Polimorfizmi tespit edilmiĢ olanlarda PON1 enzim polimorfizminin Real Time-PCR (Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemi ile tespit edilmesi amaçlanmaktadır. Kontrol grubu olarak da MTHFR Polimorfizmi homozigot wild type bulunan kiĢiler çalıĢmaya alınarak karĢılaĢtırma yapılması amaçlanmaktadır.
2. GENEL BĠLGĠLER
2.1. Paraoksonaz-1 (PON1) Proteini
Paraoksonaz (PON), arilesteraz (E.C. 3.1.1.2) ve paraoksonaz (E.C.3.1.8.1) aktivitesine sahip, kalsiyum bağımlı glikoprotein yapısında olan bir ester hidrolazdır (Durrington ve ark., 2001). Enzimin paraoksonaz olarak adlandırılması, paraokson, metil paraokson ve klormetil paraoksona yüksek derecede seçicilik göstermesinden dolayıdır (Mackness ve ark.,1985).
Yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde (HDL) bulunan, kalsiyuma bağımlı bir ester hidrolaz olan PON1 enzimi karaciğerde sentezlenmektedir (Antikainen ve ark., 1996). Paraoksonaz, önceden organofosfat bileĢiklerini hidroliz etme özelliği nedeni ile toksikoloji alanında çalıĢılmıĢ, antioksidan etkileri nedeni ile Koroner Kalp Hastalığı riskinden korunulabileceği düĢünülerek son zamanlarda güncellik kazanmıĢtır (Azarsız, 2000).
Ġlk olarak 1953 yılında Aldridge (1953) tarafından p-nitrofenil asetat, propiyonat ve bütiratı hidroliz eden A-esteraz olarak teĢhis edilmiĢ olan Paraoksonaz, 1961’de Uriel tarafından insan serumunda elektroforezden sonra HDL immunopresipitatlarında saptanmıĢtır, ancak onlar PON1'in HDL'nin bileĢeni olduğunu belirleyememiĢlerdir (La Du, 1992). Mackness ve arkadaĢları tarafından HDL-kolesterol ayırımı yapılırken lipoprotein fraksiyonunda arilesteraz aktivitesine rastlanmıĢtır (Mackness ve ark., 1985). Ġnsan serum paraoksonazının genetik olarak saptanması 1973'te bir grup Alman araĢtırıcı tarafından yapılmıĢtır (Geldmacher-von Mallinckrodt ve ark.,1973). Paraoksonazın toksik olan organofosfatlar üzerine etkisi incelenmiĢ ve saflaĢtırılması yapılmıĢtır (Brophy ve ark., 2001).
PON1 aktivitesinin HDL ile sıkı fiziksel ilĢkisi Apolipoprotein A1 partikülleri içermesinden dolayıdır ve aynı zamanda katalitik bölgesi LDL oksidasyonuna karĢı enzimatik koruma sağlar (Aviram ve ark., 1998b). insan serumunun saflaĢtırılması iĢleminde apo A1'in uzaklaĢtırılmasının zor olması Apo A1 ile PON1 'in yakın iliĢkili olduğunu göstermiĢtir (La Du ve Novais, 1989). PON1'in oldukça hidrofobik N-terminal ucu onu HDL lipitllerine bağlarken LDL ve VLDL'ye bağlamaması apo
A1'den dolayı olabileceğini düĢündürmektedir (Mackness ve ark., 1998b). Ġmmünoafinite kromatografisi kullanılarak yapılan deneyler, insan PON1 enziminin apo A1 ve klusterin ile iliĢkili olduğunu ve total HDL’nin bir bölümünü oluĢturduğunu göstermiĢtir (Blatter ve ark.,1993; Kelso ve ark., 1994).
2.2. Paraoksonazın Yapısı ve Özellikleri
Ġnsanda 7. kromozomun uzun kolunda q-21.3 ve q-22.1 arasında yerleĢmiĢ paraoksonaz gen ailesinin bilinen PON1, PON2 ve PON3 olarak adlandırılan 3 üyesi bulunur (Primo-Parma ve ark., 1996). Memeliler arasında; nüklelotid seviyesinde benzerlikleri %81-91 iken aminoasit seviyesindeki benzerlikleri yaklaĢık olarak %60 ve nükleotid seviyesinde yaklaĢık %70 özdeĢlik gösterir (Primo-Parma ve ark., 1996; La Du, 1999). Her üç proteinin dokulardaki ekspresyonları, dağılımları birbirinden farklıdır (Mackness ve ark., 1998a).
Kanda HDL ile birlikte bulunan PON1'in karaciğer tarafından üretildiği ve kana verildiği düĢünülmektedir. ÇeĢitli insan ve tavĢan dokusu Northern blot analizi ile incelendiğinde saptanabilir PON1 mRNA'nın sadece karaciğerde olduğu belirlendi (Hassett ve ark., 1991). Enzim aktivitesinin ve konsantrasyonunun PON1 geninin polimorfizmiyle birlikte diyet, yaĢam biçimi, sigara içimi ve çeĢitli hastalıklardan etkilendiği gösterilmiĢtir (Mackness ve ark., 1991b).
PON1, insan serumunun ksenobiotikleri hidrolize etme kapasitesinin varlığı nedeniyle uzun zamandır çalıĢılmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalıĢmalarda PON1'in fizyolojik substratlarını bulmak ve aterosikleroz ile iliĢkisini araĢtırmak amaçlanmıĢtır (Mackness ve ark., 2002). PON2 ve PON3 ancak son zamanlarda araĢtırma konusu olmuĢtur ve halen PON1 kadar iyi anlaĢılamamıĢlardır (Mackness ve ark., 2002).
PON1 ve PON3 genleri karaciğer ve plazmada yoğun olarak bulunurken, PON2’nin karaciğer, böbrek, kalp, beyin, testis dokularında ve endotel tabakasında bulunduğu çeĢitli yöntemlerle gösterilmiĢtir (Mazur, 1946).
Genetik faktörler ve çeĢitli çevresel faktörler PON ekspresyonunu ve aktivitesini düzenler. PON1 aktivitesi bireyler arası (10 kattan 40 kata kadar) ve etnik gruplar arası farklılık gösterir. Cinsiyete bağlı değiĢiklik gözlenmez (Fere ve ark., 2003).
2.3. PON1’in Yapısı
Paraoksonaz gen ailesi; PON1, PON2 ve PON3 olmak üzere bilinen üç üyeye sahiptir. PON1 ile PON2 ve PON3 karĢılaĢtırıldığında 7. ekzonda kodlanan 105 aminoasit içinde üç nükleotid rezidüsüyle ayrılır (Michael ve ark., 2000; Liang, 2003).
PON1, minimum 43 kDa ağırlığında, 354 aminoasitten oluĢan, insan serumundan saflaĢtırılan bir glikoproteindir. Ġzoelektrik noktası 5.1’dir. Dört farklı konumda proteine bağlı karbohidrat üniteleri (total ağırlığın %15.8’i) bulunur (Durrington ve ark., 2001). Potansiyel karbohidrat zincirleri ve amino terminal ucunda hidrofobik baĢ gösterilmiĢtir (La Du ve ark., 1999) (ġekil 2.4). Yapıda yer alan sistein artıkları, PON1’in yapısal ve fonksiyonel özelliklerine katkıda bulunmaktadır. Protein yapısında bulunan tek disülfid bağı 42 ve 353. konumlardaki sisteinlerin bağ yapması ile oluĢur ve polipeptid zincirinin siklik yapıda olmasına neden olur. Yapıda bulunan üç sistein aminoasidinden 283’teki serbest halde bulunur (Sorenson ve ark., 1995). Sisteinler esteraz aktif merkezinin anahtar bileĢeni olmasını sağlamıĢtır. Bu da enzim aktivitesinin sülfhidril bileĢikleri ile inhibe olmasını sağlar ve bu inhibisyon sistein ile geri döner. Bu durum PON1’in antioksidan kapasitesinin serbest tiyol gruplarıyla orantılı olduğunu göstermektedir (Jaouad ve ark., 2006).
PON1'de bulunan iki aminoasit polimorfizminden biri 55. pozisyonda (metionin/lösin, M/L) diğeri ise 192. pozisyonda (arjinin/glutamin, R/Q) polimorfizmleridir (Adkins ve ark., 1993) (ġekil 2.1). PON1' de bulunan hidrofobik bölge, HDL lipidlerine kolayca bağlanmayı sağlamaktadır (BaĢkol ve Köse, 2004).
ġekil 2.1. Ġnsan Serum Paraoksonaz Enziminin Yapısı (Solak, 2007) 2.4. PON1 Gen Polimorfizmi
Paraoksonaz gen familyasında bulunan her üç gen de (PON1, PON2 ve PON3) 7. kromozom üzerinde lokalizedir (ġekil 2.2). PON1 7. Kromozomun uzun kolunda, 21. gen bölgesinde (7q21.3) yerleĢmiĢtir (Mackness ve ark., 2002).
Kromozom 7 - NC_000007.13, yer: 7q21.3
ġekil 2.2. PON 1, PON 2 ve PON 3 genlerinin insan 7. kromozomu q21. ve q22. bantları üzerindeki yerlerinin gösterimi (Anonim, 2011a)
PON1'de gözlenen iki yaygın polimorfizm, 55. kodonda metionin (M) ile lösinin (L) yer değiĢtirdiği (M/L 55) ve 192. pozisyonda glutamin ile argininin yer değiĢtirdiği (Q/R 192) polimorfizmidir (Jay ve Aldons, 1998; Schmidt ve Schmidt, 1998) (ġekil 2.7). Her iki polimorfizmin tespit edilmesi restriksiyon endonükleazlar ile gerçekleĢtirilmektedir (Humbert ve ark., 1993). PON1 gen polimorfizmleri; 55. kodondaki metiyonin/lösin
değiĢiminde A→T baz değiĢimi ve 192. kodonda glutamin/arjinin değiĢiminde A→G değiĢimi ile oluĢmaktadır (Humbert ve ark., 1993; Primo-Parmo ve ark., 1996).
PON1 M/L55 ve Q/R192 kodlanma bölgesindeki polimorfizmlerinden baĢka PON1’in promoter bölgesinde de en az beĢ polimorfizm daha belirlenmiĢtir. Bu polimorfizmler B107/B108 (C/T), B126 (C/G), B160/B162 (A/G), B824/B832 (A/G) ve B907/B909 (C/G) bölgelerde bulunmaktadır (ġekil 2.3) (Brophy, 2001). PON1 genindeki bu promotor polimorfizmlerinin gen ekspresyonu ve enzimlerin serum düzeyleri üzerinde önemli etkisinin olduğu bulunmuĢtur (Liang, 2003; Leviev ve James, 2000).
ġekil 2.3. PON1 enzimi promoter bölgesi ve polimorfizmleri (dokuz adet ekzon (E1-E9)) (Brophy, 2001)
PON1’in hidrolitik aktivitesini değiĢtiren M/L55 ve Q/R192 polimorfizmlerin, lipid peroksidasyonunu etkilediği çeĢitli çalıĢmalarda gösterilmiĢtir (Aviram ve ark., 1998a; Mackness ve ark., 1998). PON1’in 55. pozisyonda metionin yerine lösin gelmesinin aktivite üzerine etkisinin çok fazla olmadığı bildirilmiĢtir 192. pozisyondaki arjinin yerine glutamin gelmesi ise aktiviteyi 9 kat azaltmaktadır (Mackness ve ark., 2004). Kodlayan bölgedeki ikinci polimorfizm olan M/L 55 polimorfizmi, PON 1 enzim aktivitesini,Q/R 192 polimorfizminden bağımsız olarak etkilemektedir. Substrat olarak paraokson kullanıldığı zaman, L55 taĢıyan allozimin M55 taĢıyan allozime göre daha yüksek aktiviteye sahip olduğu bildirilmiĢtir (Blatter ve ark., 1997). M/L polimorfizmi aynı zamanda karaciğerdeki enzim ekspresyonunu etkileyerek serumdaki PON1 enzimin yoğunluğunu değiĢtirmektedir (Baltter ve ark., 1997). L55 alleli M55 alleline
göre daha çok eksprese olmakta ve L55 alleli taĢıyan bireylerin serumlarında PON 1 yoğunluğu daha yüksek olmaktadır (Leviev ve ark., 2001). PON 1 enzim aktivitesinin aynı genotipe sahip bireylerde 13 kata varan farklılıklarda görülmesi, bireyler arasındaki farklılıklardan kaynaklanır.
2.5. PON1- HDL ĠliĢkisi
PON1 için serum vektör olan HDL, muhtemel enzim konsantrasyonu belirtecidir. HDL eksikliği olduğu durumlarda PON1 konsantrasyonun da düĢmesi bunun bir göstergesidir (James ve ark., 1998). PON1'de, apoAI ve apoAII içeren parçacıklar olmasına rağmen PON1'in büyük bir kısmı, HDL ile iliĢkili apoAI içerir (Blatter ve ark., 1993). PON1'in HDL’ye bağlanma eğilimi hem in vivo hem de in vitro ortamda diabet gibi HDL’nin azaldığı hastalıklardaki değiĢimini büyük oranda açıklayabilir (Deakin ve James, 2004). PON1, HDL ile fosfolipidlerden ayrılarak membrana bağlı fenilasetata etki göstermektedir. HDL’nin belirmesiyle bu etki ortadan kaybolur. Bu da HDL’nin PON1’i hücre membranından ayırabildiğini gösterir (Deakin ve James, 2004).
PON1'in mutant N-terminal ucu HDL'ye bağlanamamaktadır. Bu da PON1'in HDL'ye mutant N-terminal ucu ile bağlandığını göstermiĢtir (Sorenson, 1999). HDL veya fosfolipit ile iliĢki enzimatik fonksiyon için önemli olabilir. Üç boyutlu yapısı hakkındaki tahminler PON1'in HDL'ye bağlanmasının aktif bölgeyi özellikle de etkin bir site kapağının bir parçası olarak olan HDL-ankor bölgesini değiĢtirebildiğini göstermiĢtir (Harel ve ark., 2004).
PON1’in hücre membranının dıĢ yüzeyinde bulunduğu ve HDL yaklaĢınca lipoproteinler vasıtasıyla HDL’ye geçtiği belirtilmiĢtir (Deakin ve James, 2004).
2.6. PON Enzimi ve Hastalıklarla ĠliĢkisi
PON, HDL'ye bağlı olup, kalp damar hastalıkları ile iliĢkili olup enzim aktivitesinin diğer hastalıklarla da iliĢkili olduğu tespit edilmiĢtir. Diyabetis Mellitus (DM), hiperkolestrolemi, böbrek yetmezliği gibi KKH ile iliĢkisi olduğu bilinen hastalıklarda düĢük serum PON1 aktivitesinin genotipten bağımsız olduğu çeĢitli çalıĢmalarda rapor edilmiĢtir. PON1-192RR ve PON1-55LL genotipleri non-independent DM olgularda daha sık izlenmiĢtir (James ve ark., 2000).
PON1 düzeyinin; sigara içenlerde, hiperkolesterolemide, ileri yaĢta, obezitede, menopozda ve böbrek yetmezliklerinde azaldığı ortaya konulmuĢtur (Özkan ve ark., 2004). Yüksek oksidatif stres ve koroner kalp hastalığı ile bağlantılı olan kronik böbrek yetmezliği, PON1, katalaz ve süperoksit dismutaz antioksidant enzimatik aktivitelerinin yetersizliğinden dolayı görülmektedir. Organofosfat bileĢiklerinin çoğu nörotoksiktir. PON1 enzimi, organofosfat ve lipit peroksitlerini detoksifiye edebilme özelliğinden dolayı Alzheimer ve Parkinson gibi nörolojik hastalıkların saptanmasında anahtar element haline gelmiĢtir (Tomás ve ark., 2004).
PON1 promotör bölgesinde rastlanan polimorfizmlerin de enzimin aktivitesi, antioksidan kapasitesi ve DM ile iliĢkisi olabileceği bildirilmektedir (Ekmekçi ve ark., 2004). Polimorfizmlerden -907. konumda GG homozigot mutant bireyler retinopati geliĢimine karĢı korunmuĢ bulunurken -1074 GG ve -162 AA genotipli bireylerin yüksek mikroalbuminüri riski altında oldukları bulunmuĢtur (Hofer ve ark., 2006). Antikardiolipin antikorları pozitif bulunan bir grup hastada mmLDL’ye karĢı otoantikorların arttığı, PON1 aktivitesinin belirgin olarak düĢtüğü ve arteriyel tromboz geliĢtirme riski yüksek olan R genotipinin de artma eğiliminde olduğu izlenmiĢtir (Delgado ve ark., 2003).
2.7. Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) Enzimi
Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) enzimi; 5,10 Metilen Tetrahidrofolat (MTHF)’ın 5 Metil Tetrahidrofolat (THF)’a dönüĢümünü katalize eden bir enzimdir (Schwahn ve Rozen, 2001). 5,10-metilentetrahidrofolat redüktaz enzimi, bir flavoprotein olarak MTHFR familyasının (EC 1.5.2.20 ) bir üyesidir (Fodinger ve ark., 2000). MTHFR’ın yapısı ile ilgili ilk bilgiler, karaciğer enziminin saflaĢtırılması sonucu elde edilmiĢtir (Goyette ve Rozen, 2000; Rozen, 2003; Sibani ve ark., 2000).
MTHFR, folat metabolizmasında önemli rol oynayan bir enzimdir. Folat ise homosisteinin metilasyonu ve nükleotid sentezi gibi pek çok biyokimyasal yolda görev yapan, bir vitamindir (Roiben ve Ulrich, 2003). Enzim sitoplazmik bir enzimdir ve iki alt birimden oluĢan homodimer yapıdadır. Yapılan Western Blot analizleri sonucunda insanlarda 2 izoformu bulunduğu açıklanmıĢtır. Bu izoformlar dokulara özgüdür. 70 kDa’luk küçük alt birimlere sahip izoform karaciğerden izole edilirken, 77 kDa’luk
büyük alt birimlere sahip izoform ise diğer dokulardan izole edilmiĢtir (Homberger ve ark., 2000; Rozen, 2003). Enzim tripsinle proteolize uğratıldığında, 77 kDa’luk alt birim 40 kDa ve 37 kDa’luk iki kısma ayrılmaktadır (Rozen, 2003; Sibani ve ark., 2000). Bu ayrılma sonucunda S-adenozil metiyonin (SAM) inhibisyonu ortadan kalkmakta fakat enzimin katalitik aktivitesi değiĢmemektedir. Yapılan çalıĢmalar sonucunda katalitik bölge olan 40 kDa’luk N-terminal bölgenin substrat ve koenzim bağlama kısımlarına sahip olduğu, regülatör bölge olan 37 kDa’luk C-terminal bölgesinin ise, SAM bağlanma kısmına sahip olduğu gösterilmiĢtir (Rozen, 2003; Sibani ve ark., 2000). Memeli enzimi kendisine nonkovalent olarak bağlı bulunan FAD koenziminini içerir. Bu koenzim, NADPH’ın MTHF'a transferini sağlar (Fodinger ve ark., 2000; Goyette ve Rozen, 2000; Rozen, 2003; Hustad ve ark., 2001; Sibani ve ark., 2000).
2.7.1. MTHFR Geni
Ġnsan MTHFR geni, kromozom 1p36.3’de lokalize olmuĢtur (ġekil 2.5) ve 656 aminoasitten oluĢan MTHFR enzimini kodlamaktadır. cDNA dizisi 2.2 kb uzunluğunda olup 11 ekzondan ve 250 bç’den 1.5 kb’a kadar değiĢen farklı uzunluklardaki intronlardan oluĢmuĢtur (Homberger ve ark., 2000).
Kromozom: 1; NC_000001.10, yer : 1p36.3
ġekil 2.4. MTHFR geninin insan 1. kromozomu üzerindeki yerinin gösterimi (Anonim, 2011b)
MTHFR geni üzerinde yapılan çalıĢmalar sonucunda gen üzerinde 15 farklı mutasyon belirlenmiĢtir (Goyette ve ark., 1998; Goyette ve Rozen, 2000). Bu mutasyonlardan, vasküler hastalık, nöral tüp defektleri ve kolon kanseri ile yakından iliĢkili olduğu bildirilen C677T polimorfizminin enzimin katalitik bölgesinde, özellikle nöral tüp defektlerinde etkili olan A1298C polimorfizmi ise enzimin regülatör bölgesinde ortaya
çıkmaktadır (Bagley ve Jacob, 1998; Botto ve Yang, 2000; Shpichinetsky ve ark., 2000).
2.7.2. MTHFR C677T Gen Polimorfizmi
MTHFR 677C>T mutasyonunun moleküler genetiği 1997 yılında aydınlatılmıĢtır. Kodlanan protein, 37 oC ve daha yüksek sıcaklıklarda daha düĢük enzimatik aktiviteye sahip olduğu için, bu mutasyon termolabil mutasyon olarak da adlandırılmaktadır (Van der Put ve ark., 1998).
C677T polimorfizmi, MTHFR enzimini kodlayan gende 677. nükleotid olan Sitozin (C)’in → Timin (T)’e dönüĢmesi sonucu ortaya çıkan bir nokta mutasyonu sonucu oluĢur (Goyette ve ark., 1998; Schneider ve ark., 1998). Bu mutasyon sonucunda oluĢan proteinin 226. pozisyonunda Alanin’in yerine Valin geçmiĢ olur. Bunun sonucu olarak da MTHFR aktivitesi azalır (Demuth ve ark., 1998; Schneider ve ark., 1998; Sell ve Lugemwa, 1999). MTHFR, folat metabolizması, DNA sentezi ve tamirinde çok önemli bir role sahip olduğundan azalmıĢ MTHFR enzimi aktivitesi homosisteinden metiyonine remetilasyonun azalmasına ve hiperhomosisteinemiye yol açar (Brattstrom ve ark., 1998).
Yüksek homosistein seviyesi ile koroner arter hastalıklarının ortaya çıkıĢında artıĢa neden olan genetik polimorfizmlerden en iyi tanımlananlar, MTHFR geninde belirlenen mutasyonlardır. MTHFR geni üzerinde belli baĢlı iki mutasyonu bulunmaktadır. Bunlar; MTHFR 677C>T ve 1298A>C nokta mutasyonlarıdır (Goyette ve ark., 1998). C677T polimorfizminin, kardiyvasküler hastalıklar, strok, meme ve endometrial kanser, Down sendromu, nöral tüp kusurları, gibi hastalıklarda bir risk faktörü olduğu açıklanmıĢtır (Fodinger ve ark., 2000; Schmitz ve ark., 1996). MTHFR C677T polimorfizmini heterozigot formda (Alanin/Valin) taĢıyan bireylerde plazma homosistein düzeyi intermediyer aralıklardadır. Bu mutasyonun prevelansı etnik gruba göre büyük değiĢkenlikler gösterir. Heterozigot ve homozigot mutant sıklığı Türk populasyonunda yaklaĢık % 47,4 ve % 9,6’dır (Sazcı ve ark., 2005).
C677T mutasyonunda, MTHFR aktivitesi, homozigot mutant TT genotipinde, homozigot normal CC ve heterozigot CT genotiplerine göre azalırken, homosistein seviyesi önemli oranda yükselir (Bagley ve Jacob, 1998; Lievers ve ark., 2001).
MTHFR'nin eksikliği durumunda, homosisteinden metiyonin oluĢumundaki bir bozukluk, organizmayı hem metiyonin azalmasına hem de homosistein birikmesinden doğan toksik etkilere maruz bırakır (Schmitz ve ark., 1996; Lievers ve ark., 2001). Yapılan çalıĢmalarda MTHFR gen polimorfizmine bağlı olarak oluĢan hiperhomosisteinemi ile düĢük folat düzeyinin kanserogenez, nöral tüp defektleri ve kardiyovasküler hastalıklarla iliĢkili olabileceği ileri sürülmektedir (Shield ve ark., 1999; Payne ve ark., 2001). Polimorfizminin TT genotipinin inme, Down sendromu meme ve endometrial kanserler için de risk faktörü olduğu açıklanmıĢtır. Ayrıca akut lösemi, kolorektal ve akciğer kanseri riskinin azaldığı, endometrial kanser riskinin ise arttığı ileri sürülmüĢtür (Kang ve ark., 1991; Schmitz ve ark., 1996; Bova ve ark., 1999).
2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’da dizisi bilinen herhangi bir bölgenin in vitro Ģartlarda enzimatik olarak çoğalmasına (amplifikasyon) olanak veren DNA sentez yöntemidir. PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere uygun oligonükleotid primerlerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. PCR'da çoğaltılacak DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir; her bir zincir daha sonra küçük tamamlayıcı pirimerler ile birleĢir. Primerler çoğaltılacak DNA parçasının uç bölgelerine komlementer olan sentetik oligonükleotitlerdir. Tek zincirli DNA'yı kalıp olarak kullanan DNA polimeraz enzimi, primerin 3' ucundan itibaren nükleotidleri ilave ederek primeri uzatır. Sonuçta, primerin içinde bulunduğu yeni zincirin sentezlenmesi ile çift zincirli DNA molekülü oluĢur. Ġkinci PCR döngüsünde ilk döngüde oluĢan ürünler denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir, primerler ilave edilir ve DNA polimeraz primerleri uzatır (Klug ve Cummings, 2003). DNA polimeraz enzimi, MgCl2 ve dört çeĢit deoksiribonükleotid trifosfat (dATP,
dGTP, dTTP, dCTP) varlığında primerin 3’hidroksil ucundan uzamasını sağlamaktadır. Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluĢturmakta, polimeraz aktivitesini stimüle etmekte ve çift iplikli DNA’nın Tm derecesini arttırmaktadır. Bu nedenle MgCl2, PCR’ın özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde önemli bir etki göstermektedir.
DüĢük Mg+2
spesifik olmayan ürün artıĢına neden olmaktadır. 30-45 döngü sonunda orjinal DNA dizisi 1,000,000 katdan daha fazla çoğalmıĢ olur (Temizkan ve Arda, 2004).
2.8.1. Gerçek Zamanlı PCR (Real-Time PCR)
Real-time (eĢzamanlı) PCR amplifikasyon ve saptama iĢlemlerinin aynı kapalı sistem içinde gerçekleĢtirildiği bir yöntemdir. Real-time PCR’da oluĢan amplikonların Tm (erime ısısı) değerleri belirlenerek özgül mutasyonlar saptanabilmektedir. Amplikon kontaminasyonunun düĢük olması, iĢlemlerin tamamlanması için gerekli olan sürenin çok daha kısa olması, kalitasyon, kantitasyon iĢlemlerine, multipleks amplifikasyona ve mutasyon saptanmasına izin vermesi ve çok daha az miktarlardaki ürünün saptanabilmesi Real-time PCR’ın klasik PCR’a olan temel üstünlükleridir (Dorak, 2006). Bu yöntemde PCR sırasında oluĢan ürünler özgül proplar veya çift sarmallı DNA’ya bağlanma özelliği gösteren boyalar yardımıyla saptanmaktadır (Dorak, 2006). LightCycler cihazı kullanılarak yapılan gerçek zamanlı PCR reaksiyonundanükleik asit amplifikasyonu ile eĢ zamanlı olarak artıĢ gösteren floresans sinyalinin ölçülmesiyle kısa sürede kantitatif değerler elde edilebilmektedir, (Reuter ve ark., 2005). Hızlı ısıtma ve soğutma özelliğine sahip olan LightCycler cihazı, çalıĢmaya göre değiĢen sürelerde (yaklaĢık 20-30 dk) 30-40 PCR döngüsü gerçekleĢtirdiğinden çalıĢmalarda oldukça avantaj sağlamaktadır (Lohmann ve ark., 2000; Reuter ve ark., 2005). Gerçek zamanlı-PCR cihazı yüksek hızı yanında, kontaminasyon riskini de minimuma indirmektedir (Reuter ve ark., 2005).
2.8.2. Multipleks PCR
Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin birlikte çoğaltılması multipleks PCR olarak adlandırılır. Multipleks PCR birden fazla bölgeye bağlanan multipleks primerler ile gerçekleĢtirilir. Multipleks PCR’da birden fazla DNA segmentinin, birden fazla primer çifti kullanarak aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılması söz konusudur. Bu PCR gen delesyonlarının haritalanması, küçük delesyonların, çerçeve kayması ve nokta mutasyonlarının analizinde kullanılan bir yöntem olduğundan "Duchenne Muscular Dystrophy" (DMD) ve kistik fibrozis gibi genetik hastalıkların tanısında kullanılmaktadır (Temizkan ve Arda, 2008).
Multipleks PCR’ın en önemli avantajı çok kısa süre içerisinde çabuk netice vermesi ve diğer rutin tekniklere oranla daha sensitif ve spesifik olmasıdır. Multipleks PCR analizleri farklı dalga boylarında ıĢık yayan çoklu boyalar ile kullanılabilir. Boya tabakası doğru seçilmediğinde makine hala diğer boyaların spektrumlarını okuyacağından hatalı sonuç alınabilir (Dorak, 2006).
2.8.3. LightCycler Cihazında Kullanılan Hibridizasyon Probları Ġle PCR’nin Takibi
LightCycler cihazı ile genotipleme çalıĢmalarında özgün primerlerin yanında testin özgüllüğünü arttırmak amacıyla hedefe özgü hibridizasyon probları kullanılmaktadır. Bu hibridizasyon probları, Floresans boyalarla iĢaretlenen diziye özgü oligonükleotid problarıdır. DNA zincirine baĢ ve kuyruk pozisyonunda hibridize olacak Ģekilde dizayn edilen bu problar, DNA zincirindeki polimorfik bölgeyi örten sensor hibridizasyon probu (HybProbe) ile bu proba yakın bir bölgeye bağlanan anchor problardan oluĢmaktadır (Reuter ve ark., 2005). Hibridizasyon probları solüsyon içerisinde ayrı ayrı durmaktadırlar. HybProbe donör probu 3' ucunda fluoresein ile HybProbe akseptör prob ise 5' ucunda LightCycler kırmızı boya ile etiketlidir (uzatmayı önlemek için akseptör probu ayrıca 3' fosforlaĢtırılmıĢtır). HibritleĢtirme, PCR’nin denatürasyon iĢlemi sırasında meydana gelmez. Probların arasındaki mesafe iki boya etiketi arasındaki enerji transferini engellediği için bu faz sırasında akseptör boyasından floresan tespit edilmeyecektir.
Donör boya, boyanın emme maksimumu ile eĢleĢen bir eksitasyon filtresi seçerek LightCycler Cihazının ıĢık kaynağı ile uyarılır (örneğin florosein için 483 nm). Bu dalga boyu donör molekülündeki bazı elektronları yer seviyesinden daha yüksek bir enerji seviyesine doğru harekete geçirir. Bu enerji aĢağıdakiler ile serbest kalır: Enerji serbest kaldığında elektronlar yer seviyesine geri döner. Akseptör modülüne enerji transferi yaparak donörün kendisinin floresanı söndürülür.
Ġki floresan boya ile iĢaretlenmiĢ olan probların yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresans oluĢumuna yol açmakta ve yeĢil ıĢığın enerjisi LC Red 640 boyası, 640 nm dalga boyundaki kırmızı floresan ıĢığın yayılmasına neden olmaktadır. Ġki prob arasında meydana gelen bu enerji transferi, “Fluoresance Resonance Energy Transfer” (FRET), olarak adlandırılmaktadır. FRET
probları iki farklı floresan boya ile iĢaretli oligonükleotidlerdir. Probların birinin 3' ucu diğerinin ise 5' ucu floresan boya ile iĢaretlidir. Problar amplifiye olan hedef DNA ile birinin kuyruk kısmı diğerinin baĢ kısmına gelecek Ģekilde hibridize olurlar. Böylece iki floresan boya birbirine yakın konumda bulunur. Ġlk propdaki floresan boya sistemin ıĢık kaynağı ile uyarıldığında belli bir dalga boyunda floresan ıĢık yayar. Eğer hibridizasyon olmuĢsa yani iki floresan boya birbirine yeteri kadar yakınsa (1-5 nükleotid) yayılan enerji ikinci floresan boyayı harekete geçirir ve daha uzun dalga boyunda ikinci bir floresan ıĢık yayılır. Bu enerji transferi FRET olarak adlandırılır ve iki probun arasındaki uzaklıkla yakından iliĢkilidir (Dorak, 2006).
Bu enerji transferi sonucunda oluĢan floresans miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifadeyle PCR siklusu süresince oluĢan amplikonların miktarına bağlı olarak artmaktadır (Van der Put ve ark., 1998). LightCycler cihazının optikle ilgili birimi olan F2 kanalı, 640 nm’deki kırmızı ıĢığın yoğunluğunu ölçmektedir. Ölçüm, ıĢımanın maksimum olduğu annealing fazı sonunda yapılabilmektedir. Problar hedef DNA dizisine yan yana bağlanarak ıĢıma yayarlar. Donör boya enerji yaymasına neden olan cihazın ıĢık kaynağı ile uyarılır. Yayılan enerji akseptör boyayı uyarır. Akseptör boya tarafından yayılan floresan her uzama adımının sonunda floresan Ģiddeti en yüksek durumda olduğu zaman ölçülür (Van der Put ve ark., 1998).
Annealing fazından sonra, sıcaklık artar ve hibridizasyon probları baĢlayan uzama (elongation) aĢaması sırasında amplikondan ayrılırlar. Elongation aĢamasından sonra oluĢan amplikonlar çift iplikli olduklarından hibridizasyon probları ile hibridize olamazlar. Bu durumda, iki prob birbirlerinden uzakta ve serbest halde oldukları için FRET gerçekleĢemez (Van der Put ve ark., 1998).
2.8.4. Erime Eğrisi (melting curve) Analizi
Erime Eğrisi analizinin amacı, hedef DNA’nın karakteristik erime sıcaklığını belirlemek ve ürünleri erime sıcaklıklarına dayanarak tanımlamak veya genotiplemektir. Diziye özgü hibridizasyon problarının tek iplikli DNA’ya hibridizyonu ile mutasyonların, SNP’lerin belirlenmesi ve görüntülenmesi gerçekleĢmektedir. DNA sarmalının ısıtıldığında ayrıldığı veya eridiği sıcaklık, baz sırasına, zincir sarmalın uzunluğuna ve sarmalın G-C içeriğine bağlı olarak geniĢ bir aralıkta değiĢebilir. Örneğin, erime
sıcaklıkları aynı uzunlukta fakat farklı G-C/A-T oranı olan ürünler için veya uzunluğu ve G-C içeriği aynı fakat farklı G-C dağılımı olan ürünler için değiĢebilir. Aynı zamanda, iki DNA molekülü arasındaki çift uyumsuzlukları erime sıcaklığında azalmaya yol açar. Bu etki kısa DNA hibritleri için daha belirgindir ve bu nedenle prob tabanlı genotipleme analizinin temeli Ģudur: Mükemmel olarak eĢleĢtirilmiĢ prob, yanlıĢ eĢleĢtirilmiĢ tekli baz mutasyonu taĢıyan bir hedef sırasına bağlı olan probdan daha yüksek sıcaklıkta eriyecektir (Anonim, 2006). Ġki Tm derecesi arasındaki fark ile DNA zincirinde mutasyon olup olmadığı belirlenebilmektedir.
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Örneklerin Seçimi ve Tanımı
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Tıp Fakültesi Bilimsel AraĢtırmalar Değerlendirme Komisyonundan "Yüksek Homosistein Düzeyi ve Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Polimorfizmi Bulunan Hastalarda Paraoksonaz Enzim Polimorfizminin AraĢtırılması" adlı çalıĢmamız için önce 22.10.2010 Tarih ve 10-BADK-020 Proje no ile gerekli Etik kurul onayı alındı. Kontrol ve hasta grubunu oluĢturan bireyler, GaziosmanpaĢa Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi polikliniklerine çeĢitli Ģikayetler ile gelen ve uzman doktor tarafından değerlendirilip Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) mutasyonu çalıĢılmıĢ kiĢilerden seçildi. Yüksek Homosistein düzeyi bulunan yeterli hasta sayısına ulaĢılamadığı için bu parametre çalıĢmaya dahil edilmedi. MTHFR C677T mutasyonu homozigot wild type olan 200 kiĢi kontrol grubu olarak, MTHFR C677T mutasyonunu heterozigot veya homozigot mutant olarak taĢıyan 300 kiĢi ise hasta grubu olarak seçildi. Hasta ve kontrol gruplarından gerekli onam formları alındı. Hastalardan alınan tam kanlar, içinde disodyum etilendiamin tetraasetik asit (EDTA; 3 mg/L) olan tüplere alındı. EDTA’lı tam kan örneklerinden DNA izolasyonu standart metodlarla yapıldı.
3.2. PON1 Enzimine Ait Primer ve Prob Tasarımı Primer PON1-192-F 5'-TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3' PON1-192-R 5'-CCTTCTGCCACCACTCGAAC-3' PON1-55-F 5'-CCTGCAATAATATGAAACAACCTG-3' PON1-55-R 5'-CTAGAACACAGAAAAGTGAAAGAAAAC-3' Prob 192-Sensor 5'-CCCCTACTTACAATCCTGGGAGAT-Fluo-3' 192-Anchor 5'- LCRed705-ATTTGGGTTTAGCGTGGTCGTATGTTG-3' 55-Sensor 5'-CTCTGAAGACATGGAGATACTGCC- Fluo -3'
55-Anchor 5'- LCRed640-ATGGACTGGCTTTCATTAGCTCTGTGAGT-3'
F: Forward primer, R: reverse primer, LCRed705: fluorophore LightCycler Red 705, LCRed640: fluorophore LightCycler Red 640.
3.3. PON1 Gen Polimorfizminin Real-Time PCR Hibridizasyon Problu Yöntemi ile LightCycler 480 II Cihazında Saptanması
PON1 gen polimorfizmini, Roche LightCycler 480 II cihazında ve hibridizasyon prob yöntemi ile ölçülen ticari (Metabion PON1 D-82152) kiti kullanarak tespit ettik. I) Gerekli Materyaller:
LightCycler plate (Cat.-No 02297706), LightCycler cover plate (Cat.-No 04729757001), LightCycler FastStart DNA Master HybProbe (Cat.-No 12239272001), Metabion PON1 Kit (Cat.-No D-82152), MgCl2 (Cat.-No 11645300).
II) PON1 Enzim Polimorfizmi Ġçin Uygulanan Çoklu (Multiplex) PCR Deney Protokolü:
Deney protokolü aĢağıdaki çizelgede Çizelge 3.1. verilmiĢtir.
Çizelge 3.1. LightCycler’da PON1 55 ve 192 genotiplerinin melting point analizleri için kullanılan PCR Ģartları
Ġçerik Hacim BaĢlangıç
konsantrasyonu Son
Konsantrasyon PON1-55 Primforw
a
2 L 5 pmol/L 2 M
PON1-55 Primrev
a 2 L 5 pmol/L 2 M
PON1-55 Probe Fluo (sensor)a 2 L 1.5 pmol/L 0.6 M PON1-55 Probe LC640 (anchor)a 2 L 1.5 pmol/L 0.6 M PON1-192 Primforw
a 2 L 5 pmol/L 2 M
PON1-192 Primrew
a 2 L 5 pmol/L 2 M
PON1-192 Probe Fluo (sensor)a 2 L 1.5 pmol/L 0.6 M PON1-192 LC705 (anchor)a 2 L 1.5 pmol/L 0.6 M MgCl2
b 1,6 L
25 mM 1.6 mM
LC FastStart Master HybProbb 2 L 10X 1X
Kalıp DNA 4,4 L 200-400 ng/50 L
Toplam hacim 24 L
a :Metabion, Martinsried, Deutschland. b: Roche Diagnostics, Indianapolis, USA.
3.4. PON1 Enzim Polimorfizmi Ġçin uygulanan RT-PCR protokolü
Program Denaturasyon Ölçme Erime Soğutma
Analiz modu None Ölçme Eğrisi Erime Eğrisi None
Döngü 1 32 1 1
Segment 1 1 2 3 1 2 3 1
Hedef sıcaklık, ºC 95 95 58 72 95 40 75 40
Ġnkübasyon zamanı,
sn 600 10 20 20 30 30 0 30
Sıcaklık geçiĢ oranı,
ºC/sn 20 20 20 20 20 20 0,1 20
Okuma modu None None Single None None None Cont. None
3.5. Real-Time PCR Sonuçlarının Değerlendirilmesi
ÇalıĢma sonunda oluĢan erime eğrisi pik derecelerine göre hasta ve kontrol grubuna ait bireylerin genotiplendirilmeleri homozigot wild type (normal), homozigot mutant ve heterozigot olarak belirlendi. 640 nm dalga boyunda 55. kodonda bulunan mutasyon tespit edilmektedir. 55. kodon homozigot wild type genotipe sahip olması durumunda yani metionin (M) aminoasiti bulunuyorsa erime değeri (Tm) 63C olmaktadır. Eğer homozigot mutant genotipe sahipse, yani metionin aminoasiti yerine lösin (L) aminoasiti gelmiĢ ise Tm değeri 59C olmaktadır. Heterozigot genotip durumunda ise her iki sıcaklıkta da Tm değeri elde edilir. 660 nm dalga boyunda 192. kodonda bulunan mutasyonun varlığı tespit edilmektedir. 192. kodon homozigot wild type genotipe sahip olması durumunda yani glutamin (Q) aminoasiti bulunması durumunda Tm değeri 63C olmaktadır. Eğer homozigot mutant genotipe sahipse, yani glutamin (Q) aminoasiti yerine arginin (R) aminoasiti gelmiĢ ise Tm değeri 58C olmaktadır. Heterozigot genotip durumunda ise her iki sıcaklıkta da Tm değeri elde edilir.
3.6. Ġstatistiksel Yöntemler
ÇalıĢmada kullanılan kategorik değiĢkenler (gen polimorfizm dağılımları) yönünden yapılan karĢılaĢtırmalarda ki-kare testleri kullanılmıĢtır. Kategorik değiĢkenler sayı ve yüzde ile ifade edilmiĢtir. p değerleri 0,05’in altında hesaplandığında istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiĢtir. Hesaplamalar hazır istatistik yazılımı ile yapılmıĢtır (IBM SPSS Statistics 19, SPSS inc., an IBM Co., Somers, NY).
4. BULGULAR
Multipleks-PCR’ın optimizasyonu çalıĢmalarında farklı oranlarda primer-prob, MgCl2
ve polimeraz konsantrasyonları kullanılması yanında döngü sayısı, primer bağlanma ısısı ve süresi gibi farklı reaksiyon koĢulları uygulandı. En uygun sonuçlar 2 M primer, 0,6 M prob, 1,6 mM MgCl2 (1,6 L) değerleri ile elde edildi. Multipleks-PCR
koĢullarının optimizasyonunda en ideal koĢullar 32 döngü ve 58°C birleĢme ısısı olarak belirlendi. ÇalıĢma sonucunda LightCycler cihazından elde edilen grafikler aĢağıdaki Ģekillerde verilmiĢtir (ġekil 4.1, 4.2, 4.3, 4.4).
ġekil 4.1. PON 55 kodonuna ait erime eğrisi (melting curve)
ġekil 4.2. PON 55 kodonuna ait erime piki (melting peak)
ġeki l 4.3. PON 192 kodonuna ait erime eğrisi (melting curve)
ġekil 4.4. PON 192 kodonuna ait erime piki (melting peak)
PON 55 ve 192 polimorfizmlerine ait genotip dağılımları Çizelge 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 ve 4.6’da verilmiĢtir. Çizelgelere ait Ģekiller, ġekil 4.7, 4.8, 4.9 ve 4.10'da verilmiĢtir. Çizelge 4.1. PON 55 polimorfizmine ait gruplar arası genotip dağılımları
MTHFR C677T Genotip (PON 55 M/L) CC (n= 200) CT/TT (n=300) MM 23 (%12) 28 (%9,3) ML 92 (%46) 142 (%47,3)
LL 85 (%42) 130 (%43,3) p=0,737
PON 55 genotipi değerlendirildiğinde, MTHFR polimorfizmi taĢıyan bireyler ile taĢımayan bireyler (kontrol grubu) arasında PON 55 polimorfizmi açısından anlamlı fark bulunmamıĢtır (p=0,737).
ġekil 4.5. PON 55 polimorfizmine ait genotip dağılımları grafiği (W: Homozigot Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
Çizelge 4.2. PON 55 polimorfizmine ait gruplar arası genotip dağılımları MTHFR C677T Genotip (PON 55 M/L) CC (n= 200) CT (n=220) TT (n=80) MM 23 (%12) 22 (%10) 6 (%8) ML 92 (%46) 102 (%46) 40 (%50) LL 85 (%42) 96 (%44) 34 (%42) p=0,878
MTHFR polimorfizmi homozigot wild type (CC), Heterozigot (CT) ve homozigot mutant (TT) olan bireyler arasında PON 55 M/L polimorfizmi açısından anlamlı fark bulunmamıĢtır (p=0,878).
ġekil 4.6. PON 55 polimorfizmine ait grupların genotip dağılımları grafiği (W: Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
Çizelge 4.3. PON 192 polimorfizmine ait genotip dağılımları MTHFR C677T Genotip (PON 192 Q/R) CC (n= 200) CT/TT (n=300) QQ 81 (%41) 117 (%39) QR 95 (%47) 123 (%41) RR 24 (%12) 60 (%20) p=0,055
MTHFR polimorfizmi homozigot wild type-CC olan (kontrol) ve mutant (heterozigot-CT ve homozigot mutant-TT) olan bireyler arasında PON 55 M/L polimorfizmi açısından anlamlı fark bulunmamıĢtır (p=0,055).
ġekil 4.7. PON 192 polimorfizmine ait genotip dağılımları grafiği (W: Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
Çizelge 4.4. PON 192 polimorfizmine ait gruplar arası genotip dağılımları MTHFR C677T Genotip (PON 192 Q/R) CC (n= 200) CT (n=220) TT (n=80) QQ 81 (%41) 77 (%35) 40 (%50) QR 95 (%47) 96 (%44) 27 (%34) RR 24 (%12) 47 (%21) 13 (%16) p=0,022*
*: PON 192 genotipi homozigot-RR olan hastalar MTHFR polimorfizmi yönünden hem wild type-QQ hem de heterozigot-QR hastalardan farklı bulunmuĢtur (sırasıyla p<0,001 ve p<0,001).
MTHFR C677T polimorfizmi dağılımı (frekansı) açısından PON 192 genotipi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant grubu arasında yapılan karĢılaĢtırma sonucunda anlamlı fark bulunmuĢtur. Yapılan ikili karĢılaĢtırmalar sonucunda PON 192 genotipi homozigot mutant (RR) olan kiĢiler hem homozigot wild type (QQ) hem de heterozigot (QR) olan kiĢilerden önemli düzeyde farklı bulunmuĢtur
(sırasıyla p<0,001 ve p<0,001), buna karĢın PON 192 genotipi wild type (QQ) olan ve heterozigot (QR) olan kiĢiler arasında anlamlı fark bulunmamıĢtır (p>0,05).
ġekil 4.8. PON 192 polimorfizmine ait grupların genotip dağılımları grafiği (W: Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
Çizelge 4.5. PON 55 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılımı Cinsiyet Genotip (PON 55 M/L) Bayan (n = 448) Erkek (n = 52) MM 47 (%10) 4 (%8) ML 213 (%48) 21 (%40) LL 188 (%42) 27 (%52) p=0,380
Bayan ve erkekler arasında PON 55 genotipinin dağılımı açısından anlamlı bir fark bulunmamıĢtır (p=0,380).
ġekil 4.11. PON 55 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılım grafiği (W: Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
Çizelge 4.6. PON 192 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılımı Cinsiyet Genotip (PON 192 Q/R) Bayan (n = 448) Erkek (n = 52) QQ 177 (%40) 21(%40) QR 199 (%44) 19 (%37) RR 72 (%16) 12 (%23) p=0,374
Bayan ve erkekler arasında PON 192 genotipinin dağılımı açısından anlamlı bir fark bulunmamıĢtır (p=0,374).
ġekil 4.12. PON 192 polimorfizminin cinsiyetlere göre dağılım grafiği (W: Wild type, HT: Heterozigot, HO: Homozigot mutant)
4.1. Kontrol ve ÇalıĢma Grubunun KarĢılaĢtırmalı Analizi
MTHFR polimorfizmini heterozigot (CT) ve homozigot mutant (TT) olarak taĢıyan bireyler ile MTHFR polimorfizmi wild type-CC olarak tespit edilmiĢ (kontrol grubu) kiĢiler, PON1 55 ve 192 polimorfizmleri açısından istatistiksel olarak SPSS 19.0 programı kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 ve 4.6'da verilmiĢtir. p<0,05 değerinden küçük değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiĢtir.
Çizelge 4.2' deki sonuçlara göre PON 55 Polimorfizmi MTHFR homozigot wild type (CC) olan kontrol grubunda incelendiğinde 23 kiĢide (%12) homozigot wild type (MM), 92 kiĢide (%46) heterozigot (ML) ve 85 kiĢide (%42) homozigot mutant (LL) olarak; MTHFR heterozigot (CT) olan grupta 22 kiĢide (%10) homozigot wild type (MM), 102 kiĢide (%46) heterozigot (ML) ve 96 kiĢide (%44) homozigot mutant (LL); MTHFR homozigot mutant (TT) olan grupta 6 kiĢide (%8) homozigot wild type (MM), 40 kiĢide (%50) heterozigot (ML) ve 34 kiĢide (%42) homozigot mutant (LL) olarak tespit edilmiĢtir. PON1 55 polimorfizmi açısından p değeri p>0,05 olarak bulunduğundan kontrol ve hasta grubu arasında anlamlı bir fark görülmemiĢtir.
Çizelge 4.4' deki sonuçlara göre PON 192 polimorfizmi, MTHFR homozigot wild type-CC olan kontrol grubunda incelendiğinde 81 kiĢide (%41) homozigot wild type (QQ), 95 kiĢide (%47) heterozigot (QR) ve 24 kiĢide (%12) homozigot mutant (RR) olarak; MTHFR Heterozigot (CT) olan grupta 77 kiĢide (%35) homozigot wild type (QQ), 96 kiĢide (%44) heterozigot (QR) ve 47 kiĢide (%21) homozigot mutant (RR); MTHFR homozigot mutant (TT) olan grupta 40 kiĢide (%50) homozigot wild type (QQ), 27 kiĢide (%34) heterozigot (QR) ve 13 kiĢide (%16) homozigot mutant (RR) olarak tespit edilmiĢtir. MTHFR C677T polimorfizmi dağılımı (frekansı) açısından PON 192 genotipi wild type, heterozigot ve homozigot mutant grubu arasında yapılan karĢılaĢtırma sonucunda anlamlı fark bulunmuĢtur (p=0,022). Yapılan ikili karĢılaĢtırmalar sonucunda PON 192 genotipi homozigot mutant (RR) olan hastalar hem homozigot wild type (QQ) hem de heterozigot (QR) hastalardan önemli düzeyde farklı bulunmuĢtur (sırasıyla p<0,001 ve p<0,001), buna karĢın PON 192 genotipi homozigot wild type (QQ) olan ve heterozigot (QR) olan hastalar arasında anlamlı fark bulunmamıĢtır (p>0,05).
PON 55 polimorfizminin cinsiyetler arasındaki dağılımı Çizelge 4.5' deki sonuçlara göre incelendiğinde bayanlarda 47 kiĢide (%10) homozigot wild type (MM), 213 kiĢide (%48) heterozigot (ML) ve 188 kiĢide (%42) homozigot mutant (LL) olarak; erkeklerde 4 kiĢide (%8) homozigot wild type (MM), 21 kiĢide (%40) heterozigot (ML) ve 27 kiĢide (%52) homozigot mutant (LL) olarak tespit edilmiĢtir. Gruplar arasında anlamlı bir farklılık görülmezken (p>0,05) PON 55 polimorfizmi her iki grupta da heterozigot ve homozigot mutant oranı wild type oranına göre daha yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. PON 192 polimorfizminin cinsiyetler arasındaki dağılımı Çizelge 4.6'daki sonuçlara göre incelendiğinde bayanlarda 177 kiĢide (%40) homozigot wild type (QQ), 199 kiĢide (%44) heterozigot (QR) ve 72 kiĢide (%16) homozigot mutant (RR) olarak; erkeklerde 21 kiĢide (%40) homozigot wild type (QQ), 19 kiĢide (%37) heterozigot (QR) ve 12 kiĢide (%23) homozigot mutant (RR); olarak tespit edilmiĢtir. Gruplar arasında anlamlı bir farklılık görülmezken (p>0,05) PON 192 polimorfizmi bayanlarda ve erkeklerde homozigot wild type ve heterozigot polimorfizm oranı homozigot mutant oranına göre belirgin Ģekilde yüksek bulunmuĢtur.
5. TARTIġMA ve SONUÇ
Çevre ve birey arasındaki iliĢkiyi ve genetik çeĢitliliğin nasıl etkilendiğini bize en iyi açıklayan polimorfik allellerdir. Regülatör bölgede bulunan polimorfik alleller, genlerin transkripsiyonel regülasyonunu etkileyerek fenotiplerin belirlenmesinde önemli rol oynarlar (Nussbaum ve ark., 2005). Polimorfizm tespitlerinde ve gen seviye ölçümlerinde LightCycler Real-Time PCR yöntemi duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle son yıllarda sıkça kullanılmaya baĢlanmıĢ bir yöntem olması nedeniyle çalıĢmamızı bu yöntemle gerçekleĢtirdik.
ÇalıĢmamızda, bölgemizde de yaygın olarak görülen MTHFR C677T polimorfizminin dağılımını, hasta ve kontrol gruplarında PON 55/192 polimorfizmi ile kıyaslamayı hedefledik. Polimorfizm analizi Real-time PCR yöntemi ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Bu yöntemin geleneksel PCR-RFLP yöntemine göre, genotiplerin kolay ve doğru analiz edilmesi, çabuk sonuç alınması gibi avantajları bulunmaktadır. Real-time PCR yöntemi, hızlı ve duyarlı olması nedeniyle klinik kullanım ve geniĢ çaplı araĢtırmalar için uygun gözükmektedir (Hiratsuka ve ark., 2002).
Bu çalıĢmada kullanılan hasta grubunda MTHFR mutasyonu bulunan 300 kiĢilik grupta mutasyon taĢıma oranları 220 kiĢide heterozigot (CT) (% 44,0) ve 80 kiĢide homozigot mutant (TT) (%16) olarak belirlenmiĢtir. Kontrol grubu olarak belirlediğimiz 200 kiĢi (%40) MTHFR mutasyonu bakımından homozigot wild type (CC) genotipli bireylerden oluĢmaktadır. ÇalıĢmamıza aldığımız hasta ve kontrol grubunda çalıĢılan PON1 55/192 polimorfizmlerinin, MTHFR C677T mutasyonu ile iliĢkisi istatistiksel olarak belirlenmiĢtir.
MTHFR enzimi, folat döngüsü içerisinde görev alan ve 5,10 MTHF’yi 5-MTHF’ye katalize eden enzimdir(Schwahn ve Rozen, 2001). MTHFR enziminin geni 1p 36.3’de -lokalize olup bu gen üzerinde çeĢitli nonsense ve missense mutasyonlar vardır (Goyette ve ark., 1994). Bu mutasyonlar enzim aktivitesini farklı Ģekillerde etkilemektedir. 677 CT polimorfizmi enzim aktivitesini % 55-65 oranında azaltmaktadır. Azalan enzim aktivitesi, hiperhomosisteinemiye neden olmakta ve çeĢitli klinik problemler ortaya çıkmaktadır (Roiben ve Ulrich, 2003). MTHFR polimorfizminin, özellikle homosistein metabolizması üzerine olan olumsuz etkilerinden dolayı polimorfizminin nöral tüp
kusurları, strok, kardiyovasküler hastalıklar, Down sendromu, meme ve endometrial kanser gibi çeĢitli hastalıklar için bir risk faktörü olduğu bildirilmiĢtir (Schmitz ve ark., 1996; Fodinger ve ark., 2000; Werstruck ve ark., 2001). Bir çalıĢmada bu polimorfizmin lipid metabolizmasını da olumsuz etkilediği belirtilmiĢtir (Murphy ve ark., 2002). Yapılan bir çalıĢmada homosistein ile sağlanan endoplazmik retikulum stresinin yol açtığı sterol düzenleyici unsur bağlayan proteinin aktivasyonunun kolesterol/trigliserit biyosentezi ve alımından sorumlu olan genlerin aĢırı ekspresyonuna yol açtığı ileri sürülmüĢtür (Werstruck ve ark., 2001). Bu kolesterolün hücre içi birikimine yol açacaktır ve homosistein’in lipid mekanizmasını etkilemede olası yollardan biridir. Önceki çalıĢmalarda tHcy ile total, LDL, ve HDL-kolesterol arasındaki bir iliĢkiden söz etmiĢlerdir (Loktionov ve ark., 1999; Qujeq ve ark., 2001). Ayrıca PON1 homosistein-tiolaktonu parçalayarak açil hidrolaz olarak etki gösterir (Billecke ve ark., 2000; Jakubowski, 2000) ve düĢük yoğunluklu lipoprotein lipoksidasyon türevlerine yönelik benzer etkinlik sergiler (Cao ve ark., 1999). Benzer mekanizmalarda yer aldığı görülen MTHFR ve PON1 genotipleriyle ilgili bu veriler ıĢığında, MTHFR ve PON1 polimorfizmleri arasındaki iliĢki incelenmiĢtir.
ÇalıĢmaya aldığımız hasta grubunda venöz yetersizlik, serebrovasküler hastalıklar, amiloidoz, habitüel abortus vb. tanılar almıĢ hastalar yer almaktadır. MTHFR 677 CT polimorfizmini taĢıyan bu hastalarda PON 55 polimorfizmini taĢıyanların dağılımına bakıldığında bu polimorfizmi heterozigot ve homozigot mutant olarak taĢıyanların oranı oldukça yüksek bulunmuĢtur (sırasıyla %47 ve %43). PON 192 polimorfizminde ise yine heterozigot oranı daha yüksek bulunmuĢtur (%41). Bu durum hastalıkların tanılarının konmasına yardımcı olması bakımından MTHFR C677T polimorfizmine ek olarak PON 55/192 polimorfizminin de kullanılabileceğinin bir göstergesidir.
Kontrol grubu olarak kullanılan MTHFR homozigot wild type olan grupta PON 55 polimorfizmi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %12, %46 ve %42 olarak tespit edilmiĢtir. ÇalıĢma grubuna alınan MTHFR heterozigot olan kiĢilerde PON 55 polimorfizmi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %10, %46 ve %44 olarak tespit edilmiĢtir. MTHFR homozigot mutant olan grupta PON 55 polimorfizmi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %8, %50 ve %42 olarak tespit edilmiĢtir. ÇalıĢma ve kontrol grubunun her ikisinde de PON 55 polimorfizm oranı yakın değerlerde
bulunmuĢtur. MTHFR polimorfizmi homozigot wild type (CC), heterozigot (CT) ve homozigot mutant (TT) olan bireyler arasında PON 55 M/L polimorfizmi açısından anlamlı fark bulunmamıĢtır (p=0,878). Her iki grupta da PON 55 polimorfizminin homozigot wild type oranı düĢükken, heterozigot ve homozigot mutant polimorfizm oranlarının daha yüksek olduğu görülmüĢtür. Bu sonuçlara göre bölgemizde PON 55 polimorfizm oranının oldukça yüksek olduğu görülmüĢtür.
PON 192 Polimorfizmi, MTHFR negatif olan grupta homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %41, %47 ve %12 olarak tespit edilmiĢtir. ÇalıĢma grubuna alınan MTHFR heterozigot olan kiĢilerde PON 192 polimorfizmi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %35, %44 ve %47 olarak tespit edilmiĢtir. MTHFR homozigot mutant olan grupta PON 192 polimorfizmi homozigot wild type, heterozigot ve homozigot mutant oranları sırasıyla %50, %34 ve %16 olarak tespit edilmiĢtir. ÇalıĢma ve kontrol grubunun kıyaslandığında p=0,022 değeri kontrol ve çalıĢma grubu arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermiĢtir. PON 192 genotipi homozigot mutant olan kiĢiler hem homozigot wild type hem de heterozigot hastalardan önemli düzeyde farklı bulunmuĢtur. Bu durum MTHFR ve PON 192 polimorfizmlerinin iliĢkili olduğunu ve bu iki polimorfizminin toplumdaki görülme sıklığının yüksek olduğunu göstermektedir.
Son yıllarda yapılan çalıĢmalar ile PON1’in LDL oksidasyonunu önlediği gösterilmiĢtir ve kardiyovasküler hastalıklar için koruyucu bir faktör olup olamayacağı tartıĢılmıĢtır (Ayub ve ark., 1999). Enzimin iki farklı alleli olabileceği ve bu genetik polimorfizmler nedeniyle farklı kiĢilerde aktivitelerinin değiĢik olduğu ortaya konmuĢtur (Ayub ve ark., 1999). PON 1 geninde metioninden lösine mutasyonun (M55L) yapay ester substratı ile enzim aktivitesinde azalmaya neden olurken glutaminden arjinine mutasyon (Q192R) çok hızlı inaktivasyonundan dolayı düĢüĢe neden olur. Her iki polimorfizm kuvvetli bağlantı eĢitsizliği içindedir (Hegele, 1999). ÇalıĢmamızda da hasta ve kontrol grubunda mutasyon çeĢitliliği bulunması nedeniyle kontrol ve hasta grubuna aldığımız kiĢiler arasında anlamlı fark bulunmamasına neden olmuĢ olabilir.
Rontu ve arkadaĢları bir çalıĢmalarında PON 55 LL genotipine sahip Koroner arter hastalığına (KAH) sahip bireylerin aterosklerotik plakların alanı ve bu alanlardaki fibrotik lezyonun PON 55 MM genotipine sahip bireylere göre daha fazla olduğunu
göstermiĢlerdir (Rontu ve ark., 2003). ÇalıĢmamızda bulduğumuz sonuçlarda da LL genotipli hasta ve kontrol grubunun MM genotipini taĢıyanlara göre oldukça yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. ÇalıĢmamızda KAH araĢtırılmadığı için ileri çalıĢmalar yapılarak bu kiĢilerde PON 55 polimorfizminin etkisinin izlenmesi gerekmektedir. Türklerde R allel sıklığı Avrupa ırkına yakın değerler gösterirken doğu populasyonlarından düĢüktür (Karakaya ve ark., 1991). Avrupa populasyonlarında düĢük aktivite izoformu ve bimodalite izlenmekteyken, Afrika ve Uzakdoğuda düĢük aktiviteli genotip saptanmamıĢtır ve bu ırklarda dağılımın unimodal olduğu belirlenmiĢtir (Mallinckrodt ve ark., 1979). Paraoksonaz/arilesteraz’ın 192 pozisyonda polimorfik dağılımı Türk populasyonunda trimodal dağılım gösterdiği söylenmiĢtir (Karakaya ve ark., 1991). ÇalıĢmamız da bu bulguları doğrular nitelikte olup Q allel sıklığının daha fazla olduğu gözlemlenmiĢtir.
Thomas-Moya ve arkadaĢları, rat’larla yaptığı bir çalıĢmada kalori kısıtlamayla PON1 aktivitesinde çok ciddi bir düĢüĢ olduğu ve özellikle bu sonuçların diĢi farelerde daha iyi gözlendiğini bu nedenle PON1’in cinsiyetler arasında da önemli bir fark gösterdiğini rapor etmiĢlerdir (Thomas-Moya ve ark., 2006). Fere ve arkadaĢlarının çalıĢmasında ise cinsiyete bağlı değiĢiklik gözlenmemiĢtir (Fere ve ark., 2003). Yaptığımız çalıĢmada da iki cins arasında PON 55/192 genotiplerinin dağılımı açısından anlamlı bir fark görülmemiĢtir.
Amerikada ki bazı çalıĢmalarda RR genotipi CAD ile iliĢkili bulunurken Avrupada farklı gruplar bu iliĢkiyi göstermekte baĢarısız olmuĢtur. Bu farklılıklar populasyonlar arasındaki etnik farklılıklar yanında gen-gen ve gen-çevre etkileĢimlerinin bulunmakta olduğunu ve diğer risk faktörlerinden dolayı vasküler riskin yüksek öngördüğü ihtimali özellikle önemlidir (Senti ve ark., 2001).
PON1 enzimi üzerine yapılan çalıĢmalar enzimin LDL ve HDL partiküllerinin oksidasyonunu önleyerek ve diğer mekanizmalarla aterosklerotik oluĢumu engellediği ya da yavaĢlattığını göstermiĢtir. Bu çalıĢmalar, ateroskleroz ve diabet gibi serbest radikallerin patogenezde rol oynadığı hastalıklarda PON1 enziminin önemini ortaya çıkarmıĢtır (Ekmekçi, 2004).
Stevens ve ark., Paraoksonazın karsiogenezdeki rolünü göstermek için yaptıkları çalıĢmalarda PON 55 polimorfizmi bakımından MM genotipli kadınlarda %57 artmıĢ meme kanseri, %85 artmıĢ invaziv meme kanseri insidansını göstermiĢlerdir (Stevens
