T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
SİSPLATİN NEFROTOKSİSİTESİ OLUŞTURULAN
RATLARDA EPİGALLOKATEŞİN GALLATIN ETKİLERİNİN
ARAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ Dr. Mustafa TİMURKAAN
TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Ayhan DOĞUKAN
DEKANLIK ONAYI
Prof. Dr. İrfan ORHAN DEKAN
Bu tez Uzmanlık Tezi standartlarına uygun bulunmuştur. ____________________
Prof. Dr. Emir DÖNDER
İç Hastalıkları Anabilim Dalı Başkanı
Tez tarafımızdan okunmuş, kapsam ve kalite yönünden Uzmanlık Tezi olarak kabul edilmiştir.
Prof. Dr. Ayhan DOĞUKAN __________________
Danışman
Uzmanlık Jüri Üyeleri
... __________________ ... __________________ ... __________________ ... __________________ ... __________________
TEŞEKKÜR
Uzmanlık eğitimim sürecinde, eğitimime büyük katkıları olan başta tez danışmanım Prof. Dr. Ayhan DOĞUKAN olmak üzere, İç Hastalıkları Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Emir DÖNDER ve diğer saygıdeğer hocalarım, Prof. Dr. İbrahim Halil BAHÇECİOĞLU, Prof. Dr. Ahmet IŞIK, Prof. Dr. Hüseyin ÇELİKER, Doç. Dr. Yusuf ÖZKAN, Doç. Dr. Mehmet YALNIZ, Doç. Dr. Emin Tamer ELKIRAN, Doç. Dr. Süleyman Serdar KOCA, Doç. Dr. Aziz KARAOĞLU, Doç. Dr. Ramiz ÇOLAK, Yrd. Doç. Dr. Cem AYGÜN, Yrd. Doç. Dr. Bilge AYGEN’e teşekkür ederim.
Tezimin tüm aşamalarında değerli bilgilerini aktaran, her konuda destek olarak, yol gösteren tez danışmanı Nefroloji Bilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Ayhan DOĞUKAN’a, Veterinerlik Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları öğretim üyesi Prof. Dr. Kazım ŞAHİN’e, tezimin istatistiklerinin yapılması ve sonuçların yorumlanma safhasında emeği geçen Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümü öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Mehmet TUZCU’ya, histopatolojik inceleme safhasındaki yardımlarından dolayı Patoloji Bilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. İbrahim Hanifi Özercan’a teşekkür ederim.
Uzmanlık eğitimim boyunca birlikte çalıştığım dostluklarını esirgemeyen tüm asistan ve uzman olmuş arkadaşlarıma, iç hastalıkları servislerinde çalışan tüm hemşire, personel ve kliniğimiz çalışanlarına teşekkür ederim.
Tüm hayat boyu olduğu gibi asistanlığım süresince de bana sevgi ve desteklerini biran bile eksik etmeyen ve bana sabırlarını sunan sevgili annem, babam ve kardeşime teşekkür ederim.
Yazım aşamasında da her zaman olduğu gibi; her türlü desteğini esirgemeyen, varlığıyla güven veren yol arkadaşım, sevgili eşim Dr. Esra Suay TİMURKAAN ve gülümsemesiyle motivasyon sağlayan kır çiçeğim, kızım LAMRA’ya sonsuz teşekkür ederim.
ÖZET
Sisplatin (CDDP) nefrotoksisitesi böbrekte oksidatif strese neden olur ve CDDP’nin klinik kullanımını kısıtlar. Epigallokateşin gallat (EGCG) yeşil çaydan derive edilen güçlü bir antioksidandır. Bu çalışmada; CDDP’nin neden olduğu nefrotoksite ve lipid peroksidasyonuna EGCG’nin etkisi deneysel olarak araştırıldı.
Çalışmada, 4 gruba (n=7) ayrılarak toplam 28 adet erkek Wistar rat kullanıldı. (i) Kontrol grubu, (ii) EGCG (100 mg/kg/gün) grubu, (iii) CDDP verilen CDDP (7 mg/kg i.p, tek doz), (iv) EGCG (100 mg/kg/gün)+CDDP grubu (7 mg/kg i.p., tek doz). CDDP uygulaması serum üre nitrojeni ve kreatininde belirgin bir artışa neden oldu (p<0.001). Serum üre nitrojeni ve kreatinin düzeyleri EGCG+CDDP grubunda CDDP grubuna göre daha düşüktü (p<0.001). CDDP verilen ratlarda serum malondialdehid (MDA) düzeylerinde belirgin artış gözlendi (p<0.05). EGCG, MDA’daki artışı önledi (p<0.05). Renal Bax protein ekspresyonu CDDP grubunda kontrol grubuna göre daha yüksekti, EGCG tedavisi ile Bax düzeylerinde anlamlı azalma oldu (p<0.05). Bcl-2 protein ekspresyonu EGCG+CDDP grubunda CDDP grubuna göre daha yüksekti (p<0.05). Böbrek dokusunda Hsp60 ve Hsp70 ekspresyonu yalnız CDDP verilen ratlara göre, CDDP ile birlikte EGCG verilen ratlarda daha düşüktü (p<0.001). CDDP‘nin neden olduğu renal histopatolojik değişiklikler EGCG tedavisi ile belirgin ölçüde düzeldi.
Bu sonuçlar CDDP’nin oksidatif strese ve böbrek hasarına neden olduğunu gösterir. EGCG tedavisi oksidatif stresi azaltarak ve Bax/Bcl-2 protein ekspresyonlarını etkileyerek sisplatin nefrotoksisitenin önlenmesinde terapötik rol oynayabilir.
ABSTRACT
THE INVESTIGATION of THE EFFECTS OF EPIGALLOCATECHIN GALLATE (EGCG) in CISPLATIN-INDUCED NEPHROTOXICITY in
RATS
Cisplatin (CDDP)-induced nephrotoxicity is related to an increase in oxidative stress in the kidney and limits clinical use of CDDP. Epigallocatechin gallate (EGCG), a very potent antioxidant derived from green tea. In the present study, we investigated the effect of EGCG against CDDP-induced lipid peroxidation and nephrotoxicity in rats.
Male wistar rats (n=28, 8 wk-old, between 200-215 g) were divided into four groups: (i) control rats, (ii) EGCG (100 mgkg-1, daily)-control rats, (iii) CDDP-injected rats, CDDP group (7 mgkg−1 i.p, single dose) (iv) EGCG-treated (100 mgkg−1, daily) CDDP-injected rats (EGCG+CDDP group). CDDP administration resulted in significant increase in serum urea nitrogen and creatinine (p<0.001). Serum creatinine and urea nitrogen levels were lower in rats treated with EGCG+CDDP compared with rats treated with CDDP alone (p<0.001). The serum from the CDDP-treated rats showed a significant increase in malondialdehyde (MDA) levels in comparison to the values (p<0.05). EGCG prevented the rise of MDA (p<0.05). Renal Bax protein expression was significantly higher in CDDP-treated rats compared with control rats, and EGCG treatment significantly reduced the levels of Bax (p<0.05). Bcl–2 protein expression was higher in EGCG+CDDP administered rats than CDDP-injected rats (p<0.05). The expression of renal Hsp60 and Hsp70 was significantly lower in EGCG+CDDP group compared with rats treated with CDDP alone (p<0.001). CDDP-induced renal histopathological changes were significantly improved with EGCG.
These results show that CDDP produces oxidative stress and renal damage. In conclusion, our study show that EGCG, which reduces oxidative stress and changes the expression of Bax and Bcl-2 protein, has significant potential as a therapeutic intervention for CDDP-induced renal injury.
İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR iii ÖZET iv ABSTRACT v İÇİNDEKİLER vi TABLOLAR LİSTESİ ix ŞEKİLLER LİSTESİ x KISALTMALAR LİSTESİ xi 1. GİRİŞ 1 1.1. Sisplatin 1
1.1.1. Sisplatinin Farmakokinetik Yapısı 2
1.1.2. Sisplatinin Yan Etkileri ve Nefrotoksisite 2
1.1.3. Patogenez 5
1.1.3.1. Hücresel toksisite 5
1.1.3.2. Vazokonstriksiyon 5
1.1.3.3. Proinflamatuar etkiler 5
1.1.3.4. Proksimal tübüldeki etkiler 6
1.1.4. Sisplatin Nefrotoksisitesinin Klinik Yansıması 6
1.1.4.1.Renal Bozulma 6 1.1.4.2. Hipomagnezemi 8 1.1.4.3. Trombotik anjiopati 8 1.1.4.4. Fanconi-benzeri sendrom 8 1.1.4.5. Tuz kaybı 9 1.1.4.6. Anemi 9 1.2. Oksidatif Sistem 9 1.2.1. Lipid Peroksidasynu 10
1.2.2. Biyolojik Sistemlerde Lipid Peroksidasyonun Sonuçları 10
1.3.3. Endojen Antioksidanlar 12
1.3.3.1 Enzimatik Antioksidanlar 12
1.3.3.2. Nonenzimatik Antioksidanlar 14
1.3.3.3. Diğer Nonenzimatik Endojen Antioksidanlar 14
1.3.5. Diğer antioksidanlar (Farmakolojik) 14
1.3.5.1. Yeşil Çayın Bileşenlerinin Kimyası 15
1.3.5.2. Çay Polifenollerinin Emilimi, Dağılımı, Metabolizması ve
Uzaklaştırılması 15
1.3.5.3. Çay Polifenollerinin Metabolizma ve Sağlık Üzerine Etkileri 17 1.3.5.3.1. Yağ Metabolizması Üzerine Etkileri 17 1.3.5.3.2. Karbonhidrat Metabolizması Üzerine Etkileri 18 1.3.5.3.3. İyonların Emilimi Üzerine Etkileri 18 1.3.5.3.4. Hormon Metabolizması Üzerine Etkileri 18
1.3.5.3.5. Sağlık Üzerine Etkileri 18
1.3.5.4. Kateşinlerin Antioksidan Aktivitesi 19
1.4. Sisplatin ve Apoptozis 20
1.4.1. Apoptozun Gen Regülasyonu 21
1.4.1.1. p53’ün Rolü 21 1.4.1.2. Bcl–2 / Bax 21 1.5. Hsp 23 2. GEREÇ VE YÖNTEM 24 2.1. Hayvan Materyali 24 2.2. Deneme Düzeni 24 2.3. Laboratuar Analizi 25
2.3.1. Western Blot Analizi ile Protein Ekspresyonunun Ölçümü 26
2.4. Histopatolojik Değerlendirme 27
2.5. İstatistiksel analizleri 27
3. BULGULAR 28
3.1. Gruplarda Üre ve Kreatinin Düzeyleri 28
3.1.1. Üre Düzeyleri 28
3.1.2. Kreatinin Düzeyleri 28
3.2. Serum MDA Düzeyleri 29
3.4. Böbrek Bax Expresyonu 29
3. 5. Böbrek Bcl-2 Expresyonu 29
3.6. Böbrek Hsp60 Expresyonu 30
3.8. Histopatolojik Sonuçlar 32
4. TARTIŞMA 34
5. KAYNAKLAR 43
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 1. Antioksidan Maddelerin Sınıflandırılması. 13
Tablo 2. Çay Yaprağının Bileşimi. 16
Tablo 3. Farklı Çay Tiplerinin Fenolik Madde Kompozisyonu. 17 Tablo 4. Saf antioksidanlar ve çay fraksiyonlarının antioksidan aktivitesi. 20
Tablo 5. Araştırmada kullanılan diyetin bileşimi. 24
Tablo 6. Gruplarda serum üre-N ve kreatinin düzeyleri. 28
Tablo7. Gruplarda serum MDA düzeyleri. 29
Tablo 8. EGCG uygulamasının rat böbrek dokusundaki morfolojik değişiklikler
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1. Cis-Diamminedichloroplatinum (CDDP ). 1
Şekil 2. Memeli hücrelerinde apoptotik programın basitleştirilmi şeması. 22 Şekil 3. Gruplarda ratların böbrek dokusu bax ekspresyon düzeyleri. 30 Şekil 4. Gruplarda ratların böbrek dokusu Bcl-2 ekspresyon düzeyleri. 30 Şekil 5. Gruplarda ratların böbrek dokusu Hsp60 ekspresyon düzeyleri. 31 Şekil 6. Gruplarda ratların böbrek dokusu Hsp70 ekspresyon düzeyleri. 31 Şekil 7. Hematoxylin and eosin (H&E) ile gruplara göre böbreğin histopatolojik
KISALTMALAR LİSTESİ ABY : Akut Böbrek Yetmezliği
AIF : Apoptozis İndükleyici Faktör
Apaf-1 : Apoptotik Proteaz Aktivite Edici Faktör-1 ARE : Antioksidan Cevap Elementi
ATP : Adenintrifosfat BSO : Butionin Sulfoksimin BUN : Kan Üre Nitrojeni
Ca : Kalsiyum
CDDP : Sisplatin
Cu : Bakır
DNA : Deoksiribonükleik asit EC : Epikateşin
ECG : Epikateşingallat EGC : Epigallokateşin EGCG : Epigallokateşin galat EPO : Eritropoietin
FDA : Food and Drug Administration GFH : Glomeruler Filtrasyon Oranı GSH : Glutatyon GSH-Px : Glutatyon Peroksidaz GSSG : Okside Glutatyon GST : Glutatyon-S-Transferaz H2O2 : Hidrojen Peroksit IL-6 : İnterlökin-6 İ.P. K : İntraperitoneal : Potasyum MDA : Malondialdehit Mg : Magnezyum Na : Sodyum
ROS : Serbest Oksijen Radikalleri SF : Serum Fizyolojik
SOD : Süperoksid Dismutaz TNF-α : Tümör Nekroz Faktor-alfa
TPA : 12-o-tetradekanoil porbol-13-asetat
1. GİRİŞ 1.1. Sisplatin
Sisplatin (cis-diamminedichloroplatinum(II) =CDDP) birçok malignensinin tedavisinde kullanılan potent ve değerli bir kemoterapi ajanıdır(1).
Sisplatinin antitümöral aktivitesi, Rosenberg ve ark.(2) 1961’li yıllarda başlayan çalışmalarının sonucunda şans eseri olarak ortaya çıkarılmıştır. Amonyum klorür içeren odacık içine bırakılan platinum elektrodlar sayesinde Echerichia Coli’nin hücre bölünmesinin durduğu, ancak uzamanın devam ettiği gözlenmiştir. Bu etkinin, elektrodlar arasında elektrik akımı ilerlerken, burada üretilen elektroliz ürünlerinin varlığı neticesinde oluştuğu anlaşılmıştır. Elektroliz ürünlerinin analiziyle ilk olarak ammonium chloroplatinate elde edilmiş, daha sonra bu ajanın, nötral türleri olan –trans ve –cis izomerlerine dönüşmesiyle cis-diamminedichloroplatinum II elde edilmiştir (3) (şekil 1).
Faz 1 çalışmalarda, CDDP’nin belirgin gastrointestinal ve böbrek toksisitesinin görülmesi üzerine nerede ise terk edilmek üzere iken, testiküler kanserlerde elde edilen başarılı sonuçlar, bol hidrasyon ve mannitol kullanımı ile nefrotoksisitenin azaltılabileceğinin görülmesi üzerine tekrar ilaç üzerinde çalışmalar yapılıp, geliştirildikten sonra, 1978’de FDA’nin (Food and Drug Administration) onayıyla klinik uygulama alanına hızla girmiştir (1, 4-5). CDDP günümüzde de; daha çok Akciğer küçük hücreli tümörleri, over, testis, mesane, baş-boyun kanserleri gibi solid tümörlerde ve refrakter lenfoma gibi hematolojik malignensilerde kullanılan geniş spektrumlu bir antineoplastik ilaçtır (5).
NH3
Cl Pt Cl NH3
Şekil 1. Cis-Diamminedichloroplatinum (CDDP )
Sisplatin cis yapılanmasında iki klorlu “yer değiştiren grup” içeren nötral bir moleküldür. CDDP molekülü içerisindeki ‘’-trans’’ yerine ‘’–cis’’ yapılanması sayesinde deoksiribonükleik asitlere (DNA) bağlanması ve aktivite kazanması gerçekleşmektedir. Bu açıdan cis yapılanmasının etkisi oldukça önemlidir (2, 6). Bu
yapı kan plazması gibi klorür içeriği 100 mM’dan yüksek olan ortamlarda stabildir. Hücre içi klorür yoğunluğunun az olduğu ortamlarda ise molekül yapısındaki klorür atomlarını kaybederek, DNA ve diğer büyük moleküllerle kovalent olarak bağlanıp reaktif elektrofillerini verir (7). CDDP pürinlerin N7 pozisyonu ile reaksiyona girip mono veya bifonksiyonel DNA fragmantasyonlarının oluşmasına sebep olur (8). CDDP DNA etkileşimi sonucunda d(GpG)Pt, d(ApG)Pt ve d(GpNG)Pt zincir içi çapraz bağlanmaları oluşur. Bu bağlar ile DNA sarmalında yerel kıvrımlanmalar ve açılmalar gerçekleşir. Bu değişikliklerle hücre zedelenmesi oluşturup, Apoptozis düzeyindeki morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerle etkisini gerçekleştirir (9-10). Ayrıca CDDP’nin radyasyon ve diğer kemoterapatik ajanlarla sinerjistik etkileşimi olmaktadır. Platin bileşiklerinin hem letal hem de subletal radyasyonla indüklenen hasarın onarım proçesini inhibe ettiği gösterilmiştir.
1.1.1. Sisplatinin Farmakokinetik Yapısı
Sisplatin gastrointestinal kanaldan emilmez, plazma proteinlerine yaygın olarak bağlanır (% 90) (11-12). Ratlarda dolaşımdaki total plazma platinumun % 50’si CDDP verilişinden bir saat sonra proteinlere bağlı olarak tespit edilir (10). İntravenöz bolus olarak verilmesini takiben serbest CDDP iki saat içinde plazmada tesbit edilemez hale gelir. 1 mg/kg CDDP’nin bir saatlik infüzyonu sonunda pik plazma düzeyleri oluşur, sonra hızla azalır. Sıçanlara CDDP verilmesinden 30 dk. sonra böbrek, mesane, karaciğer, femur, böbrek üstü bezi ve ince bağırsaklarda plazmadan daha yüksek oranda CDDP saptanır (13). İlacın prostat ve overlerdeki yoğunlukları da yüksek miktarlardadır (14). CDDP’nin merkezi sinir sistemine geçiş oranı düşüktür (11, 12).
İnsan ve hayvan çalışmalarında ilk 24 saatte ilacın % 80’inin idrarla atıldığı tespit edilmiştir. İlacın % 8’i sonraki 24 saatte atılır. CDDP’nin safra kanalı yoluyla atılım oranı % 10’un altındadır (15).
Uzamış infüzyonlarda azalmış böbrek klirensi nedeniyle total CDDP ve değişmeden atılan ilaç yüzdesi azalır. Böbrek yetmezliklerinde CDDP’nin yarı ömrü uzar (12).
1.1.2. Sisplatinin Yan Etkileri ve Nefrotoksisite
Sisplatin tedavisine bağlı olarak bulantı-kusma, nefrotoksisite, nörotoksisite, ototoksisite ve daha seyrek olarak da oküler toksisite gözlenebilir (16).
Sisplatin etkisi kümülatif ve doza bağımlıdır. Düşük dozlarda (≤40 mg/m2) böbrek hasarı genellikle geri dönüşümlüdür. Daha yüksek dozlarda (2 mg/kg veya 75 mg/m2) böbrek hasarı akut ve geri dönüşümsüz olabilir. CDDP kullanan hastaların 1/3’ünde böbrek hasarı oluşabilir. Kreatinin klirensi 70 ml/dak’nın altında olanlarda ve 60 yaşın üzerindeki hastalarda risk artar. Şayet aminoglikozidler gibi nefrotoksik ilaç kullanımı da söz konusu ise yüksek CDDP dozları ve hızlandırılmış infüzyon hızları böbrek hasarı riskini daha da arttırır (12). Kreatinin kliresinin azalması nefrotoksisite açısında başlangıç klinik bulgularından olup, serum kreatinin yüksekliği de gözlenebilir (16, 17). CDDP alan hastaların % 25’inde 1-2 hafta süreli ve geri dönüşümlü azotemi meydana gelebilir. Kan üre nitrojeni (BUN) ve kreatinin değerlerinde görülen bu yükselme hafif ve geri dönüşümlü ya da ağır ve geri dönüşümsüz olabilir. BUN ve kreatinin seviyelerindeki pik seviyelere tedavi sonrası 13. günde ulaşılır ve ortalama 21 günde normal seviyelere döner (16).
Sisplatin sonrası gözlenen nefrotoksitenin etkisi net olarak bilinmemekle birlikte genel kabul gören görüş; renal hasarın renal peroksidasyonla ilgili mekanizma üzerinden olduğudur. Yapılan çalışmalarda CDDP tedavisi sonrasında in vivo şartlarda lipit peroksidasyonundaki artıştan ziyade, peroksidasyona karşı koruyucu enzim aktivitelerinde azalma olduğu tespit edilmiştir (18). Sıçanlarda CDDP tedavisi sonrasında glutatyon (GSH), Glutatyon-S-Transferaz (GST), redüktaz ve peroksidaz aktiviteleri böbrek; kortikal, mikrozomal ve sitozolik fraksiyonları da azalır. Lipit peroksidasyonu ve okside glutatyon (GSSG) ise artar GST’nin sınıfındaki azalma oldukça belirgindir (10). Lipit peroksidasyonuna karşı koruyucu rolü olan GST, glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve katalaz enzimlerinin böbrek ve karaciğerlerde azaldığı sıçan ve insan çalışmalarında gösterilmiştir (19, 21).
Dokularda çalışılan enzimler içinde en ciddi azalmayı gösteren böbrekteki GST aktivitesidir (22). GST enzimi alkilleyici ajanların detoksifikasyonlarının başlatılmasında önemli bir fizyolojik role sahiptir. Bu enzim, zararlı etkiye sahip ajanlarla glutatyonun sülfidril grubu arasındaki reaksiyonu katalizleyerek daha fazla suda eriyebilen ürünler meydana getirir (21). GST izoenzimleri incelendiğinde CDDP tedavisi alan ratların böbreklerinde özellikle -GST’nin aktivitesinde azalma olduğu görülüp, bunun da CDDP’ye bağlı böbrek hasarı ile yakından ilişki içerisinde olduğu
görülmüştür (19, 23). CDDP‘ye bağlı nefropatide CDDP’nin sülfür grubu içeren moleküllerle olan etkileşimi de önemlidir. Nükleofilik sülfür atomu CDDP’nin bağlanma yeridir. CDDP cis- Pt(NH3)2(H2O) + cis- Pt(NH3)2 Cl (H2O)]+ gibi hidrolize olmuş ürünleri, sülfür grubu içeren moleküllerle CDDP’ye göre çok daha hızlı olarak etkileşime girer (23). Pozitif yüklü hidrolize ürünler, CDDP kadar kolayca hücre zarlarını geçemez. Bu nedenle CDDP’nin hidrolize olmuş ürünlerinin etkisine duyarlı noktaların başında, proksimal tübülüs hücreleri gelmektedir (24).
Sisplatin metabolitlerinin GSH ve metallotioninler gibi sülfidril grubu içeren proteinler ve sitozolik hücre proteinlerine bağlanması son derece önemlidir. Protein ve protein olmayan yapılarda sülfidril grupları enzim aktiviteleri gibi birçok hücresel fonksiyonun devamlılığı için kullanılır (25, 26). Sülfidril içeren gruplarla CDDP’nin etkileşimi başta GSH olmak üzere bazı hücresel koruyucularda azalmaya neden olur. CDDP’ye bağlı GSH azalmasının GSH’nın oksidasyonundan çok CDDP’nin sülfidril gruplarına doğrudan bağlanmasıyla olduğu tespit edilmiştir (27). Yine benzeri şekilde CDDP’nin indüklediği böbrek hasarında olduğu gibi GSH seviyelerini azaltan bir başka madde olan Butionin Sulfoksimin (BSO) kullanımı ile de renal hasarın arttığı bildirilmiştir (28). Sülfidril içeren bir yapısı olan ve nükleofilik özelliklere sahip olan GSH, CDDP’nin DNA ve diğer büyük moleküllerle olan etkileşimini engeller. BSO ile ortaya çıkarılan GSH azalmasının CDDP‘nin tümör hücrelerine karşı olan etkisini arttırdığı da ileri sürülmüştür (15). Bunun aksini düşünerek GSH ve sülfidril içeren bileşiklerin kullanımının CDDP’ye bağlı oluşan nefropatide koruyucu rolünün olabileceği ileri sürülmüştür (18, 27, 29). Bununla birlikte bu maddelerin koruyucu rolünün olmadığını ileri süren yayınlar da mevcuttur (17).
Sisplatin tedavisine bağlı olarak mitokondrilerde solunum zincirinin devamlılığının bozulması, mitokontrilerde kalsiyum çıkışının artması, kontraktil proteinlerin inaktivasyonu, adenintrifosfat (ATP) üretiminin azalması, sodyum (Na)+ potasyum (K)+ - ATP’az ve kalsiyum (Ca)++/ magnezyum(Mg)+ ATP’az gibi değişik ATP’azların etkilenmesi ortaya çıkar. Bu enzim aktivitesinin inhibisyonu ile Na+/K+ iyonlarının akımı etkilenerek hücre içi K+ seviyeleri düşmesi gözlenebilir ve bu durum hücresel toksisiteye sebep olabilir (30, 32). Mitokondrial GSH azalması mitokondri içindeki sülfidril gruplarının kaybını da beraberinde getirir (28).
Sisplatin uygulanan deney hayvanları kontrol gruplarıyla karşılaştırılmış ve mevcut mitokondri kaybının yanında şişme ve birleşmeye bağlı mitokondri yüzey alanında bir artış görülmüştür (33). CDDP nefrotoksisitesinde mitokontrial DNA hasarı da önemlidir (18). CDDP’nin indüklediği nefropatide hemodinamik faktörler de önemli rol oynamaktadır. CDDP tedavisine bağlı olarak ortaya çıkan platelet aktive edici faktörün (PAF) arteriolar ve/veya mezangial vazokonstriksiyona neden olarak renal kan akımı ve GFH’yi (glomerular filtrasyon hızı) azalttığı bildirilmektedir. CDDP’ye bağlı renal hasarın başlangıcında görülen proksimal tüp emilim bozukluklarının azalmış renal kan akımı ile arttığı ve böbrek hasarında preglomeruler vazokonstriksiyonun önemli rol oynadığı ileri sürülmüştür (34, 35).
1.1.3. Patogenez
Sisplatine maruziyeti takiben renal disfonksiyonların gelişimine birçok mekanizma neden olmaktadır. Bunlar selüler toksisite, renal mikrovasküler yapıda vazokonstriksiyon ve proinflamatuvar etkilerdir.
1.1.3.1. Hücresel toksisite
Özellikle düşük klor ortamında CDDP güçlü hücresel toksindir. Hücrelerin içinde, CDDP’deki klor atomları su molekülleri ile yer değiştirirler. Bu hidroliz ürününün nükleusda DNA ile sitoplazmada GSH ile reaksiyona giren aktif bir yapı olduğuna inanılır (12). Tümör ve diğer bölünen hücrelerde, CDDP-DNA “intrastrand crosslink” sitotoksisitesi ile sonuçlanır (36). Bu moleküler olayların kanser hücrelerinin çoğalmasını durdurmada sorumlu olduğuna inanılır (37, 38).
1.1.3.2. Vazokonstriksiyon
Renal mikrovasküler yapıdaki vazokonstriksiyon CDDP uygulanmasından hemen sonra ortaya çıkıyor gibi gözükmektedir (39, 40).
1.1.3.3. Proinflamatuar etkiler
Sisplatin; tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-6 (IL-6), interferon-gama (İFN-γ), hücresel inflamatuar cevapta T hücreleri, nötrofiller ve hücresel inflamatuar cevabın diğer komponentlerinin farklılaşması, matürasyonu ve aktivasyonu sağlayan kaspaslar gibi proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu artırmaktadır (41, 42). CDDP ile oluşturulan akut böbrek yetmezliğinin (ABY) deneysel modelinde böbrekte endotelyal hücre adhezyon moleküllerinin artmış ekspresyonunu ve T hücreleri ve lökositlerin daha sonraki infiltrasyonu
gösterilmektedir (43-45). Bu mediatörlerin potansiyel önemi bu inflamatuar yollarda defekti olan sıçanlarda CDDP’ye maruziyeti takiben ABY’nin şiddetinin daha az olması ile gösterilmiştir (42, 46, 47).
1.1.3.4. Proksimal tübüldeki etkiler
Proksimal tübül hücreleri CDDP’den selektif şekilde etkilenirler. Bu hem nekroz hem de apoptozis ile gösterildiği gibi, prolifere olmayan hücreler DNA’ya hasar veren ajanların toksisitesine genellikle daha az sensitifdirler (48). Gözlenen nefrotoksisite için muhtemel nedenler; yardımcı transport ile renal uptake’inin artması, proksimal tübüldeki CDDP’nin GSH’a ve sistein-glisin konjugatlarına metabolize olması (49) ve reaktif oksijen tiplerinin oluşumudur (50-52).
Sisplatin-ile oluşan nefrotoksisite için öne sürülen diğer hücresel etkiler: Mitokondrial F1F0-ATPaz’ın inhibisyonunun, sitokrom C salınımına ve apoptotik
hücre ölümüne neden olarak membran potansiyeli ve mitokondrial oksidatif fosforilasyonu azaltması (53).
Proksimal tübülde yağ asidi oksidasyonunun inhibisyonundan dolayı, böbrek dokusunda non-esterifiye yağ asidleri (NFED) ve trigliseridlerin akümülasyonu ve hiperlipideminin indüksiyonu (54, 55).
Renal epitelyal hücrelerde peroxisome-proliferator-activated-receptor-alpha (PPAR-α) aktivitesinin direkt inhibisyonu (56, 57).
1.1.4. Sisplatin Nefrotoksisitesinin Klinik Yansıması
Sisplatin nefrotoksisitesinin en önemli belirtisi ilerleyici olabilen renal bozulmadır. Diğer renal belirtiler hipomagnezemi, tuz kaybı, Fanconi-benzeri sendrom ve anemiyi içermektedir.
1.1.4.1.Renal Bozulma
Renal bozulma insidansı ilacın uygulama dozu ve frekansına ve nefrotoksisiteyi tanımlamak için kullanılan kriterlere göre değişmektedir. CDDP ile yapılan başlangıç faz I ve faz II çalışmalarında nefrotoksisite gözlenmiştir ve yoğun hidrasyon rejimleri kullanılmadan önceki dönemlerde bu çalışmalardan % 50 daha fazla görülmüştür (1, 58).
Renal yetmezliğin bu insidans ve şiddeti daha sonraki dönemlerde artmakta ve daha da ileriki dönemlerde geri dönüşümsüz olmaktadır. Sonuç olarak; CDDP
tedavisinin durdurulması genellikle progresif renal bozulmanın erken kanıtları başladığında olur.
Bu gözlemler platinumun konvansiyonel dozlarının uygulamasında yapılmaktadır. Potent anti-tümör aktivitesine rağmen, CDDP hematopoiteik kök hücre transplantasyonu öncesi kemik iliği ablasyonu için gereken yüksek dozlarda şiddetli toksisite nedeni ile kullanılamazlar (59). Bunun yerine bu amaç için daha az toksik bir analog olan karboplatin kullanılmaktadır.
Eğer renal yetmezlik ilerlememiş ise, nefrotoksisiteli hastalarda idrar çıkışı, konsantrasyon defekti nedeni ile tipik olarak 1000 ml/gün olmaya devam eder. Bu defekt üriner konsantrasyon için zıt akım gradyanın gerekli olduğu henle kulpunda veya antidiüretik hormonun etki yeri olan toplayıcı tübüllerde platinum ile oluşan hasarı göstermektedir (60). Toplayıcı tübüllerdeki hasar su kanallarının (aquaporin) azalmış ekspresyonu ile birliktedir (61). Ayrıca CDDP nefrotoksisitesinin organik katyonik transporter ile oluşabileceği de gözükmektedir (62).
Sisplatine bağlı ABY genellikle nonoligürik şekilde olur. Poliürinin iki ayrı safhası vardır. CDDP verildikden sonraki ilk 24-48. saatlerde idrar osmolaritesi düşer ancak GFH düşmez. Bu erken poliüri spontan olarak düzelir. İkinci poliüri 72-96 saatlerde osmolarite ve GFH düşüklüğü ile birlikte gelişen fazdır. İlk faz dışarıdan verilen yüksek doz vazopressine yanıt verir. Bu fazda prostaglandinlerin fazla salgılanması ile oluşan konsantrasyon defektleri oluşmaktadır. Prostaglandin sentezinde artış olmasına rağmen dışarıdan verilen aspirin ve diğer antienflamatuarlara yanıt yoktur. Bu faz boyunca vazopressin seviyesi düşüktür. Gelişen poliüri ise böbrekteki konsantrasyon defektine bağlıdır. Bu fazda prostaglandinlerin ve vazopressinin rolü yoktur (63). Özellikle yüksek doz uygulanan CDDP tedavisi sonrasında plazma K+ seviyelerinde belirgin azalma olduğu gözlenmiştir. Bu durum renal K+ kaybına bağlı olup beraberinde Mg+ eksikliğine de yol açabilir. Ayrıca kemoterapi esnasındaki şiddetli kusmalar da hipokalemiyi derinleştirir (3, 17). Proksimal tübüldeki reabsorbsiyonun düşüşü Na+ ve suyun daha distal segmentlere salınmasına sebep olur. Bu da Na+ yükü bağımlı K+ sekresyonuna yol açıp, mevcut hipokalemiyi daha da derinleştirir (17, 64).
Yapılan çalışmalarda CDDP’nin hem proksimal hem de distal tübüllerde Na+ reabsorbsiyon hızlarını etkilediği, renal Na+ kaybının doza bağımlı olduğu ve hemen
her zaman yüksek doz CDDP tedavisine eşlik ettiği gösterilmiştir (>40 mg/m2/gün). Hastalarda gözlenen Na+ klirensindeki artışın tedaviyi izleyen 6 ay boyunca devam edebileceğine dikkat çekilmiştir (17, 64).
1.1.4.2. Hipomagnezemi
Normal erişkinlerde filtre edilen Mg+’nin sadece % 25’i proksimal tübülden reabsorbe edilir. Yapılan çalışmalarda CDDP (20 mg/m2/gün) ile 4-6 siklus sonrasında hipomagnezeminin geliştiği gösterilmiştir (65). Bu çalışmalarda akut klinik tablo sıklıkla gözlenmemektedir. Bu durumun sebebi Mg+’deki düşüşün yavaş olarak gözlenmesine bağlanmıştır. Yüksek doz CDDP ile tedavi edilen hastalarda Mg+ klirensinde belirgin bir artış ve plazma Mg+ seviyesinde anlamlı düşüş gözlenmemiştir. CDDP’nin henle kulpunun çıkan kolunda Mg+ transportunu değiştirdiği anlaşılmıştır. Proksimal tübülden Mg+ reabsorbsiyonu azalması ile birlikte hastalara uygulanan serum fizyolojik infüzyonu da plazma Mg+ seviyesinin düşmesine katkıda bulunmuş, hatta bu artış mannitol kullanımıyla % 40-50 oranında şiddetlenmiştir (62).
1.1.4.3. Trombotik anjiopati
Sisplatin, bleomisin ile birlikte verildiğinde; hemolitik-üremik sendromun (HÜS) veya trombotik trombositopenik purpuranın (TTP) özellikleri ile birlikte olan trombotik mikroanjiopatiden oluşan renal yetmezliğin farklı bir formu ile birlikte olabilir (66). Trombotik mikroanjiopati ayrıca gemsitabin ile CDDP verildiğinde de tanımlanmıştır. Bu bozukluk muhtemelen sekonder trombosit aktivasyonu ile olan direkt vasküler yaralanmayı yansıtmaktadır.
Renal yetmezliğin başlaması ani veya yavaştır. Yavaş olduğunda, tedavi bırakıldıktan aylar sonra da gelişebilir. Tanı mikroanjiopatik hemolitik anemi veya trombositopeninin varlığı ile konur.
1.1.4.4. Fanconi-benzeri sendrom
Sisplatin ile oluşan nefrotoksisite Fanconi-benzeri bir sendromun gelişmesi ile olabilir. Bu sendrom; glukoz ve aminoasidlerin (alanin, valin, lösin, metionin) üriner konsantrasyonlarının artması ve trikarboksilik asid siklus (TCA) metobolitlerinin (laktat ve piruvat) idrarda bulunması ile tanımlanır. Tübüler hasarın bir belirteci olmasının yanında, glukozüri ayrıca CDDP ile oluşan glukoz intoleransı ve glukoz uyarısına anormal insulin ve glukagon cevabı nedeni ile olan hiperglisemi sonucu da
olabilir (54, 67, 68). Klasik Fankoni sendromu hiç bildirilmemiştir, ancak orta derecede tübüler disfonksiyon devam edebilir (69).
Ayrıca, yüksek moleküler ağırlıklı proteinler ve N-acil-beta-glucozaminidaz (NAG) gibi glomerüler ve tübüler toksisite belirteçleri, akut CDDP nefrotoksisitesinde oldukça artmıştır (70).
1.1.4.5. Tuz kaybı
Klinik olarak belirgin tuz kaybı, vaka bildirimlerinde ve küçük klinik serilerde tanımlanmış olan CDDP nefrotoksisitesinin nadir bir belirtisidir (71-72).
1.1.4.6. Anemi
Sisplatin sıklıkla anemi ile ilişkilidir ve bu diğer kan hücreleri üzerine olan myelosüpressif etkisinin dışındadır. İnsan ve hayvan çalışmaları CDDP ile oluşan renal tübüler yaralanmanın anemiye neden olan eritropoietin (EPO) eksikliğinden kaynaklandığını düşündürmektedir (73).
EPO-stimüle edici ajanlar ile tedavi böyle durumlarda yararlı olabilir. 1.2. Oksidatif Sistem
Sağlıklı bir organizmada normal metabolizma sırasında serbest oksijen radikalleri (ROS) oluşmaktadır. Bu nedenle ROS’ların varlığı her zaman biyolojik bozukluk olarak kabul edilmemektedir. Oksidatif hasar oluşmasında serbest ROS yapımında artış ve/veya antioksidan sistem yetersizliği söz konusudur. Hiperoksi, inflamasyon, iskemi, radyasyon, antibiyotik tedavisi gibi bazı hücresel metabolik bozukluk durumlarında artan ROS üretimi durumunda membranlar, enzim, nükleik asit ve polisakkaritler üzerine toksik etki ile doku hasarı gelişmektedir. Antioksidan sistem yetersizliğinde ise ortamdan uzaklaştırılamayan ROS ile doku hasarı ortaya çıkmaktadır (74). Hafif oksidatif stres artışı durumuna dokular ekstra antioksidan sistemlerini aktifleştirerek yanıt verirler. Şiddetli oksidatif stress, hüce hasarı ve ölümüne sebep olabilir. Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikalller; oksijen kökenli olanlardır. ROS aerobik metabolizma esnasında üretilir ve hücredeki tüm moleküller (özellikle lipidler) ile reaksiyona girebilirler (75). ROS’ların önemli kaynaklarından biri nötrofil, monosit, eozinofil ve makrofajlarda bulunan plazma membranına bağımlı nikotin adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidazdır. Fagositik hücreler stimüle edildiğinde oksijen tüketiminde artış ve hekzos-monofosfat şantının aktivasyonu gerçekleşir (76).
1.2.1. Lipid Peroksidasynu
Lipid peroksidasyonu poliansature lipidlerin ROS’lar tarafından oksidatif bozunma reaksiyonudur. Lipid peroksidasyonu, membranda bulunan ve fosfolipid, glikolipid, gliserid ve sterol yapısında yer alan poliansature yağ asitlerinin, ROS tarafından peroksitler, alkoller, aldehitler, hidroksi yağ asitleri, etan, pentan gibi çeşitli ürünlere yıkılması reaksiyonudur (77). Lipid peroksidasyonuna yol açan serbest radikaller, bir yada daha çok sayıda eşleşmemiş elektronları içeren moleküllerdir. Eşleşmemiş iki elektronu nedeniyle kararsız yapıda olan moleküler oksijenin redüklenmesi ya da eksitasyonu süperoksit anyonu (O2-), hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikali (OH-) ve singlet oksijen (1O2 ) gibi, serbest oksijen radikallerini oluşturmaktadır (78, 79).
1.2.2. Biyolojik Sistemlerde Lipid Peroksidasyonun Sonuçları
Lipid peroksidasyonu sonucu açığa çıkan ürünler, membran permeabilitesini ve mikroviskozitesini önemli ölçüde etkilemektedir. Membranlardaki yağ asitlerinin peroksidasyonuyla oluşan kısa zincirli yağ asitleri ve bazı aminoasitleri içeren yapısal proteinlerin oksidasyonu, membran permeabitesinin artmasına ve membrandaki akışkanlığın azalmasına neden olmaktadır (80, 81).
Lipid hidroperoksitleri ve lipid peroksi radikalleri, ROS gibi aynı hücrenin birçok komponenti ile reaksiyona girerek, sellüler ve metabolik fonksiyonlar üzerinde toksik etkilerini gösterirler (77, 80). Membrana bağlı reseptörlerin ve enzimlerin inaktivasyonuna yol açarlar. Böylece;
Membranın sekretuar fonksiyonunun kaybına neden olurlar.
Transmembran iyon gradientini bozarlar. Ca+2 gibi iyonlara karşı non-spesifik permeabiliteyi artırırlar.
Mitokondride oksidatif fosforilasyonu çözerler, mikrozomal enzim aktivitelerinde değişikliklere yol açarlar, subsellüler organellerin bütünlüğünün kaybolmasına neden olurlar.
Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonu, malondialdehit (MDA) üretimi ile sonuçlanmaktadır (80). Membran komponentlerinin polimerizasyonuna ve çapraz bağlanmalarına neden olan MDA; deformabilite, iyon transportu, enzim aktivitesi ve hücre yüzeyindeki determinantların agregasyonu gibi,
iç membranın bazı özelliklerini değiştirmektedir. Ayrıca diffüze olabildiğinden, DNA’nın nitrojen bazlarıyla reaksiyona girmektedir. MDA bu özelliklerinden dolayı mutajenik, genotoksik ve karsinojenik bir bileşiktir (80-82).
Yağ asidi hidroperoksitlerinin başka bir toksik etkisi de araşidonik asit metabolizmasında gözlenmektedir. Yüksek lipid peroksid seviyeleri prostasiklin sentezini güçlü bir şekilde inhibe edeceğinden araşidonik asit metabolizması tromboksan sentezine doğru yeniden düzenlenecek, nihayetinde nötrofil stimülasyonu, süperoksit anyon üretimi ve trombosit agregasyonu tekrar module olacaktır (80).
Aterosklerotik proçesde ilk adım vasküler endotelyal tabakanın hasarıdır. Aterosklerotik plağın yapısındaki ansature yağ asitlerinin oksidasyonu sonucu açığa çıkan lipid peroksitleri ilave peroksit üretimine yol açtıkları gibi arteryel duvarın protein, mukopolisakkarit gibi başka komponentlerini hasara uğratmaktadır. İnsan plazma lipoproteinleri arsasında en çok LDL’lerin peroksidasyona maruz kaldığı gösterilmiştir. Peroksidasyon sonucunda LDL’nin bileşimi ve biyolojik özellikleri değişerek modifiye LDL oluşmaktadır (82).
Sonuç olarak; hücre membranı hasarında, aterosklerozda, kanser ve yaşlanmada etyolojik bir faktör olarak lipid peroksidasyonu önemli şekilde yer işgal etmektedir.
1.3. Antioksidan Savunma Sistemleri
Hücreler, oksidatif hasarı önleyen, sınırlayan ya da kısmen tamir eden koruyucu mekanizmalara sahiptirler (83).Memeli hücrelerinde oksidan ürünlere karşı korunma üç prensip içinde gerçekleşmektedir (83, 84):
a- Oluşan radikallerin detoksifikasyonu, b- Radikal reaksiyonlarının sona erdirilmesi, c- Radikal oluşumunun sınırlandırılması. 1. 3.1. Antioksidanların Sınıflandırılması
Antioksidan maddeler endojen, eksojen ve gıda kaynaklı antioksidanlar olarak 3 grupta toplanırlar (85). Antioksidan maddelerin sınıflaması Tablo.1’de gösterilmiştir.
1. 3. 2. Antioksidanların Etki Mekanizmaları Antioksidanlar etkilerini 4 yol ile gerçekleştirirler (86).
bir moleküle çevirme işlemiyle antioksidan etki oluşumu
2. Bastırıcı etki: ROS’larla etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltarak veya inaktif şekle dönüştürerek antioksidan etki oluşumu
3. Onarıcı etki: ROS’ların oluşturduğu oksidatif streste süperoksid dismutaz (SOD) enzim aktivitesinin arttırılması ile koruyucu etkinlik gerçekleştirilmesi
4. Zincir kırıcı etki: ROS’ları kendine bağlayarak (hemoglobin gibi) zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyerek antioksidan etki oluşturulması
1.3.3. Endojen Antioksidanlar 1.3.3.1 Enzimatik Antioksidanlar
SOD, sitokrom oksidaz, katalaz, GSH-Px, glutatyon redüktaz serbest radikallerin birikmesini ve lipid peroksidasyonunun başlamasını önleyen enzimlerdir (87).
1. Sitokrom oksidaz sistemi: Hücrelerdeki oksijenin % 95-99 kadarını etkisizleştirir. Yetmezlik durumunda diğer enzimler devreye girer (83).
2. Süperoksid dismutaz (SOD): Süperoksit radikallerini hidrojen perokside dönüştüren dismutasyon reaksiyonunda etkili metalloprotein yapısındaki enzimlerdir (87). Serbest radikallere karşı organizmadaki ilk savunma SOD enzimiyle gerçekleşir. SOD, katalaz ve glutatyon peroksidazdan farklı olarak serbest radikali substrat olarak kullanır.
Emzimin fizyolojik fonksiyonu, oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit radikallerin zararlı etkilerine karşı korumaktır. Böylece lipid peroksidasyonunu inhibe eder. SOD aktivitesi, yüksek oksijen kullanımı olan dokularda fazladır ve doku pO2 artışı ile artar. Normal metabolizma sırasında hücreler tarafından yüksek oranda süperoksit üretimi olmasına rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler süperoksit düzeyleri düşük tutulur. SOD’un ekstrasellüler aktivitesi düşüktür. Organizmada oksidan stresin attığı klinik durumlarda SOD enzim aktivitesi artarak koruyucu etkinliğini devam ettirir. Üremi, Down sendromu, karaciğer hastalığı, böbrek yetmezliği olan hastaların eritrositlerinde Cu-Zn SOD enzim aktivitesi yüksek bulunmuştur (88).
Tablo 1. Antioksidan Maddelerin Sınıflandırılması
I-Endojen antioksidanlar 1-Enzim olanlar
a-Mitokontrial sitokrom oksidaz sistemi b-Süperoksid dismutaz
c-Katalaz
d-Glutatyon peroksidaz, Glutatyon –S-transferaz e-Hidroperoksidaz
2-Enzim olmayanlar
a-Lipid fazda bulunanlar
i - -tokoferol (E vitamini) ii - - karoten
b-Sıvı fazda bulunanlar: Askorbik asit, melatonin, ürat, sistein, seruloplazmin, transferin, laktoferin, myoglobin, hemoglobin, ferritin, metionin, albumin, bilirubin, glutatyon
II- Eksojen Antioksidanlar (ilaçlar)
1- Ksantinoksidaz İnhibitörleri: Tungsten, allopurinol, oksipurinol, folik asit 2- NADPH Oksidaz inhibitörleri: Adenozin, lokal anestetikler
3- Rekombinant Süperoksid Dismutaz
4- Endojen antioksidan aktiviteyi arttıran maddeler: Ebselen, asetilsistein 5- Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol, albumin 6- Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin, seruloplazmin 7- Sitokinler: Tümör nekroz factor(TNF), IL-1
8- Demir şelatörleri III- Gıda antioksidanları
1- Butylated Hydroxytoluen( BHT ) 2- Butylated Hydroxyanisone (BHA) 3- Sodyum Benzoat
4- Fe-Süperoksid Dismutaz
3- Glutatyon ve Glutatyon Enzimleri : Glutatyon enzimleri 3 ana grupta toplanır (85).
a- GSH-Px
b-Fosfolipid Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz (PGSH-Px) c-Glutatyon S- Transferaz:
4- Glutatyon redüktaz ve Glukoz –6- fosfat dehidrogenaz: Antioksidan savunma etkinliğinin sürdürülmesi için oksitlenmiş glutatyonun tekrar indirgenmiş şekle dönüşmesi gerekir. Glutatyon redüktaz NADPH varlığında oksitlenmiş glutatyonun indirgenme reaksiyonunu katalizler. Bu oksido-redüksiyon enziminin koenzimi NADPH varlığında oksitlenmiş glutatyonun indirgenme reaksiyonunu katalizler. Bu oksido-redüksiyon enziminin koenzimi NADPH, prostetik grubu ise flavin adenin dinükleatidir (FAD). Sitozol ve mitokondride lokalizedir. Şelat yapıcı ajanlar ve steroid hormonları glukoz –6-fosfat dehidrogenaz enzimini inhibe ederler (85).
5- Katalaz: Hidrojen peroksitin (H2O2) indirgenmesini katalizler, ancak katalaz H2O2’nin üretildiği tüm hücresel komponentlerde bulunmaz. Bu nedenle radikallere karşı korumada ikincil derecede önemli olduğu kabul edilir ve % 20 oranında stoplazma, % 80 oranında peroksizomlarda lokalizedir. Katalazın indirgeyici aktivitesi H2O2, metil hidroperoksitleri etil hidroperoksitleri gibi küçük moleküllere karşıdır. Büyük moleküllü hidroperoksitlerine ise etki etmez (85, 87).
1.3.3.2. Nonenzimatik Antioksidanlar
1-E Vitamini: Tüm hücresel membranlarda bulunur ve lipid peroksidasyonuna karşı koyucudur. Singlet oksijenin kuvetli bir tutucusudur. Ayrıca hidroksil radikali, peroksi radikali ve süperoksitlerle direkt olarak reaksiyona girebilir. Önemli bir endojen ve eksojen antioksidan olarak hücre membranı bütünlüğünün korunması α-tokoferolün başlıca görevlerinden biridir (75, 89).
2- β –Karoten: A vitamini ön maddesi olan beta karoten etkili bir singlet oksijen ve radikal tutucu antioksidandır. Beta karoten çok etkin olarak triklormetilperoksil radikallerini indirger ve hücresel membranlarda bulunur (83).
3- C Vitamini: Biyolojik ortamların çoğunda askorbat olarak bulunan C vitamini hücre dışı sıvıların en önemli antioksidanıdır. Askorbat etkili olarak H2O2, hipoklorit, süperoksit, hidroksil ve peroksil radikallerini ve singlet oksijeni tutar. C vitamini fizyolojik ve yüksek konsantrasyonlarda antioksidan etkilidir. (83, 87).
1.3.3.3. Diğer Nonenzimatik Endojen Antioksidanlar
Bazı durumlarda albumin, ürik asit, sistin, bilüribin, seruloplazmin, transferrin, ferritin, keratinin, laktoferrin, östrojenler gibi ufak moleküller de serbest radikallere karşı koruyucu rol oynarlar.
1.3.4. Eksojen Antioksidanlar
1- Besinlerdeki doğal antioksidanlar: Vitamin A, C, E ve β –Karoten 2- Besinlere eklenen antioksidanlar
1.3.5. Diğer antioksidanlar (Farmakolojik)
Çok sayıda ilaç ve kimyasal madde serbest radikallerle oluşan hasarları azaltmak için ya da engel olmak için kullanılmaktadır. Deneysel olarak değişik sitoprotektif etkileri gösterilmiş birçok antioksidan vardır.
İnsan sağlığı bakımından antioksidan fonksiyonları ile ön plana çıkan maddeler E ve C vitaminleri, karotenoidler ve fenolik maddelerdir (90). Fenolik
maddeler, meyve, sebze, baharat, tahıl ve içecekler gibi bitkisel gıdalarda yaygın olarak bulunmaktadır. Çay; fenolik maddelerce zengin içeceklerden birisidir.
Günümüzde sudan sonra en popüler içecek olan çay, güneybatı Çin ve kuzeydoğu Hindistan orjinli çay bitkisinin (Camellia sinensis L. (O) Kuntze), assamica vesinensis çesitlerinin taze yapraklarından üretilmektedir (91). Dünya genelinde üretimi yapılan çaylar, yeşil çay, oolong çay ve siyah çay olmak üzere başlıca üç grup altında sınıflandırılır. Çay bitkisinden hasat edilen yaprakların, kıvırma ile birlikte hemen bir ısıl uygulamaya (genellikle buhar uygulaması) maruz bırakılarak, kurutulmasıyla elde edilen yeşil çay, dünya çay tüketiminin yaklaşık olarak % 20'sini oluşturmakta ve daha çok Japonya, Çin ve diğer Asya ülkelerinde yaygın olarak tüketilmektedir (92, 93). Son yıllarda yapılan pek çok araştırmada sağlık üzerine yararlı etkileri bildirilen yeşil çayın dünya çapında da popülerliği hızla artmaktadır.
1.3.5.1. Yeşil Çayın Bileşenlerinin Kimyası
Çay yapraklarının bileşimi klimatolojik, kültürel ve genetik faktörlere bağlı olarak değişmektedir (94). Çay fenollerinin miktarı diğer bileşenlere göre oldukça fazladır (Tablo 2).
Çay yaprağındaki polifenollerin yaklaşık 3/4’ünü flavanoller, flavanollerin de % 60-70’ini (-)-epigallokateşin-3-gallat (ECGC) oluşturur (94). Bunların yanı sıra quercetin, kaempferol ve rutin gibi flavanoller, kafein, fenolik asitler, theanine ve koku bileşikleri yeşil çayda bulunan diğer bileşiklerdir (97). İşleme yöntemine bağlı olarak çayın fenolik madde miktarıyla birlikte fenolik madde kompozisyonu da değişmektedir (Tablo 3). Örneğin siyah çay kuru maddede % 3-10, oolong çay % 8-20, yeşil çay ise % 30-42 oranında toplam flavanol içermektedir (98).
1.3.5.2. Çay Polifenollerinin Emilimi, Dağılımı, Metabolizması ve Uzaklaştırılması
Çay polifenollerinin farmakolojik özelliklerinin incelenmesi amacıyla insanlar üzerinde yapılan bir çalışmada; epigallokateşin galat (EGCG), epigallokateşin (EGC) ve epikateşin’nin (EC) plazmadaki en yüksek düzeylerine sindirimden yaklaşık olarak 1.4-2.4 saat sonra ulaşıldığı saptanmıştır. EGCG’nin (5.0-5.5 saat) yarısının vücuttan uzaklaştırılması, EGC ve EC’ninkinden (2.5 ve 3.4 saat) daha uzun sürede olmuştur. Toplam idrar EGC ve EC’sinin % 90’lık kısmı 8 saat içinde dışarı atılmıştır. Yeşil
çayın içilmesinden sonra tükrükteki EGC, EGCG ve EC seviyelerinin aynı sürede plazmadakinin 2 katına çıktıgı bildirilmektedir. Tükrükteki kateşinlerin yarılanma ömrü 10-20 dk. olup, plazmadakinden daha kısa sürede olmaktadır. Kateşinlerin (EGCG ve EGC’nin) oral mukozayla absorbe edildiğini gösteren ifadeler de bulunmaktadır. Sıçanlar üzerinde yapılan daha detaylı farmakolojik çalışmalar, yeşil çayın damar içerisine enjeksiyonundan sonra yarılanma ömrü EGCG, EGC ve EC için sırasıyla 212, 45 ve 41 dk olarak bulunmuştur. EGCG’nin en yüksek düzeyine bağırsaklarda, EGC ve EC’nin en yüksek düzeyine ise böbreklerde rastlanmıştır. Yeşil çay solüsyonlarının sıçanlara içme suyu şeklinde verildiği zaman, EGC ve EC’nin kandaki seviyeleri EGCG’ninkinden yüksek bulunmuş, fakat EGC ve EC’nin seviyesi uzun süreli yemlemeden sonra azalmıştır (101).
Tablo 2. Çay Yaprağının Bileşimi (95-96).
Bileşen Kuru Maddede (%)
Flavanoller (Kateşinler) Epikateşin (EC)
Epikateşingallat (ECG) Epigallokateşin (EGC) Epigallokateşin galat (EGCG) Kateşin (C)
Gallokateşin (GC)
Flavanoller ve flavanol glikozitleri Leykoantosiyaninler
Polifenolik asitler ve depsitler Toplam polifenoller Kafein Aminoasit ve protein Basit karbonhidratlar Polisakkaritler Kül Selüloz Lignin Lipidler Organik asitler Pigmentler 17-30 1-3 3-6 3-6 9-13 1-2 3-4 3-4 2-3 5 30-36 3-4 15-19 4 13 5 7 6 2-3 0.5-1,5 0.5
Tablo 3. Farklı Çay Tiplerinin Fenolik Madde Kompozisyonu (99-100). Bileşen Yeşil Çay Siyah Çay Oolong Çayı Epikateşin 6.06a; 1.0-9.54b; 7.22-13.3c; 0.55-0.87e 4.0b; 4.1d; 0.04e 1.75a; 0.34e
Epikateşin gallat 5.34a; 3-4.92b; 1.42-4.54c; 1.95-2.91e 1.19-11b; 8.0d 3.58a; 0.63e Epigallokateşin 36.53a; 2.0-36.2b; 3.94-7.92c; 0.44-0.88e 0.9-6.0b; 10.5d; 0.19e 7.7a; 0.38e Epigallokateşin Galat 18.10a; 6.0-32.6b; 5.55-10.4c; 13.37-13.74e 0.95-12.0b; 16.6d; 0.3e 8.99a; 3.62e
Gallokateşin Galat 0.26-0.38e - 0.11e
Gallokateşin 2.57-2.81b 0.40-1.57b - Gallik asit 0.74-0.78b; 0.23-0.52e 2.79-3.33b; 1.83e 0.58e Teaflavin - 2.5d 0.66a Tearubugin - 59.4d -
* a mg/g; b mg/100 mL; c %; d mg/g (kuru maddede); e % (kuru maddede)
1.3.5.3. Çay Polifenollerinin Metabolizma ve Sağlık Üzerine Etkileri 1.3.5.3.1. Yağ Metabolizması Üzerine Etkileri
Yeşil çay kateşinleri, hayvanlarda (sıçan, fare ve tavşan) yağ metabolizmasını farklı yollardan etkilemekte ve arterlerde plakaların oluşmasını engellemektedir. Yeşil çay kateşinlerinin tüketimi, dışkıdaki yağın atılımını artırmak suretiyle
trigliseritlerin ve kolesterolün emilimini azaltmaktadır (102-104). Çay kateşinleri sistemik etkileri ile direkt kolesterol sentezini inhibe etmektedir. Yeşil çay kateşini tüketimi, özellikle insanda plazma LDL kolesterolünü azaltmak ve plazma HDL kolestrolünü ise artırmak suretiyle damar sertliğini önlemektedir (102). Yapılan çalısmaların sonuçları, uzun süreli çay kateşini tüketiminin yağ metabolizmasını düzenlemek suretiyle yüksek yağlı gıda tüketiminden kaynaklanan obeziteyi önlediğini göstermiştir. Bu mekanizma vasıtasıyla, şeker hastalığının ve koroner kalp hastalıgı riskinin yeşil çay tüketimiyle azaldığı saptanmıştır (105).
1.3.5.3.2. Karbonhidrat Metabolizması Üzerine Etkileri
Çay kateşinleri hipoglisemik ajan olarak pankreasın β hücrelerini zarardan koruyarak, insulin salgısını ve biyolojik aktivitesini artırmaktadır. Normal kan glukoz düzeyine sahip sıçanlara oral yoldan uygulanan glukoz tolerans testinde, yeşil çay kateşini tüketiminin plazma insülin ve trigliserit seviyesini azalttığı fakat plazma glukoz seviyesini etkilemediği bildirilmiştir (106). Yapılan çalışmaların sonuçları; yeşil çay kateşinlerinin tip 2 şeker hastalarını da kapsayan lipid ve glukoz metabolizma hastalıklarına karşı yararlı bir etkiye sahip olduğunu ve önleyici rol oynadığını göstermiştir (105).
1.3.5.3.3. İyonların Emilimi Üzerine Etkileri
Çay kateşinleri Fe eksikligi durumunda demirin emilimini etkilemekte ve anemiye yol açmaktadır. Yeşil çayın uzun süre tüketilmesi Cu’nun emilimini etkilememekte ancak Zn’ninkini azaltmakta ve manganınkini (Mn) artırmaktadır. Yeşil çay kateşinlerinin iyon metabolizmasını ve tüketimini etkileyecek potansiyeli bulunmaktadır. Çünkü flavonoidler metal iyonlarıyla etkileşime girmektedir (105).
1.3.5.3.4. Hormon Metabolizması Üzerine Etkileri
On üç hafta süreyle % 5 gibi yüksek düzeyde yeşil çay ekstraktı içeren rasyonla beslenen sıçanlarda plazmadaki tiroid hormonlarının seviyesinin değiştiği ve tiroid bezinin büyüdüğü saptanmıştır. Yeşil çayın uzun süre çok yüksek miktarlarda tüketilmesi, tiroid bezinin fonksiyonunu olumsuz etkilediğini göstermiştir.
1.3.5.3.5. Sağlık Üzerine Etkileri
LDL oksidasyonu da içeren çesitli faktörler kalp-damar rahatsızlıklarının başlamasını ve ilerlemesini etkileyebilmektedir. Yeşil çay kateşinleri antioksidan özelliğinden dolayı, oksidatif enzimlerin aktivitesini önlemek veya hücresel
antioksidanları artırmak suretiyle, arterlerde LDL oksidasyonu ve plaka oluşumunu önlemektedir. Ayrıca plazmada HDL düzeyini artırmak suretiyle kalp-damar rahatsızlıklarını azaltabilmektedir. Yapılan bir çalışmada yüksek düzeyde yağ ve kolesterol içeren rasyonları tüketen hayvanlarda, çay polifenollerinin serum ve karaciğer lipidlerindeki artışı önlediği, serum total kolesterolünü azalttığı, total lipidlerin ve kolesterolün dışkıyla atılımını artırdığı saptanmıştır (107, 108).
Çay tüketiminin deri, akciğer, özefagus, mide, karaciğer, pankreas, meme, prostat ve kolon kanserlerinin oluşumuna neden olan kimyasal kanserojenlere karşı koruma sağladığı bildirilmektedir (94, 96, 101). Yeşil çayın polifenol fraksiyonları H2O2 oluşumunu teşvik eden 12-o-tetradekanoil porbol-13-asetat (TPA)’ı ve 8- hidroksideoksi guanozin oluşumunu inhibe etmektedir. Yeşil çay preparatları TPA tarafından teşvik edilen epidermal ornitin dekarboksilaz, preoin kinaz C, lipoksigenaz ve siklogenaz gibi kanserin ilerlemesiyle ilgili enzimlerin aktivitesini önlemektedir (101, 109). ECGC’nin prostat ve meme tümörlerinin büyümesine ek olarak deri, mide, kolon ve akciger kanserlerini; teaflavinlerin ise akciğer ve özefagus kanserinin oluşumunu önlediği bildirilmektedir (110).
Aşırı derecede şişman fareler üzerinde yapılan çalışmalar, farelerin 10 haftadan daha uzun süre yeşil çay tüketmeleri durumunda obezitenin ve yağlı karaciger sendromunun önlendiği saptanmıştır. Bu durum artan enerji tüketimine rağmen yeşil çay kateşinlerinin etkisiyle azalan besin maddesi emiliminden kaynaklanmaktadır (111).
Ayrıca yeşil çay tüketimi kırmızı kan hücrelerinin hemolizinde azalmaya neden olmaktadır. Yeşil çay kırmızı kan hücre membranındaki çoklu doymamış yağ asitlerini serbest radikallerin oksidasyonundan; serbest radikallerin başlamasında önemli rol oynayan katyonları ve Cu+2’i inaktif etmek için bir şelatör olarak görev yapmak; serbest radikal zincirini tahrip edici olarak görev yapmak ve okside olan α– tokoferolü yeniden aktif hale getirmek suretiyle korumaktadır (112).
1.3.5.4. Kateşinlerin Antioksidan Aktivitesi
Çayın antioksidan aktivitesi esas itibariyle içerdiği fenolik maddelerden kaynaklanmaktadır. Saf antioksidanlar ve çay fraksiyonlarının antioksidan aktivitesi Tablo 4’de verilmiştir. Yeşil çay fenolik maddelerce zengin olan bazı içeceklere göre daha yüksek antioksidan aktiviteye sahip olmaktadır. Yeşil çay yapısındaki kateşinlerin yüksekliğinden dolayı vitamin C ve E’den daha güçlü antioksidan aktiviteye sahiptir (113). Çay kateşinlerinin antioksidan aktiviteleri büyükten küçüğe
doğru epigallokateşin gallat>epigallokateşin>epikateşin gallat>epikateşin şeklinde sıralanmaktadır (107).
1.4. Sisplatin ve Apoptozis
Apoptozis programlı hücre ölümüdür ve normal dokuların homeostazı açısından önemlidir. Normal embriyonik gelişimde hücrelerin fokal delesyonunda da işlev görmektedir. Apoptotik hücre ölümünün kanser dışında da pek çok durumda potansiyel patojenik rolü vardır; örnek olarak AIDS, nörodejeneratif hastalıklar verilebilir.
Total büyüme veya regresyonu değerlendirirken, apoptozis ve proliferasyon arasındaki denge önemlidir. Tüm bunlar göstermektedir ki apoptozis ve apoptozis regülasyonunun moleküler olaylarını anlamak ve apoptozisi yönlendirecek yolları saptamak gerekmektedir (114-116).
Tablo 4. Saf antioksidanlar ve çay fraksiyonlarının antioksidan aktivitesi (107)
Vitaminler IC50(μM)* -karoten E vitamini C vitamini Çay Fenolleri Gallik asit Kateşin Klorojenik asit Epikateşin Epikateşin gallat Epigallokateşin Epigallokateşin gallat Çay Fraksiyonları
Siyah çay ekstraktı (%46.32)
Kafeinsiz siyah çay ekstraktı(%47.08) Teaflavinler
Yeşil çay ekstraktı (%46.19)
Kafeinsiz yeşil çay ekstraktı(%49.15) Saf siyah çay polifenolleri(%91.38) Saf yeşil çay polifenolleri(%95.22)
4.30 2.40 1.25 1.25 0.67 0.30 0.19 0.14 0.10 0.08 0.59 0.59 0.29 0.22 0.22 0.16 0.13 *IC50: %50 inhibisyon saglayan antioksidan konsantrasyonu
1.4.1. Apoptozun Gen Regülasyonu
Apoptozun genetik mekanizması ilk kez Caenorhabditis elegans isimli nematodun gelişim aşamalarında belirlenmiştir.
Apoptozun regülasyonu nematodlardan insana kadar çoğu aynı gen kontrol süreci ile oldukça sıkı bir biçimde korunmaktadır. Ölüm sinyali, gen ekspresyonu ile düzenlenebilmesine rağmen, süreç genotoksik hasar (kemoterapi, radyasyon vb) veya sitokinlerin olmaması gibi (eritropoietin vb) farklı uyaranlarla harekete geçirilebilir. DNA sarmalındaki nükleotit azlığı, DNA-bağlı transkripsiyon faktör p53 ile başlayan bir dizi olayı aktive eder ve hücre apoptotik yola girer (117).
1.4.1.1. p53’ün Rolü
Bir tümör süpresör gen olarak çalışan p53 mutasyona uğradığı ya da bulunmadığı zaman hücre yaşamı uzar. p53 protein ürünü, DNA’ya doğrudan bağlanarak hasarı tanıdıktan sonra, ya G1’de hücre siklusunun durmasını indükleyerek tamir için gerekli zamanı kazanır ya da hasar fazlaysa apoptoza yönlendirir. Ayrıca p53’ün Bax / Bax, Bax / Bcl–2, Bcl–2 / Bcl–2 gruplarının oranlarını düzenlediği düşünülmektedir (118).
1.4.1.2. Bcl–2 / Bax
Apoptozun regülasyonu Bcl–2/Bax gen ailesi ile sağlanır (118, 119). Bcl– 2/Bax gen ailesinin ürünleri, mitokondri ve çekirdek zarlarının yanısıra endoplazmik retikulum zarının üzerinde de yer alırlar ve homodimer ya da heterodimerler şeklinde kompleks oluşturarak çalışırlar (118, 120). Örneğin; Bcl–2’nin Bax ile olan etkileşiminde Bcl–2’nin oranının daha yüksek olması hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlarken, Bax'ın daha fazla olması durumunda hücre ölüme gitmektedir (121). Son yıllardaki, hücrenin yaşamı ya da ölümü konusundaki araştırmalar dikkatleri mitokondri üzerinde toplamıştır (122).
Mitokondiriler çift zarlı organellerdir. Bcl–2, bir protoonkogendir ve ürettiği protein, mitokondirinin sitoplazmaya dönük dış zarı üzerinde ve endoplazmik retikulumun bir bölümü olan çekirdek zarında yerleşmiştir (123). Bu proteinler, iyon alışverişini düzenler ve zarın parçalanmasına karşı koruyucu etki yaparlar. Özellikle anti-apoptotik genler içinde yer alan Bcl-xL'in mitokondriyal hasarı engelleyerek mitokondriyi koruduğu ileri sürülmektedir. Bu sayede apoptoz inhibisyonu gerçekleşmektedir (124). Bcl–2 ailesinin bir diğer ilginç özelliği de reaktif oksijen
düzeylerinin apoptoz üzerindeki etkilerini pro-oksidan gibi davranarak kontrol etmesidir (122).
Bax proteinleri sitoplâzmada da bulunur. Apoptotik sinyalin alınmasından sonra Bax proteinleri, mitokondri zarının "permeabilite geçiş poruna" doğru yönlenirler ve buraya bağlanırlar. Bu bağlanma, seçici iyon geçirgenliğini azaltabilir. Zardaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF (Apoptosis Inducing Factor) gibi mitokondri zarı içinde yer alan faktörler sitoplâzmaya geçerler. AIF, doğrudan kromatin kondansasyonunun ve nüklear fragmantasyonun meydana geldiği çekirdeğe doğru yönelirken, sitoplâzmadaki sitokrom c apoptozun en son basamağında görev alır. Sitokrom c, bir sitoplazma proteini olan Apaf-1 (apoptotik proteaz aktivite edici faktör-1) 'in aktivatörüdür (118). Sitokrom c‘nin Apaf-1'e bağlanması prokaspaz-9'u aktive eder ve oluşan bu kompleks "apoptosom" olarak isimlendirilir (125). Prokaspaz-9'un aktivasyonu, bir seri kaspaz aktivasyonunu başlatır (118). Apaf–1 aynı zamanda ATP‘ye de bağlanır. Bu olay apoptozun neden enerji gereksinimi duyduğunu açıklamaktadır (120). (Şekil 2)
Cisplatin nefrotoksisitesinde Bax geninin de rol oynadığı düşünülmekle beraber kanıtlar yeterli değildir. Cisplatin nefrotoksisitesinde, renal tübüler hücre mitokondrilerinde Bax gen aktivasyonu ve birikiminin ve akut böbrek hasarının eşlik ettiği gösterilmiştir (126). İskemik reperfüzyon hasarı sonrası tübüler epitelyal hücrelerde Bcl-2 protein artışı; hücresel otofaji süpresyonu ve apoptozis inhibisyonu sağlayabilmektedir (127).
1.5. Hsp
Isı şok proteinleri
Isı şok proteinleri (Hsp) hücresel hasarın çeşitli formalarında salınabilen proteinlerdir. Bazı Hsp’lerin (HspP60-70) -vitro olarak T hücre aracılı immun yanıtı direk olarak uyarmaktadır. Deneysel çalışmalarda Hsp60-70 injeksiyonu sonrası geçici proteinüri ve minimal organ hasarı oluştuğu, fakat bu hasarın son dönem böbrek yetmezliğine ilerlemediği gözlemlenmiştir. Enjeksiyon sonrası 10-12 saat sonra global glomeruler nekroz, tubulointertisyel hasar ve anüri görülmüştür. Deneysel çalışmalarla da oksidatif stres altındaki tubuler hücre hasarı sırasında hücresel düzeyde Hsp60 ve Hsp70 proteinlerinin ekspresyonlarının arttığı gözlemlenmiştir (128).
Hsp60 primer olarak mitokondriyal bir protein olarak bilinir. Ancak önemli miktarda Hsp60 çok sayıda hücrenin ekstra-mitokondriyal sitozolünde bulunmaktadır
(129). Hsp60 Bax, Bak ve Bcl-XL’e bağlanır, Bcl-2’ye bağlanmaz. Hipoksi esnasında bu kompleks ayrılır, Bax mitokondriye Hsp60 ise plazma membranına hareket eder. Baxın bu hareketiyle sitokorom c salınır ve kaspaz kaskadı aktive olur. Hsp60 lokalizasyonu ise apopitoz ve TNF artışı ile korelasyon gösterir (130).
Bu bilgilerin ışığı altında, bu çalışmada antioksidan etkili olan EGCG’nin cisplatin verilen ratlarda, hücre fonksiyonlarında anahtar rol oynayan bazı proteinlerin (Hsp60, Hsp70, Bax, Bcl–2) ekspresyonu üzerine etkiler araştırılmıştır. Ayrıca EGCG’nin böbrekteki histopatolojik değişimler, böbrek fonksiyon testleri (serum üre, kreatinin düzeyleri) ve oksidatif stres (MDA düzeyleri) üzerine etkileri de araştırıldı.
2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Hayvan Materyali
Çalışmada Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırma Merkezinden (FÜDAM) temin edilen ve ağırlıkları 200-215 g arasında değişen erkek Wistar albino cinsi ratlar kullanıldı (n=28, 8 haftalık) Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’ndan (FÜHADEK), onay alındıktan sonra, çalışma standart deneysel hayvan çalışmaları etik kurallarına uygun olarak yapıldı. Yemler, özel çelik kaplarda ve su da paslanmaz çelik bilyeli biberonlarda normal musluk suyu olarak verildi. Deney hayvanları Elazığ Yem Fabrikasında özel olarak hazırlanan pelet yemle beslendi. Deney süresince hayvanlara yem ve su ad libidum olarak verildi. Ratlara verilen yemin bileşimi Tablo 5’de gösterilmiştir.
Tablo 5. Araştırmada kullanılan diyetin bileşimi
Yem ham maddeleri %
Buğday Mısır Arpa Kepek Soya Küspesi Balık Unu E-Kemik unu Melas Tuz *Vitamin Karması **Mineral Karması 10 21 14 8 25 8 4 4 4 1 1
*Vitamin karması: Deney hayvanlarına verilen yemlerin vitamin karmasında A, D3, E, K, B1, B2, B6, B12 vitaminleri ile nikotinamid, folik asit, D-biotin ve kolin klorit bulunmaktadır.
**Mineral karması: Mangan, demir, çinko, bakır, iyot, kobalt, selenyum ve kalsiyumdan oluşmuştur.
2.2. Deneme Düzeni
Deneysel çalışmalara başlamadan önce, çıkabilecek aksaklıkların asgariye indirilmesi amacıyla ön çalışma yapıldı. Deney hayvanlarının bulundukları ortam
sıcaklığı 22±2 ˚C ve 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık olacak şekilde takip edildi. Hayvanlara yem ve su ad libitum olarak verildi.
Bir defalık intraperitoneal (i.p.) CDDP enjeksiyonu ile nefrotoksisite oluşturuldu. CDDP (Sigma Chemical Co, USA), % 0.9 salin (1 ml/100 gr/kg i.p.) içinde 7 mg/kg olacak şekilde i.p. enjeksiyon yoluyla araştırmanın 3. gününde tek dozda uygulandı.
Ratlar rastgele aşağıdaki şekilde gruplandırıldı:
1. Kontrol Grubu (n=7): CDDP uygulanmayan, 3. Gün i.p. olarak sisplatinle eşit hacimde izotonik salin solusyonu (1 ml/kg/gün) uygulanan ve bazal diyetle beslenen grup.
2. EGCG grubu (n=7): CDDP uygulanmayan, 3. Gün i.p. olarak sisplatinle eşit hacimde izotonik salin solusyonu (1 ml/kg/gün) uygulanan ve sisplatin uygulamasından 2 gün önce ve uygulamadan sonra 10 gün süreyle EGCG (TEAVİGO, DSM Co, Switzerland ) (100 mg/kg) verilen ratlar
3. CDDP (Sisplatin) grubu (n=7): CDDP (CDDP; Sigma Chemical Co, USA), % 0.9 salin (1 ml/100 gr/kg i.p.) içinde (7 mg/kg) uygulanan ratlar
4. EGCG + CDDP grubu (n=7): CDDP uygulanan ve cisplatin uygulamasından 2 gün önce ve uygulamadan sonra 10 gün süreyle EGCG (100 mg/kg) verilen ratlar.
EGCG gavaj yolu ile 100 mg/kg dozda fizyolojik salinde sulandırırılarak (%0.89) (131), CDDP uygulmasından 2 gün önce ve uygulamadan sonra 10 gün toplam 12 gün süreyle günde 1 kez olacak şekilde uygulandı. Cisplatin uygulamasından 10 gün sonra ratlar hayvanlar anestezi altında dekapite edilerek histopatolojik ve western blot analizleri için doku örnekleri alınmış ve western analizleri yapılıncaya kadar analizler yapılıncaya kadar –80 ˚C’ de saklanmıştır. Böbrekler fosfat tamponlu solüsyon ile (PBS; 0.15 M NaCl ve 0.01 M sodyum fosfat tamponu, ph 7.4) aorta yoluyla perfüze edilerek histolojik inceleme için çıkarıldı. Serum üre-azotu ve kreatinin ölçümleri için kan alındı.
2.3. Laboratuar Analizi
Kan örnekleri 300 g’de 10 dk süreyle santrifüje edildi ve serumları ayrıldı. Serum üre nitrojeni ve kreatinini biyokimyasal analizör ile (Olympus AU-660,
