ÖZET
TÜTÜN SAPLARINDAN KS LOOL GOSAKKAR T ÜRET M Kader ERDO AN
Gaziosmanpa a Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisli i Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi
2007, 76 sayfa
Danı man : Yrd. Doç. Dr. Özlem AKPINAR
Jüri : Prof.Dr. Levent YILMAZ Jüri : Prof.Dr. Metin YILDIRIM
Jüri : Prof.Dr. Ufuk BAKIR Jüri : Doç.Dr. Zeliha YILDIRIM
Bu çalı mada Tokat ili için önemli bir tarımsal atık olan tütün sapları, ksilooligosakkarit üretimi için kullanılmı tır. Ksilooligosakkaritler asit hidroliz ve enzimatik hidroliz ile üretilmi tir. Tütün saplarından elde edilen ksilan, ksilanaz kullanılarak hidroliz edilmi ve ksilooligosakkarit verimi üzerine pH, sıcaklık, hidroliz periyodu, substrat konsantrasyonu ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelenmi tir. Kullanılan tüm enzimatik hidroliz reaksiyonlarında az miktarda ksiloz ile polimerizasyon derecesi (DP) 2’den 6’ya kadar ve 6’dan büyük (X2>X3>X4>X5>X6 ve >X6) olan ksilooligosakkaritler elde edilmi tir. Ksiloligosakkarit üretimindeki artı 8-24 saatten sonra durmu tur. Optimum hidroliz ko ulları 40ºC, pH 5,5 ve %2’lik ksilan konsantrasyonu olarak belirlenmi tir. Ksilooligosakkaritler sülfürik asit kullanılarak da üretilmi tir ve ksilooligosakkarit verimi üzerine hidroliz periyodu, substrat konsantrasyonu ve asit konsantrasyonunun etkisi incelenmi tir. Asit hidrolizi ile ksilooligosakkarit üretildi inde fazla miktarda monosakkarit ve farklı miktarlarda (X2>X3>X4>X5>X6 ve >X6) oligosakkaritler üretilmi tir. Tütün saplarından ksilooligosakkaritlere dönü üm en iyi 0,25 M H2SO4 ile 30 dakikada gerçekle mi tir. Reaksiyon zamanı ve asit konsantrasyonunun artması ile monosakkarit üretimi de artmı tır.
Asit hidrolizi ile üretilen ksilooligosakkaritler 30 kDa ve 1 kDa’luk membranlar kullanılarak ultrafiltrasyonla safla tırılmı ve konsantre edilmi tir. 2 a amalı membran i leminden sonra 1 kDa membranın tutulanı ço unlukla oligosakkaritleri içerdi i saptanmı tır. Ancak monosakkaritlerin daha fazla uzakla tırılması için nanofiltrasyon
membranları kullanılmalıdır. Enzimle üretilen Ksilooligosakkaritler için de 10 kDa ve 3 kDa’luk membranlar kullanılmı tır. 10 kDa’luk membran ile ksilanazın ve hidroliz olmamı olan ksilanın uzakla tırılması önemli miktarda oligosakkarit kaybı olmadan ba arılmı tır. 2 a amalı membran prosesinden sonra önemli bir miktarda oligosakkarit içeren 3 kDa’luk membranın geçeni elde edilmi tir.
ABSTRACT
PRODUCTION OF XYLOOLIGOSACCHARIDES FROM TOBACCO STALKS Kader ERDO AN
Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Science Department of Food Engineering
Masters Thesis 2007, 76 pages
Supervisor : Assist. Prof. Dr. Ozlem AKPINAR
Jury : Prof.Dr. Levent YILMAZ Jury : Prof.Dr. Metin YILDIRIM
Jury : Prof.Dr. Ufuk BAKIR Jury : Assoc. Prof. Dr. Zeliha YILDIRIM
In this research xylooligosaccharides were produced from tobacco stalk, a major agricultural waste in the city of Tokat. Enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis were used for production of xylooligosaccharides. Xylan, optained from tobacco stalk, was hydrolyzed using xylanase preparation and the effects of pH, temperature, hydrolysis period, substrate and enzyme concentrations on the xylooligosaccharide yield were investigated. Xylooligosaccharides in the degree of polymerization range of 2 to 6 and bigger than 6 (X2>X3>X4>X5>X6 and >X6) were obtained with minor quantities of xylose in all the enzymatic hydrolysis conditions used. The xylooligosaccharide production rate stopped increasing after 8-24 hr hydrolysis. The optimal hydrolysis conditions were determined as 40 ºC, pH 5,5 and 2% xylan. Xylooligosaccharides were produced with hydrolyzing xylan by sulphuric acid and the effects of hydrolysis period, substrate and acid concentrations on the xylooligosaccharide yield and degree of polymerization were investigated. When acid hydrolysis performed for production on xylooligosaccharides, different amount of oligosaccharides (X2>X3>X4>X5>X6 and >X6) and major quantities of monosaccharide were obtained. From our results, the best xylan conversion from tobacco stalk xylan to xylooligosaccharides were achieved with 0,25 M H2SO4 with 30 minutes reaction period. Increasing the reaction period or acid concentration resulted in high increase in monosaccharide yield.
The xylooligosaccharides obtained by acid hydrolysis was refined and concentrated via ultrafiltration by using 30 and 1 kDa membranes. After a two-step membrane processing, the retentate of 1 kDa membrane containing mostly oligosaccharides was obtained. However, to remove the monosaccharides more, nonafiltration membrane was necessary to be used. For enzymatic produced xylooligosaccharides, 10 kDa and 3 kDa membrane were used. Removal of xylanase and unhydrolyzed xylan was achieved without loosing important amount of oligosaccharides by 10 kDa membrane. After a two-step membrane processing, the permeate of 3 kDa membrane containing mostly oligosaccharides was obtained.
TE EKKÜR
Ara tırmanın planlanmasında ve yürütülmesinde eme i olan ve çalı manın her a amasında deste ini ve ilgisini hiç esirgemeyen danı man hocam sayın Yrd.Doç.Dr. Özlem AKPINAR’ a; tezimi okuyup de erlendirdikleri için de erli jüri üyelerim Prof.Dr. Metin YILDIRIM, Prof.Dr. Levent YILMAZ, Prof.Dr. Ufuk BAKIR ve Doç.Dr. Zeliha YILDIRIM’a ve de erli aileme sonsuz te ekkürlerimi sunarım.
Ç NDEK LER
ÖZET ...i
ABSTRACT...iii
TE EKKÜR...v
Ç NDEK LER ...vi
EK LLER L STES ...ix
TABLOLAR L STES ...xi
KISALTMALAR L STES ...xii
1. G R ...1
2. L TERATÜR ÖZET ...4
2.1. Türkiye’de Bulunan Tarımsal Atıklar...4
2.2. Lignoselülozik Materyaller...6 2.2.1. Selüloz ...7 2.2.2. Lignin...10 2.2.3. Hemiselüloz ...11 2.2.3.1. Kullanım Alanları ...14 2.2.3.1.1. Ksilooligosakkaritler...14 2.2.3.1.2. Ksilitol ...15 2.2.3.1.3.2,3-Bütandiol ...16 2.2.3.1.4. Di er Kullanım Alanları ...16
3. KS LOOL GOSAKKAR TLER ...17
3.2. Fiziksel Özellikleri ve Gıda Açısından Önemleri...19
3.3. Kullanım Alanları ...20
3.4. Ksilooligosakkaritlerin Elde Edilme Yöntemleri ...21
3.4.1. Otohidroliz...22
3.4.2. Enzimatik Hidroliz...23
3.4.3. Asit Hidroliz ...26
3.5. Safla tırma Yöntemleri ...27
4. MATERYAL VE METOT ...29 4.1. Materyal ...29 4.2. Metot...30 4.2.1. Tütün Atıklarının Karakterizasyonu ...30 4.2.1.1. Nem...30 4.2.1.2. Kül ...30 4.2.1.3. Lignin...31 4.2.1.4. Selüloz ...31 4.2.1.5. Ksilan...32 4.2.1.6. Özüt çeri i ...32
4.2.2. Büyük Ölçekte Tütün Sapları Ksilanının (TSK) Ekstraksiyonu...33
4.2.3. Tütün Sapları Ksilanının Karakterizasyonu...34
4.2.3.1. Üronik Asit ...34
4.2.3.2. eker Kompozisyonu...35
4.2.4. Tütün Sapları Ksilanının Enzimatik Hidrolizasyonu...35
4.2.6. Membran Filtrasyon...37
4.2.7. TLC ( nce Tabaka Kromatografisi) ...37
4.2.8. ndirgen eker...38
4.2.9. HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi)...38
4.2.10. Toplam eker...38
4.2.11. Furfural ...39
5. ARA TIRMA SONUÇLARI VE TARTI MA ...40
5.1. Tütün Atıklarının Karakterizasyonu ...40
5.2. Tütün Sapları Ksilanının Karakterizasyonu...41
5.3. Tütün Sapları Ksilanının Enzimatik Hidrolizasyonu...42
5.4. Tütün Sapları Ksilanının Asit Hidrolizasyonu ...51
5.5. Membran Ayırma...58
6. SONUÇ VE ÖNER LER...64
7. KAYNAKLAR ...66
EK LLER L STES
ekil Sayfa No
2.1. Bitki hücre duvarının ematik gösterimi...6 2.2. Selülozun yapısı...7 2.3. A. Intra ve intermoleküler hidrojen ba lı β-1,4-D-glikoz
zincirleri B. Kristal ve amorf bölgeleri içeren selüloz
mikrofibrillerinin yapısı ...8 2.4. Ligninin yapısı ...10 2.5. De i ik kaynaklardan elde edilen ksilanın yapısı...12 2.6. Lignoselülozik materyallere ön i lemlerin etkisinin ematik
gösterimi...13 2.7. Ksilanazların ksilan substratı parçalama biçimleri ...25 5.1. Ksilanaz ile TSKdan KO üzerine pH’nın etkisi...43 5.2.TSKdan KO üretimi üzerine farklı pH de erlerinin (pH4,5, 5,5
ve 6,5) etkisinin HPLC analizi...44 5.3. Ksilanaz ile TSKdan KO üretimi üzerine sıcaklı ın etkisi...45 5.4.TSKdan KO üretimi üzerine farklı sıcaklık de erlerinin (30ºC,
40ºC ve 50ºC) etkisinin HPLC analizi ...46 5.5. TSKdan KO üretimi üzerine enzim konsantrasyonunun etkisi ...47 5.6. TSKdan KO üretimi üzerine farklı enzim konsantrasyonlarının
(1,4 U/mL, 2,7 U/mL, 4,1 U/mL, 8,2 U/mL ve 16,5 U/mL) ve
reaksiyon zamanlarının (8sa ve 24sa) etkisinin HPLC analizi...48 5.7. TSKdan KO üretimi üzerine substrat konsantrasyonunun etkisi...49
5.8. TSKdan KO üretimi üzerine farklı substrat konsantrasyonlarının (%1, %2, %3, %4 ve %5) ve reaksiyon zamanlarının (8 sa ve 24 sa)
etkisinin HPLC analizi ...50 5.9. TSKdan KO üretimi üzerine asit konsantrasyonunun etkisi...52 5.10. TSKdan KO üretiminde farklı asit konsantrasyonlarının
furfural olu umu üzerine etkisi ...52 5.11. TSKdan KO üretimi üzerine farklı asit konsantrasyonlarının
(0,125 M, 0,25 M ve 0,5 M) ve reaksiyon zamanlarının (30dk, 60dk ve 240dk) etkisinin HPLC analizi ...53 5.12. TSKdan KO üretimi üzerine substrat konsantrasyonlarının etkisi ...54 5.13. TSKdan KO üretimi üzerine farklı substrat konsantrasyonlarının
(%1, %2 ve %4) ve reaksiyon zamanlarının (30 dk, 60 dk ve 240 dk) etkisinin HPLC analizi...55 5.14. %2’lik TSKnın 0,25 M H2SO4 ile 0, 30, 60 ve 240.
dakikalardaki hidroliz reaksiyonunun HPLC analizi ...56 5.15. TSKdan KO üretiminde zamanın furfural üretimi üzerine etkisi ...57 5.16. Asit hidrolizi ile elde edilen TSK hidrolizatının 30 kDa
ve 1 kDa membran ile ayırımından elde edilen sonuçların HPLC analizi...60 5.17. Enzimatik hidroliz ile elde edilen TSK hidrolizatının
10 kDa ve 3 kDa membran ile ayırımından elde edilen
TABLOLAR L STES
Tablo Sayfa No
2.1. Türkiye’nin tarımsal atıkları ve üretimleri... 5
2.2. Tokat’ın tarımsal atıkları ve üretimleri... 5
2.3. Lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön i lemler ... 14
5.1. Tütün atıklarının karakterizasyonu ... 41
5.2. Tütün sapları ksilanının eker kompozisyonu ... 42
5.3.Asit hidrolizi ile elde edilen KOlerin 30 kDa ve 1 kDa membranlarından geçen kısımlarındaki gerikazanımı...59
5.4. Asit hidrolizi ile elde edilen KOlerin 30 kDa ve 1 kDa membranların rejeksiyonu ... 59
5.5. Enzim hidrolizi ile elde edilen KOlerin 10 kDa ve 3 kDa membranlarından geçen kısımlarındaki gerikazanımı...62
5.6. Enzim hidrolizi ile elde edilen KOlerin 10 kDa ve 3 kDa membranların rejeksiyonu ...62
KISALTMALAR L STES Monosakkarit ... M Ksilobiyoz... X2 Ksilotriyoz ...X3 Ksilotetroz...X4 Ksilopentoz ...X5 Ksiloheksoz...X6 Ksilooligosakkarit...KO Polimerizasyon derecesi ...DP Tütün sapları ksilanı...TSK
1. G R
Türkiye’de yılda üretilen yakla ık 13 milyon ton tarımsal atık mevcuttur. Bunlardan biriside Tokat yöresinde bol bulunan tütün saplarıdır. Tütün (Nicotiana sp.) dünyanın bir çok bölgesinde yeti tirilen önemli bir bitkidir. Tütün yaprakları sigara yapımında kullanılmaktadır. Tütün sapları ise tütün yaprakları ayrıldıktan sonra tarlada kalan atıklardır. Bunlar hayvan yemi olarak de erlendirilebilir ancak ço unlukla ya yakılmakta yada tarlada çürümeye bırakılmaktadır. Bunlar hayvan beslenmesinde yada sigara ka ıdı yapımında kullanılabilir. Fakat bu kullanım önemli bir ekonomik de ere sahip de ildir (Martin et al., 2002). Günümüzde artan çevresel endi eler, bu bol bulunan tarımsal atıkların çevreye dost teknolojilerde kullanımları üzerine odaklanılmasına sebep olmu tur (Agrupis et al., 2000). Bu materyallerin, de eri daha yüksek bir ürüne dönü türülmesi hem bu atıkların uygun bir ekilde ortadan kalkmasına sebep olacak, hem de çiftçiye ek bir gelir sunacak ve kırsal alanlarda i imkanı yaratacaktır. Lignoselülozik do aya sahip olan tütün sapları içerdikleri yüksek ksilan içeri i nedeniyle etanol, glikoz, ksiloz, ksilitol ve ksilooligosakkaritler (KOler) gibi çe itli kimyasalların üretimi için yenilebilir bir kaynak olarak kullanılabilirler.
KOler ksiloz ünitelerine sahip eker oligomerleridir. KOler do al olarak meyveler, sebzeler, bambu filizleri, bal ve sütte bulunurlar. Endüstriyel olarak da ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden üretilirler (Vazquez et al., 2000).
KOler sindirilemeyen oligosakkaritler olarak sınıflandırılmaktadır. Prebiotik olarak nitelendirilen KOler, gastrointestinal sistemin endogonik türlerinin yararını artırıcı olarak nitelendirilmektedirler (Van Loo et al., 1999). KOlerin alımı sonucu üremesi te vik edilen Bifidobakteriler patojen mikroorganizmaların üremesini engellerler (Fooks et al., 1999), minerallerin biyolojik olarak kullanımını iyile tirmektedirler, toplam ve LDL-kolesterol seviyesini dü ürerek kalp-damar hastalıklarının geli mesini önlemektedir. Bunların
hayvanlarda yapılan çalı malarda deneysel olarak uyarılan, kanser riskini azalttı ı gösterilmi tir (Van Loo et al., 1999).
Uygun bir lignoselülozik materyalden elde edilen ksilan enzim, asit ve ısı ile hidroliz edilerek KOler üretilebilir. Ksilan asit ile hidirolizi esnasında KOlerin yanında furfural gibi istenmeyen bile iklerin de elde edilmesi söz konusudur. Isı ile hidroliz (otohidroliz) de ise KOler ksilan ekstraksiyonuna ihtiyaç duymadan direk olarak lignoselülozik materyallerden üretilmektedir. Ancak bu yöntemde de hidroliz olayının daha ileri giderek furfural gibi istenmeyen maddeler olu turma riski vardır. Enzimle hidroliz daha spesifik ve ılımlı ko ullarda gerçekle ti i için ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadı ı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olu mamaktadır. Ayrıca enzimatik hidrolizde, enerji ihtiyacı da daha dü üktür. Ancak bu yöntemde hidroliz için gereken enzimlerin üretimi oldukça zahmetli, pahalı ve zaman alıcıdır.
Oligosakkaritleri ürettikten sonra en önemli a amalardan birisi de istenilen polimerizasyon aralı ına kadar safla tırmadır. Gıda amaçlı kullanılan oligosakkaritler çok saf materyaller olmayıp daha çok iki veya daha çok DPye sahip oligomer karı ımlarıdır. Amaç yüksek molekül a ırlıklı polisakkaritleri ve yararlı özelli i olmayan dü ük molekül a ırlıklı ekerleri ve di er bile ikleri istenilen üründen ayırmaktır. Bu amaçla kullanılan vakum altında buharla tırma, kromatografi veya solvent ektsraksiyonu zaman alıcı ve büyük ölçeklerde üretim için pratik ve ekonomik de ildir (Alanso et al., 2003). Di er bir yöntem ise ultrafiltrasyondur. Ultrafiltrasyonla elde edilen hidrolizat büyük molekül a ırlıklı polisakkaritlerden ve proteinlerden kurtularak daha sonra nanofiltrasyonla konsantre edilirken aynı zamanda dü ük molekül a ırlıklı ekerler ve di er nötralizasyon ürünlerinden arındırılır (Kamada et al., 2002).
KOlerin elde edilmesi oldukça zahmetli ve pahalıdır. Ancak bunların yaygın olarak kullanılması, bunların ucuz bir kaynaktan üretilmesine, toksik bile ikler olu umuna izin vermeden, verimli bir biçimde hidrolizasyonuna ve daha sonra ucuz ve pratik bir yöntemle
istenilen DPye kadar safla tırılıp konsantre edilmesine ba lıdır. Bu amaçla bu çalı mada tütün saplarının KO üretimine uygunlu u ara tırılmı tır.
Literatürde imdiye kadar hammadde olarak tütün sapları kullanılarak ksilooligosakkaritlerin üretimiyle ilgili herhangi bir çalı ma mevcut de ildir. Bu tez tütün saplarından KO üretimi için enzimatik ve asit hidroliz metotlarını içeren 2 farklı hidroliz metodunu incelemi tir. Bunun ı ı ında, tütün saplarından ksilan üretimi, ksilan verimi ve üretilen ksilanın kimyasal kompozisyonu incelenmi , tütün sapları ksilanından (TSK) enzimatik ve asit hidroliz ile KO üretimi gerçekle tirilmi tir. Bu çalı ma; hidroliz ko ullarının optimizasyon çalı malarını, hidrolizatın analizini, iki metodun kar ıla tırılmasını, her iki yolla üretilen KOlerin membran yöntemleriyle safla tırılması ve bu metotların uygulamalarının önerileri kapsamaktadır.
2. L TERATÜR ÖZET
2.1. Türkiye’de Bulunan Tarımsal Atıklar
Türkiye zengin tarımsal potansiyeli ile geli mekte olan bir ülkedir ve bu potansiyelinden dolayı Türkiye’deki tarımsal sektördeki üretimi olu turan (bu day, arpa, tütün, pamuk, mısır gibi) bitkilerin tipi ve miktarı, büyük oranda tarımsal atı ın olu masına neden olmaktadır. Türkiye’de üretilen tarımsal atıklar, tarla ürünleri için saman (bu day, arpa, çavdar, yulaf, pirinç, yerfıstı ı ve soya), sap (mısır, darı, tütün, ayçiçe i ve pamuk), kabuk (pirinç ve yerfıstı ı), sömek (mısır) ve çırçır atı ı (pamuk); bahçe ürünleri için çekirdek (kayısı, vi ne, eftali, limon, portakal, mandarin ve greyfurt), budama (kayısı, vi ne, zeytin, antepfıstı ı, ceviz, badem, fındık, eftali, limon, portakal, mandarin ve greyfurt); kabuk (antepfıstı ı, ceviz, badem ve fındık) ve pirina (zeytin); hayvanlar için gübre’yi (inek, koyun ve kümes hayvanları) içermektedir. Türkiye’deki tarımsal atıkların çe itleri ve yıllık üretim miktarları Tablo 2.1’de gösterilmektedir. Tokat bölgesinde üretilen tarımsal atıklar (Tablo 2.2) ise ço unlukla saman (bu day, arpa, çavdar, yulaf, pirinç ve soya), sap (mısır, tütün, ayçiçe i ve pamuk), kabuk (pirinç) ve sömek (mısır); bahçe ürünleri için çekirdek (kayısı, vi ne ve eftali), budama (kayısı, vi ne, antepfıstı ı, ceviz, badem, fındık ve eftali) ve kabuk (antepfıstı ı, ceviz, badem ve fındık); hayvanlar için gübre (inek, koyun ve kümes hayvanları)’den olu maktadır (Anonim, 2007).
Hiçbir ekonomik de eri olmayan tarımsal atıklar hayvan beslenmesinde kullanılabilir ancak bu kullanımının çok fazla ekonomik olarak de eri yoktur. Genellikle bu tarımsal atıklar ya tarlalarda çürümeye bırakılmakta yada yakılmaktadır. Kontrol edilemeyen bu uygulamalar belirgin çevresel etkilere yol açmakta ve aynı zamanda yararlı kaynaklara zarar vermektedir (Anonim, 2007). Bu yüzden bu tip atıkların uygun bir ekilde de erlendirilmesini sa layacak yöntemlerin ve yolların bulunması gereklidir.
Tablo 2.1. Türkiye’nin tarımsal atıkları ve üretimleri (Anonim, 2007).
Tarla ürünleri Atıklar Üretimler (ton) Alan (ha) Atıklar (ton)
Bu day Saman 22,439,043 9,265,785 23,433,811 Sap 4,964,802 Mısır Sömek 2,952,394 565,109 1,905,027 Arpa Saman 7,921,456 3,549,858 8,394,564 Çavdar Saman 253,243 145,907 358,221 Yulaf Saman 322,830 146,020 321,938 Darı Sap 7,283 3,605 0 Saman 209,534 Pirinç Kabuk 332,142 67,161 77,749 Tütün Sap 181,320 222,515 410,487 Sap 2,554,418 Pamuk Çır çır atı ı 2,474,868 687,787 742,463 Ayçiçe i Sap 839,066 545,914 2,280,098 Saman 0 Yerfıstı ı Kabuk 71,594 25,167 28,638 Soya Saman 45,944 15,114 22,214
Tablo 2.2. Tokat’ın tarımsal atıkları ve üretimleri (Anonim, 2007).
Tarla ürünleri Atıklar Üretimler (ton) Alan (ha) Atıklar (ton)
Bu day Saman 368,061 146,825 463,757 Sap 51,057 Mısır Sömek 17,019 4,391 10,892 Arpa Saman 70,866 30,750 87,165 Çavdar Saman 78 50 94 Yulaf Saman 742 530 876 Saman 2,136 Pirinç Kabuk 1,780 322 481 Tütün Sap 4,897 6,780 9,794 Ayçiçe i Sap 982 519 3,928 Soya Saman 8 3 6
2.2. Lignoselülozik Materyaller
Lignoselülozik materyaller yüksek kullanılabilirliklerinden dolayı biyoyakıt üretimi için fermente olabilir ekerlerin önemli bir kayna ını olu turmaktadır. Bununla birlikte di er kullanım alanları KO, ksilitol, 2,3-bütandiol ve laktik asit üretimidir. Temel lignoselülozik kaynaklar tarımsal atıklar, ormancılık atıkları, evsel atıklar ve otsu bitkileri içerir. Selüloz, lignin ve hemiselüloz lignoselülozik materyalleri olu turan polimerlerdir. Ana bile en selülozdur (%35-50) ve bunu hemiselüloz (%20-35) ve lignin (%10-25) takip eder (Foyle et al., 2007). Bunlar bitki hücre duvarında hep beraber bulunur. ekil 2.1’de bitki hücre duvarının ematik gösterimi görülmektedir.
ekil 2.1. Bitki hücre duvarının ematik gösterimi. A) hücre duvarı katmanları B) ikincil hücre duvarının yapısı. PW: birincil hücre duvarı; SW 1, SW 2, SW 3: ikincil hücre duvarları (Beguin and Aubert, 2000).
2.2.1. Selüloz
Selüloz dünyada en yaygın olarak bulunan organik bir polimerdir. Saf formda pamukta, lignin ve hemiselülozla birle ik olarak odunsu bitkilerin hücre duvarında bulunmaktadır. Ayrıca bitki olmayan bakteri, alg ve hayvanlar tarafından da üretilebilmektedir (Akpınar, 2003).
Selüloz, -1,4 ba ıyla birbirine ba lı glikoz ünitelerinden olu ur. Glikoz üniteleri sandalye formunda (4C1) bulunur. Bu formda, serbest hidroksil grupları ekvatoral, hidrojen grupları da ekseneldir. Her glikoz ünitesi kom usuna 180º açıyla bakar. Bu yüzden polimerin tekrarlanan ünitesi glikoz de il selobiyozdur ( ekil 2.2) (Akpınar, 2003). Moleküler büyüklük selülozun kayna ına göre de i im gösterir. Ortalama molekül a ırlı ı 1 000 000’dur (Köksel, 1998).
ekil 2.2. Selülozun yapısı
Intra ve intermoleküler hidrojen ve van der Waals ba ları sebebiyle selülozon yapısı oldukça kararlı davranır ( ekil 2.3.A). Intramoleküler hidrojen ba ları zincirdeki glikoz moleküllerinin birbirine olan pozisyonlarını etkileyerek polimerin hafifçe bükülerek kurdele gibi bir ekil almasına neden olur. Intermoleküler hidrojen ve van der Waals ba ları selüloz zincirlerini bir araya getirerek kristalitleri olu turur. Bu kristal bölgeler birbirinden daha az kristal, amorf bölgelerle ayrılmı tır ( ekil 2.3.B). Selülozun kristallik
O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH Se Glukoz
derecesi orijine ve örne e uygulanan muamele yöntemine göre de i ir. Genelde do al selüloz %70 kristallik derecesine sahiptir. Kristallik derecesi en fazla olan Valonia selüloz, kristallik derecesi en az olan ise asitle muamele edilmi selülozdur (Akpınar, 2003).
Selüloz genellikle izoenzimler eklinde çoklu formda bulunan enzim kompleksleriyle hidrolize u ratılmaktadır. Selülazlar indüklenmi enzimlerdir ve sadece selüloz, sellobiyoz, laktoz ve di er -1,4 ba lı glukanların varlı ında geli en mikroorganizmalarca üretilmektedirler (Köksel, 1998). Selülazlar, selülozun -1,4 ba ını parçalayarak glikoza hidroliz ederler. Selülazlar bakteri yada küfler tarafından üretilirler.
Clostridium, Cellulomanas, Bacillus, Thermonospora gibi bakteriler ve Trichoderma, Fusarium, Humicola, Penicillium ve Schizophyllum gibi küfler selülaz enzimlerinin en
etkili üreticileridirler (Akpınar, 2003).
A. B.
ekil 2.3. A. Intra ve intermoleküler hidrojen ba lı β-1,4-D-glikoz zincirleri B. Kristal ve amorf bolgeleri içeren selüloz mikrofibrillerinin yapısı (Anonim, 2002).
Selobiyoz
Kristal bölge
Kristal bölge
Amorf bölge
Amorf bölge
Hububat tanelerinde selüloz, daneyi çevreleyen dı katmalarda fazla miktarda bulunmakta olup, ö ütme sırasında kepekle birlikte büyük ölçüde ayrılmaktadır. Ancak daha sonraki hububat i leme a amalarında büyük bir de i ime u ramamaktadır. nsan ve hayvan beslenmesinde selülozun fonksiyonu hemiselüloz, pektin ve gamlarla birlikte besinsel lif kompleksini olu turmasıdır. Hububat ürünlerindeki besinsel lif miktarı kullanılan un veya irmi in ekstraksiyon de erine ba lıdır. Selüloz meyve suyu üretiminde bulanıklı ı arttırıcı di er polisakkaritler gibi ortamdan klarifikasyonla uzakla tırılmaktadır. Ancak bulanık meyve suyu üretiminde bulanıklı ın sebebi olan selüloz vb. lifli maddeler dibe çökmekte ve bulanıklı ın sürekli olmamasına neden olmaktadır. Pektik maddelerle birlikte kompleks halde bulunan selüloz, meyve ve sebzelerin yapısal özelliklerinde önemli bir yere sahiptir (Köksel, 1998).
Kimyasal modifikasyonlara u ratılmı selüloz türevleri gıdaların yapısını, hidrofilik özelliklerini ve fonksiyonel kalitesini olumlu yönde etkilemekte ve çe itli tipteki selüloz modifikasyonları gıda endüstrisinde katkı maddeleri olarak ve ba ka amaçlarla kullanılmaktadır (Köksel, 1998). Safla tırılmı odun pulpu %18’lik NaOH ile muamele edildi inde alkali selüloz elde edilir. Alkali selüloz kloroasetikasitin sodyum tuzu ile reaksiyona girdi inde karboksimetilesterselülozun sodyum tuzu (Selüloz-O-CH2-COO -Na+) olu ur. Metilselüloz ve hidroksipropilselüloz, selülozun suda çözünen di er eterlerini temsil etmektedir. Alkali selüloz metilklorür ile muamele edildi inde yapıya metileter grupları girer ve metilselüloz (Selüloz-O-CH3) (MS) elde edilir. Hidroksipropilmetilselüloz (HPMS) ise alkali selülozun hem propilen oksit hem de metil klorür ile muamelesi sonucu elde edilir. Mikrokristal selüloz (MKS), selülozun kontrollü hidrolizi ile elde edilmektedir (Köksel, 1998).
2.2.2. Lignin
Lignin, bitki hücre duvarında en çok bulunan üçüncü polimerdir. Lignin oldukça heterojen bir yapıdadır ve sınırsız yapı ve boyuttaki dallanmı polimerlerdir ( ekil 2.4) (Das and Singh, 2004). Koniferil alkol, sinapil alkol ve koumaril alkol olmak üzere üç monomerden olu mu tur. Bitki hücre duvarındaki peroksidazlar yada lakkazlar bu monomerleri okside ederler (Hammel, 1997). Yumu ak odunsulardaki lignin sadece koniferil alkolden olu urken, sert odunsulardaki lignin hem koniferil alkol hemde sinapil alkol içermektedir (Ramos, 2003).
Ligninin en önemli özelliklerinden birisi, polisakkaritleri bir arada tutarak bitkiye yapısal sertli i vermektir. Yumu ak odunsularda ki lignin içeri i sert odunsulardan biraz daha yüksektir. Çünkü yumu ak odunsular daha fazla çapraz ba lı lignin içerirler (Jeffries and Jin, 2000).
2.2.3. Hemiselüloz
Hemiselüloz, selülozdan sonra do ada ikinci olarak en çok bulunan polisakkarittir. Lignoselülozik biyokütlenin yakla ık %20-35’ini olu tururlar. Hemiselülozlar, pentozlar (ksiloz, arabinoz), heksozlar (mannoz, glikoz, galaktoz) ve eker asitlerinden olu an heterojen polimerlerdir (Saha, 2003). Hemiselülozun ekerleri ksilopiranoz, D-glukopiranoz, D-galaktopiranoz, L-arabinofuranoz, D-mannopiranoz ve D-glukopiranosiluronik asit ile iz miktarda di er ekerlerdir. Ayrıca asetil ve metil alt gruplarını da içerir. skelet yapısı 1,4 ba ı ile ba lı ekerlerden olu an hemiselüloz, -1,2, -1,3 ve -1,6 noktalarında dallanma gösterir. Hemiselüloz yapısındaki ekerlere göre isimlendirilir. Örne in glikomannan, glikoronoksilan, arabinoglikoronoksilan, arabinogalaktan, galaktoglikomannan gibi (Obembe et al., 2006). Ba lıca yapıları bitki tipine ba lıdır ve aynı bitkinin farklı kısımları arasında de i iklik gösterebilir ( ekil 2.5) (Han and Rowell, 1997). Sert odunsu bitkilerin hemiselülozu daha çok ksilan içerirken, yumu ak odunsu bitkilerin hemiselülozu daha çok glikomannan içermektedir.
Dallanma oranı ve eker kompozisyonu ksilanın kayna ına ba lıdır. Sert odunsu bitkilerin yapısında ksiloz birimlerinin %60-70’i asetille mi tir. Genel olarak bitkilerde hemiselülozun polimerle me derecesi selülozdan dü üktür. Sert odunsu bitkilerde ksilanının DPsi (150-200) yumu ak odunsu bitkilerdeki ksilanın DPsinden (70-130) daha yüksektir (Saha, 2003; Ebringerova et al., 2005).
E
ekil 2.5. De i ik kaynaklardan elde edilen ksilanın yapısı. A: O-aseti-4-O-metilglikoronaksilan (sert odunsu bitkiler); B: Arabinoksilooligosakkarit (bu day kepe i); C: Arobino ksilan (çimen); D: Arabino-4-O-metilglikoro ksilan (yumu ak odunsu bitkiler). E: Keçiboynuzu gamı O OH O H O H OH O OH O O H OH O OH O O H O O OH O O H OH O OH O O H O OH O O OH O AcO RO O OH O AcO O O O H O OAc O O H O OH OR O H O OH O H H3CO HOOC O O H OH CH2OH O O H OH CH2OH OH O OH O O H RO O OH O O H O O O H O O OR O O OH OH H3CO COOH O O H OH HC O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H CH COOH2C H3CO OH O OH OH H3CO COOH O O H OH CH2OH O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H A B C D O O OH O AcO RO O OH O AcO O O O H O OAc O O H O OH OR O H O OH O H H3CO HOOC O O H OH CH2OH O O H OH CH2OH OH O OH O O H RO O OH O O H O O O H O O OR O O OH OH H3CO COOH O O H OH HC O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H CH COOH2C H3CO OH O OH OH H3CO COOH O O H OH CH2OH O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H A B C D
Yumu ak odunsu ksilanı ço unlukla arabino-metil-glikoronoksilan’dır. 4-O-metil-glikoronoksilan’a ilave olarak -L-arabinofuronosid üniteleri de içerir. Tek yıllık bitkilerin ksilanı odunsu dokuların ksilanından daha heterojen bir yapı gösterir (Han and Rowell, 1997).
Lignoselülozik biyokütle kompozisyonu çe itlilik gösterir. Bu materyallerin yapısı çok komplekstir ve ana biyokütle genellikle enzimatik hidrolize kar ı dirençlidir. Ksilan, hücre duvarının yapısal bütünlü ünde önemli bir rol oynar (Saha, 2003). Ksilan, hücre duvarında lignin ve selülozla beraber bulundu undan, lignoselülozik biyokütleye enzimatik hidrolizden önce ön i lem uygulanması gerekmektedir ( ekil 2.6). Lignoselülozik materyallere fermente olabilir ekerleri açı a çıkarmak yada enzimatik hidrolize hazır hale gelmeleri için fiziksel, kimyasal yada termal i lemler uygulanmalıdır (Jeffries and Jin, 2000).
Selüloz, hemiselüloz ve lignini birbirinden ayırmak amacıyla organik çözücü, sıcak su, buhar, amonyak, hidrojen peroksit, alkali, konsantre asit, sulu asit, SO2, CO2, kireç gibi çe itli materyaller kullanılabilir. Tüm i lemler ile biyokütlenin boyutu küçültülür ve fiziksel yapısı açılır ( ekil 2.6) (Saha, 2003). Tablo 2.3’de uygulanan öni lemler özetlenmi tir.
ekil 2.6. Lignoselülozik materyallere ön i lemlerin etkisinin ematik gösterimi (Mosier et al., 2005). Ön i lemler Amorf bölge Kristal bölge
Tablo 2.3. Lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön i lemler (Saha, 2003)
Metot Örnek
Termo mekanik Ö ütme, kesme
Otohidroliz Su buharı, yüksek basınç, süperkritik
karbondioksit
Asit uygulaması Sulu asit (H2SO4, HCI), konsantre asit (H2SO4, HCI)
Alkali uygulaması Sodyum hidroksit, amonyum, alkali
hidrojen peroksit
Organik solvent uygulaması Metanol, etanol, bütanol, fenol
2.2.3.1. Kullanım Alanları
Ksilanlar, genellikle dü ük molekül a ırlıkları, dü ük çözünürlülükleri ve ticari kaynaklarının yetersizliklerinden dolayı az bir kullanım alanı bulmu tur ve modifikasyonlarına olan ilgi, selüloz ve ni asta gibi mevcut ticari polisakkaritlerle kar ıla tırıldı ında oldukça dü üktür (Ebringerova et al., 2005). Daha yaygın olarak ksilanın parçalanmasıyla üretilen KOler veya ksilitol gıda endüstrisinde kullanılmaktadır.
2.2.3.1.1. Ksilooligosakkaritler
KOler -1,4 ba ı ile ba lı ksiloz ünitelerine sahip eker oligomerleridir. Endüstriyel olarak ksilanca zengin lignoselülozik maddelerden üretilirler. KOlere ilgi teknolojik özellikleri yanında sa lık üzerine de prebiyotik etkilerinden dolayı son yıllarda artmı tır (Vazquez et al., 2000). Bu konu ileride daha detaylı olarak verilmi tir.
2.2.3.1.2. Ksilitol
Ksilitol, 5 karbonlu eker alkolüdür, ço unlukla alkali ortamda odun hidrolizasyonundan elde edilen ksilozun kimyasal yolla indirgenmesi ile üretilir. Kimyasal i lemin olumsuz tarafları yüksek basınç (50 atm üstü) ve yüksek sıcaklık (80-140°C) uygulanması ve pahalı katalizör (Raney-Nikel) kullanılmasıdır. Bunun yanında hemiselüloz hidrolizinden elde edilen yan ürünlerin uzakla tırılması birkaç adımda gerçekle ir. Kimyasal üretiminde ya anan problemler nedeni ile ksilitolun fermentasyonla üretimi daha çok ilgi çekmeye ba lamı tır. Birçok maya ve küf, ksiloz metabolizmasının ilk adımında ksilozun ksilitole indirgenmesini katalizleyen NADPH’a sahiptir (Bostancı ve ark., 2007).
Ksilitol, bir çok meyvede do al olarak bulunan bir tatlandırıcıdır. Sebzeler ve insan vücudu do al olarak ksilitol üretir. Aslında vücutta 5-15 g/gün olu maktadır. Do al olarak hu a acı, bö ürtlen, çilek, ye il salata, karnabahar, erik, fıstık, muz ve mantarda da bulunur. Bitkilerden elde edilebildi i gibi ticari olarak hemiselülozdan üretilebilir. Ksilitol beyaz kristal eklinde olup nane gibi serinleten ho bir tadı vardır. Ksilitolün alerjik bir etkisi yoktur. Sukrozla benzer derecede tatlılı a sahip olmakla beraber, erime ısısı oldukça dü ük derecede oldu u için, ferahlık ve serinlik hissi verir. Görünü ü ve tadı ekere benzer. Fazla miktarda alınması ishale neden olur. Ksilitol a ızda fermente olmaz. Hayvan ve insan deneylerinde çürük önleyici oldu u görülmü tür. Minenin remineralizasyon sürecini uyarır. Floritle sinerjik etki göstererek a ız hijyeni ürünlerinin etkinli ini arttırır. Fermente edilebilen tüm ekerlerin yerine tatlandırıcı kullanıldı ında çürük olu madı ı ve ekerlemelerde, sakızlarda, alkolsüz içeceklerde, çe itli ilaçlarda, pastillerde sukrozun yerine ksilitol kullanılmasının çürük riskini azaltıcı oldu u ifade edilmektedir. A ızdaki plak miktarını azalttı ı ortaya çıkmı tır. Alkolsüz içecekler, dondurma, sakız ve ekerlemeler gibi çe itli ürünlerde ksilitol kullanılmaktadır. Japonya, Finlandiya, skandinav ülkeleri ve Sovyetler Birli i’nde diyabetik ürünlerde, Almanya’da ise damar içi beslenme ürünlerinde sıklıkla kullanılmaktadır (Bostanci ve ark., 2007).
2.2.3.1.3. 2,3-Bütandiol
2,3-Bütandiol 2,3-bütilen glikol (2,3-BD) olarak ta bilinen, sıvı yakıt, çözücü ve çe itli sentetik polimer ve reçinelerin ön maddesi olarak uygulama alanları olan de erli bir kimyasaldır. 2,3-BD’nin dehidrasyon ürünü endüstriyel çözücü metil etil keton, çok dü ük kaynama noktası nedeni ile yakıta daha çok uygundur. Daha ileri dehidrasyon ürünü olan 1,3-bütandien, polimer endüstrisinin önemli bir monomeri ve sentetik kauçu un ba langıç maddesidir. 2,3-Bütandiol katalitik dehidrojenasyonu ile olu turulan diasetil yüksek de erli gıda katkı maddesidir (Saha, 2003).
2.2.3.1.4. Di er Kullanım Alanları
Hemiselüloz laktik asit üretiminde de kullanılır. Laktik asit gıda, kozmetik, ilaç ve kimya endüstrisinde geni çapta kullanılmaktadır. Ayrıca hemiselüloz ferulik asit üretiminde de kullanılır, feruluk asit çe itli bitki hücre duvarlarında bulunan bir sinamik asittir (Saha, 2003).
3. KS LOOL GOSAKKAR TLER
KOler ksiloz ünitelerine sahip eker oligomerleridir ve KOler do al olarak meyveler, sebzeler, bambu filizleri, bal ve sütte bulunurlar. Endüstriyel olarak da ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden üretilirler (Vazquez et al., 2000). KO üretimi için kullanılabilecek tipik lignoselülozik materyaller sert odunsular (Garrote et al., 2003b), mısır koçanı (Yang et al., 2005), saman (Parajo et al., 2004) gibi tarımsal atıklar, malt kekleri ve kepektir (Vazquez et al., 2000).
3.1. Sa lık Açısından Önemleri
KOler prebiyotik olarak sınıflandırılmaktadırlar. Prebiyotikler ba ırsak sistemi tarafından hidrolize ve absorbe edilmeyen, ba ırsakta ya ayan en az bir bakterinin aktivitesini ve üremesini te vik eden ve böylece sa lı a olumlu etkide bulunan sindirilemeyen gıda katkılarıdır (Voragen, 1998).
KOler sindirilemeyen oligosakkaritler olarak sınıflandırılmaktadır. Bunlar ksiloz monomerleri arasındaki ba ın konfigürasyonunda olmasından dolayı insan sindirim enzimleri ( -glikozidaz, maltose-isomaltaz, sukraz) tarafından hidrolizasyona dayanıklıdır (Van Loo et al., 1999). Bu özellik, KOleri ekerlemelerde ve dü ük kalorili diyet gıdalarda kullanımında ve diyabetli bireylerin tüketimi için uygun hale getirir (Mussatto and Mancilha, 2007).
KOlerin alımı sonucu üremesi te vik edilen Bifidobakteriler asidik ortam yarattıklarından patojen mikroorganizmaların üremesini engellerler. Bu bakteriler ba ırsak mukozasının fonksiyonunu artırarak, patojenik mikrofloranın buraya ba lanarak
ço almasını engellemektedirler. Bunlar aynı zamanda bifidin ve bifidosin gibi do al antimikrobiyal maddeler salgılar ve ba ı ıklık sistemini uyarırlar. Bu antimikrobiyal maddeler, Clostritium ssp., Bacteroides, E.coli, Salmonella gibi patojenlerin üremesini engellemektedirler (Fooks et al., 1999).
KOler antimikrobiyal aktivite göstermektedirler. Christakopoulos et al. (2003) enzimatik hidroliz ile ürettikleri asidik KOlerin antimikrobiyal aktivitelerini Gram (+) ve Gram (-) bakteriler üzerinde test etmi ve bu bakteriler üzerinde pozitif etkilerinin oldu unu kanıtlamı tır.
KOler minerallerin biyolojik olarak kullanımını iyile tirmektedirler. Ara tırmalar bu materyallerin Ca ve Mg absorbsiyonunu artırdı ını göstermi tir (Van Loo et al., 1999). Mineral absorpsiyonunun genel olarak ince ba ırsaktaki difüzyondan ileri geldi i kabul edilir. Fakat ara tırmalar, fermente olabilir bile enlerin de ba ırsakta mineral absorpsiyonunu te vik etti ini göstermektedir. Ba ırsak mikroflorası tarafından fermantasyonu ve bunun sonucunda da kısa zincirli ya asitlerinin üretiminden dolayı, bu bile enler ba ırsaktaki epitel hücrelerin üremesini te vik eder ve ba ırsak pH’sını dü ürürler. Kısa zincirli ya asitleri ve dü ük pH, özellikle kalsiyum, magnezyum ve demir gibi çözünmeyen minerallerin çözünmesine yardımcı olur (Tungland and Meyer, 2002). Bu tip kanıtlar KOlerin osteoporosis riskini azaltabilece ini göstermektedir. Prebiyotikler toplam ve LDL-kolesterol seviyesini dü ürerek kalp-damar hastalıklarının geli mesini önlemektedir. Bunların hayvanlarda yapılan çalı malarda deneysel olarak uyarılan, kanser riskini azalttı ı gösterilmi tir (Van Loo et al., 1999).
KOler dı kı hacmini artırdıklarından ve ba ırsak hareketlili ini olumlu yönde de i tirdiklerinden dolayı kabızlık üzerine etkilidirler. KOlerin fermantasyonu sonucu olu an kısa zincirli ya asitleri etkili bir ekilde absorbe edilirler ve ba ırsak epitel hücreleri tarafından kullanılırlar. Su ve tuz absorpsiyonunda oldu u gibi geli imleri te vik edilir, osmotik basıncın etkisiyle dı kı hacmi artar ve sonuç olarak da ba ırsak hareketlili i iyile ir (Mussatto and Mancilha, 2007).
KOler spesifik olarak kısa zincirli ya asitleri olu turan bakteriler için substrat olarak rol oynarlar ve ba ırsak pH’sını dü ürebilirler. Kolondaki bifidobakterilerin artı ı ve ba ırsak pH’sının azalması kalın ba ırsaktaki karsinojenler üzerine direkt bir etkiye sahiptir. KOlerin antikarsinojenik ve antimutajenik etkilerinin mekanizması tam olarak anla ılamamı tır. Ancak muhtemel mekanizmaları: kolondaki patojenik bakterilerin miktarını azaltarak karsinojenik maddelerin üretimini azaltmaları ve/veya ba ırsak pH’sını dü ürerek enzimatik reaksiyonları etkilemeleri ve/veya mevcut karsinojenik maddelerin miktarını azaltmaları ve/veya ba ırsak kanser olu umunun ba lama ve te vik a amaları üzerine engelleyici etkilerini kullanmaları üzerinedir (Tungland and Meyer, 2002).
KOler kalp hastalıkları, diyabet ve obezite riskini dü ürürler (Mussatto and Mancilha, 2007). Bu 3 mekanizma ile açıklanmaktadır. Bunlardan ilki glikoz yada insülin konsantrasyonundaki de i ikliklerdir. KOler yemeklerden sonra kandaki glikoz seviyesini azaltırlar. kincisi ba ırsaktaki kısa zincirli ya asitlerinin (propiyonat, asetat, butirat) üretimidir. Propiyonat, kolestrol ve lipogenesisi engeller. Üçüncü mekanizma ise ba ırsakta safra asidinin bo alması ve çökelmesini sa layarak serum kolestrol seviyesini dü ürmeleridir. Serum lipit seviyesi ve kardiyovasküler hastalıklar arasında güçlü ve pozitif bir ili ki vardır. KOler kardiyovasküler hastalıkların önlenmesinde etkili ve güçlü bir etkiye sahiptirler (Swennen et al., 2006).
3.2. Fiziksel Özellikleri ve Gıda Açısından Önemleri
KOler dü ük DPye sahip karbonhidratlardır. Bu nedenle de dü ük moleküler a ırlı a sahiptirler. 2-10 arası monosakkarit ünitesi içerirler (Roberfroid, 2000). KOler suda çözünebilir ve sukroza göre 0,3-0,6 kat daha tatlıdır. Tatlılık kimyasal yapısına, DPye ve ortadaki mono ve disakkarit düzeyine ba lıdır (Voragen, 1998). Tatlılık zincir uzadıkça azalır (Roberfroid, 2000). Dü ük tatlılık derecesi, onların dolgu maddesi ve lezzet artırıcı olarak kullanımlarını uygun hale getirir (Voragen, 1998).
KOlerin indirgenme güçleri az olsa da, ısıl i lem uygulanan gıdalarda Maillard reaksiyonuna duyarlıdırlar (Voragen, 1998; Mancilla-Margalli and Lopez, 2002). KOler, 4 den dü ük pH’larda ve uzun süre normal depolanmı gıdalarda hidrolize olabilirler ve besinsel fizyolojik de erlerini kaybederler. Stabiliteleri, farklı oligosakkaritlerde eker cinsine, halka tipine, anomerik konfigürasyona ve ba tipine göre de i iklik göstermektedir. Genelde, β−ba ı α−ba ına göre daha dayanıklıdır. Heksozlar pentozlara ve deoksi ekerlere, piranozlar ise furanozlara göre daha dayanıklıdır (Voragen, 1998). KOler donmu gıdaların donma noktasını de i tirebilirler ve ısıl i lem görmü gıdalarda Mailard reaksiyonundan dolayı olu an esmerle menin iddetini kontrol edebilirler. Yüksek nem tutma ve dü ük su tutma kapasitesi sa larlar (Mussatto and Mancilha, 2007). KOler mineralleri ba lamazlar ve i lenmi gıdalarda kullanımları kolaydır. Ni asta retrogradasyonunu inhibe ederler (Voragen, 1998). KOler ince ba ırsakta sindirilemediklerinden ve absorbe olmadıklarından kalorisizdirler. Ancak ba ırsak fermantasyondan dolayı, çözünür diyet liflerine benzer olarak yakla ık 1,5 kcal/g enerji verir (Roberfroid, 2000).
3.3. Kullanım Alanları
KOler son birkaç 10 yıldır fonksiyonel gıda katkısı olarak piyasada yer almaktadır ve endüstriyel uygulamaları gittikçe artmaktadır. Ba lıca kullanımları içecekler (meyveli içecekler, kahve, kakao, çay, soda ve alkolü içecekler), süt ürünleri (fermente süt, süt tozu ve dondurma), jeller, pudingler ve erbetler gibi tatlılar; eker, kurabiye, bisküvi ve kahvaltılık tahıllar gibi ekerlemeler; çikolata ve tatlılar; ekmek ve hamur i leri; reçel ve marmelatlar gibi meyve ürünleri; balık ezmesi ve tofu gibi ürünleri kapsamaktadır (Mussatto and Mancilha, 2007).
Ksilooligosakkaritler oligosakkarit marketinin sadece küçük bir kısmını olu turmaktadır fakat talep her yıl artmaktadır. 2000’lerde yakla ık 60 irket
ksilooligosakkaritleri yakla ık 100 üründe kullanmı tır. Bu rakam gittikçe artmaktadır (Nabarlatz, 2006).
Kozmetik ve eczacılık sektörü de KOlerin fizikokimyasal özelliklerini kullanmaktadır. KOlerin kullanımı hayvan endüstrisinde de artmaktadır. Hayvanlarda ksiloligosakkaritler büyümeyi artırır ve beslenmeyi de i tirir. Erken ölümleri engeller ve dı kı kokusunu azaltır (Swennen et al., 2006).
Genelde bunların tüketimi, güvenli olarak dü ünülen seviyeden (15 g/gün) daha dü ük oldu u için, rahatlıkla gıdalara karı tırılarak kullanılmaktadır. Saf formda KOlerin etkili dozu 0,7 g/gün’dür (Voragen, 1998).
Yakın gelecekte KOler özellikle ya am tarzıyla ili kili hastalıkların azaltılmasında önemli rol oynayacaktır. Fizyolojik fonksiyonlarına ilave olarak KOler gıdaların fizikokimyasal özelliklerine yararlı modifikasyonlar sa lamaları kullanımlarını daha da te vik etmektedir (Swennen et al., 2006).
3.4. Ksilooligosakkaritlerin Elde Edilme Yöntemleri
KOlerin elde edilmesi oldukça zahmetli ve pahalıdır. Ancak bunların yaygın olarak kullanılması, bunların ucuz bir kaynaktan üretilmesine, toksik bile ikler olu umuna izin vermeden, verimli bir biçimde hidrolizasyonuna ve daha sonra ucuz ve pratik bir yöntemle istenilen DPye kadar safla tırılıp konsantre edilmesine ba lıdır.
Uygun bir lignoselülozik materyalden elde edilen ksilan enzim, asit ve ısı ile hidroliz (otohidroliz) edilerek KOler üretilebilir.
3.4.1. Otohidroliz
Otohidroliz, KOlerin ksilan ekstraksiyonuna ihtiyaç duymadan direk olarak lignoselülozik materyallerden üretilmeleridir. Lignoselülozik materyaller ısı ve sulu ortamda kendili inden hidroliz olmaktadır (Garrote et al., 2002).
Ksilan, hemiselülozun ana bile enidir. Hemiselülozun di er bile enleri ise araban ve asetil gruplarıdır. Otohidroliz, ba lıca reaksiyon ürünü olarak ksiloz ve KO olu umuna yol açan ksilanın hidrolizine neden olur. (Garrote et al., 2001). Lignoselülozik materyallere sulu ortamda 130-230ºC sıcaklık uygulandı ında, suyun otoiyonizasyonundan ve hammadde de bulunan asidik türlerin (üronik asit, asetik asit) iyonizasyonundan meydana gelen hidronyum iyonları hemiselülozu depolimerize ederek çözünür oligomerlere, ekerlere ve eker parçalanma ürünlerine (furfural ve hidroksimetilfurfural) dönü ümünü katalizlerler.
Otohidroliz reaksiyonunun tek a amada gerçekle mesinin yanında korozyon probleminin olmaması ve pis atıkların olu maması di er önemli faydalarıdır (Garrote et al., 1999). Ayrıca lignoselülozik materyallerin otohidrolizi biyokütle kullanımı için çevreye dost bir prosestir (Garrote et al., 2003b). Bu yüzden pek çok uygulamaları bulunmaktadır. Otohidroliz uygulaması ile ksilooligosakarit üretimi ile pek çok çalı ma yapılmı tır ve imdiye kadar mısır koçanından (Parajo et al., 2004, Garrote et al., 2002, Garrote et al., 2003b, Vazquez et al., 2006, Nabarlatz et al., 2007a, Garrote et al., 2001), Eucalyptus
globulus odunundan (Garrote et al., 1999, Parajo et al., 2004, Garrote et al., 2003b,
Vazquez et al., 2005, Garrote et al., 2003a), pirinç kavuzundan (Parajo et al., 2004, Nabarlatz et al., 2007a), arpa kavuzundan (Parajo et al., 2004), badem kabu undan (Nabarlatz et al., 2007a), zeytin çekirde inden (Nabarlatz et al., 2007a), bu day (Nabarlatz et al., 2007a) ve arpa sapından (Nabarlatz et al., 2007a) KO üretilmi tir. Bu yöntemin KO üretiminde en büyük dezavantajı ise fazla miktarda ksiloz ve ksiloz üretimine ba lı olarak furfural gibi istenmeyen maddeler üretmesidir. Hidrolizasyon sonunda olu an ürün KOlerin yanında fazla miktarda lignin ve selüloz parçalanma ürünlerini de içerir ve bu
yüzden iyi bir ekilde hidrolizatın safla tırılması gerekmektedir. Ayrıca, oldukça yüksek sıcaklık ve basınçta çalı an otoklav da gerekmektedir.
3.4.2. Enzimatik Hidroliz
Lignoselülozik biyokütlede ksilan genellikle ksilan-lignin komplesinde bulunmaktadır ve bu yüzden de hidrolize kar ı dirençlidir. Ksilan içeren lignoselülozik materyallerden direk enzimatik hidrolizle KOlerin üretimi sadece turunçgil kabukları gibi hassas materyaller için uygundur (Vazquez et al., 2000). Bu nedenle KO üretimi 2 a amada gerçekle ir: lignoselülozik biyokütleden ksilanın alkali ekstraksiyonu ve bunu takiben de ksilanın enzimatik hidrolizi.
Lignoselülozik biyokütledeki ksilanın alkali ekstraksiyonu için NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, H2O2 yada bu bile iklerin karı ımı kullanılır (Habibi and Vigron, 2005; Yoon et al., 2006; Sun et al., 2002; Pellerin et al., 1991; Sun et al., 1998; Zilliox and Debeire, 1998; Lisboa et al., 2005; Yanez et al., 2006). Bu polimerlerin pH stabilitesinden dolayı alkali ortamda ksilan içeren lignoselülozik materyallerin ekstraksiyonu gerçekle ir. Bazı durumlarda hammadde, lignin yada pektik maddelerin uzakla tırılması için, okside edici ajanlar, tuzlar yada alkollerle ön i leme tabi tutulabilir. Bu durumda ksilan asit, alkol yada ketonları içeren organik asitlerle çöktürme i lemi hemiselüloz ve hemiselüloz parçalanma ürünlerinin geri kazanımına izin verir (Vazquez et al., 2000).
Enzimatik hidroliz ksilanazlar tarafından gerçekle tirilir. Ksilanazlar ksilanın -1,4 ba ını parçalayarak, ksiloza hidroliz ederler. Ksilanın kompleks yapısından dolayı ksiloza tamamen hidrolizi için en az üç tane enzim gerekir. Ksilanazlar endoksilanazlar (1,4- -D-xylan xylohydrolases, EC 3.2.1.8), -D-ksilanazlar (1,4- -xyloside -D-xylanohydrolases, EC 3.2.1.37) ve esterazlardan olu ur (Bakır, 2002). Endoksilanaz ksilanı rasgele parçalar, -ksilozidaz KOleri ksiloza hidrolize eder, asetik asit (asetilksilan esteraz), ferulik asit
(ferulik asit esteraz) ve p-kumarik asit (p-kumarik asit esteraz) gibi bile ikler esterazlarla parçalanır. Ayrıca arabinoz ve 4Ometil glukuronik asit birimlerini sırası ile -arabinofuranozidaz ve -glukouronidaz enzimleri ile ksilan iskeletinden uzakla tırılır.
ekil 2.7’de ksilanı parçalayan enzimlerin parçalama mekanizmaları gösterilmi tir (Saha, 2003).
Bachmann and McCarthy (1989) endo-ksilanaz, -ksilozidaz, -arabinofuranozidaz ve Thermomonospora fusca’nın sahip oldu u asetilksilan esteraz arasında önemli bir sinerjik etkinin oldu unu rapor etmi lerdir.
Birçok mikroorganizmanın farklı tipte ksilanaz üretti i bilinmekte ve enzimin yapısı farklı organizmalar arasında da de i iklik göstermektedir. Bunlar arasında en fazla ilgiyi Trichoderma spp. gibi mantarlardan üretilen enzimler çekmektedir. T. reesei, T.
harzianum, T. viride ve T. koningii’yi içeren Trichoderma spp. selülolitik ve ksilanolitik
enzimlerin bilinen en iyi üreticileridir (Chen et al., 1997).
KOlerin enzimatik olarak üretimleri için ve ksiloz üretimini engellemek için enzim kompleksi dü ük ekzoksilanaz ve/veya -ksilozidaz aktivitesine sahip enzim kompleksleri istenir (Vazquez et al., 2000).
Enzimle hidroliz daha spesifik ve ılımlı ko ullarda gerçekle ti i için ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadı ı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olu mamaktadır. Ayrıca enzimatik hidrolizde, enerji ihtiyacı da daha dü üktür. Ancak bu yöntemde hidroliz için gereken enzimlerin üretimi oldukça zahmetli, pahalı ve zaman alıcıdır.
ekil 2.7. Ksilanazların ksilan substratı parçalama biçimleri (Beg et al., 2001)
KOlerin enzimatik hidroliz ile üretimi ile ilgili pek çok çalı ma yapılmı tır. imdiye kadar yulaf atıklarından (Chen et al., 1997), a açlardan (Freixo and Pinho, 2002), mısır koçanından (Pellerin et al., 1991; Ai et al., 1991; Yoon et al., 2006), bu day saplarından (Zilliox and Debeire, 1998; English et al., 1997) KOler üretilmi tir. Eucalyptus
globulus odununun enzimatik hidrolizi için Trichoderma longibranchiatum’dan elde edilen
Bioxilanase, Aspergillus niger’den elde edilen Hemicellulase 90, Trichoderma viride’den elde edilen Selülaz T4, Trichoderma reesei’den elde edilen Celluclast ve Trichoderma
reesei’den elde edilen EconaseR HC400’ü kullanmı tır. Akpınar et al. (2007) pamuk saplarından KO üretimi için kullandı ı enzimatik hidrolizde Aspergillus niger’den üretilen ticari ksilanaz (Veron 191)’ı kullanmı tır. Zilliox ve Debeire (1998) KO üretimi için
kullandı ı bu day samanının enzimatik hidrolizi için termofilik Bacillus D3 su undan üretilen endo-1,4- -ksilanaz kullanmı tır. Pellerin et al. (1991) mısır koçanı ksilanının enzimatik hidrolizi için Clostridium thermolacticum TC21’den üretilen endo1,4 -ksilanaz, -ksilozidaz, -glikozidaz ve endo-1,4- glukanaz kullanmı tır. Christakopoulos et al. (2003) hu a acı ksilanının enzimatik hidrolizi için Thermoascus aurantiacus 10. aile ait ve Sporotrichum thermophile 11. aileye ait endoksilanaz kullanmı lardır.
3.4.3. Asit Hidroliz
Ksilanın enzimatik hidrolizinin pek çok avantajları olmasına ra men, enzimatik hidrolizin bazı dezavantajları vardır. Ksilan yapısındanki farklı eker grupları, asetil grupları ve dallanmalar enzimatik hidrolize kar ı direnç göstermektedir ve üretilen ürünün DPsini kontrol etmek çok zordur (Sun et al., 2002). Enzimatik hidrolizde üretilen KOlerin DPsi, kullanılan enzime ba lıdır. Buna kar ılık asit ile hidroliz reaksiyonunda kullanılan asidin cinsinden ve ksilan yapısından ba ımsız olarak, ksiloz üniteleri arasındaki glikozidik ba ları hidroliz etmektedir. Alternatif olarak, ksilan enzimle hidrolize edildi i gibi asitle de hidrolize edilebilir. Lignoselülozik biyokütle de ksilan, ksilan-lignin kompleksi içinde bulundu undan hidrolize kar ı direnç göstermektedir. Bu nedenle de hidroliz i lemi, lignoselülozik biyokütlenin alkali ekstraksiyonu ve bunu takiben de ksilanın asit hidrolizi olmak üzere 2 a amada gerçekle ir.
Lignoselülozik materyallerden asit hidrolizi ile KO üretimi için H2SO4, HCI ve tri
fluoro asetik asit gibi asitler kullanılabilmektedir (Sun et al., 2002; Larsson et al., 1999). Bu metot DPsi 2-15 arasındaki KOlerin hazırlanması için kullanılan pratik bir yöntemdir
(Sun et al., 2002).
Bu yöntemin de en büyük dezavantajlarından birisi, KOlerin yanında furfural gibi istenmeyen bile iklerinde elde edilmesinin söz konusu olmasıdır. Ayrıca fazla
monosakkarit üretimi söz konusudur. Bunun yanında asit bazla nötralize edilece inden nötralizasyon ürünlerinin uygun bir ekilde uzakla tırılması gerekti inden, üretim maliyetlerini artırmaktadır (Vazquez et al., 2002).
3.5. Safla tırma Yöntemleri
Oligosakkaritleri ürettikten sonra en önemli a amalardan birisi de istenilen polimerizasyon aralı ına kadar safla tırmadır. Gıda amaçlı kullanılan oligosakkaritler çok saf materyaller de ildir. ki veya daha fazla DPye sahip oligomer karı ımlarıdır. Amaç yüksek molekül a ırlıklı polisakkaritleri ve yararlı özelli i olmayan dü ük molekül a ırlıklı ekerleri ve di er bile ikleri istenilen üründen ayırmaktır. Bu amaçla kullanılabilecek safla tırma yöntemleri:
• Vakum evaporasyon • Solvent ekstraksiyon • Kromatografik metotlar • Membran ayırma
Vakum evaporasyon ile KOlerin konsantrasyonu artırılabilir ve furfural gibi uçucu bile enler uzakla tırılabilir (Vazquez et al., 2005).
Solvent ekstraksiyon, otohidroliz ürününün eker olmayan bile enlerinin uzakla tırılması için uygun olan bir yöntemdir (Moure et al., 2006). Solvent ekstraksiyonda ksilan parçalanma ürünlerinin safla tırılması amacıyla formik, asetik ve propionik asit gibi organik asitler ile alkol, aseton ve 2-propanol gibi organik solventler kullanılabilir (Vazquez et al., 2000). Safla tırmanın derecesi ve geri kazanılan ürün kullanılan solvente, lignoselülozik materyale ve eker olmayan bile enlere ba lıdır (Moure et al., 2006).
KOlerin safla tırılması amacıyla kullanılan kromatografik metotlar adsorpsiyon ve iyon de i tirici reçineleri içermektedir. Adsorbsiyonla safla tırma için aktif kömür, asit çamur, bentonit, diatome topra ı, alüminyum hidroksit, alüminyum oksit, titanyum, silika ve gözenekli sentetik materyaller gibi adsorbentler kullanılabilir (Vazquez et al., 2000). Adsorbsiyon KO içeren bile enlerin safla tırılması amacıyla kullanılırken, iyon de i tirici reçineler tuzun giderilmesinde ve di er istenmeyen bile enlerin uzakla tırılmasında kullanılır (Vazquez et al., 2005).
KOlerin safla tırılması amacıyla kullanılan vakum evaporasyon, kromatografik metotlar veya solvent ektsraksiyonu zaman alıcı ve büyük ölçeklerde üretim için pratik ve ekonomik de ildir (Alanso et al., 2003). Di er bir yöntem ise membran ayırma teknikleridir. Ultrafiltrasyonla elde edilen hidrolizat büyük molekül a ırlıklı polisakkaritlerden ve proteinlerden kurtularak daha sonra nanofiltrasyonla konsantre edilirken aynı zamanda dü ük molekül a ırlıklı maddeler ve di er nötralizasyon ürünleri gibi istenmeyen materyallerden arındırılır (Kamada et al., 2002).
Membran ayırma yöntemlerinde safla tırma ve konsantrasyon çok fazla enerji tüketmeden ve zararlı organik solventler kullanılmadan gerçekle ir. Bu yöntemde kullanılan cihazların kullanımı kolaydır ve istenilen yere kolaylıkla ta ınabilir. Ayrıca cihaz çok fazla yer kaplamamaktadır (Akpinar et al., 2007).
Goulas et al. (2002) galakto-oligosakkarit urubu (ticari oligosakkarit karı ımı)’nun safla tırılması için nanofiltrasyon uygulamasını kullanmı tır. Vegas et al. (2006) pirinç kabu unun otohidrolizi ile elde etti i KOlerin safla tırılması amacıyla ultra ve nano-filtrasyon uygulamalarını kullanmı tır. Akpınar et al. (2007) pamuk saplarında enzimatik hidrolizle elde ettti i KOlerin safla tırılması amacıyla ultrafiltrasyon kullanmı tır. Nabarlatz et al. (2007b) badem kabu undan otohidroliz ile elde etti i KOlerin safla tırılması amacıyla ultrafiltrasyon uygulamalarını kullanmı tır. Freixo et al. (2002) kayın a acı ksilanına uyguladı ı enzimatik hidroliz sonucu elde etti i oligosakkaritleri farklı boyutlardaki membranlarla safla tırmı tır.
4. MATERYAL VE METOT
4.1. Materyal
Ara tırma 2005-2007 yılları arasında Gaziosmanpa a Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisli i Bölümünde yürütülmü tür. Ara tırma için gerekli olan tütün sapları Tokat ili Yayladalı köyündeki tarlalardan temin edilmi tir.
Tütün yaprakları toplandıktan sonra tarlalarda kalan tütün sapları güne te kurutulduktan sonra ö ütülerek KO üretimi için hazır hale getirilmi tir.
Aspergillus niger’den elde edilen ksilanaz (Veron 191) AB Enzymes’den (AB
Enzymes, Darmstadt, Almanya) temin edilmi tir. Aluminyum-destekli silica gel 60 TLC plakaları, Sigma’dan (Sigma Chemical Company, MO, USA), Aminex HPX87H ve Aminex 42A HPLC kolonları Biorad’dan (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) alınmı tır. Ksilooligosakkarit standardı, ksilobiyoz (X2), ksilotriyoz (X3), ksilotetroz (X4), ksilopentoz (X5) ve ksiloheksoz (X6) Megazyme’den (Megazyme, Bray, rlanda) ve di er kullanılan kimyasalların hepsi ya Sigma’dan (Sigma Chemical Company, MO, USA) yada Merk’den (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) temin edilmi tir.
4.2. Metot
4.2.1. Tütün Atıklarının Karakterizasyonu
4.2.1.1. Nem
Tütün atıklarının nem içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Tütün atıkları darası alınmı petri kutularına (G2) yakla ık 2’ er gram (G1) tartılarak 105ºC’lik etüvde 3 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda kaplar desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları (G3) belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) nem miktarları a a ıdaki formül kullanılarak hesap edilmi tir.
% Nem = [(G1 + G2) – G3 ] / G1x 100
4.2.1.2. Kül
Tütün atıklarının kül içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Tütün atıkları darası alınmı porselen krozelere (G2) yakla ık 1’er gram (G1) tartılarak önce elektrikli ısıtıcıda ön yakma i lemi gerçekle tirilmi tir. Daha sonra örnekler kül fırınına (Protherm furnaces, model: PLF 115M) alınarak sıcaklık kademeli bir ekilde 600ºC’ye çıkartılarak 5 saat yakılmı tır. Bu süre sonunda porselen krozeler desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları (G3) belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) kül miktarları a a ıdaki formül kullanılarak hesap edilmi tir.
% Kül = [(G3-G2) / G1] x 100
4.2.1.3. Lignin
Tütün atıklarının lignin içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Önceden ö ütülüp etüvde 105ºC’de kurutulmu olan tütün atıklarından 300 mg alınıp %72’lik H2SO4 ile 30ºC’de 1 saat kadar karı tırılmı ve 84 mL distile su ile asit içeri i %3’e kadar seyreltilmi tir. Seyreltilmi materyal 2 saat kaynatılmı ve bunu takiben materyal önceden darası alınmı porlu kroze ile filtre edilmi tir. Filtrasyon sonunda kalan katı kısım sıcak su ile yıkanmı ve 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilerek tütün atıklarının yüzde (%) lignin içerikleri hesap edilmi tir.
4.2.1.4. Selüloz
Tütün atıklarının selüloz içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (Han and Rowel, 1997). Öncelikle 2,5 g tütün atı ı üzerine 80 mL distile su ilave edilmi ve 70ºC’de her 60 dakikada bir, toplam 6 kez 1 g sodyum klorit (NaCIO2) ve 0,5 mL asetik asit (CH3COOH) ile muamele edilerek reaksiyon 24. saatte durdurulmu ve örnekler filtre edilmi tir. Filtrasyon sonunda kalan katı kısım aseton (C3H6O) ile yıkanmı ve 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilmi tir. Böylece tütün atıklarındaki lignin ortamdan uzakla tırılmı tır. Daha sonra elde edilen 2 g örnek 25 mL %17,5’luk NaOH ile muamele edilip darası alınmı porlu kroze ile filtre edilerek hemiselüloz uzakla tırılmı tır. Kalan katı kısım 100 mL %8,3’lük NaOH ve distile suyla yıkanmı , yıkanan örne e 15 mL %10’luk asetik asit ilave edilerek tekrar distile suyla
yıkama i lemi gerçekle tirilmi tir. Daha sonra örnekler 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilmi tir.
4.2.1.5. Ksilan
Yukarıda %17,5 NaOH muamelesinden elde edilen filtrat hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karı ımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra ksilan filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC’de kurutulmu tur (ASTM, 1993).
4.2.1.6. Özüt içeri i
So uk Suda Çözünürlük: Tütün atıklarının so uk suda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 300 mL distile su ile 23±2ºC’de 48 saat manyetik karı tırıcıda karı tırılmı tır. Elde edilen bu karı ım darası alınmı kaba filtre ka ıdından süzülerek, so uk su ile yıkanmı tır. Daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 2 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının so uk suda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Sıcak Suda Çözünürlük: Tütün atıklarının sıcak suda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 100 mL distile su ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna (Elektro-mag, model: M956) yerle tirilerek 3 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülerek, sıcak su ile yıkanmı tır. Daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 2 saat bekletilmi tir. Bu süre
sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının sıcak suda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Alkol-Benzen karı ımında çözünürlük: Tütün atıklarının alkol-benzen karı ımında çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 50 mL %95’lik etilalkol ve 100 mL benzen ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna yerle tirilerek 6 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü ve daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 1 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının alkol-benzen karı ımında çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Diklorometanda çözünürlük: Tütün atıklarının diklorometanda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 150 mL %98’lik diklorometan ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna yerle tirilerek 6 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü ve daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 1 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının diklorometanda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
4.2.2. Büyük Ölçekte Tütün Sapları Ksilanının (TSK) Ekstraksiyonu
Tütün atıklarının ksilan ekstraksiyonu Zilliox ve Debeire (1998)’e göre yapılmı tır. Öncelikle 20 g tütün atı ı 1000 mL destile su ile karı tırılıp 60ºC’de 16 saat inkübe edilip bu süre sonunda süzülmü tür. Daha sonra pelete 170 mL %24’lük KOH + %1’lik NaBH4 ilave edilerek 35ºC’de 3 saat özütlenmi tir. Süspansiyon 25ºC’de 10 dk. 5000xg’de
santrifüj (Boeco U-32R type 1610-13) edilerek çökelti uzakla tırılmı ve sıvı kısmın Whatman 41 ile filtrasyonu sa lanmı tır. Elde edilen süpernatant, hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karı ımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC’de kurutulmu tur.
4.2.3. Tütün Sapları Ksilanının Karakterizasyonu
4.2.3.1 Üronik Asit
Tütün atıklarından elde edilen ksilanın üronik asit içeri i m-hidroksidifenil metodu ile D-glukoronik asit standardı kullanarak belirlenmi tir (Melton and Smith, 2001). 5 mg TSK 2 mL konsantre sülfürik asitle karı tırılıp buz içine yerle tirilmi ve toplam hacim 10 mL olana kadar distile su ile seyreltilmi tir. Örnekler 10 dakika 2000xg’de santrifüj edilmi ve sıvı kısımdan 400 µL alınarak 40 µl 4 M sulfamik asit/potasyum sulfamat çözeltisi (pH 1,6) ile karı tırılmı tır. Üzerine sülfürik asit içinde hazırlanmı 2,4 mL 75 mM sodyum tetraborat eklenmi ve 100ºC su banyosu içinde 20 dakika kaynatılmı tır. Örnekler oda sıcaklı ına kadar so utulduktan sonra 80 µL m-hidroksidifenol çözeltisi eklenmi tir. Kontrol de m-hidroksidifenol çözeltisi yerine 80 µL %0,5’lik NaOH eklenerek yapılmı tır. Örnekler 10 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildikten sonra olu an pembe renk spektrofotometrede (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201) 525 nm’de okunmu tur.
