4.1. Materyal
Ara tırma 2005-2007 yılları arasında Gaziosmanpa a Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisli i Bölümünde yürütülmü tür. Ara tırma için gerekli olan tütün sapları Tokat ili Yayladalı köyündeki tarlalardan temin edilmi tir.
Tütün yaprakları toplandıktan sonra tarlalarda kalan tütün sapları güne te kurutulduktan sonra ö ütülerek KO üretimi için hazır hale getirilmi tir.
Aspergillus niger’den elde edilen ksilanaz (Veron 191) AB Enzymes’den (AB
Enzymes, Darmstadt, Almanya) temin edilmi tir. Aluminyum-destekli silica gel 60 TLC plakaları, Sigma’dan (Sigma Chemical Company, MO, USA), Aminex HPX87H ve Aminex 42A HPLC kolonları Biorad’dan (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) alınmı tır. Ksilooligosakkarit standardı, ksilobiyoz (X2), ksilotriyoz (X3), ksilotetroz (X4), ksilopentoz (X5) ve ksiloheksoz (X6) Megazyme’den (Megazyme, Bray, rlanda) ve di er kullanılan kimyasalların hepsi ya Sigma’dan (Sigma Chemical Company, MO, USA) yada Merk’den (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) temin edilmi tir.
4.2. Metot
4.2.1. Tütün Atıklarının Karakterizasyonu
4.2.1.1. Nem
Tütün atıklarının nem içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Tütün atıkları darası alınmı petri kutularına (G2) yakla ık 2’ er gram (G1) tartılarak 105ºC’lik etüvde 3 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda kaplar desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları (G3) belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) nem miktarları a a ıdaki formül kullanılarak hesap edilmi tir.
% Nem = [(G1 + G2) – G3 ] / G1x 100
4.2.1.2. Kül
Tütün atıklarının kül içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Tütün atıkları darası alınmı porselen krozelere (G2) yakla ık 1’er gram (G1) tartılarak önce elektrikli ısıtıcıda ön yakma i lemi gerçekle tirilmi tir. Daha sonra örnekler kül fırınına (Protherm furnaces, model: PLF 115M) alınarak sıcaklık kademeli bir ekilde 600ºC’ye çıkartılarak 5 saat yakılmı tır. Bu süre sonunda porselen krozeler desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları (G3) belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) kül miktarları a a ıdaki formül kullanılarak hesap edilmi tir.
% Kül = [(G3-G2) / G1] x 100
4.2.1.3. Lignin
Tütün atıklarının lignin içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). Önceden ö ütülüp etüvde 105ºC’de kurutulmu olan tütün atıklarından 300 mg alınıp %72’lik H2SO4 ile 30ºC’de 1 saat kadar karı tırılmı ve 84 mL distile su ile asit içeri i %3’e kadar seyreltilmi tir. Seyreltilmi materyal 2 saat kaynatılmı ve bunu takiben materyal önceden darası alınmı porlu kroze ile filtre edilmi tir. Filtrasyon sonunda kalan katı kısım sıcak su ile yıkanmı ve 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilerek tütün atıklarının yüzde (%) lignin içerikleri hesap edilmi tir.
4.2.1.4. Selüloz
Tütün atıklarının selüloz içerikleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (Han and Rowel, 1997). Öncelikle 2,5 g tütün atı ı üzerine 80 mL distile su ilave edilmi ve 70ºC’de her 60 dakikada bir, toplam 6 kez 1 g sodyum klorit (NaCIO2) ve 0,5 mL asetik asit (CH3COOH) ile muamele edilerek reaksiyon 24. saatte durdurulmu ve örnekler filtre edilmi tir. Filtrasyon sonunda kalan katı kısım aseton (C3H6O) ile yıkanmı ve 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilmi tir. Böylece tütün atıklarındaki lignin ortamdan uzakla tırılmı tır. Daha sonra elde edilen 2 g örnek 25 mL %17,5’luk NaOH ile muamele edilip darası alınmı porlu kroze ile filtre edilerek hemiselüloz uzakla tırılmı tır. Kalan katı kısım 100 mL %8,3’lük NaOH ve distile suyla yıkanmı , yıkanan örne e 15 mL %10’luk asetik asit ilave edilerek tekrar distile suyla
yıkama i lemi gerçekle tirilmi tir. Daha sonra örnekler 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilmi tir.
4.2.1.5. Ksilan
Yukarıda %17,5 NaOH muamelesinden elde edilen filtrat hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karı ımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra ksilan filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC’de kurutulmu tur (ASTM, 1993).
4.2.1.6. Özüt içeri i
So uk Suda Çözünürlük: Tütün atıklarının so uk suda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 300 mL distile su ile 23±2ºC’de 48 saat manyetik karı tırıcıda karı tırılmı tır. Elde edilen bu karı ım darası alınmı kaba filtre ka ıdından süzülerek, so uk su ile yıkanmı tır. Daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 2 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının so uk suda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Sıcak Suda Çözünürlük: Tütün atıklarının sıcak suda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 100 mL distile su ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna (Elektro-mag, model: M956) yerle tirilerek 3 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülerek, sıcak su ile yıkanmı tır. Daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 2 saat bekletilmi tir. Bu süre
sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının sıcak suda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Alkol-Benzen karı ımında çözünürlük: Tütün atıklarının alkol-benzen karı ımında çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 50 mL %95’lik etilalkol ve 100 mL benzen ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna yerle tirilerek 6 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü ve daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 1 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının alkol-benzen karı ımında çözünürlükleri hesap edilmi tir.
Diklorometanda çözünürlük: Tütün atıklarının diklorometanda çözünürlükleri gravimetrik olarak hesaplanmı tır (ASTM, 1993). 2 g tütün atı ı 150 mL %98’lik diklorometan ile karı tırılmı ve karı ım sıcak su banyosuna yerle tirilerek 6 saat refluks edilmi tir. Elde edilen bu karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü ve daha sonra filtre ka ıdı içeri i ile birlikte 105ºC’lik etüvde 1 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda filtre ka ıtları desikatöre alınıp 1 saat süre ile so uması sa landıktan sonra a ırlıkları belirlenmi tir. Bu i leme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek tütün atıklarının diklorometanda çözünürlükleri hesap edilmi tir.
4.2.2. Büyük Ölçekte Tütün Sapları Ksilanının (TSK) Ekstraksiyonu
Tütün atıklarının ksilan ekstraksiyonu Zilliox ve Debeire (1998)’e göre yapılmı tır. Öncelikle 20 g tütün atı ı 1000 mL destile su ile karı tırılıp 60ºC’de 16 saat inkübe edilip bu süre sonunda süzülmü tür. Daha sonra pelete 170 mL %24’lük KOH + %1’lik NaBH4 ilave edilerek 35ºC’de 3 saat özütlenmi tir. Süspansiyon 25ºC’de 10 dk. 5000xg’de
santrifüj (Boeco U-32R type 1610-13) edilerek çökelti uzakla tırılmı ve sıvı kısmın Whatman 41 ile filtrasyonu sa lanmı tır. Elde edilen süpernatant, hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karı ımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC’de kurutulmu tur.
4.2.3. Tütün Sapları Ksilanının Karakterizasyonu
4.2.3.1 Üronik Asit
Tütün atıklarından elde edilen ksilanın üronik asit içeri i m-hidroksidifenil metodu ile D-glukoronik asit standardı kullanarak belirlenmi tir (Melton and Smith, 2001). 5 mg TSK 2 mL konsantre sülfürik asitle karı tırılıp buz içine yerle tirilmi ve toplam hacim 10 mL olana kadar distile su ile seyreltilmi tir. Örnekler 10 dakika 2000xg’de santrifüj edilmi ve sıvı kısımdan 400 µL alınarak 40 µl 4 M sulfamik asit/potasyum sulfamat çözeltisi (pH 1,6) ile karı tırılmı tır. Üzerine sülfürik asit içinde hazırlanmı 2,4 mL 75 mM sodyum tetraborat eklenmi ve 100ºC su banyosu içinde 20 dakika kaynatılmı tır. Örnekler oda sıcaklı ına kadar so utulduktan sonra 80 µL m-hidroksidifenol çözeltisi eklenmi tir. Kontrol de m-hidroksidifenol çözeltisi yerine 80 µL %0,5’lik NaOH eklenerek yapılmı tır. Örnekler 10 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildikten sonra olu an pembe renk spektrofotometrede (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201) 525 nm’de okunmu tur.
4.2.3.2. eker Kompozisyonu
Tütün atıklarından elde edilen ksilanın eker kompozisyonu HPLC ile belirlenmi tir (ASTM, 2003). Tütün atıklarından elde edilen 0,3 g ksilan önce 3 mL %72’lik H2SO4 ile karı tırılmı ve 30oC’lik su banyosunda her 15 dakikada bir karı tırılarak 2 saat inkübe edilmi tir. Örnekteki asit içeri i 77,55 mL distile su eklenerek %4’e kadar seyreltilmi ve 100ºC’de kaynayan su banyosunda 4 saat kadar inkübe edilmi tir. Bu sürenin sonunda örnekler oda sıca ına kadar so utulmu ve CaCO3 ile pH de eri 5-6’ya ayarlanmı tır. Elde edilen örnek 25ºC’de 10 dakika 5000xg’de santrifüj edilmi ve bu i lem sonucunda filtre edilerek örnekler eker kompozisyonun belirlenmesi için hazır hale getirilmi tir.
Hidrolizasyon esnasında olu an KOlerin miktarı refraktometrik dedektöre (model 200) ve kolon fırınına (model 200) sahip Perkin Elmer HPLC sisteminde analiz edilmi tir. Kolon olarak Aminex HPX87H (Biorad) kolonu kullanılmı tır. Örnekler enjeksiyondan önce 0,20 µm boyutlu filtrelerden geçirilmi tir. Hareketli faz olarak 5 mM H2SO4 su kullanılmı tır. Örnekler 45ºC’de ve 0,4 mL/dk akı hızı ile 45 dakika kolondan elut edilmi tir.
4.2.4. Tütün Sapları Ksilanının Enzimatik Hidrolizasyonu
Öncelikle kullanılan enzimin protein içeri i Bradford metodu ile bovin serum albumun standardı kullanarak spektrofotometrik olarak belirlenmi tir (Bradford, 1976). 500 µL örnek 5 mL 0,5 mg/mL Bradford çözeltisi ile karı tırılmı ve 10 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildikten sonra olu an renk spektrofotometrede 595 nm’de okunmu tur. Enzim konsantrasyonları istenen endoksilanaz aktivitesine göre ayarlanmı tır. Bir unite (U) enzim aktivitesi 1 dakikada 1 µmol ksiloz üreten enzim miktarı olarak tanımlanmı tır (Bailey et al., 1992).
Ticari olarak elde edilen ksilanaz, TSK ile inkübe edilerek KOler üretilmi tir. Enzimatik hidrolizasyon farklı enzim (0, 1,4, 2,7, 4,1, 8,2 ve 16,5 U/mL) ve substrat konsantrasyonları (%0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10) ile farklı sıcaklıkta (30, 40, 50ºC) ve farklı pH de erlerinde (4,5, 5,5, 6,5) gerçekle tirilerek üretim ko ulları optimize edilmi tir. De i ik zaman aralıklarında (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 sa) örnekler alınmı , enzimin aktivitesi 100ºC’de 5 dakika kaynatılarak durdurulduktan sonra üretilen KOlerin miktarı ve kompozisyonu incelenmi tir. Hidrolizasyon ürünlerinin miktarı olu an indirgen ekerlerin miktarı DNS metodu ile ve olu an KOlerin kompozisyonu da TLC ve HPLC ile incelenmi tir (Chen et al., 1997 ).
4.2.5. Tütün Sapları Ksilanının Asitle Hidrolizasyonu
Asitle hidrolizasyon için farklı substrat konsantrasyonları (%0, 1, 2, 3, 4, 5), de i ik konsantrasyonlardaki asitlerle (0, 0,125, 0,250, 0,5) inkübe edilmi ve reaksiyondan belirli zaman aralıklarında (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 sa) örnekler alınarak ko ullar optimize edilmi tir. Elde edilen örneklerin pH de eri CaCO3 ile 5-6’ya ayarlanarak hidrolizasyon i lemi durdurulmu tur. Daha sonra örnekler 25ºC’de 10 dakika 5000xg’de santrifüj edilmi ve bu i lem sonucunda filtre edilerek üretilen KOlerin miktarı ve kompozisyonu incelenmi tir. Hidrolizasyon ürünlerinin miktarı olu an indirgen ekerlerin miktarı DNS metodu ve olu an KOlerin kompozisyonu da TLC ve HPLC ile incelenmi tir (Chen et al., 1997 ).
4.2.6. Membran Filtrasyon
Enzimatik yöntemle %2 TSKdan 4,1 U/mL enzim ile pH 5,5 ve 40oC’de 8 saatte elde edilen KO karı ımından, 40 mL öncelikle yüksek molekül a ırlıklı polisakkaritler ve enzimleri uzakla tırmak için büyük gözenek yapısına sahip membrandan (10 kDa) tutulanın hacmi 1-1,5 mL kalana kadar ultrafiltrasyona tabi tutulmu tur. stenilen DPde KOlerin üretimi amacıyla elde edilen 38 mL filtrat daha küçük gözenek yapısına sahip membranlardan (3 kDa) geçirilerek tutulanın hacmi 1-1,5 mL kalana kadar ikinci bir ultrafiltrasyona tabi tutulmu tur. Sonuçlarda Fenol/sülfürik asit metodu ile toplam eker tayini ve HPLC analizleri yapılmı tır (Goulas et al., 2002 ).
Asit hidroliz yöntemi ile %2 TSKdan 0,25 M H2SO4 ile 30 dakikada elde edilen KO karı ımından, 40 mL öncelikle yüksek molekül a ırlıklı polisakkaritler ve çözünmeyen tuzları uzakla tırmak için büyük gözenek yapısına sahip membrandan (30 kDa) tutulanın hacmi 1-1,5 mL kalana kadar ultrafiltrasyona tabi tutulmu tur. stenilen DPde KOlerin üretimi amacıyla elde edilen 38 mL filtrat daha küçük gözenek yapısına sahip membranlardan (1 kDa) geçirilerek tutulanın hacmi 3 mL kalana kadar ikinci bir ultrafiltrasyona tabi tutularak safla tırılıp konsantre edilmi tir. Sonuçlarda Fenol/sülfürik asit metodu ile toplam eker tayini ve HPLC analizleri yapılmı tır (Goulas et al., 2002 ).
4.2.7. TLC ( nce Tabaka Kromatografisi)
Silika tabakalar üzerine uygulanan KOler hareketli faz olarak etil asetat: asetik asit:su (2:2:1) karı ımı ile TLC tankının içinde geli tirilmi tir. Bu silika tabakalar oda sıcaklı ında kurutulduktan sonra etanol-sülfürik asit (18:2) karı ımı ile spreylenip 110°C’de 10 dakika bekletilmi tir (Chen et al., 1997).
4.2.8. ndirgen eker
ndirgen eker DNS metodu ile ksiloz standardı kullanılarak belirlenmi tir (Miller, 1959). Enzimatik hidrolizasyon sonunda elde edilen örneklerden 50 µL alınarak 950 µL distile su ile karı tırılmı tır. Bu karı ımın üzerine 1,5 mL DNS ilave edilerek vorteks karı tırıcı ile örnekler homojen hale getirilmi tir. 100°C’de 5 dakika kaynatma i leminden sonra örnekler oda sıcaklı ına so utulmu ve olu an renk spektrofotometrede 560 nm’de okunmu tur.
4.2.9. HPLC
Hidrolizasyon esnasında olu an KOlerin miktarı refraktometrik dedektöre (Perkin Elmer Model 200) ve kolon fırınına (Perkin Elmer Model 200) sahip Perkin Elmer HPLC sisteminde analiz edilmi tir. Kolon olarak Aminex HPX42A (Biorad) kullanılmı tır. Örnekler enjeksiyondan önce 0,20 µm boyutlu filtrelerden geçirilmi tir. Hareketli faz olarak distile-deiyonize su kullanılmı tır. Örnekler 50ºC’de ve 0,4 mL/dk akı hızı ile 45 dakikada kolondan elut edilmi tir.
4.2.10. Toplam eker
Toplam eker miktarı fenol/sülfürik asit metodu ile ksiloz standardı kullanarak spektrofotometrik olarak belirlenmi tir (Dubois et al., 1956). Hidrolizasyon sonunda elde edilen örneklerden 0, 20, 40, 60, 80 ve 100 µL alınarak son hacimleri 100 µL’ye saf su ile tamamlanmı tır. Bu karı ım üzerine 50 µL %80’lik fenol çözeltisi ve 2 mL H2SO4 ilave
edilerek örnekler vorteks karı tırıcı ile homojen hale getirilmi tir. Oda sıcaklı ında 10 dakikalık inkübasyon i leminden sonra olu an renk spektrofotometrede 490 nm’de okunmu tur.
4.2.11. Furfural
Furfural miktarı AOAC Official Method 960.16’ya göre furfural standardı kullanılarak belirlenmi tir. Hidrolizasyon ve membran ayırma sonunda elde edilen örnekler 1:1 oranında etilalkol ile karı tırılarak spektrofotometrede 277 nm’de okunmu tur (AOAC, 1997).