Sideritis libanotica linearis BĐTKĐSĐNĐN SEKONDER METABOLĐTLERĐNĐN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERĐZASYONU VE BAZI BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTELERĐNĐN ĐNCELENMESĐ
Bülent AYHAN Y.Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ
2008
Y. LĐSANS TEZĐ
Sideritis libanotica linearis BĐTKĐSĐNĐN SEKONDER
METABOLĐTLERĐNĐN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERĐZASYONU
VE BAZI BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTELERĐNĐN ĐNCELENMESĐ
Bülent AYHAN
TOKAT 2008 Her hakkı saklıdır
Başkan: Doç.Dr. Ahmet TUTAR Đmza: Üye: Doç.Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ Đmza: Üye: Doç.Dr. Mahfuz ELMASTAŞ Đmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat ya p ı l m a d ı ğı n ı , tezin he rh a n gi b i r kı s mı n ı n bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
Bülent AYHAN
i
Sideritis Libanotica Linearis BĐTKĐSĐNĐN SEKONDER METABOLĐTLERĐN SAFLAŞTIRILMASI, KAREKTERĐZASYONU VE BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTELERĐNĐN
ĐNCELENMESĐ
BÜLENT AYHAN Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ
Bu çalışmada Sideritis Libanotica Labill subsp. Linearis (Bentham) Bornm. bitkisinin biyolojik aktiviteleri ve kimyasal yapısı incelenmiştir. Öncelikle antioksidan aktivitesi, insektisit ve anti kanserojen etkileri incelendi. Yapılan incelemelerde antioksidan ve anti kanserojen aktivite göstermesine karşın insektisit etki göstermemiştir. Aktivite testleri önce ham ekstrelerde denendi. Daha sonra antioksidan denemeleri fraksiyonlarda yapılarak etkili fraksiyon belirlendi. Çalışmanın ikinci aşamasında antioksidan aktivite gösteren fraksiyonlardaki bileşiklerin yapıları aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bu kapsamda üç farklı flavon bir diterpen iki tane karbonhidrat çok sayıda uçucu yağ molekülü ve yağ asitleri belirlenerek yapıları aydınlatıldı. Yapı tayinleri için NMR, GC-MS, HP-LC, UV, IR, gibi yöntemler kullanıldı, fakat iki tane flavonun yapısı madde yetersizliğinden dolayı gerçekleştirilemedi.
2008, 90 sayfa
Anahtar kelimeler: Sideritis libanotica linearis, flavon, diterpen, uçucu yağ, sabit yağ asitleri, karbonhidratlar
ii
INVESTIGATION OF PURIFCATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF SECONDER METABOLITES OF
Sideritis Libanotica Linearis PLANT
BÜLENT AYHAN Gaziosmanpasa University
Institution of Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ
In this study, biological activities and chemical structures of sideritis libanotica linearis plant were investigated. Firstly, antioxsidant activity, insectiside and anti carcinogen effects were investigated. In this investigation, although it exhihbits high antioxidan and anti carcinogen activity, doesn’t show insectiside activity. Activity tests were tried in the raw exstracts. After trying antioxidant tests, the effective fractions was determined using repeated colum chromatographies. In the second step of this work, the structures of the compounds were determined in the antioxidantly active fractions. In this context, three different flavones, one diterpene, two carbohydates, a lot of essantial oils and fatty acides were characterized. Methods of NMR, GC-MS, HP-LC, UV, IR were used for the characterization of structures, but the structures of two flavones were not characterized due to the inefficient material.
2008, 90 pages
Keywords : Sideritis libanotica linearis, flavon, diterpen, essential oil, fatty acids, carbohydrates.
iii
120510) bir araştırma projesi olup Doç. Dr. Đbrahim Demirtaş yöneticiliğinde gerçekleştirilmiştir.
Başta çalışmalarımda her türlü ekonomik ve teknik desteği sağlayan D.P.T' ye ve değerli hocam Doç. Dr. Đbrahim Demirtaş' a, tür teşhisinde yardımcı olan Cumhuriyet Üniversitesi öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. H. Aşkın Akpulat' a, antioksidan çalışmalarımda yardımcı olan Doç. Dr. Mahfuz Elmastaş'a, bitkinin toplanmasında ve uçucu yağ çalışmalarımda yardımcı olan Doç. Dr. Đsa Telci 'ye, insektisit etki çalışmalarında yardımcı olan Arş. Gör. Ömer Cem Karakoç 'a, anti kanserojen çalışmalarında yardımcı olan Arş. Gör. Ayşe Şahin'e, yüksek lisans öğrencileri Hüseyin Akşit ve Ali Rıza Tüfekçi' ye, kimya anabilim dalı yönetici ve hocalarıma, sona bırakmama rağmen benim için çok değerli olan yaşamımda desteklerini esirgemeyen sevgili aileme teşekkür ederim.
Bülent AYHAN Eylül 2008
iv ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii ĐÇĐNDEKĐLER ... iv KISALTMALAR DĐZĐNĐ ... vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ ... vii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ ... ix 1.GĐRĐŞ ... 1 2.KAYNAK ÖZETLERĐ ... 3
2.1. Bitkinin Tanımı ve Familyası ... 3
2.1.1. Labiatae (Lamiaceae) ... 3
2.1.2. Sideritis Cinsi ... 3
2.1.3. Sideritis libanotica Labill. Subsp. linearis (Bentham) Borm. ... 5
2.2. Biyolojik Etki Çalışmaları Hakkında Bilgiler ... 6
2.2.1. Antioksidan Aktivite ... 6
2.2.2. Đnsektisit Etki ... 9
2.3. Bitkilerde Bulunan Bileşenler Hakkında Bilgiler ... 11
2.3.1. Flavonoidler ... 11
2.3.2.Terpenler ... 14
2.3.3. Uçucu Yağlar ... 18
2.3.4. Sabit Yağlar ... 23
3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 24
3.1. Biyolojik Aktivite Çalışmaları ... 28
3.1.1. Antioksidan Aktivite ... 28
3.1.1.1. Total Antioksidan Aktivite Testi ... 30
3.1.1.2. Total Đndirgeme Gücü (Oyaizu Metodu Đle) ... 31
3.1.1.3. Serbest Radikal Giderme aktivitesi ( DPPH testi) ... 31
3.1.2. Đnsektisit Aktivite Testleri ... 32
3.1.2.1. Sitophilus granarius (Buğday biti) ... 32
3.1.2.2. Tek Doz Kontak Etki Denemeleri ... 33
3.1.2.3. Đstatistiksel Analizler ... 33
3.1.3. Anti kanserojen Aktivite Testleri ... 33
3.2. Kimyasal Bileşenlerin Đzolasyon ve Analizleri ... 39
3.2.1. Flavon, Terpen ve Şeker Đzolasyonu ... 39
3.2.1.1. Vakum Kromatografisi ... 39
3.2.1.2. Kolon kromatografisi ... 40
3.2.2. Uçucu Yağ analizi ... 45
3.2.2.1. Uçucu Yağın GC-MS Analizi ... 45
3.2.2.2. Uçucu Yağların Belirlenmesi ... 46
3.2.3. Sabit Yağ Asitleri ... 47
v
4.1. Đzolasyon Çalışmaları ... 48
4.1.1. Terpen ... 48
4.1.2. Flavon ... 53
4.1.3. Karbonhidratlar ... 63
4.1.4. Uçucu Yağ Đzolasyonu ... 70
4.1.5. Sabit Yağ Asitleri ... 74
4.2. Biyoloji Aktivite Çalışmaları ... 76
4.2.1. Antioksidan Aktivite Testleri... 76
4.2.1.1 Total Đndirgenme Gücü ... 77
4.2.1.2. Total Antioksidan Aktivite ... 78
4.2.1.3. Serbest Radikal Giderme ... 79
4.2.2. Đnsektisit Etki Denemeleri ... 81
4.2.3. Antikanserojen Aktivite Denemeleri ... 82
5. SONUÇ ... 86
KAYNAKLAR ... 88
vi
DEPT Đng.Distortionles Enhancement by Polarization Transfer APT Đng. Attached Proton Test
UV Ultra Viyole Spektroskopisi DMSO Dimetil sülfoksit
CUFH Cumhuriyet Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Herbaryumu DEPT Đng.Distortionles Enhancement by Polarization Transfer APT Đng. Attached Proton Test
EDTA Etilendiamin tetra asetik asit DNA Deoksiribonükleik asit
vii
Şekil 2.2. Kromon (benzo-γ-piron) ve 2-fenil benzopiron ... 11
Şekil 2.3. Sideritis öztürkii’ den Đzole Edilen Bileşiklerin Yapısı ... 12
Şekil 2.4. Bazı Flavonoid Bileşiklerinin Đskelet Yapısı ... 13
Şekil 2.5. Đzopren Birimleri ... 14
Şekil 2.6. Sideritis Türlerinde Bulunan Diterpen Bileşiklerin Yapıları ... 16
Şekil 2.7.Örnek Uçucu Yağ Molekülleri ... 18
Şekil 2.8. Gliserit ve Sterollere Örnek Molekülleri ... 23
Şekil 3.1. Sitophilus granarius Böceği ... 32
Şekil 3.2: Đnkübatör ... 34
Şekil 3.3: Hücre Kültür Flaskları ... 34
Şekil 3.4: Besi yerlerinin Flasklara Alınışı ... 34
Şekil 3.5: Besi Yerinin Pipetlenmesi ... 35
Şekil 3.6: Đnkübatör ... 35
Şekil 3.7. Hücre Sayma Đşlemi ... 36
Şekil 4.1. F4’den Đzole Edilen Bir Diterpen, Sideritiol ... 48
Şekil 4.2. Sideritiol Bileşiğine Ait H1 NMR Spektrumu ... 49
Şekil 4.3. Sideritiol Bileşiğinin C13 NMR Spektrumu ... 50
Şekil 4.4. Sideritiol Bileşiğinin APT Spektrumu ... 51
Şekil 4.5. Sideritiol Bileşiğine Ait DEPT-90 Spektrumu ... 52
Şekil 4.6.Sideritiol Bileşiğinin DEPT-135 NMR Spektrumu ... 53
Şekil 4.7. Sideritis libanotica linearis Bitkisinden Đzole Edilen Flavon Molekülü ... 53
Şekil 4.8 Flavon Türevinin H-1 NMR Spektrumu ... 54
Şekil 4.9. Flavon Türevinin OH Gruplarındaki Hidrojenlerin Döteryum Đle Değiştirilmiş H-1 NMR Spektrumu ... 55
Şekil 4.10. Flavon Türevinin C-13 Spektrumu ... 56
Şekil 4.11. Flavon Türevinin APT Spektrumu ... 57
Şekil 4.12. Flavon Türevinin DEPT 135 spektrumu ... 58
Şekil 4.13. Flavon Türevinin DEPT 90 Spektrumu ... 59
Şekil 4.14. Flavona ait IR Spektrumu ... 60
Şekil 4.15. Diglikozid Kısmı Uzaklaştırılan Flavonun Proton NMR. ... 61
Şekil 4.16. Diglikozid Kısmı Uzaklaştırılan Flavonun APT NMR Spektrumu ... 62
Şekil 4.17.F7 Fraksiyonundan Elde Edilen Karbonhidratın H1 NMR Spektrumu ... 63
Şekil 4.18. F7 Fraksiyonundan Elde Edilen Karbonhidratın C13 NMR Spektrumu ... 64
Şekil 4.19. F7 Fraksiyonundan Elde Edilen Karbonhidratın 13C DEPT–135 Spektrumu .... 65
Şekil 4.20 F7 Fraksiyonundan Elde Edilen Karbonhidratın 13C APT Spektrumu ... 66
Şekil 4.21. F7 Fraksiyonundan Elde Edilen Karbonhidratın 13COFF Spektrumu ... 67
Şekil 4.22. F8 Fraksiyonundan Đzole Edilen Karbonhidrat Molekülü ... 67
Şekil 4.23. Asetillenen F8 Fraksiyonundan Kolon Kromatografisi Đle Elde Edilen Bileşikler. ... 68
viii
Şekil 4.27. Hekzan Fraksiyonunda Gelen Yağ Asitlerinin GC-MS Spektrumu ... 74
Şekil 4.28. Hekzan /CHCl3 Fraksiyonunda Gelen Yağ Asitlerinin GC-MS Spektrumu ... 76
Şekil 4.29. Metanol/kloroform Çözücü Karışımında Kolon Kromatografisinden Alınan Fraksiyonlarının Total Đndirgeme Gücü Aktiviteleri ... 77
Şekil 4.30 Total Antioksidan Aktivite ... 78
Şekil 4.31. Serbest Radikal Giderme Aktivite % si ... 79
Şekil 4.32. Antioksidan Testleri Đçin Yapılan Kolon Đşleminde Đzole Edilen Flavonlara Ait 1H-NMR Spektrumları ... 80
Şekil 4.33. Proliferasyon Deneyi (I) Sonuçları (500 mikrogram ekstre için) ... 82
Şekil 4.34. Proliferasyon Deneyi (I) Sonuçları (1000 mikrogram ekstre için) ... 83
Şekil 4.35. Proliferasyon Deneyi (II) Sonuçları (500 mikrogram ekstre için) ... 83
Şekil 4.36. Proliferasyon Deneyi (II) Sonuçları (1000 mikrogram ekstre için) ... 84
Şekil 4.37. Proliferasyon Deneyi (III) Sonuçları (500 mikrogram ekstre için) ... 84
ix
Çizelge Sayfa
Çizelge 2.1 Türkiye’deki sideritis Türlerinin Yerel Çay Adları ... 4
Çizelge 2.2. Terpenlerin Sınıflandırılması ... 14
Çizelge 2.3. Sideritis Türlerinde Bulunan Diterpen Bileşikleri ... 17
Çizelge 2.4. Sideritis Türlerinden Đzole Edilen Uçucu Yağlar ... 19
Çizelge 3.1. Metanol Ekstresine Yapılan Kolon Kromatografi Đşlemler ... 19
Çizelge 3.2. Vero Hücrelerinin Proliferasyon Deney Dizaynı (1000 µg/mL) ... 37
Çizelge 3.3. Vero Hücrelerinin Proliferasyon Deney Dizaynı (500 µg/mL) ... 39
Çizelge 3.4. Vakum Kromatografisinde Alınan Fraksiyonlar ve Yapılan Đşlemler ... 39
Çizelge 3.5. F3 Fraksiyonuna Uygulanan Kolon Kromatografisi. ... 40
Çizelge 3.6. F4 Nolu Fraksiyona Uygulanan Kolon Kromatografisi ... 41
Çizelge 3.7. F6 Fraksiyonuna Uygulanan Kolon Kromatografisi ... 42
Çizelge 3.8. F7 Fraksiyonuna Uygulana Kolon Kromatografisi ... 44
Çizelge 3.9. Asetillenen F8 Fraksiyonuna Uygulanan Kolon Kromatografisi ... 49
Çizelge 4.1. Uçucu Yağ bileşenleri, % Oranları ve Kapalı Formülleri ... 73
Çizelge 4.2. F1 ve F2 Fraksiyonlarının Sabit Yağ Bileşenleri ve Nispi Oranları ... 75
Çizelge 4.3. Kontakt toksidite Denemelerinden Elde Edilen Bulgular ... 81
Çizelge 4.4. Sideritis libanotica linearis’ den Elde Edilen Ekstraktın S. granarius Üzerindeki Kontak Etkileri ... 81
1. GĐRĐŞ
Sideritis türlerinin toprak üstü kısımları çay ve halk ilacı olarak eski yıllardan beri kullanılmaktadır. Ayrıca halk arasında genellikle “dağ çayı, yayla çayı, ada çayı” olarak isimlendirilen bu türlerden hazırlanan çaylar soğuk algınlığı, öksürük ve sindirim sistemi rahatsızlıklarında kullanılmakta ve bal yapıcı özelliklerinden dolayı arılarca tercih edilmektedir (Tekeli ve ark., 2008). Ayrıca 5 sidertis türünden (Sideritis akmanii, S. niveotomentosa, S. brevidens, S. rubriyora, S. gulendamii) elde edilen diterpenlerden epoksi yapısında olan bileşiğin böcek kovucu etkisi görülmüştür (Bondi ve Ark., 2000). Sideritisin bir türünün iltihap önleyici ve ağrı giderici olarak etkili olduğu saptanmıştır (Hernendez-Perez 2002). Bu tür biyolojik aktivite gösteren bileşikler genelde bitkide bulunan sekonder metabolitlerden kaynaklanmaktadır. Bitkilerde sekonder metabolitler hakkında farklı tanımlama yapılmaktadır. Bir tanıma göre; protein, lipit, nükleik asit ve karbonhidrat gibi temel bileşiklerin dışında kalan bileşikler olarak tanımlanmaktadır. Bir başka tanımlama ise; bitkilerin maruz kaldıkları olumsuzluklara karşı (patojen, stres, vb) hayatiyetinin devam edebilmesi için ve kendilerini bunlara karşı savunabilmesi için sentezledikleri bileşikler olarak tanımlanabilir. Bu bileşikler ayrıca biyolojik aktivite gösterdiklerinden dolayı fonksiyonel bileşikler olarak da tanımlanmaktadır. Günümüzde antioksidan bileşikler tıp, eczacılık, gıda gibi alanlarda sıkça kullanılmaktadır. Antioksidanların kullanım amaçları farklı alanlarda farklılık arz etmektedir. Eczacılıkta ilaç yapımı, tıp alanında sağlıklı yaşamın devam ettirilmesi, gıda alanında ise mamul gıdaların tazeliğinin koruması ve raf ömürlerinin uzatılması amacıyla kullanılmaktadır. Bu amaç için kullanılan antioksidan bileşiklerin çoğu, maliyeti düşük olduğu için sentetik antioksidanlardır. Son yıllarda antioksidan bileşiklerin doğal kaynaklardan izolasyonu ve karakterizasyonu konusunda çok çalışma yapılmaktadır. Bitkilerden elde edilen ilaç ham maddelerinin yan etkilerinin azlığı sebebiyle bu alandaki çalışmalar hızla artmıştır.
Yaptığımız literatür araştırmalarına göre, Sideritis libanotica linearis (SLL) bitkisinde sekonder metabolitlerin çalışılmadığı ve biyolojik aktivitelerle (antioksidan, insektisit, antimutajenik) ilgili herhangi bir çalışma yapılmadığı görülmüştür.
Biyolojik aktivite ile ilgili bu türün ham ekstresinin sadece antioksidan aktivitesi çalışılmış, sekonder metabolitlerle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. SLL bitkisinin ham metanol ekstresi üzerine çalışılmıştır (Tepe ve ark., 2006). S. bilgerana P.H. Davis, S.libanotica Labill ssp. linearis ve Sideritis hispida P.H. Davis’in toplam fenolik madde konsantrasyonu, β-karoten-linoleik asit sisteminde oksidasyonu engelleme oranı ve antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Bu değerler standart antioksidan oldukları bilinen BHT ve BHA ile karşılaştırılmıştır. Sonuç itibariyle türlerin fenolik madde bakımından oldukça zengin olduğu dolayısıyla kullanılan yöntemlerde de kuvvetli antioksidatif özelliğe sahip olduğu anlaşılmıştır (Tekeli ve ark 2008). Bitkiler kendilerini korumak için çeşitli savunma sistemlerine sahiptir. Son yıllarda sentetik insektisitlerin bilinçsizce kullanımı sonucunda zararlılarda oluşan dayanıklık, insan ve çevreye olumsuz etkileri nedeniyle doğal insektisitler üzerinde çalışmalar artmıştır. Diğer yandan, ülkemizde bitkisel kökenli etkili maddeler hakkındaki çalışmaların sayısı oldukça azdır. Sentetik insektisitlerin keşfinden önce tarımsal zararlılarla mücadelede bitkisel kökenli doğal insektisitlerin kullanımı önemli bir yer tutmuştur. Sentetik insektisitlerin, bitkisel kökenli doğal insektisitlere göre daha etkili, etki sürelerinin daha uzun ve piyasada kolay elde edilebilmesi nedeniyle kullanımı yaygınlaşmıştır. Sentetik insektisitler sahip oldukları birçok avantajın yanı sıra başta kalıntı, dayanıklılık ve çevre kirliliği gibi problemleri de beraberinde getirmiştir. Son yıllarda insanlar bu sorunlara giderek daha duyarlı olmakta ve çözüm yolları aramaktadır. Zararlılarla etkili mücadeleyi sağlayabilecek alternatif maddeler içinde bitkisel kökenli doğal insektisitlerin, sentetik insektisitlerin yerini alabilecek potansiyelde oldukları görülmüştür. Organik tarımın popüler olduğu son yıllarda bu insektisitlerin kullanımına gerek duyulmaktadır.
Bu nedenle bu çalışmada Sideritis libanotica spp. linearis bitkisinin sekonder metabolitleri saflaştırıldı, yapıları aydınlatıldı ve biyolojik aktiviteleri (antioksidant, antikanserojen ve insektisitlere karşı) incelendi. Antioksidant etkiye sahip molekül saflaştırıldı ve yapısı aydınlatıldı. Ayrıca bu çalışmada, bitkinin uçucu yağ analizi ve sabit yağdaki yağ asitlerinin analizi de yapıldı.
2. KAYNAK ÖZETLERĐ
2.1. Bitkinin Tanımı ve Familyası
2.1.1. Labiatae (Lamiaceae)
Lamiaceae; adaçayı, kekik, nane gibi birçok faydalı bitkileri içine alan çok geniş bir familyadır. Türkiye florasında Lamiaceae familyası 46 cins, 571 tür ve toplam 763 takson ile temsil edilmektedir. Bu 571 türün % 44,2 si endemiktir. Ülkemizde tıbbi ve aromatik bitkiler yönünden Ege ve Akdeniz bölgesi çok zengin bir yapıya sahiptir (Başer 2006).
2.1.2. Sideritis Cinsi
Sideritis cinsi, 46 tür ve 53 taksondan oluşmaktadır. Đçerdiği taksonlardan 39 tanesi endemik olan bu cins, % 78,2’lik endemizm oranı ile Türkiye florasında en fazla endemik tür içeren cinslerden biridir (Tekeli ve ark., 2008).
Sideritis türleri; tek ya da çok yıllık otlar veya küçük çalılar yapısında olan, gövdeleri dik ve yükseltili, dört köşe ve genelde tüylüdür. Sideritis türleri ömürleri bir yıldır ve ertesi yıl aynı kökten tekrar çıkarlar. Genellikle temmuz ayı içerinde çiçek açarlar. 4–10 çiçekli, çiçekler arası mesafeli ya da az çok birbirine yakın, brakteler yapraksı, tam ya da kaliks tüpünü örtmüş korolla genelde sarı bazen beyaz ya da mor, korolla tüpü kaliksten uzun değil, üst dudak diktir (Büyükkaya, 2002).
Sideritis cinsi, dünyada özellikle akdeniz havzasında yayılış göstermekle birlikte dünyanın her bölgesinde rastlanmaktadır. Sideritis türleri ülkemizin çeşitli bölgelerinde farklı adlarda çay olarak kullanılmaktadır.
Çizelge 2.1. Türkiye’deki sideritis türlerinin yerel çay adları (Şahin 2003)
Türler Kullanıldığı bölge Mahalli Adı
S. congesta Antalya, Alanya, Güney Anadolu, Manavgat, Mersin, Anamur, Muğla, Fethiye, Konya
Yayla çayı, dağ çayı
S. arguta Gündoğmuş, Antalya, Alanya, Güney Anadolu
Dağ çayı
S. argyrea Gündoğmuş, Antalya, Alanya, Güney Anadolu
Eşek çayı, acı çay
S. Pisidica Boiss ht. Heldr.
Muğla, Antalya, Alanya, Güney Anadolu, Elmalı, Güneydoğu Anadolu
Çay çalbaşı, dağ çayı, eldivan çayı
S. parfoliata Alanya, Güneydoğu Anadolu Dağ çayı
S. parfoliata Balikesir, Bergama Kandil çayı
S. libanotica ssp. Libaratica
Elmalı Dağ çayı, ada çayı
S. libanotica ssp. Linearis
Muğla Bozlan çayı
S.libanotica ssp. Labill Güney Anadolu Bozlan çayı, dağ çayı, yayla çayı S. bilgerena P.H. Davis Konya - S.libanotica ssp. Linearis
Konya Altınbaş, acem arpası
S.libanotica ssp.linearis
Afyon, Antalya, Akseki, Erdemli, Muğla, Konya, Kahramanmaraş
Düğümlü çay, ince çay, yayla çayı, çay otu S.libanotica ssp.
curdica
Kahramanmaraş Dağ çayı
S. syriaca ssp. rusariensis
Çizelge 2.1. Türkiye’deki sideritis türlerinin yerel çay adları (Şahin 2003) (devam)
Türler Kullanıldığı bölge Mahalli Adı
S. syriaca ssp. L. Antalya -
S. athoa Balıkesir Kedi kuyruğu
S. hispida P.H.Davis Konya -
S. dichotoma Balıkesir Sarıkız çayı
S. trojana Çanakkele, Bayramıç Kazdağı çayı
S. tmolea Ödemiş Sivri çay
S. sitrikta Boiss et Heldr
Muğla, Antalya Dağ çayı
S. tmolea P.H. Davis Ödemiş, Đzmir, Ege Bölgesi, Bozdağ, Gaziantep
Balbaşı, sivri çayı
S. amasiaca Çorum Dağ çayı
S. germanicopolitana Amasya Tosbağa çayı
S. sipylea Ödemiş Sivri çay
2.1.3. Sideritis libanotica Labill. subsp. linearis (Bentham) Borm.
Çok yıllık otsu, tabanda odunsu gövde dik, basit veya nadiren dallanmış veya çalı biçimindedir. Bitki 20–100 cm uzunluğundadır. Odunsu bir köke sahiptir. Gövde ve dallar dört köşe, beyaz, yünsü keçemsi tüylü, aşağıda örtü ve salgı tüysüzdür. Yapraklar kısa saplı ya da sapsızdır. Gövde ortasındaki yaprakları sapsızdır Yaprağın iki yüzü uzun örtü tüylü olup tüyler üst yüzde daha uzun ve sıktır. Salgı tüyü her iki yüzde vardır. Yaprak uçları da kör uçludan keskin sivri uçluya değişir. 1100–1800 m yükseltilerinde kireçli ve bitki örtüsünün az olduğu bölgelerde yetişir (Davis, 1988).
2.2. Biyolojik Etki Çalışmaları Hakkında Bilgiler 2.2.1. Antioksidan Aktivite
Canlılar yaşamlarını devam ettirebilmesi için gerekli olan enerji ihtiyacını karşılayabilmeleri, alınan besinlerin metabolizmaya girişi ile mümkün olmaktadır. Vücut tarafından alınan besinlerin enerjiye dönüştürülmesi için oksijen kesinlikle kullanılmalıdır. Katabolizma sırasında harcanan oksijenin bir dezavantajı, reaktivitesi çok yüksek olan reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikallerin meydana gelmesidir. Bu radikallerin üretimi stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığın da sebebidir. Bu nedenle strese dayalı hastalıklar başta olmak üzere bir hastalık tedavisinde preperatif antioksidan maddelerin kullanılması hekimler tarafından tavsiye edilmektedir.
Reaktif oksijen ara ürünlerden (ROS) oluşan önemli serbest radikaller superoksit (·
O¯2),
hidroksil radikali (.
OH), nitrik oksit (NO·
, NO2·) ve lipit radikalleridir (RO·, ROO·, R· ). Bu
radikaller, kararsız ve canlı sistemlerde diğer madde ve gruplarla kolay bir şekilde reaksiyona girerler. Oluşan yeni ürünler hücre harabiyeti, hücre ölümü, yaşlanma ve birçok hastalığa neden olabilen zararlı ürünlerdir. Biyolojik membran lipitleri, kolayca oksitlenebilir çoklu doymamış yağ asitleri içerirler. Özellikle bu yağ asitleri reaktif oksijen ara ürünlerinden etkilenerek hücre harabiyeti ve hücre ölümüne yol açar.
Serbest radikaller yaşlanmayı kolaylaştırdığı gibi Alzeimier’s hastalığı, Parkinson hastalığı, romatizma hastalıkları, kalp rahatsızlığı, damar sertliği ve kanser gibi hastalıklara öncülük eder. Reaktif oksijen ara ürünleri, lipit peroksidasyonu, protein oksidasyonu ve dejenerasyonu, DNA hasarı gibi ciddi zararlara yol açabilir.
Canlı vücutlar, katabolizma sonucu oluşan ürünleri zararsız hale getirerek çeşitli sistemlerle dışarı verirler. Vücuttaki zararsızlaştırma sistemlerinden birisi antioksidan sistemi olarak tarif edilen antioksidan madde ve antioksidan enzim sistemidir (glutatyon reduktaz, süperoksit dizmutaz vb.).
Bu sistem katabolizma sonucu meydana gelen reaktif oksijen ara ürünleri ile reaksiyona girerek zararlı olan etkilerini ortadan kaldırır. Örneğin; flavanoidler singlet oksijen ve hidroksil radikallerini zararsız hale getirirler.
Reaktif oksijen ara ürünlerinden etkilenen diğer bir önemli alan ise gıda sektörüdür. Lipitlerin radikalik peroksidasyonu hemen hemen bütün besin ürünlerinde meydana gelmektedir. Özellikle gıda sanayisinde depolama ve nakil sırasında meydana gelen çürüme ve bozulmaları engellemek çok önemlidir. Çünkü çürüme ve bozulmadan dolayı kötü koku yayan maddeler meydana gelir. Bu maddeler çoğu zaman toksik özelliğe sahip, lipit ve vitaminlerin yapısını bozan zararlı maddelerdir. Bu bağlamda, gıda sanayisinde bu istenilmeyen durumları ortadan kaldırmak için yıllardan beri araştırmalar yapılmaktadır. Sanayiciler oksidasyonu önlemek için çoğu zaman sentetik orijinli kimyasal maddeleri kullanmak zorundadırlar.
Elde edilen metanol ekstraktının serbest radikal (DPPH˙) giderme aktivitesi, total antioksidan aktivitesi ve indirgeme gücü aktivitesi ölçüldü. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E), bütillenmiş hidroksit toluen (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin aktiviteleri ile karşılaştırıldı. Bu amaçla sentezlenen çoğu bileşikler, fenolik bileşikler veya türevleridir. Bunlarda hala gıda sanayisinde bu amaçla kullanılan beta hidroksi toluen (BHT) ve Beta hidroksi Anisol (BHA) bileşiklerinin toksik etkilerinden şüphelenilmektedir.
Bunlar gıda sanayinde kullanılan kimyasal maddelerin büyük çoğunda toksik, kanserojen vb. istenilmeyen etkilere sahiptirler. Bu nedenle; son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır. Tokoferoller en önemli doğal antioksidan olarak düşünülmektedir. Ancak bu doğal antioksidan madde pahalı olduğu için gıda sanayisinde kullanılması maliyeti artırdığından dolayı pek tercih edilmezler.
OH OCH3 C(CH3)3 (H3C)3C OH CH3 C(CH3)3 (H3C)3C 1 2
Bütillenmiş Hidroksi Toluen (BHT) Bütillenmiş Hidroksi Anisol (BHA)
CH3 H3C HO CH3 O CH3 (CH2CH2CH2CH)3 CH3 CH3 3 α-Tokoferol (Vitamin E) Şekil 2.1. Antioksidan aktivite testlerinde kullanılan standartlar
Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler:
i. Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme, toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronsiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler.
ii. Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme, bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler.
L + Vit E LH + Vit E
iii. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki, zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler.
Fenton reaksiyonu
Fe+2 + H2O2 Fe+3 + HO· + OH
Fe+2 seruloplazmin Fe+3
iv. Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması, onarıcı etkidir. Antioksidan
sistem; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar.
2.2.2. Đnsektisit Etki
Đnsan ve hayvanlarda olduğu gibi bitkilerin de zararlıların saldırılarından kendilerini korumak için çeşitli savunma sistemlerine sahip olduğu bilinmektedir. Bunlar bitkideki morfolojik engeller ve bazı biyokimyasal olaylar arasında değişen bir dizi faktörlerdir. Bitkilerdeki biyokimyasal olaylardan sonra sentezlenen sekonder metabolitler, zararlı böcekler ile mücadelede önemli rol oynarlar.
Zararlılar üzerinde davranışsal ve fizyolojik etkilere sahip olan bu metabolitler, çok değişik kategorilerde sınıflandırılmaktadır. Bu bileşiklerden bazıları alkaloidler, glikozitler, fenoller, terpenoidler, taninler ve saponinlerdir. Tarımda bu doğal insektisitler, zararlılar ile mücadelede yüzyıllardan beri doğrudan veya dolaylı olarak kullanılmıştır. Ancak son zamanlardaki teknolojik gelişmeler ve sentetik insektisitlerin ekonomik değere sahip olması neticesinde doğal insektisitlerin yerini sentetik kimyasallar almıştır. Ancak böceklerin sentetik insektisitlere karşı dayanıklılığı ve çevreye ve insan sağlığına olan zararlarından dolayı doğal insektisitler tercih edilmektedir.
Son yıllarda bu kimyasalların ekosisteme olan zararları bilindiğinden biyolojik mücadele, kültürel mücadele ve mekanik mücadele gibi kontrol yöntemleri giderek yaygınlaşmaktadır.
Zararlı böcek popülasyonlarında insektisitlere karşı direncin ekolojik genetiğinin çalışılabilmesi ve biyolojik mücadele stratejilerinin geliştirilebilmesi için dirence neden olan genlerin teşhis edilmesi ve metabolizmasının anlaşılması gerekmektedir.
Aslan ve grubu (2006) yaptıkları bir çalışmada, Sideritis trojana bitkisinden izole ettikleri 7-epikankandiol, 7-epikankandioldiasetat ve 18-asetilsideroksol bileşiklerinin S. granarius (buğday biti) üzerine insektisit aktiviteleri incelenmiştir. 7-epikankandiol ve 18-asetilsideroksol bileşiklerinin buğday biti üzerine insektisit aktivite gösterdiği 7-epikankandioldiasetat bileşiğinin ise insektisit olarak aktif olmadığı tespit edilmiştir. Böcekler, içinde buğday, un ve tütün bulunan kaplarda kültüre edilmişler ve bitkiden izole edilen bileşikler uygulandıktan sonra 25 °C sıcaklıkla 12 saat karanlık ve 12 saat aydınlık periyotlarında inkübe edilmişlerdir. Denemelerde 10 böcek kullanılmış ve ekstraktlar 0,5, 1,5 ve 2 μL/L dozlarında aseton çözeltileri halinde verilmiştir. Denemeler sonunda, buğday bitinin 7-epikankandiol ve 18-asetilsideroksol bileşiklerine karsı hassas oldukları tespit edilmiştir.
Rozman ve grubu (2007) yaptıkları çalışmada, bitkilerde doğal olarak bulunan uçucu yağların, depo zararlıları üzerine etkilerini araştırmak amacıyla, standart olarak temin ettikleri dokuz farklı ucucu yağ (1,8-sineol, camphor, eugenol, linelool, karvakrol, tymol, borneol, bonylacetate, linalyl acatate) bileşenlerinin fumigant aktivitelerini incelemişlerdir. Yapılan denemelerde ise, bütün bileşenlerin 24 aplikasyonda % 100 ölüm oranına sahip oldukları tespit edilmiştir.
2.3. Bitkilerde Bulunan Bileşenler Hakkında Bilgiler 2.3.1. Flavonoidler
Genellikle sarı renkli olmaları nedeniyle, latince sarı anlamına gelen flavus sözcüğünden türetilerek flavonoid adını alan bileşiklerdir. Flavonoid bileşikleri, flavon (2-fenilkromon)’un bitkiler aleminde yaygın olarak bulunan türevleridirler. Bunlardan 3-OH içerenlere flavonoller, 2,3- çift bağı indirgenmiş olanlara flavanlar, fenil grubu 3- yerinde olanlara izoflavonlar denir. Genellikle bu bileşikler sarı renkli bitkisel pigmentlerdir.
Flavonoid kromon türevi maddelerdir. Kromon; benzo-γ-pirondur ve bitkilerde şimdiye kadar rastlanmamıştır. Doğal olarak birçok flavonoid bulunmaktadır. Bu flavonoid, fenil grubunun kromon halkasında bulunan hidroksil gruplarının sayısı ve konumu, ayrıca metil eterlerinin bulunması ile birbirinden ayrılmaktadır. Bitkilerde birçok renkli bileşiği oluşturan bu maddelerin renkleri, hidroksil grubu ve ortamın pH’sına bağlı olarak koyu sarı renk içermektedir.
4 5 Şekil 2.2. Kromon (benzo-γ-piron, 4) ve 2-fenil benzopiron (5)
Flavonoid, bitkilerin ikincil metabolitleri olup bitkilerin kök, sap, çiçek, polen, meyve ve tohum gibi her bölümünde bulunabilirler. Bitkilerin ikincil metabolitleri gereksinimleri için kullandıkları karbonhidratlar, aminoasitler gibi birincil metabolitlerden oluşurlar. Sideritis türlerinde izole edilen flavonoid genellikle flavon yapısında olup flavonol ve nadiren flavanonlara da rastlanmaktadır. Flavonoidde ise glikazidasyon genellikle 7 numaralı konumdaki hidroksil üzerindedir. Bu oksijene bağlı glikozun yanı sıra alloz ve ksiloza da rastlanılmıştır. 1 O O A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O O A B 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6'
O O OH OCH3 O O O O O OH R1 O R2 OH HO HO HO HO OH R1: OAc R2: OH R1: OH R2: OH R1: OAc R2: H 6 7 8
-Şekil 2.3. Sideritis öztürkii’den izole edilen bileşiklerin yapısı
Son yıllarda yeni bulunan Sideritis Öztürkii’den yeni flavonlar bulunmuştur.
7-O-[2'''-O-p-kaffeoil-6'''O-asetil-β-D-glukopiranozil-(12)-β-D-glukopiranozit],
7-O-[2'''-O- kaffeoil-β-D-glukopiranozil-(12)-β-D-glukopiranozit],
7-O-[2'''-O-p-kumaroil-6'''-β-O-asetil–D-glukopiranozil)(12)-β-D-glucopyranozit]. (Ezer ve ark., 2004)
O O O O O O OH O O OH O O O O O O O O O O O O O O O C H O 5 9 10 Flavonlar Đzoflavonlar Flavonoller
Dihidroflavonoller Flavononlar Kalkonlar
Flavanlar Antosiyanidler Đzofalvonlar
Biflavanoitler Neoflavonoitler Oronlar Kumaranlar 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2.3.2.Terpenler
Đzopren iskelet birimleri içeren bütün bileşiklere terpenler adı verilir. Terpenlerin izoprenle ilişkisini belirtmek amacıyla izoprenoidler de denmektedir. Terpenler iki ya da daha çok izopren birimi içerebilirler. Molekülleri açık zincir ya da halkalı olabilir. Çift bağlar, hidroksil grupları, karbonil grupları ve daha başka işlevsel grup içerebilirler. C ve H den başka elementleri içeren bileşiklere de terpenoid denir. Terpenoidler, bitkiler ve hayvanlarda bulunan doğal bileşiklerin en önemli ve en geniş sınıflarından birisidir. Bitkilerde serbest halde bulunabildikleri gibi, glikozitleri, organik asit esterleri ve bir kısmı da proteinlerle birlikte bulunur.
C CH3 CH CH2 H2C izopren veya 21
Şekil 2.5. Đzopren birimleri
Mono terpenler ve seskiterpenler gibi küçük moleküllü terpenoidler su buharı destilasyonu, daha büyük moleküllü terpenoidler ise ekstraksiyon yöntemi ile ayrılabilirler.
Çizelge 2.2. Terpenlerin sınıflandırılması
Đzopren sayısı Sınıfı Karbon Sayısı
1 Hemiterpenler 5 2 Monoterpenler Seskiterpenler 10 3 15 4 Diterpenler 20 5 Seskiterpenler 25 6 Triterpenler 30 8 Tetraterpenler (Karotenoidler) 40 n Politerpenler (5)n
Terpenlerin ana maddesi izopren birimleridir. Bu nedenle terpenler izopren birimlerinin sayısına göre sınıflandırılır. Terpenler fiziksel özelliklerine göre iki grupta incelenirler.
Uçucu Terpenler: Su buharı destilasyonu ile sürüklenebilen küçük moleküllü monoterpenler ve seskiterpenlerdir.
Uçucu Olmayan Terpenler: Büyük moleküllü seskiterpenler, diterpenler, triterpenler ve politerpenlerdir.
Terpenler uygun kromatografik yöntemlerle saflaştırılırlar. Saflaştırmada genellikle kolon ve preperatif ince tabaka kromatografisi yöntemleri kullanılabildiği gibi pek çok kromatografik yöntemlerde kullanılabilir.
Diterpenler, dört Đzopren ünitesinden oluşan 20 karbonlu moleküllerdir. Diterpenler, steroidlerden ve triterpenlerden daha kolay oksitlenir. Bu nedenle diterpenler de kimyasal reaksiyonlarda farklılıklar gözlenir.
Türkiyedeki sideritis türleri daha çok monoterpen içerir Türkiye’de bulunana sideritis türlerindeki terpen çeşitleri aşağıda verilmiştir (Başer, 2002).
Monoterpenler: Amasiaca, argyrea, armeniaca, athoa, bilgerana, brevidens, congesta, dichotoma, erythrantha var. erythrantha, erythrantha var. cedretorum, galatica, germanicapolitana ssp. germanicapolitana, germanicapolitana ssp. viridis, gulendamii, hispida, huber-morathii, libanotica ssp. libanotica, libanotica ssp. kurdica, lycia, niveotomentosa, phrygia, rubriflora, scardica ssp. scardica, serratifolia. sipylea, stricta, syriaca ssp. nusairiensis, trojana, vuralii
Seskiterpenler: Akmanii, albiflora, brevibracteata, caesarea, cilicica, condensata, curvidens, hololeuca, leptoclada, libanotica ssp. linearis, libanotica ssp. violascens, montana ssp. montana, montana ssp. remota, ozturkii, pisidica, tmolea, Vulcanica
Oksijenli seskiterpenler: Phlomoides, taurica
Diterpenler: Perfoliata OH R1 R2 R2 O R1 O OAc O CHO R2 R1 OH R2 R1 R3 R4 R2 R1 R3 R4 O CHO OH OH OH OH O 22.R1=OH,R2=OAc 23.R1=OAc,R2=OH 24.R1=H , R2=OH 25.R1=R2=OH 26.R1=R2=OH 33.R1=R2=OAc 27.R1=OH,R2=OAc 28.R1=OAc, R2=OH 38.R1=H,R2=OH 29.R1=R3=R4=OH,R2=OAc 30.R1=OAc,R2=R3=R4OH 35.R1=R2=R3=R4=OAc 37.R1=R2=R3=R4=OH HO 31.R1=R3=R4=OH,R2=OAc 32.R1=OAc,R2=R3=R4=OH 36.R1=R2=R3=R4=OAc 40.R1=R4=H,R2=OH,R3=OAc 41.R1=R4=H,R2=R3=OH 42.R1=R3=OH,R2=OAc 43.R1=OAc,R2=R3=OH, R4=H 44.R1=R2=R3=OH,R4=H 45.R1=H,R2=R3=R4=OH 1 2 3 4 5 6 7 8 17 9 10 11 12 13 14 15 16 18 20 19 39 46 34
Şekil 2.6. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşiklerin yapıları (Ghoumari ve ark., 2005).
Çizelge 2.3. Sideritis türlerinde bulunan diterpen bileşikleri (Ghoumari ve ark., 2005)
Bileşikler Bölgeler Sideritis türleri
24 Đspanya candicans 22, 23, 25, 37 Đspanya leucantha 22, 23, 25 Đspanya linearifolia 22, 23, 25, 37 Đspanya lagascana 40 Đspanya glacialis 22, 23, 25 Đspanya luteola 22, 23 Đspanya voroi
22, 23, 25 Đspanya Hirsuta subsp. nivalis
22, 23, 25 Đspanya almeriensis
22, 23, 25 Đspanya granatensis
22, 23 Đspanya zafrae
22, 23, 25 Đspanya leucantha var incana
22, 25, 41 Türkiye akmanii 22, 24, 25 Türkiye niveotomentosa 22, 25 Türkiye gulendamii 22, 23, 24, 25 Turkiye argyrea 22, 24, 42 Türkiye sipylea 41, 42 Yunanistan theezans 44 Đspanya paulii 40, 41, 42 Yunanistan roeseri 40, 41, 45 Đtalya sicula 22, 23, 24, 37 Đspanya hirsuta 22, 23, 25 Đspanya funkiana 22, 23 Đspanya flavovirens 22, 23, 25 Đspanya arborescens
22 Đspanya leucantha var. Meridionalis
38, 39 Đspanya infernalis
24, 38 Đspanya * cystosiphon
24, 38 Đspanya* sventenii
24, 39 Đspanya ferrensis
24, 38 Đspanya canariensis var pannosa
22, 23, 24 Türkiye brevidens
22, 23, 24, 41 Türkiye rubriflora
41 Türkiye dichotoma 22, 23, 24, 25 Türkiye athoa; agryrea
23 Türkiye trojana
22, 23, 41, 42 Türkiye oztürkii
25 Morocco ochreleuca
22, 23, 25, 37, 42-44 Đspanya biflora
40, 41 Yunanistan Euboea; distans; syriaca
2.3.3. Uçucu Yağlar
Uçucu yağlar, bitkilerden su buharı damıtması ile elde edilebilen, oda sıcaklığında genelde sıvı olan, uçucu, kuvvetli kokulu ve yağımsı karışımlardır. Uçucu yağ taşıyan bitkiler daha çok sıcak iklim bölgelerinde yetişmektedir. Ülkemizi de içine alan akdeniz bölgesi, uçucu yağ taşıyan bitkiler açısından en zengin bölgelerden biridir. Bazı familyalar uçucu yağ taşıyan cinsleri nedeniyle önem kazanmışlardır. Labiatae familyasında bulunan birçok akdeniz bölgesi ve avrupa bitkisi, önemli uçucu yağ kaynaklarıdır. Bitkinin türüne göre farklı damıtma yöntemleri uygulanmaktadır. Bunlar; adi destilasyon, su buharı destilasyonu ve buhar destilasyonudur. Uçucu yağlar, bitkinin, yaprak, kök, çiçek, rizom ve odununda daha çok sap ve kabuklarında ise nadiren bulunurlar. Bitkiler genellikle % 1–2 oranında hatta bazen daha az miktarlarda bulunurlar.
Bitkiler yetiştikleri yükselti ve iklim koşularına göre uçucu yağ oranları ve bileşenleri değişmektedir (Pala-Paul ve ark., 2006).
OH
OCH3
OH
Timol Anetol Mentol
47 48 49
Şekil 2.7. Örnek uçucu yağ molekülleri
Türkiye deki Sideritis türlerinde çok miktarda monoterpen içerdiği seskiterpen ve diterpenlerin oranının çok az olduğu bildirilmiştir (Başer, 2002).
Çizelge 2.4. Sideritis türlerinden izole edilen uçucu yağlar (Pala –Paul ve ark 2006).devam Sideritis türü %Uçucu yağ Ana bileşikler
S.angustifolia lam - α-pinen (%10,8-20,6), β-bisabolol (%2,5-20,2),1,8-sineol (%4,6-16,6) S.argya P.H. Davis 0,45 β-pinen (%19,7), α-pinen(%13,8) S.armeniaca Bornm 0,54 β-pinen (%39,3 ), α-pinen (%16,5),
β-fellandren (%10,5)
S.bilgerana P.H. Davis 0,26 β-pinen (%51,2), α-pinen (%30,2) S.breviders P.H. Davis - β-pinen (%14),1,epi-kubenol (% 13,1)
α-pinen (%7,9) S.caesarea H. Duman,
Z.Aytaç&K.H.C.Başer
0,02 β-Karyofilen (%8,3) karyofilen oksit (%7,4) S.chamaedryfolia Cav - β-karyofillen (%32,5)
karyofillen oksit (%14,3) S.clandestina Hayek ssp. clandestina 0,26 α-pinen (%20,1) S.congesta P.H.Davis&Heldr 0,83 Muurol-5-en-α –ol (%11,7) Muurol-5-en-β-ol (%33) 0.45 α-pinen (%34,6 ) β-pinen (%24,6) S.curvidens Stapf 0,02 Bisiklogermakren (%20,6)
Spathulenol (%12,4) S.erythrantha Boiss. Heldr.
var. cedretorum
0,70 Mirsen (%24,3) α-pinen (% 12,4) S.erythrantha Boiss. Heldr.
var. erythrantha
Çizelge 2.4.Sideritis türlerinden izole edilen uçucu yağlar (Pala–Paul ve ark., 2006) (devam)
Sideritis türü %Uçucu yağ Ana bileşikler S.Flavovirens(Rouy) F.Alcaraz, M.Peinado, J.M.Martinez-Parra, J.S. Carrion&P.Sanchez-Gomez - Fençilasetat(%12,0-27,7), fençon(%11,9)α-pinen (%8,2-18,7) 1,8-sineol(%1,4–13,4), limonen (%3,4–12,7)
S. foetens Benth. - Timol (%2,3–20,0), p-simen
(%12,3-19,8), sabinen (%8,6–13,4), α-pinen (%5,5–11,6)
S. hirsuta L. β-fellandren(%23,8)α –fellandren(%9,2),
α-Pinen (%8.2), (Z) -β-Guaien S. hololeuca Boiss. et Heldr.
Apud Bentham
0,02 β-pinen %35,5, α-pinen%16.0, β-fellandren %9,6
S. ibanyezii Pau 0,71 α-Fençil asetat (%16,0), sabinen(%12,8), α-pinen (%10,7)
S.lanata L. 0,03 Hexadecanoic acid (%10,7),
spathulenol (%9,5)
S. leucantha Cav. - α-Pinen (%23,6–25,8), sabinen (%7,2– 10,4), fençon(%6,2–10,2) S. montana L. 0,16 Germakren D (%41,1), bicyclogermakren (%10,9) S. montana ssp. montana 0,05 Germakren D (%24,6), bisoklogermakren(%10,8) S. montana L. ssp. remota (D’Urv.) P. W. Ball 0,03 Bisiklogermakren (%13,9), germakren D(%10,3)
S. mugronensis J. Borja 0,02 δ -Kadinen (%2,0– 47,0), 1,8-sineol (%0,4–28,7), Bisabolol (%3,0–27,2), sabinen (%0,6–12,6)
Çizelge 2.4. Sideritis türlerinden izole edilen uçucu yağlar (Pala–Paul ve ark., 2006) (devam)
Sideritis türü % Uçucu yağ Ana bileşikler
S.ozturkii Aytaç & Aksoy 0,20 α-Pinen (%31,1), β -pinen (%20,2)
S. pauli Pau 0,32 α-Pinen (%48,0)
S. raeseri Boiss. & Heldr. ssp. attica
(Heldr.) Papan & Kokkini
0,37
0,17
α-Pinen (%24,8), β -pinen (%18,0)
α-Pinen (%28,7), β -pinen (%27,2) S. phlomoides Boiss. & Bal. 0,20 β -Karyofilen (%30,7), α-bisabolol
(%16,2) S. raeseri Boiss. & Heldr.
ssp. raeseri
0,12 β -Pinen (%9,1)
S. romana L. ssp. romana 0,05 Timol (%24,9), 1-okten-3-ol (%12,6), borneol (%9,2)
S. rubriflora Hub.-Mor. - β -Pinen (%13,2), α-pinen (%9,9), epi-kubenol (%7,8) 0,13 β -Karyofilen (%18,8), nerolidol (%12,1) S. scardica Griseb. 0,03 0,40 β -Pinen (%17,9), karvakrol (% 14,8), α-pinen (%7,3) Mentol (%8,5), 9-eikosen (%6,3), geraniol (%5,6)
S. sipylea Boiss. - Verbenon (%15,2), terpineol (%9,5) / karvakrol(%81.2), terpinen-4-ol (%8,2) S. stricta Boiss. et Heldr
Apud Bentham
0,4 α-Pinen (%35,2)
Çizelge 2.4. Sideritis türlerinden izole edilen uçucu yağlar (Pala–Paul ve ark., 2006) (devam)
Sideritis türü % Uçucu yağ Ana bileşikler S. syriaca L. Leaves
Inflorescences
0,05 Hekzadekanoik asid (%31,1), epi-α-bisabolol (%14,5)
0,07 epi-α-Bisabolol (%25,7), benzil benzoat (%17,7)
0,12 Mirsen (%50,5)
S. syriaca L. - α-Pinen (%19,5), karvakrol (%11,9),
timol (%7,2) S. syriaca L. ssp. syriaca 0,19 Karvakrol (%33,7)
S. taurica Stephan ex Willd. 0,08 α-Bisabolol (%10,3), β -pinen (%9,3) S. tmolea P. H. Davis 0,33 α-Kadinol (%21,9),
β -karyofilen (%10,6) 0,3 α-Bisabolol (%8,4)
S. tragoriganum Lag. - α-Pinen (%7,8–17,7), 1,8-sineol (%6.8– 15,9), β -karyofilen (%0,3–14,6), karyofilen oksit (%10,2), fençon (%6,1–7,8) S. tragoriganum × S. leucantha - α-Pinen (%50,1), sabinen (%10,6)
S. vulcanica Hub.-Mor. 0,02 β –karyofilen(%10,2) hekzadekanoik asit(%9,7) S. vuralli
H. Duman&K.H.C. Başer
0,10 β -Pinen (%35,3), 1,8-sineol (%14,6), α-Pinen (%14,5),
2.3.4. Sabit Yağlar
Đlaç hammaddeleri yönünde sabit yağlar önemlidir. Bilimsel anlamda sabit yağlar, bir gliserin molekülünün benzer veya birbirinden farklı üç yağ asidi molekülüyle bir enzim eşliğinde oluşturduğu yapılardır ve Trigliserid adını alırlar. Sabit yağlar karışımında başlıca, gliseritlerden başka serbest yağ asitleri, steroller A, D, E vitaminleri gibi yağda çözünen vitaminlerden başka, az miktarda uçucu yağ, reçine, hidrokarbon ihtiva eder. Yaşamsal değere sahip olan sabit yağlar, doymamış yağ asitleri ve içeriğinde A, D, E, K vitaminlerini taşıyan sindirimi kolay olan yağlardan oluşurlar. Gliseritlere ve sterollere örnek moleküller Şekil 2.8 de verilmiştir. Sabit yağlardaki gliseritler genellikle trigliseritlerdir. Yani, gliserolun 3-OH grubu da yağ asitleri ile esterleşmiş olarak bulunur. Bu yağ asitlerinin üçü de aynı olabildiği gibi farklı da olabilirler. Aynı asitlerle esterleşmiş olanlara doğada ender rastlanır.
O O R O O R O O R Trigliserit CH2OH CHOH CH2OH Gliserol HO Kolesterol Lanosterol 50 51 52 53 HO
Şekil 2.8. Gliserit ve sterollere örnek moleküller
Soğuk presleme gibi doğal yöntemlerle elde edilen yağlarda ise yağ verimi düşüktür. Örneğin, soğuk pres ile soya yağında Lesitinler (Fosfolipidler), Fitosteroller, organik mineraller, lignanlar ve E Vitamini (Tokoferol) gibi maddeler yağa geçebilmektedir. Yine, soğuk pres ile alınan zeytinyağı, enerji metabolizmasında (başta kalp kası olmak üzere) büyük rol oynayan Koenzim - Q 10’un (Ubikinon) en zengin kaynaklarından biridir. Bitkilerin hemen hemen her bölümünde yağ bulunmakla beraber genellikle
tohumlar sabit yağlar bakımından zengindir. Bitkisel yağları elde etmek için kullanılan yöntem ufak farklılıklarla beraber aynıdır. Yağ elde edilmesi sırasında uygulanan yöntemler, yağda çözünen vitaminlerin ve diğer değerli yan ürünlerin yapılarını bozmaktadır.
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Tez projesi kapsamında yapılan bu çalışmada tür teşhisi Cumhuriyet Üniversitesi Eğitim Fakültesi öğretim üyelerinden Yrd. Doç. Dr. H. Aşkın AKPULAT tarafından gerçekleştirildi. Ekstraksiyon ile izolasyon aşamaları Gaziosmanpaşa Üniversitesinin Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Bitki Araştırma Laboratuarında, antioksidan çalışmaları Kimya bölümü Biyokimya laboratuarında, anti kanserojen aktiviteleri ise Biyoloji bölümü Moleküler biyoloji laboratuarında, insektisit ve uçucu yağ izolasyonu Ziraat Fakültesi Entamoloji ve Tarla bitkileri laboratuarlarında gerçekleştirilmiştir. Ham bitki ekstresinden kolon kromatografisi yöntemi ile flavanoidler, terpenoidler ve karbonhidratlar izole edildi. Sabit yağlar ve uçucu yağlar GC-MS ile aydınlatıldı.
Kullanılan Reaktifler Antioksidan testler
Etanol, DPPH, linoleic asit, metiyonin, FeCl3, FeCl2, bütanol, potasyum dihidrojen fosfat,
dipotasyum hidrojen fosfat, amonyum tiyosiyanat.
Antikanserojen testler
Besi yerleri (DMEM), penicilin streptomycin solüsyonu, tyripsin EDTA, trypan Blue, PHA (Phytohemagglutinin),
Serik Sülfat Çözeltisi
10 g Seryum sülfat 50 ml % 98 lik sülfirük asit çözeltisinde çözülerek destile su ile 500 ml’ye tamamlandı. Serik sülfat belirteci plakalara püskürtüldükten sonra lekeler oluşuncaya kadar ısıtıcıda bekletildi.
Kolon kromatografisi
Kolon kromatografisi elde edilen ekstreleri fraksiyonlara ayırmak için kullanıldı. Sabit faz olarak (0.063–0.200 mm) (Merck) kullanıldı. Burada kullanılan çözücü sistemi Đ.T.K üzerinde denenerek bulundu. Bu çalışmada 110 cm uzunluğunda 3.5 cm çapında, 50 cm uzunluğuna 10 cm çapında ve 50 cm uzunluğunda 4 cm çapında özel yapım kolonlar kullanıldı. Kolonun alt kısmına pamuk konduktan sonra hekzan ile süspansiyon haline getirilmiş silika jel yavaş yavaş dolduruldu.
Her ilaveden sonra silika jelin çökmesi beklendi ve çözücü alt kısımdan alındı. Bu şekilde kolonun 2/3 ünden fazlası dolduruldu. Üstteki çözücünün bir kısmı alındı ve ayrılacak olan ekstre kolona ilave edildikten sonra çözücü karışımı dolduruldu.
Đnce tabaka kromatografisi (ĐTK)
Đnce tabaka kromatografisi bir reaksiyonun tamamlanıp tamamlanmadığını gözlemek, herhangi bir maddenin saf olup olmadığını anlamak ve karışım halindeki maddeleri ayırmak için kullanılan bir metottur. Bu çalışmada, Merck markası tarafında üretilen silika jel (25 DC-Alufolien 20x20 cm Kisegel 60 F254).) 0,1 mm kalınlığındaki hazır plakalar
kullanıldı .Bu çalışmada ĐTK’ dan;
1. Kolondan alınan maddelerin saflığının kontrolünde ve kimyasal reaksiyonların tamamlanıp tamamlanmadığını kontrol etmek amacıyla,
2. Çözücü sistemlerin denenmesinde,
3. Karışım halindeki maddelerin ayrılmasında kullanıldı.
Silica gel
Asetilleme ve Hidroliz reaksiyonları
Asetilleme için piridin ve asetik anhidrit kullanıldı. HCl (Flavon bileşiğinin hidrolizi için kullanıldı).
Kullanılan Çözücüler
Ekstraksiyon işlemleri ile kolon kromatografisi işlemlerinde teknik çözücüler destile edilerek kullanılmıştır. GC-MS ve HPLC yüksek saflıkta Merck çözücüler kullanılmıştır. Kullanılan çözücüler; aseton, hekzan, kloroform, diklormetan, eter, metanol, etilasetat, eterdir.
Kullanılan Cihazlar UV spektrofotometre
Jasko V–530 UV/VIS spektrofotometre cihazı kullanıldı. Santrifüj
FALC marka santrifüj aleti kullanıldı. Mikro uygulayıcı
Burkard marka mikro aplikatör. Bitki ekstrelerinin böceklere topikal uygulanması amacıyla kullanılmaktadır.
Steril kabin
Esco Class II Type A2, hücre kültürlerinin hazırlanması ve bitki ekstresinin hücreler üzerine etkisinin araştırılmasında kullanıldı.
Đnverted mikroskop
Leica marka, hücrelerin sayımı için kullanıldı. Đnkübatör
NMR
1
H, 13C NMR spektrumları için Bruker marka 400 MHz NMR cihazı kullanılmıştır, karbon NMR spektrumu 100 MHz NMR cihazında kaydedilmiştir. Çözücü olarak detörokloroform ve detöro DMSO, standart olarak ise TMS kullanıldı.
Erime noktası
Electrotermal 9100 Erime Noktası Tayin Cihazı
Gaz Kromatografi-Kütle Spektroskopisi (GC-MS) Perkin Elmer marka Clarus 500 GC seri nolu cihaz.
Manyetik karıştırıcı
IKA KS 130 Basic marka manyetik karıştırıcı.
IR spektrofotometresi Jasco marka 430 FT/IR.
Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Perkin Elmer marka 200 seri nolu cihaz.
Neo Clevenger
Bitkisel Materyal
Bu çalışmada Tokat Ballıca yöresinde yetişen (Rakım:942, koordinatlar: 4014858-3617155) Lamiaceae familyasına ait Sideritis libanotica Labill subsp. linearis (Bentham) Bornm. bitkisi 23 Haziran 2006 tarihinde toplanmıştır. Tür teşhisi Cumhuriyet Üniversitesi öğretim üyesi Dr. Aşkın AKPULAT tarafından yapılarak Cumhuriyet Üniversitesi herbaryumuna kaydedilmiştir (8413-CUFH).Bitki çok yıllık olup 30–90 cm boyunda basit ve dallanmış beyaz tüylü, tüylü kısım kökten gövdeye doğru azalmaktadır. Gövde üzerindeki yapraklar 4-8 çift halinde bulunur. Đnternodlar 3–10 cm orta yapraklar daha çok düz bazen gövdeye doğru genişleyen biçimde 1-8x0,3–2 cm yaprak ucu düz veya çıkık yaprak ucu düzgün testere dişli veya hafif dişli, çiçek tüplükleri 6 tane 2–15 arasında çiçekli, çiçekler arası 2–9 cm dir. Orta brakte üçgenimsi çiçekler sarı renklidir. Bu bitkinin, toprak üstü kısmı gölgede kurutuldu sonra öğütülerek ekstraksiyon işlemlerine hazır hale getirildi. Öğütülmüş bitkinin miktarı 1000 g olup ekstraksiyon işlemi için bitkisel materyal, % 96’lık metanol ile 1 hafta muamele edildi. Adi süzgeç kâğıdı ile süzülen metanol alındı, kalan kısım tekrar metanol ile ekstrakte edildi. Bu işlem, organik çözücünün renginin kaybolmasına kadar devam edildi. Daha sonra organik çözücüler birleştirilerek evaporatörde uçuruldu ve ham ekstre tartılarak miktarı belirlendi (135,66 g) .
3.1. Biyolojik Aktivite Çalışmaları
Sideritis Libanotica Labill. subsp. Linearis (bentham) Bornm bitkisinin biyolojik aktivite çalışmalarında, antioksidan, insektisit ve anti kanserojen aktiviteleri çalışıldı.
3.1.1. Antioksidan Aktivite
Antioksidan aktivite çalışmalarında; total antioksidan, total indirgeme gücü ve serbest radikal giderme (DPPH testi) aktivite testleri yapıldı.
Antioksidan aktivite testleri için yapılan kolon kromatografisi
Kolon kromatografisinde 7 gr ham ekstre kullanıldı. Önce bu ekstre metanol de çözüldü ve 22 g silika jel kullanıldı. Đşlem için seçilen özel olarak imal edilmiş 3 boğumlu kolon aynı tip silika jel ile doldurulduktan sonra hazırlanan ekstre kolona verildi.
Çizelge 3.1. Metanol ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri. Fraksiyonlar Uygulanan Çözücü Sistemi Yapılan Đşlemler
1–22 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
23 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
24 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
25 CH3OH:CHCl3 (2:8) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
26 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
27 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
28 CH3OH:CHCl3 (2:8) -
29–35 CH3OH:CHCl3 (3:7) -
36–39 CH3OH:CHCl3 (3:7) -
40–52 CH3OH:CHCl3 (3:7) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
53–69 CH3OH:CHCl3 (3:7) -
70–100 CH3OH:CHCl3 (3:7) -
101–129 CH3OH:CHCl3 (3:7) -
130–142 CH3OH:CHCl3 (4:6) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı. GC-MS uygulaması yapıldı.
143–171 CH3OH:CHCl3 (4:6) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
172–192 CH3OH:CHCl3 (4:6) -
193–201 CH3OH:CHCl3 (4:6) -
202–205 CH3OH:CHCl3 (4:6) -
206–213 CH3OH:CHCl3 (4:6) -
214–282 CH3OH:CHCl3 (5:5) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
283–318 CH3OH -
Metanol: kloroform (2:8) karışımı ile başlandı. Giderek metanol miktarı arttırılarak %100 metanol ile kolon işlemi tamamlandı. Kolon kromatografisinde elde edilen fraksiyonlar ĐTK tabakalarına tatbik edilerek maddelere ait lekeler UV (254 ve 366 nm) ışığı altında incelendi.
Gözlenen madde izlerinden fraksiyonlar belirlenerek birleştirildi. Fraksiyonlar, gelen bileşenlere göre birleştirilerek 5 farklı fraksiyon elde edildi.
Yukarıda ki Çizelge 3.1’de birleştirilen fraksiyonlar çözücü sistemleri ve fraksiyonlara uygulanan işlemler toplu halde verilmiştir.
Testler, çok karışım içeren fraksiyonlara uygulanmamıştır. Bu nedenle etkili fraksiyonlarda ki bileşenlerin yapısı kolaylıkla saflaştırılarak aydınlatılmıştır. Ancak madde miktarı az olan bileşiklerin proton NMR spektrumlarına göre flavon türevleri olduğu belirlenmiş fakat karbon NMR’ı alınamadığı için yapısı tam olarak aydınlatılamamıştır.
3.1.1.1. Total Antioksidan Aktivite Testi
Bitki ekstraktının antioksidan aktivitesini belirlemek için tiyosiyanat metodu kullanıldı. 1 mg/ml konsontrasyonda olacak şekilde hazırlanan stok çözeltiden, 0,5 ml alınarak vezin kaplarına ilave edildi, üzerine 2,5 ml linoleik asit ve 2 ml tampon çözelti (pH 7.0 , 0,04 M, fosfat tamponu) eklendi. Bu işlemler standartlar (BHA, BHT ve α-tokoferol) içinde yapıldı.
Karışımlar 37 oC de 5-6 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Daha sonra bu numunelerden 50 µl alındı, üzerine 2,35 ml alkol eklendi, 50 µl FeCl2 (ışık almayacak) ve 50 ml
amonyum tiyosiyanat eklendi ve 500 nm de absorbans okundu. Kontrol çözelti olarak 2.5 ml linoleik asit üzerine 2,5 ml tampon çözelti konuldu. Kör ise numune dışındaki çözeltilerdir (etanol, FeCl2, amonyum tiyosiyanat) .
Lipid peroksidasyon yüzdesi şu formülle bulundu.
% inhibisyon= ( A0-A1) / A0 x 100
A0; kontrol reaksiyonun absorbansı,
3.1.1.2. Total Đndirgeme Gücü (Oyaizu Metodu)
Her bir ekstre 50, 100, 250, 500 µl alındı ve toplam hacim 2.5 ml olacak şekilde tamponla tamamlandı. Daha sonra 2,5 ml K3Fe(CN)6 eklendi ve 50 oC de 20 dk bekletildi. Sonrasında
çıkarılarak oda sıcaklığına getirildi. 2,5 ml TCA eklenir ve 3000 rpm de 10 dk santrifüj edildi.
Süpernatant kısmından 2,5 ml alındı ve üzerine 2,5 ml deiyonize su eklendi. 0.5 ml FeCl3
eklendi ve 700 nm de ölçüm yapıldı. Kontrol (ekstre dışında kalan kısım, 2,5 ml tampon ile başlandı ve sırayla işlemler devam ettirildi), α-tokoferol, BHT, BHA standartlarına da aynı işlemler uygulandı. Kör: FeCl3 + su + TCA / FeCl3 + su (Elmastaş ve ark., 2006).
3.1.1.3. Serbest Radikal Giderme aktivitesi ( DPPH testi)
Bitki ekstraktlarının serbest radikal giderme aktivitesi Blois metoduyla 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) kullanılarak ölçüldü. Bu metot, koyu menekşe renkli olan DPPH çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda rengin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrofotometre ile ölçülmesi esasına dayanır. Renk ne kadar açılır ve çözeltinin absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikali giderme gücü o oranda artar diye yorumlanabilir.
Đn vivo olarak bu bitki ekstresinin serbest radikalleri giderebilme aktivitesinin olup olmadığını anlayabilmek için farklı konsantrasyonlarda (50–150 µg mL-1) bitki ekstraktlarının etanol’deki çözeltileri (3 mL) üzerine etanol’deki 0,1 M DPPH çözeltisinden 1 mL eklendi. Oluşan karışım iyice karıştırıldıktan sonra 30 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 517 nm’de absorbansları ölçüldü.
Aşağıdaki formül kullanılarak % DPPH aktivitesi hesaplandı.
3.1.2. Đnsektisit Aktivite Testleri
3.1.2.1. Sitophilus granarius (L.) (Buğday biti)
Ergin, parlak koyu kahve veya esmer renkli, başucunda bir çift kuvvetli mandibula bulunan hortumla sonlanır.
Şekil 3.1. Sitophilus granarius böceği
Pronotum ve elitra üzerinde oval, derin çukurcuklar, kısa, sık ve sarımsı tüyler bulunmakta, pronotum üzerindeki çukurcuklar dağınık, elitra üzerindeki çukurcuklar, ardı ardına gelerek çizgiler oluşturmakta, arka kanatlar bulunmadığı için uçma yeteneği bulunmamaktadır. Büyüklüğü 3-5 mm’ dır (Yıldırım ve ark, 2001).
Böcek Kültürlerinin Yetiştirilmesi
Denemede kullanılan S. granarius erginleri Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü’ne ait stok kültürlerinden elde edilmiştir. S. granarius, erginlerinin yetiştirilmesinde 5 litrelik cam kavanozlar kullanılmıştır. Kavanozların ağızları paket lastiği yardımıyla tül ile kapatılmıştır. Hazırlanan böcekler kavanozlara alınarak 27±2 °C sıcaklıkta karanlık iklim odasında muhafaza edilmiştir.
S. granarius erginlerinin yetiştirilmesi
S. granarius’den tek yaşta populâsyonlar elde etmek için 5 litrelik kavanozlar 1/3 oranında temiz buğday ile doldurulmuştur. Ergin dişi ve erkekler 48 saat süreyle bu kavanozlar içine alınarak yumurtlamaya bırakılmıştır.
48 Saat sonunda ergin bireyler kavanozlardan uzaklaştırılmış ve sadece yumurtaların kalması sağlanmıştır. Bu kültürler Bölüm 3.1.2.1.’deki şartlarda inkübe edilerek ergin çıkışları beklenmiştir. 45 Gün içerisinde yeni nesil ergin bireyler çıkmıştır.
3.1.2.2. Tek Doz Kontak Etki Denemeleri
Bu çalışma için 65 ml hacmine sahip cam tüpler kullanılmıştır. Bitki ekstraktları aseton ile %10 ekstrakt/aseton (v/v) karışımı olacak şekilde seyreltilmiştir ve bitki ekstraktları için 1 µL/böcek olacak şekilde micro-aplicator yardımıyla böceğin abdomeninden uygulanmıştır. Her tekerrür için 20 adet böcek kullanılmış ve deneme 3 tekerrürlü olarak kurulmuştur. Uygulama yapılan böcekler daha önceden yıkanarak kurutulmuş olan 10 gr buğday ile doldurulmuş, 65 ml’lik tüplere transfer edilmişlerdir. Cam tüplerin ağızları tül ile kapatılarak böcekler 27±2 ºC’de inkube edilmeye bırakılmıştır. Muamele sonuçları 24 saat aralık ile 3 gün süreyle takip edilmiş ve ölü birey sayıları kayıt altına alınmıştır. Deneme tesadüfî blok deneme deseninde kurulmuş olup her bir blokta muameleler ve kontrol bulunmaktadır. Kontrolde 1 µL/L dozunda aseton kullanılmıştır.
3.1.2.3. Đstatistiksel Analizler
Tek-Doz tarama testlerinde alınan sonuçlar ilk önce % ölüm değerlerine çevrilmiş daha sonra arcsin transformasyonuna tabi tutulmuştur. Oluşan değerler varyans analizi ve bunu takip eden Tukey çoklu karşılaştırma testiyle analiz edilmiştir. Tüm istatiksel analizler MĐNĐTAB Release 14 paket programı yardımıyla yürütülmüştür (McKenzie ve Goldman, 2005).
3.1.3. Antikanserojen Aktivite Testleri Vero hücrelerinin hücre kültürü
Đstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji Bölümü’nden Vero hücreleri temin edildi. Öncelikle temin edilen vero hücrelerinin kültüre edilerek ortama adaptasyonu ve dondurulmuş stok hücre sayısının arttırılması sağlandı. Tüm işlemler steril kabinde gerçekleştirildi.
Hücrelerin hazırlanması: Steril flaskda bulunan vero hücrelerinin bulunduğu besiyeri uzaklaştırıldı, hücreler trypsin-EDTA (10 mL) ile 1–2 dakika inkübe edildi (veya CO2
inkübatöründe, 37 °C). Böylece yüzeye yapışan hücrelerin yüzeyden sökülmesi sağlandı.
Şekil 3.2: Đnkübatör Şekil 3.3: Hücre kültür flaskları
Đnkübatörden çıkarılan flask içerine besi yeri DMEM- (10 mL) eklenerek ortam nötralize edildi ve flask çalkalanarak hücre süspansiyonu falkon tüpüne aktarıldı, yarı hızda (600 RPM, 5 dk.) santrifüj edilerek hücrelerin çökeltilmesi sağlandı. Besiyeri steril olarak boşaltıldıktan sonra, hücre çökeltisi DMEM + besi yeri (5-10 mL) ile bir pipet yardımı ile süspansiyon haline getirildi. Diğer taraftan steril 500 mL’lik flasklara 25–30 mL DMEM besi yerinden konuldu.
Şekil 3.4. Besiyerlerinin flasklara alınışı
Bu flasklara süspansiyon edilen hücrelerden 1 mL konuldu ve flasklar kapakları yarı açık halde inkübatöre yerleştirildi. Bu işlem (split) her 4 günde bir tekrarlandı.
Şekil 3.5: Besiyerinin pipetlenmesi Şekil 3.6: Đnkübatör
Her seferde hücrelerin büyümesi ve kontamine olup olmadığı inverted mikroskop altında kontrol edildi.
Hücrelerin dondurulması ve saklanması
Hücre pelletinden DMEM - % 10 DMSO karışımı ile hazırlanan hücre süspansiyonu 1 ml (yaklaşık 1x106 hücre/ml) steril 2 ml cryoviallere aktarılır ve tüpler doğrudan sıvı azot içinde veya 1 gün -80 oC de bırakıldıktan sonra sıvı azot içinde saklandı.
Hücrelerin sayılması işlemi
Besi yeri ile süspansiyon edilen karışımdan 10 µL alınarak Thoma Lamına damlatıldı. 5 kuyucukta bulanan hücreler mikroskop altında sayıldı.
Hücre sayısı= 5 kuyucuktan sayılan hücre sayısı
DMEM (Dulbecco’s Modifie
1000 ml’lik bir behere deiyonize su (
atılarak manyetik karıştırıcıya alındı. Üzerine DMEM (1L için bir şişe) boşaltıldı. Oluşan karışım üzerine NaHCO
7,2 ayarlandı. Toplam haci
mikronluk steril filtrelerden vakum altında steril şişelere süzüldü. + 4
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium hazırlanması
500 ml’lik steril şişede b
Bovine Serum (FBS), 10 ml Penstrep ilave edildi. Tüm işlemler steril kabinde ve steril malzemeler kullanılarak gerçekleştirildi. +
Penicilin Streptomycin ç Oda sıcaklığında veya 37
ml hacimli steril tüplere alınarak
Şekil 3.7. Hücre sayma işlemi
Hücre sayısı= 5 kuyucuktan sayılan hücre sayısı x 50.000 x seyreltme faktör
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-High Glucose) çözeltisinin h
1000 ml’lik bir behere deiyonize su (700–800 ml) konuldu. Beher içine manyetik balık atılarak manyetik karıştırıcıya alındı. Üzerine DMEM (1L için bir şişe) boşaltıldı. Oluşan karışım üzerine NaHCO3 (2,2 gr) ilave edildi ve pH metre ile HCl çözeltisi kullanılarak pH
hacim 1L’ye tamamlandı. Bu çözelti steril kabine alındı ve 0, mikronluk steril filtrelerden vakum altında steril şişelere süzüldü. + 4
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-High Glucose) Plus ç
500 ml’lik steril şişede bulunan DMEM çözeltisinden 60 ml alındı ve bu şişeye 50 ml fetal Bovine Serum (FBS), 10 ml Penstrep ilave edildi. Tüm işlemler steril kabinde ve steril malzemeler kullanılarak gerçekleştirildi. + 4oC de saklandı.
Penicilin Streptomycin çözeltisi
ığında veya 37 de çözünen Penicilin Streptomycin çözeltisi steril kabinde 10 ml hacimli steril tüplere alınarak -20 de saklandı.
seyreltme faktörü
zeltisinin hazırlanması
ml) konuldu. Beher içine manyetik balık atılarak manyetik karıştırıcıya alındı. Üzerine DMEM (1L için bir şişe) boşaltıldı. Oluşan HCl çözeltisi kullanılarak pH zelti steril kabine alındı ve 0,22 mikronluk steril filtrelerden vakum altında steril şişelere süzüldü. + 4 oC de saklandı.
High Glucose) Plus çözeltisinin
ulunan DMEM çözeltisinden 60 ml alındı ve bu şişeye 50 ml fetal Bovine Serum (FBS), 10 ml Penstrep ilave edildi. Tüm işlemler steril kabinde ve steril
