Girifl
Tüm beta-laktam antibiyotikler, bakterilerin sitoplaz-mik membranlar› üzerindeki penisilin ba¤lay›c› protein (PBP)'lere ba¤lan›p peptidoglikan sentezinin inhibisyonuna ve hücre duvar yap›s›n›n bozulmas›na yol açarak etkilerini gösterirler. Buna karfl›n bakteriler, [a] beta-laktamaz en-zimleri sentezleyip antibiyotiklerin beta-laktam halkalar›n› parçalayarak, [b] PBP'lerin yap›s›nda de¤ifliklik yap›p anti-biyotiklerin ba¤lanmas›n› engelleyerek ve [c] Gram-negatif bakterilerde bunlara ilave olarak d›fl membranlar›nda bulu-nan ve antibiyotiklerin geçti¤i kanallar› (porin) daraltarak veya say›lar›n› azaltarak direnç gelifltirirler (1,2).
Beta-laktam antibiyotiklerdeki beta-laktam halkas›n›n amid ba¤lar›n› parçalayarak bu antibiyotikleri etkisiz hale getiren beta-laktamazlar, bakteriler taraf›ndan ya kromo-zomlar veya plazmid ya da transpozon ad› verilen transfer edilebilir genetik elemanlar arac›l›¤› ile sentez edilirler (3,4). TEM ve SHV tipi enzimler yap›lar›ndaki bir veya birkaç amino asid de¤iflikli¤i ile etki spektrumlar›n› çok geniflletip 3. kuflak sefalosporinleri ve aztreonam› da parça-layabilir. Bu özelli¤e sahip enzimlere ESBL ad› verilmifltir. Halen 30'a yak›n ESBL tan›mlanm›fl olup, yeni enzimlerle bu say› sürekli olarak artmaktad›r (5). Bu nedenle ESBL üreten sufllarla oluflan infeksiyonlar›n tedavisi için beta-lak-tam seçiminde çok dikkatli olunmal›d›r. Son zamanlarda TEM ve SHV kökenli olmayan yeni plazmid kaynakl› ESBL'ler de tan›mlanm›flt›r. Bu yeni enzimler sefamisinler de dahil bütün sefalosporinlere karfl› etkilidirler (6-8).
ESBL'ler baflta seftazidim olmak üzere tüm 3. kuflak se-falosporinlere ve aztreonama karfl› direnç geliflmesine ne-den olurlar. Bu enzimleri tafl›yan bakteriler piperasilin ve mezlosilin gibi genifl spektrumlu penisilinlere karfl› da di-renç gösterirler. ESBL tafl›yan bakteriler ço¤u zaman
de¤i-Klebsiella pneumoniae Sufllar›nda Genifllemifl
Spektrumlu Beta-Laktamaz S›kl›¤› ve Beta-Laktam
Antibiyotik Direncinin Araflt›r›lmas›
Ramazan Aky›ld›z1, M. Fevzi Özsoy1, Hüsnü Altunay1, Nafiz Koçak1, fiaban Çavufllu1,
O. fiadi Yenen2
Özet: Bu çal›flmada Haziran 1994-May›s 1996 tarihleri aras›nda GATA Haydarpafla E¤itim Hastanesi ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Servisi laboratuvar›nda çeflitli klinik örneklerden izole edilen 67 Klebsiella pne-umoniae suflunda çift diskli sinerji ve üç boyutlu test ile ESBL s›kl›¤› araflt›r›lm›fl, ayr›ca disk difüzyon ve mikrodilüs-yon yöntemleri ile E testi (30 sufl için) kullan›larak beta-laktam antibiyotiklerden seftriakson, sefotaksim, seftazidim, se-foksitin ve aztreonama karfl› direnç durumu incelenmifltir. Çal›fl›lan 67 K. pneumoniae suflunun 10'unda (%15) ESBL varl›¤› saptanm›flt›r. ESBL varl›¤›, bu 10 suflun 8'inde her iki yöntemle, birinde yaln›z çift diskli sinerji testi ile ve di¤e-rinde yaln›z üç boyutlu test ile belirlenmifltir. Beta-laktam antibiyotiklere karfl› en yüksek direnç oranlar›, disk difüz-yon yöntemi ile sefoksitine (%28), mikrodilüsdifüz-yon yöntemi ile seftriaksona (%42) ve E testi ile seftriaksona (%50) kar-fl› bulunmufltur.
Anahtar Sözcükler: Klebsiella pneumoniae, genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar, beta-laktam antibiyotikler. Summary: The frequency of extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) and detection of beta-lactam resistance in Klebsiella pneumoniae. In this study, the frequency of ESBL investigated in the 67 Klebsiella pneumoniae strains isolated from different clinical specimens in the laboratory of Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Hay-darpafla Teaching Hospital of Gülhane Military Medical Academy between June 1994 and May 1996. The double-disk syn-ergy and three dimensional tests were used for detection of ESBL. The resistance to ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime, cefoxitin and aztreonam was also investigated by the disk diffusion, microdilution and E test (for only 30 strains) methods. Ten of the 67 K. pneumoniae strains (15%) had ESBL. In eight of these 10 strains, the ESBL production was identified by both tests, while in one of the strains only by double disk synergy test, and in the other one by three dimensional test alo-ne. In 67 K. pneumoniae strains, the highest resistance was 28% to cefoxitin with disk diffusion method, and 42% to ceft-riaxone with microdilution method. Thirty strains investigated by E-test showed the highest resistance for ceftceft-riaxone as 50%.
Key Words: Klebsiella pneumoniae, extended-spectrum beta-lactamases, beta-lactam antibiotics.
(1) GATA Haydarpafla E¤itim Hastanesi, ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Servisi, Haydarpafla-‹stanbul
(2) ‹stanbul T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Çapa-‹stanbul
3. Antimikrobik ve Kemoterapi Günleri: Klinik-Laboratuvar Uygula-malar› ve Yenilikler (16-22 May›s 1997, Kufladas›) ve 12. Antibiyotik ve Kemoterapi (Ankem) Kongresi (2-6 Haziran 1997, Antalya)'nde bil-dirilmifltir
flik mekanizmalarla beta-laktam d›fl›ndaki antibiyotik grup-lar›na karfl› da (aminoglikozidler ve kinolonlar gibi) direnç gelifltirebilirler. Bu bakteriler karbapenem türevlerine karfl› nadiren direnç gösterirler ve genellikle duyarl› kabul edile-bilirler (9).
ESBL tafl›yan bakterilerin s›kl›¤› genellikle yo¤un ba-k›m servislerinde kullan›lan genifl spektrumlu penisilin ve-ya sefalosporinlerin kullan›m› ile do¤ru orant›l›d›r (10). ESBL üreten klinik izolatlar›n ço¤unu, hastanede yatan has-talardan izole edilen ve en çok nozokomiyal salg›n sebebi olan Klebsiella pneumoniae sufllar› oluflturmaktad›r (10,11). ESBL üreten sufllarla oluflan salg›nlar, daha çok hastanede uzun süre kalanlarda, operasyon geçirenlerde, ar-teriyel ve üriner kateteri olanlarda ve özellikle yo¤un bak›m servislerindeki hastalarda oluflmaktad›r (5,12).
Klinik mikrobiyoloji laboratuvar›nda bir Gram-negatif bakterinin (özellikle K.pneumoniae ve Escherichia coli) an-tibiyotik duyarl›l›¤›na bak›larak ESBL tafl›y›p tafl›mad›¤› hakk›nda fikir sahibi olunabilir. Buna göre, ESBL tafl›yan bakteriler aztreonam ve 3. kuflak sefalosporinlere ve genifl spektrumlu penisilinlere karfl› direnç gösterirken; sefoksi-tin, beta-laktamaz inhibitörleri ve karbapenemlere karfl› du-yarl›l›klar›n› genellikle sürdürürler (10).
Bu çal›flmada GATA Haydarpafla E¤itim Hastanesinde çeflitli klinik örneklerden izole edilen K. pneumoniae suflla-r›nda ESBL s›kl›¤› ve çeflitli beta-laktam antibiyotiklere di-renç durumunun araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
Yöntemler
Bu çal›flmada Haziran 1994-May›s 1996 tarihleri ara-s›nda GATA Haydarpafla E¤itim Hastanesi ‹nfeksiyon Has-tal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Servisi laboratuvar›nda çeflitli klinik örneklerden izole edilen 67 K. pneumoniae su-flunda ESBL s›kl›¤› çift diskli sinerji ve üç boyutlu test ile saptand› ve befl de¤iflik beta-laktam antibiyoti¤e direnç du-rumu Bauer-Kirby disk difüzyon, mikrodilüsyon ve E testi (30 sufl için) yöntemleriyle in vitro araflt›r›ld›.
Disk difüzyon ve mikrodilüsyon yöntemleri NCCLS önerileri (13) do¤rultusunda uyguland›. Kontrol suflu olarak ATCC 25922 E. coli kullan›ld›. E testi için disk difüzyon yönteminde oldu¤u flekilde Petri kutular› içerisinde 4 mm kal›nl›¤›nda dökülmüfl Mueller-Hinton agar› (Oxoid) kulla-n›ld› ve agar yüzeyine 0.5 Mc Farland bakteri süspansiyo-nu inoküle edildi. Üzerine V fleklinde 2'fler adet plastik an-tibiyotik stripleri (AB Biodisk, ‹sveç) yerlefltirilerek 35°C'de 18 saat süreyle inkübe edildi. Bu sürenin sonunda oluflan elips fleklindeki zonun plastik stripi kesti¤i noktada
okunan rakam, o sufl için o antibiyoti¤in MIC de¤eri olarak kaydedildi (1,14).
Beta-laktam antibiyotiklerden seftriakson, sefotaksim, seftazidim, sefoksitin ve aztreonam kullan›ld›. Sonuçlar›n de¤erlendirilmesinde NCCLS'in önerdi¤i yorumlama kri-terleri esas al›nd›.
Çift Diskli Sinerji Testi: Deneyin tüm aflamalar›nda disk difüzyon yönteminin standardlar› sa¤land›. Sufllar›n yay›ld›¤› Mueller-Hinton agar›n›n yüzeyine diskler merkez-den merkeze uzakl›¤› 20 mm olacak flekilde dispens›r ile yerlefltirildi. Buna göre sekiz gözlü dispens›r›n karfl›l›kl› iki gözüne amoksisilin-klavulanik asid ve bunlardan birisinin çevresindeki gözlere aztreonam ve sefoksitin, di¤er amok-sisilin-klavulanik asid gözünün çevresine ise sefotaksim ve seftazidim diskleri yerlefltirildi. 18-20 saat süreyle 35°C'de inkübe edilen besiyerleri incelendi¤inde, aztreonam, sefok-sitin, seftazidim ve sefotaksime ait inhibisyon zonlar›n›n klavulanik asid diski karfl›s›nda bozularak genifllemesi ya da iki inhibisyon zonu aras›ndaki bakteri üreyen alanda üre-me olmayan bir bölgenin görülüre-mesi, di¤er bir deyimle kla-vulanik asidin antibiyoti¤i güçlendirmesi durumunda o su-flun ESBL üretti¤ine karar verildi (fiekil 1) (15,16). Deney-de kontrol olarak ESBL üretmedi¤i bilinen ATCC 25922 E. coli kullan›ld›.
Üç Boyutlu Test: Disk difüzyon yönteminin esas al›nd›-¤› bu deneyin ondan teknik olarak fark›, ek olarak Petri ku-tusunun merkezine yak›n tarafta ve antibiyotik disklerinin 3 mm uza¤›ndan besiyerinin dairesel bir flekilde kesilerek ya-r›k aç›lmas›d›r. Kesi ifllemi, tasar›m› kendimize ait olan ve T.C. Dz. K. K.l›¤› Taflk›zak Tersanesi'nde özel olarak
yap-Resim 1. Çift diskli sinerji testi.
Tablo 1. Beta-Laktam Antibiyotiklere Duyarl›, Orta Duyarl› ve Dirençli Sufllar›n Say› ve Yüzdeleri Disk Difüzyon (n=67) Mikrodilüsyon (n=67) E Testi (n=30) Antibiyotikler Duyarl› Orta Dirençli Duyarl› Orta Dirençli Duyarl› Orta Dirençli
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Seftriakson 37(55) 13(19) 17 (25) 37 (55) 2 (3) 28 (42) 14 (47) 1 (3) 15 (50) Sefotaksim 37 (5) 13 (19) 17 (25) 39 (58) 4 (6) 24 (36) 15 (50) 3 (10) 12 (40) Seftazidim 41 (61) 8 (12) 18 (27) 35 (52) 5 (8) 27 (40) 15 (50) 1 (3) 14 (47) Sefoksitin 45 (67) 3 (5) 19 (28) 34 (51) 6 (9) 27 (40) 17 (57) 3 (10) 10 (33) Aztreonam 38 (57) 12 (18) 17 (25) 38 (57) 7 (10) 22 (33) 17 (57) 1 (3) 12 (40)
t›r›lan, ucu 11 no.'lu bisturi kal›nl›¤›na eflit olacak flekilde dairesel b›çak tafl›yan bir alet ile yap›ld› (fiekil 2).
Bu yöntemin esas› kesilen yar›¤a ekilen suflun ESBL üretip üretmedi¤inin saptanmas›d›r. E¤er yar›¤a ekilen sufl ESBL üretiyorsa, antibiyotiklere ait inhibisyon zonunda ya-r›k hizas›nda bozulma ya da kesilme görülecektir (fiekil 3). Bu test direkt ve indirekt olarak uygulanabilir. Direkt yön-temde 0.5 Mc Farland bulan›kl›¤›na eflit olacak flekilde ha-z›rlanan test edilecek bakteri süspansiyonu 4 mm kal›nl›-¤›nda haz›rlanan Mueller-Hinton agar›n›n yüzeyine sürülür. Kesilen yar›¤›n içerisine ise yaklafl›k olarak 109-1010 bak-teri yo¤unlu¤una eflit olacak flekilde haz›rlanan ayn› bakte-rinin süspansiyonu inoküle edilir. ‹ndirekt yöntemde besi-yerinin yüzeyine kullan›lan antibiyotiklere duyarl› oldu¤u bilinen bir sufl sürülür. Yar›¤›n içerisine de yukar›da bahse-dildi¤i gibi haz›rlanan test edilecek sufl inoküle edilir. Bu çal›flmada indirekt yöntem kullan›ld› ve besiyerinin yüzeyi-ne 0.5 Mc Farland bulan›kl›¤›na eflit olacak flekilde haz›rla-nan ATCC 25922 E.coli suflunun kültürü sürüldü. Ard›ndan bütün besiyerlerinin dairesel kesi ifllemi yap›larak seftriak-son, sefotaksim, seftazidim ve aztreonam diskleri Oxoid disk dispens›r› kullan›larak yerlefltirildi. Yar›¤›n içerisine test edilecek bakteri süspansiyonu steril mikropipet kullan›-larak taflmayacak flekilde inoküle edildi. 35°C'de 18-20 sa-at süreyle inkübasyona b›rak›ld› ve sonuçlar ç›plak gözle de¤erlendirildi (15-17).
Sonuçlar
Bu çal›flmada 67 K. pneumoniae suflundan çift diskli si-nerji testi ve üç boyutlu yöntem ile ayr› ayr› 9 suflta (%13), toplam olarak 10 suflta (%15) ESBL üretimi saptanm›flt›r. Her iki yöntemle de ayr› ayr› ESBL üretti¤i saptanan birer suflta di¤er yöntemle ESBL saptanamam›flt›r.
Ayr›ca 5 de¤iflik beta-laktam antibiyoti¤e direncinin araflt›r›ld›¤› çal›flmam›zda disk difüzyon yöntemi ile %25-28 aras›nda, mikrodilüsyon yöntemi ile %33-42 aras›nda direnç saptanm›fl olup en yüksek direncin disk difüzyon yönteminde sefoksitine, mikrodilüsyon yönteminde ise seftriaksona ait oldu¤u belirlenmifltir. 30 suflta uygulanabi-len E testinde direnç oran› %33-50 aras›nda bulunmufl olup, en yüksek direnç oran› seftriaksona aittir (Tablo 1).
Disk difüzyon yöntemi ile beta-laktam antibiyotiklere orta derecede duyarl› bulunan sufllar mikrodilüsyon yönte-mi ile denendi¤inde, seftriaksona 13 sufltan 11'i, sefotaksi-me 13 sufltan 6's›, seftazidisefotaksi-me 8 sufltan 3'ü, sefoksitine 3
sufltan 3'ü ve aztreonama 12 sufltan 4'ü dirençli bulunmufl; ayr›ca 1 suflun sefotaksime duyarl› oldu¤u saptanm›flt›r.
Disk difüzyon yöntemiyle beta-laktam antibiyotiklere orta derecede duyarl› bulunan sufllardan E testi çal›fl›lan 30'u aras›nda seftriaksona 9 sufltan 8'i, sefotaksime 9 sufltan 4'ü, seftazidime 3 sufltan 3'ü, sefoksitine 2 sufltan 2'si ve azt-reonama 3 sufltan 1'i dirençli bulunmufltur.
Beta-laktam antibiyotiklere disk difüzyon yöntemi ile orta derecede duyarl› bulunan sufllardan çift diskli sinerji testi ve üç boyutlu test ile ESBL üretimi saptanan sufllar›n say› ve yüzdeleri Tablo 2'de gösterilmifltir.
‹rdeleme
Enterobacteriaceae familyas›nda bulunan birçok suflun bunlar aras›nda da en fazla K.pneumoniae sufllar›n›n ESBL ürettikleri bilinmektedir. Bunun nedeni kesin olarak belirle-nememifltir. Kimi yazarlar K. pneumoniae sufllar›nda spon-tan mutasyonlar›n daha s›k olarak gerçekleflti¤i fikrini öne sürmüfllerdir (18). Yo¤un bak›m servislerinde yatan, yeni cerrahi giriflim geçirmifl, invazif giriflim veya kateter uygu-lanm›fl, uzun süreli hastanede yatan hastalar ve genifl spekt-rumlu beta-laktam antibiyotik kullanan hastalardan izole edilen K. pneumoniae sufllar›nda (hastane sufllar›) ESBL üretme s›kl›¤› daha fazlad›r (10). Bu hasta gruplar›ndan izo-le ediizo-len ve beta-laktam antibiyotikizo-lere orta derecede du-yarl› bulunan K. pneumoniae sufllar›n›n ESBL üretebilecek-leri ve gerçekte dirençli olabileceküretebilecek-leri göz önünde bulundu-rulmal›d›r.
ESBL direnci, mikrodilüsyon testlerindeki stan-dard inokülumdan daha yo¤un inokülumlar›n kulla-n›ld›¤› dilüsyon yöntemi, çift diskli sinerji yöntemi, üç boyutlu yöntem ve E testi ile saptanabilmektedir (16). Bunlardan en yayg›n olarak kullan›lan› çift diskli sinerji yöntemidir. Bir çal›flmada disk difüz-yonla genifl spektrumlu sefalosporinlere duyarl› ola-rak tan›mlanan bakterilerin yaklafl›k yar›s›n›n, çift diskli sinerji yöntemi ile ESBL üretti¤i gösterilmifl ve çok düflük düzeylerde üretilen ESBL'ler bile be-lirlenebildi¤i için bunun önerilebilir bir yöntem oldu-¤u savunulmufltur (19). Ancak çift diskli sinerji yön-teminin güvenilirli¤ini azaltan çeflitli faktörler de bil-dirilmifltir. Örne¤in baz› sufllar taraf›ndan yüksek dü-zeyde oluflturulan sefalosporinazlar›n varl›¤› veya
Resim 2. Üç boyutlu testte besiyerini kesmek için kullan›lan alet.
Tablo 2. Disk Difüzyon Yöntemiyle Beta-Laktam Antibiyo-tiklere Orta Duyarl› Bulunan K. pneumoniae Sufllar›nda ESBL Saptananlar›n Say› ve Yüzdeleri
ESBL Üreten Sufllar
Antibiyotikler Çift Diskli Sinerji Testi Üç Boyutlu Test n (%) n (%) Seftriakson 4 (31) 3 (23) Sefotaksim 5 (39) 4 (31) Seftazidim 2 (25) 1 (13) Sefoksitin 1 (33) 1 (33) Aztreonam 1 (8) 1 (8)
diskler aras›ndaki uzakl›¤›n uygun olmamas› sinerjik etki-nin görülmesini önleyebilmektedir. Ayr›ca klavulanik asid diskinde meydana gelebilecek potens kayb›n›n da dikkate al›nmas› gerekti¤i belirtilmektedir (2). Son zamanlarda TEM ve SHV d›fl› baz› ESBL'lerin klavulanata dirençli ol-du¤u bildirilmifltir (5,20). Çift diskli sinerji testinin esas› klavulanat ile beta-laktam aras›ndaki yard›mlaflmaya da-yand›¤›ndan bu tür ESBL tafl›yan bakteriler bu yöntemle tespit edilemeyecektir.
TEM ve SHV kaynakl› ESBL'ler sefoksitini parçala-mazlar; buna karfl›l›k sefamisinazlar ve karbapenemazlar parçalarlar. Çal›flmam›zda ESBL üretti¤ini saptad›¤›m›z 10 sufltan yaln›zca ikisi ayn› zamanda sefoksitine dirençli bu-lunmufltur. Bu iki suflun TEM ve SHV d›fl›, di¤er 8 suflun ise TEM ve SHV kaynakl› beta-laktamaz üretti¤i düflünülebilir. fianl›da¤ ve arkadafllar› (21) K. pneumoniae sufllar›nda çift disk sinerji yöntemiyle ESBL üretme s›kl›¤›n› %18, Tö-reci ve arkadafllar› (22) %21.4, Abac›o¤lu ve arkadafllar› (23) %62.5, Büyükbaba ve arkadafllar› (24) %43.2, Vaha-bo¤lu ve arkadafllar› (25) ise hastane kaynakl› Gram-nega-tif çomaklarda %24 olarak bildirmifllerdir. Abac›o¤lu ve ar-kadafllar› (26) nozokomiyal salg›n döneminde yapt›klar› bir çal›flmada yenido¤an ünitesindeki 34 hastadan izole edilen K. pneumoniae sufllar›n›n tümünün ESBL üretti¤ini göster-mifllerdir. Gür ve arkadafllar› (27) hastane kaynakl› K. pne-umoniae sufllar›nda ESBL üretme s›kl›¤›n› %25 olarak bil-dirmifllerdir.
Yurtd›fl›nda yap›lan çeflitli çal›flmalarda K. pneumoniae sufllar› aras›nda ESBL üretme s›kl›¤›n› Liu ve arkadafllar› (28) %15.7, Sirot ve arkadafllar› (19) ise 3 y›ll›k bir süre içerisinde %11.5-15.2 aras›nda saptad›klar›n› bildirmifller-dir. Di¤er bir çal›flmada ESBL s›kl›¤›n›n Londra'da %11, Chicago'da %20, Bangkok'ta %50 olarak bulundu¤u belir-tilmifltir (10). Fransa'da yap›lan çeflitli çal›flmalarda K. pne-umoniae sufllar› aras›nda ESBL üretme s›kl›¤›n›n giderek artt›¤› gösterilmifl; bir çal›flmada ESBL s›kl›¤› 1985'te %0.74, 1987'de %8.4, 1988'de %11 olarak bulundu¤u; 16 hastaneyi kapsayan di¤er bir çal›flmada ise bu oran›n %9 olarak saptand›¤› bildirilmifltir (18). Thomson ve arkadaflla-r› (16) ESBL oluflturdu¤u bilinen sufllarla yapt›klaarkadaflla-r› araflt›r-malar›nda çift diskli sinerji yöntemi ile %79, üç boyutlu yöntem ile %93 oran›nda pozitif sonuç bildirmifllerdir.
Ülkemizde farkl› yöntemlerle yap›lan karfl›laflt›rmal› çal›flmalarda Derbentli ve arkadafllar› (29) hastane ortam›n-dan ve kolonize olmufl hastalarortam›n-dan izole edilen K. pneumo-niae sufllar›nda ESBL üretme s›kl›¤›n› üç boyutlu test ve çift diskli sinerji yöntemiyle s›ras›yla %57 ve %40 olarak bildirmifllerdir. Eskitürk ve arkadafllar› (30) çift diskli siner-ji yöntemi ve E testini karfl›laflt›rmal› olarak uygulad›klar›n-da Klebsiella sufllar›nuygulad›klar›n-da ESBL üretme s›kl›¤›n› her iki yön-temde de %54 olarak bildirmifllerdir. Çal›flmam›zda hem çift diskli sinerji testi ile hem de üç boyutlu test ile 67 su-flun 9'unda (%13) ve toplam olarak 10 suflta (%15) ESBL varl›¤› gösterilmifltir.
Çift diskli sinerji yönteminde diskler aras›ndaki uzakl›-¤›n deneyin sonucunu etkiledi¤i, bazen ESBL oluflturan sufllarla yap›lan ve diskler aras›ndaki uzakl›¤›n 30 mm ola-rak ayarland›¤› deneylerde yalanc› negatif sonuçlar elde edildi¤i bildirilmekte ve böyle durumlarda diskleri yak›n-laflt›rarak deneyin tekrarlanmas› önerilmektedir. Nitekim
Gülay ve arkadafllar› (31) yapt›klar› çal›flmada hastane in-feksiyonlar›ndan soyutlanm›fl 44 K. pneumoniae suflunda çift diskli sinerji yöntemiyle ESBL üretme s›kl›¤›n› diskler aras› mesafe 30 mm olarak uyguland›¤›nda %56.8, 20 mm olarak uyguland›¤›nda ise %88.6 olarak saptand›¤›n› bil-dirmifllerdir. Bizim çal›flmam›zda diskler aras›ndaki mesafe 20 mm olacak flekilde ayarlanm›flt›r.
TEM ve SHV d›fl› beta-laktamazlar›n ço¤unlu¤u, özel-likle karbapenemazlar ve sefamisinazlar, klavulanata daya-n›kl›d›rlar. Çift diskli sinerji testi, 3. kuflak sefalosporinler ve aztreonam›n klavulanatla yard›mlaflmas› temeline da-yanmaktad›r. Bu nedenle bu yöntemle klavulanata dayanak-l› ESBL'lerin saptanamayaca¤›n› düflünmek do¤ald›r. Thomson ve arkadafllar› (16)'n›n yukar›da sözü edilen çal›fl-may› yapt›klar› 1992 y›l›nda TEM ve SHV d›fl› ESBL'ler henüz tan›mlanmaya bafllam›fl; ancak 1995 y›l›ndaki Bush s›n›flamas›nda yerini alm›flt›r. Derbentli ve arkadafllar› (29) ise 1996 y›l›nda yapt›klar› çal›flmada TEM ve SHV d›fl› ESBL türlerini saptamam›fllard›r. Bu iki çal›flmada üç bo-yutlu test ile ESBL oran›n›n çift diskli sinerji yöntemine gö-re daha yüksek bulunmas›, yukar›da bahsedilen TEM ve SHV d›fl› ESBL'lerin çift diskli sinerji yöntemi ile saptana-mamas›na ba¤l› olabilir. Çal›flmam›zda sefoksitine dirençli olmas› nedeni ile TEM ve SHV d›fl› ESBL tafl›d›¤›n› düflün-dü¤ümüz 2 sufltan birisi üç boyutlu test ile pozitif, çift disk-li sinerji testi ile negatif sonuç vermifltir. Sonuç olarak ça-l›flmam›zda her iki yöntemle de ayn› oranda ESBL pozitif-li¤i saptanmas›n›, ESBL'lerin ço¤unun (8/10) TEM ve SHV kaynakl› olmas›na ba¤lamaktay›z. Üç boyutlu test ve çift diskli sinerji testi sonuçlar› karfl›laflt›r›ld›¤›nda, ESBL tespi-tinde arada fark olmamas›, buna karfl›l›k üç boyutlu testin uygulamas›n›n teknik olarak zor olmas› ve hata kaynaklar›-n›n çoklu¤u nedeniyle, klinik laboratuvarlar›nda çift diskli sinerji yönteminin kullan›lmas›n› önermekteyiz. Ancak ge-lecekte ESBL türlerinin uygun yöntemlerle saptand›¤› bak-teri sufllar›nda iki yöntemin karfl›laflt›r›lmas› bu konuda da-ha kesin bilgiler edinilmesini sa¤layacakt›r.
Son zamanlarda kromozom kaynakl› ESBL üretimi ol-du¤u bildirilmekle beraber, ESBL üretimi genellikle plaz-mid kaynakl› oldu¤u için bakteriler aras›nda kolayca yay›-labilmekte, bu da zaman içerisinde ESBL üretme oran›nda artmaya yol açmaktad›r (7). ESBL oluflturan bakterilerin oran›, ülkeden ülkeye, bölgeden bölgeye, hastaneden
neye, hatta ayn› hastane içinde çeflitli birimler aras›nda farkl›l›klar göstermektedir. Bu farkl›l›k lokal epidemiyolo-jik faktörlere, genel infeksiyon kontrol önlemlerine ve anti-biyotik kullan›m politikalar›na ba¤lanmaktad›r. Hastaneler-de genifl spektrumlu beta-laktamlara direnç varl›¤›n›n belir-lenmesi ve bu direncin izbelir-lenmesi, nozokomiyal infeksiyon epidemilerinin ortaya ç›kmas›n› ve yay›lmas›n› azaltmada yararlan›lmas› gereken bir kontrol yöntemidir. Antibiyotik-lere karfl› direncin en düflük düzeye indirilebilmesi için bu antibiyotiklerin mikrobiyolojik veriler göz önüne al›narak ve antibiyotik kullan›m prensiplerine uygun olarak kullan›l-mas› gerekmektedir.
Disk difüzyon yöntemi ile seftriaksona orta derecede duyarl› bulunan 4 suflun, sefotaksime orta derecede duyarl› bulunan 5 suflun, seftazidime orta derecede duyarl› bulunan 2 suflun, sefoksitine ve aztreonama orta derecede duyarl› bulunan 1'er suflun çift diskli sinerji testi ile ESBL üretti¤i-nin gösterilmesi, disk difüzyon yöntemiüretti¤i-nin bakteriyel di-renci saptamada yetersiz kalabilece¤ini göstermektedir. Se-fotaksime mikrodilüsyon ve E testi ile duyarl› ve orta dere-cede duyarl› bulunan sufllarda çift diskli sinerji testi ile ESBL üretimi gösterilmifltir. Bu durum minimal inhibitör konsantrasyon (M‹K) saptamaya yarayan yöntemlerle de yanl›fl sonuçlar al›nabilece¤ini göstermektedir.
E testi yöntemi disk difüzyon yöntemi ile dilüsyon yön-temlerinin bir kombinasyonu olarak kabul edilmektedir. E testi yönteminin referans yöntemlerle karfl›laflt›r›lmas› ama-c›yla pek çok çal›flma yap›lm›flt›r. Bu çal›flmalarda E testi sonuçlar› ile mikrodilüsyon ve disk difüzyon sonuçlar› ara-s›nda yüksek oranda uyumluluk bildirilmifltir (14,32-34).
Çal›flmam›zda disk difüzyon yöntemiyle beta-laktam antibiyotiklere orta derecede duyarl› olarak bulunan K. pne-umoniae sufllar›n›n önemli bir k›sm› mikrodilüsyon yönte-mi ve E testi ile dirençli bulunmufltur. Ayr›ca disk difüzyon yöntemiyle sefoksitin ve seftazidime orta derecede duyarl› bulunan sufllar›n yan› s›ra, duyarl› bulunan baz› sufllar da mikrodilüsyon ve E testi yöntemleriyle orta derecede du-yarl› veya dirençli bulunmufltur.
Hastane ortam›ndan izole edilen Gram-negatif bakteri-lerde antibiyotik duyarl›l›¤›n›n mikrodilüsyon yöntemiyle ortaya konmas›, beta-laktamaz üretimine ba¤l› gerçek di-rencin saptanmas›nda ortaya ç›kacak baflar›s›zl›¤› önleye-cektir. Mikrodilüsyon yönteminin pratik olmamas› ve uygu-lanma zorlu¤u, E testi ile M‹K düzeyinin saptanmas›n› ön plana ç›karmaktad›r. Ancak bunun yerine hastane ortam›n-dan izole edilen K. pneumoniae sufllar›nda ESBL varl›¤› gü-venle kullan›labilecek ve pratik uygulama kolayl›¤› olan çift diskli sinerji testi ile araflt›r›lmal›d›r.
Teflekkür
Üç boyutlu testte kesi ifllemi için kullan›lan aletin yap›l-mas›nda yard›mlar›n› esirgemeyen Taflk›zak Tersanesi Komutanl›¤›'na ve ilgili birim personeline teflekkür ederiz.
Kaynaklar
1. Keskin K. Yeni bir antibiyotik duyarl›l›k testi: E-Test. In: A¤aç fidan A, Badur S, Gülekçi G, eds. XXVII. Türk Mikrobiyoloji Kongresi (7-10 May›s 1996, Antalya) Program ve Özet Kitab›. ‹stanbul: Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti & Klinik Mikrobiyolo-ji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Derne¤i, 1996: 25: 48-51
2. Moland ES, Thomson KS. Extended spectrum β-lactamases of Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 1994;33:666-8. 3. Stratton CW. Activity of β-lactamases against β-lactams. J
An-timicrob Chemother 1988; 22 (Suppl A): 23-35
4. Sanders CC. β-Lactamases of gram-negative bacteria: new chal-lenges for new drugs. Clin Infect Dis 1992;14:1089-99 5. Sirot D. Extended-spectrum plasmid-mediated β-lactamases. J
Antimicrob Chemother 1995; 36 (Suppl A): 19-34
6. Bernard H, Tancrede C, Livrelli V, Morand A, Barthelemy M, Labia R. A novel plasmid-mediated extended-spectrum β -lac-ta mase not derived from TEM-or SHV- type enzymes. J Anti-microb Chemother 1992; 28:590-2
7. Jacoby GA. Genetic of extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13 (Suppl 1): 2-11 8. Payne DJ, Woodford N, Amyes SGA. Characterization of the
plasmid mediated β-lactamase BIL-1. J Antimicrob Chemot-her 1992; 30:119-27
9. Akova M. Beta-Laktamazlara Ba¤l› Antibiyotik Direnci. So-runlar ve Çözüm Önerileri. ‹stanbul: MSD ‹laçlar›, 1995:2-4 10. Quinn JP. Clinical significance of extented spectrum beta-lac-tamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13 (Suppl 1): 39-42
11. Katsanis G, Jacoby G. The frequency of extended-spectrum β−lactamases in isolates of Klebsiella pneumoniae. J Antimic-rob Chemother 1992; 29: 345-53
12. Philippon A, Arlet G, Lagrange PH. Origin and impact of plas-mid-mediated extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13 (Suppl 1): 17-29
13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Per formance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 4th ed. Approved Standard. NCCLS Document M2-A4. Villanova, Pa: NCCLS, 1990
14. Baker CN, Stocker SA, Culver DH, Thornsberry C. Compari-son of E test to agar dilution, broth microdilution and agar dif-fusion susceptibility testing techniques by using a special chal-lenge set of bacteria. J Clin Microbiol 1991; 29: 533-8 15. Sanders CC, Thomson KS, Bradford PA. Problems with
detec-tion of β-lactam resistance among nonfastidious gram negati-ve bacilli. Infect Dis Clin North Am 1993; 7: 411-23 16. Thomson KS, Sanders CC. Detection of extended-spectrum β
-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: com-parison of the double-disk and three-dimensional tests. Anti-microb Agents Chemother 1992; 36: 1877-82
17. Thomson KS, Mejglo ZA, Pearce GN, Regan TJ. 3-dimensi-onal susceptibility testing of β-lactam antibiotics. J Antimicrob Chemother 1984; 13:45-54
18. Jacoby GA, Medeiros AA. More extended-spectrum β -lacta-mases. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35:1697-704 19. Sirot DL, Goldstein FW, Soussy CJ, Courtieu AL. Resistance
to cefotaxime and seven other beta-lactams in members of fa-mily Enterobacteriaceae: a 3 years in France. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 1677-81
20. Tzouvelekis LS, Tzelepi E, Mentis AF, Tsakris A. Identificati-on of a novel plasmid-mediated beta-lactamase with chromo-somal cephalosporinase characteristics from Klebsiella pne-umoniae. J Antimicrob Chemother 1993; 31: 645-54 21. fianl›da¤ T, Sayg› G, Özçelik S, Çak›r N, Çeliksöz A.
Klebsi-ella pneumoniae sufllar›nda extended board spectrum beta-lak-tamazlar›n araflt›r›lmas› [Özet]. Ankem Derg 1996; 10: 120 22. Töreci K, Kaygusuz A, Öngen B, Gürler N.
Enterobacteriace-ae ailesinde ard arda izole edilen 827 suflta genifllemifl spekt-rumlu beta-laktamaz oluflturma s›kl›¤› [Özet]. Ankem Derg 1996; 10: 121
23. Abac›o¤lu YH, Yücesoy M, Gülay Z, Yulu¤ N. Extended-spectrum beta-lactamases saptanmas›nda E test ile çift disk si-nerji yönteminin karfl›laflt›r›lmas›. ‹nfeks Derg 1995; 9: 93-5 24. Büyükbaba Ö, Ayd›n D, An¤ Ö. ‹drar yolu infeksiyonu etkeni
Gram-negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu beta-lakta-mazlar›n çift disk sinerji yöntemi ile belirlenmesi. Klimik Derg 1996; 9: 27-30
25. Vahabo¤lu MH, Mülaz›mo¤lu L, Erdem ‹, Y›ld›r›m ‹, Tafler B, Avkan V. Taksim Hastanesinde β-laktam antibiyotiklere karfl› geliflen direncin surveyans›. Klimik Derg 1993; 6: 79-82 26. Abac›o¤lu YH, Aslani MM, Gülay Z, ‹nsan S, Yulu¤ N.
Resis-totyping and plasmid profile analysis of multiply resistant Klebsiella pneumoniae strains isolated during a nosocomial outbreak. ‹nfeks Derg 1995; 9: 63-6
27. Gür D, Pitt TL, Hall LMC, Akalin HE, Livermore DM. Diver-sity of Klebsiella with extended spectrum beta-lactamases at a Turkish University Hospital. J Hosp Infect 1992; 22: 163-8 28. Liu PP, Gür D, Hall LMC, Livermore DM. Survey of
preva-lence of β-lactamases amongst 1000 Gram-negative bacilli isolated consecutively at The Royal London Hospital. J Anti-microb Chemother 1992; 30:429-47
29. Derbentli fi, Katranc› H, Nakibo¤lu Y. Gram negatif çomaklar-da genifllemifl spektrumlu β-laktamazlar›n belirlenmesinde üç boyutlu yöntem ve çift disk sinerji yönteminin karfl›laflt›r›l-mas›. Ankem Derg 1996; 10:1-13
30. Eskitürk A, Korten V, Söyletir G. Akut bak›m gerektiren has talarda geliflen infeksiyonlardan izole edilen Klebsiella türle-rinde genifl spektrumlu β-laktamaz (ESBL) direnci s›kl›¤›n›n araflt›r›lmas› [Özet]. Ankem Derg 1996; 10:14
31. Gülay Z, Abac›o¤lu H, Yulu¤ N. Çift disk sinerji yönteminde diskler aras› uzakl›¤›n sonuca etkisi. ‹nfeks Derg 1995; 9: 89-92
32. Miller L, Rittenhouse S, Utrup L, Poupard J. Comparison of three methods for determination of a single MIC of an antimic-robial agent. J Clin Microbiol 1994; 32: 1373
33. Brown DFJ. E test symposium: summation. Diagn Microbiol Infect Dis 1992; 15: 489
34. Macias EA, Mason EO, Ocera HY, Larocco MT. Comparison of E-test with standard broth microdilution for determining antibiotic susceptibilities of penicillin-resistant strains of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol 1994; 32:430-2
