Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:199-202
199
HBV DNA Saptanmas›nda S›v› Hibridizasyon ve
Real-Time PCR Yönteminin Karfl›laflt›r›lmas› (*)
(*) Bu çal›flma 3. Ulusal Moleküler ve Tan›sal Mikrobiyoloji Kongresi’nde (28 Haziran-1 Temmuz 2004) poster olarak sunulmufltur.
(**) Celal Bayar Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Manisa Sinem AKÇALI (**), Tamer fiANLIDA⁄ (**), Beril ÖZBAKKALO⁄LU (**)
ÖZET
Bu çal›flmada HBV DNA’n›n saptanmas›nda kullan›lan standart yöntem olarak kabul edilen s›v› hibridizasyon yöntemi ile yak›n zamanda kullan›ma giren real-time PCR yönteminin karfl›laflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r. Rutin tarama amac›yla gönderilen ve hepa-tit B serolojik belirleyicileri (HBsAg, anti HBc total) mikro EIA (Organon Teknika) yöntemi ile pozitif olarak saptanan 55 serum örne¤i çal›flmaya al›nm›flt›r. Örnekler real time PCR ve hibridizasyon yöntemleri ile çal›fl›lm›flt›r. 55 örne¤in 29’u her iki yöntem-le de pozitif olarak beliryöntem-lenmifltir. S›v› hibridizasyon yöntemiyyöntem-le 55 örne¤in 31’i (%56), real-time PCR yöntemiyyöntem-le ise 50’si (%90) pozitif olarak saptanm›flt›r. Ancak hibridizasyon yöntemiyle negatif olarak saptan›p, real-time PCR yöntemiyle pozitif olarak sap-tanan 21 örne¤in 20’sinde HBV DNA düzeyleri, hibridizasyon yönteminin yakalama s›n›r› olan 1,4x106kopyan›n alt›nda
bulun-mufltur. Buna karfl›l›k real-time PCR ile negatif olarak saptanan 2 örnek, hibridizasyon yöntemiyle pozitif olarak de¤erlendiril-mifltir. Yap›lan istatistiksel analizlerde iki yöntem aras›nda anlaml› bir fark saptanmam›flt›r (r=0.754, p<0.05). Sonuç olarak, re-al time PCR’›n genifl bir dinamik arre-al›¤a sahip olmas› ve hibridizasyon yönteminin saptayamad›¤› miktarlar› tesbit edebilme avantajlar› göz önüne al›narak, HBV DNA’n›n kantitasyonunda duyarl› ve güvenilir bir yöntem olarak kullan›labilece¤i sonucu-na var›lm›flt›r.
Anahtar kelimeler:HBV DNA, real time PCR, hibridizasyon. SUMMARY
Comparison of Liquid Hybridisation and Real-Time PCR Methods in Determination of HBV DNA
The aim of this study was to compare the liquid hybridisation method which is used as a standard method for detection of HBV DNA and a new method, real-time PCR. Fifty-five serum samples, received for routin screening and hepatitis B markers (HBsAg, antiHBc total) were found positive by mikro EIA (Organon Teknika), were evaluated in the study. All samples were tested with real-time PCR and liquid hybridisation method. Twenty-nine of 55 samples were found positive with both real-time PCR and li-quid hybridisation method. Thirty-one of 55 samples (56%) were positive only with the lili-quid hybridisation, and 50 samples (90%) were positive only with the real-time PCR. In 21 samples HBV DNA were found negative with liquid hybridisation but were fo-und positive with real-time PCR, however, 20 of this 21 sera, HBV DNA levels were lower than the 1.4x106copy, which is known
the detection limit of the liquid hybridisation method. Furthermore, 2 samples which was found negative with the real-time PCR, were evaluated as positive with the liquid hybridisation method. There was no statistically meaningful difference between both methods (r=0.754, p<0.05). In conclusion, because of the real-time PCR has a broad detection interval and its sensitivity for the very low level of HBV DNA, it may be used as a sensitive and reliable method for the quantitation of HBV DNA.
Key words:HBV DNA, real time PCR, hibridization. G‹R‹fi
Hepatit B virus (HBV) infeksiyonlar›, tüm dünyada oldu¤u gibi ülkemizde de önemli bir halk sa¤l›¤› so-runu olmay› sürdürmektedir. Türkiye’deki prevalan-s› %3.9-12.5 araprevalan-s›nda de¤iflmekte olup, bu oran 2.5-6 milyon (ortalama 4 milyon) kiflinin HBV
tafl›-y›c›s› oldu¤unu yans›tmaktad›r (1, 2). Tüm dünyada 300 milyon HBV tafl›y›c›s› olup, bunlar›n %25-30’u siroz ya da hepatosellüler karsinom nedeniyle kaybe-dilmektedir (2-4).
Günümüzde HBV ile ilgili laboratuvar çal›flmalar›n-da moleküler biyolojik teknikler kullan›larak HBV DNA’n›n araflt›r›lmas› gittikçe yayg›nlaflmaktad›r. Özellikle herhangi bir serolojik gösterge saptana-mayan (seronegatif) kiflilerden bulaflan
posttrans-‹letiflim:Sinem Akçal›
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35: 199-202
füzyonel hepatit B olgular›nda ve HBV mutantlar› ile meydana gelen hepatit infeksiyonlar›nda, infek-siyonun tek göstergesinin HBV DNA oldu¤unun kan›tlanmas› bu çal›flmalar›n h›z kazanmas›na yol açm›flt›r.
HBV DNA’n›n gösterilmesi için birçok metot gelifl-tirilmesine ra¤men rutin olarak en s›k prob hibridi-zasyon ve hedef ço¤altma yöntemleri kullan›lmak-tad›r (5-7). Hibridizasyon yöntemlerinin duyarl›l›¤› düflük ve özgüllü¤ü yüksek iken, ço¤altma yöntem-lerinde durum bunun tam tersidir. Bu nedenle hangi yöntemlerin tan› ve tedavi takibinde kullan›labile-ce¤i belirlenmelidir.
Bu çal›flmada HBV DNA’n›n saptanmas›nda kulla-n›lan standart yöntem olarak kabul edilen s›v› hib-ridizasyon yöntemi ile yak›n zamanda kullan›ma gi-ren real-time PCR yönteminin karfl›laflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Serum örnekleri. Celal Bayar Üniversitesi T›p Fa-kültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD Seroloji laboratuar›na rutin tarama amac›yla gönde-rilen ve hepatit B serolojik belirleyicileri (HBsAg, anti HBc total) mikro EIA (Organon Teknika) yön-temi ile pozitif olarak saptanan 55 serum örne¤i ça-l›flmaya al›nm›flt›r.
S›v› hibridizasyon.Hibridizasyon yönteminde se-rum örnekleri, Digene Hybrid Capture System ile, kit prosedürüne uygun olarak çal›fl›lm›fl ve sonuçlar luminometre ile okutulmufltur. Nükleik asit miktar-lar› ölçülerek, mililitrede 5 pikogram (1,4x106
kop-ya) ve üzerindeki de¤erler pozitif olarak de¤erlen-dirilmifltir.
Real-time PCR DNA ekstraksiyonu. Serum ör-neklerinden 200 μL al›narak Nucleospin Virus kit (Biogene, Kimbolton, UK) ile DNA ekstraksiyonu yap›lm›flt›r.
DNA amplifikasyonu. Ekstrakte edilen örnekler Taq Man PCR Core reagents (Applied Biosystems) kullan›larak haz›rlanan PCR miksi içerisinde ABI Prism 7700 sekans tarama cihaz›nda (Applied Bi-osystems, Foster City, USA) amplifikasyona tabi tutulmufltur. Çal›flman›n dinamik aral›¤› 103-107
kopya/ml olup (HBV DNA Viral Quality Control-VQC panele göre), prob ve primerler Applied Bi-osystems firmas›ndan elde edilmifltir.
‹statistiksel analiz. ‹statistiksel analizlerde Max Likelihood Chi-square yöntemi ve Pearson korelas-yon analizi kullan›lm›flt›r.
BULGULAR
55 örne¤in 29’u her iki yöntemle de pozitif olarak belirlenmifltir. S›v› hibridizasyon yöntemiyle 55 ör-ne¤in 31’i (%56), real-time PCR yöntemiyle ise 50’si (%90) pozitif olarak saptanm›flt›r (Tablo 1). Ancak hibridizasyon yöntemiyle negatif olarak tan›p, real-time PCR yöntemiyle pozitif olarak sap-tanan 21 örne¤in 20’sinde HBV DNA düzeyleri, hibridizasyon yönteminin yakalama s›n›r› olan 1,4x106kopyan›n alt›nda bulunmufltur. Buna
karfl›-l›k real-time PCR ile negatif olarak saptanan 2 ör-nek, hibridizasyon yöntemiyle pozitif olarak de¤er-lendirilmifltir (Tablo 1).
Yap›lan istatistiksel analizlerde iki yöntem aras›n-daki korelasyon 0,754 olarak hesaplanm›fl, sonuçlar aras›nda istatistiksel olarak anlaml› bir fark saptan-mam›flt›r (p<0,05).
TARTIfiMA
Son y›llarda yap›lan araflt›rmalar, HBV DNA sap-tanmas›nda PCR yöntemlerinin, klasik hibridizas-yon yöntemlerine göre daha duyarl› oldu¤unu gös-termektedir. PCR ile yaklafl›k olarak 10-50 ge-nom/ml gibi eser miktardaki HBV DNA saptanabil-mektedir. Böylece, HBV DNA hibridizasyon testi negatif olan birçok hastada, PCR ile pozitif sonuç-lar elde edilmektedir. Çal›flmam›zda da hibridizas-yon yöntemiyle negatif olarak saptanan 24 örne¤in 21’i, real time PCR ile pozitif olarak tesbit edilmifl-tir. Ülkemizde bu konuda yap›lan çal›flmalara bakt›-¤›m›zda, Ero¤lu ve ark (8) hibridizasyon yöntemi ile negatif olarak saptanan 51 örne¤in 3’ünü, Yetifl-kul ve ark ise (9) 19 örne¤in 5’ini PCR ile pozitif olarak belirlemifllerdir. Bu çal›flmalarla k›yaslad›¤›-m›zda, bizim çal›flmam›zdaki PCR pozitiflik oran-lar› di¤er araflt›rmac›lardan belirgin olarak yüksek-tir. Bunun nedeninin, seçilen PCR yönteminden kaynakland›¤›n› düflünmekteyiz. Di¤er araflt›rmalar “in house” PCR ile yap›l›rken, bizim çal›flmam›zda real-time PCR yöntemi kullan›lm›flt›r.
Hibridizasyon (+) Hibridizasyon (-) TOPLAM (+) (-) TOPLAM Real-time PCR 29 21 50 2 3 5 31 24 55 Tablo 1. S›v› hibridizasyon ve real time PCR yöntemlerinin karfl›laflt›rmal› sonuçlar›.
S. Akçal› ve ark, HBV DNA Saptanmas›nda S›v› Hibridizasyon ve Real-Time PCR Yönteminin Karfl›laflt›r›lmas›
lemlerinde yerini real-time PCR’a b›rakmas› gerek-ti¤i görüflünü desteklemektedir.
Sonuç olarak, bu çal›flmada her iki yöntemle de po-zitif olarak saptanan sonuçlar, yap›lan istatistiksel analizlerle birbiriyle korele olarak tesbit edilmifltir. Real time PCR’›n genifl bir dinamik aral›¤a sahip olmas› ve hibridizasyon yönteminin saptayamad›¤› miktarlar› tesbit edebilme avantajlar› göz önüne al›-narak, HBV DNA’n›n kantitasyonunda duyarl› ve güvenilir bir yöntem olarak kullan›labilece¤i sonu-cuna var›lm›flt›r.
KAYNAKLAR
1. Çakalo¤lu Y, Ökten A, Yalç›n fi: Türkiye’de hepatit B virus infeksiyonu seroepidemiyolojisi. Gastroenterolo-ji Dergisi 1:49 (1990).
2. Taflyaran MA:HBV infeksiyonu epidemiyolojisi. “K. K›l›çturgay (ed): Viral Hepatit’ 98”, p94, Viral Hepatitle Savafl›m Derne¤i, ‹stanbul (2000).
3. Kurt H:HBV infeksiyonunun klinik bulgular›. “K. K›-l›çturgay (ed): Viral Hepatit’ 98”, p101, Viral Hepatitle Savafl›m Derne¤i, ‹stanbul (2000).
4. Robinson WS: Hepatit B virus and hepatit C virus. “GL Mandell, JE Bennett, R. Dolin (eds): Principles and Practise of Infectious Disease”, p1652, Churchill Living-stone, New York (2000).
5. Koneko S, Feinstone SM, Miller RH:Rapid and sen-sitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polimerase chain reaction technique. J Clin Microbiol 27:1930 (1989).
6. Thon EV: Evaluation of SHARP Signa-i System for enzymatSigna-ic detectSigna-ion amplSigna-ifSigna-ied hepatSigna-itSigna-is B vSigna-i- vi-rus DNA. J Clin Microbiol 33:477 (1995).
7. Ho SKN, Chan TM, Cheng IKP, La-i KN: Comparison of the second-generation Digene Hybrid Capture Assay with the Branched-DNA Assay for measurement of hepatitis B virus DNA in serum. J Clin Microbiol 37:2461 (1999).
8. Ero¤lu C, Pekbay A, Esen fi, Havuz S, Sünbül M, Günayd›n M, Leblebicio¤lu H: Hepatit B virus DNA’ s›n›n polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibrit yakala-ma sistemi ile belirlenmesi. Viral Hepatit Derg 3:390 (2001).
9. Tuncay Yetiflkul S, Ayd›n F, Çubukçu K, Özgümüfl OB, Yaz›c› Y, K›l›ç AO: Hepatit B virus DNA’ s›n›n polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibri-dizasyon yöntemleri ile araflt›r›lmas›. Viral Hepatit Derg 1:441 (2002).
Real time PCR, nükleik asit amplifikasyonu ile efl zamanl› olarak art›fl gösteren floresan sinyalin öl-çülmesiyle template miktar›n› k›sa sürede, kantita-tif olarak saptayan spesifik, duyarl› bir PCR yönte-midir. PCR’›n her döngüsünde, reaksiyon s›ras›nda-ki amplikon üretimini, floresan yay›l›m›n› indikatör olarak kullanarak görüntüler. Real time PCR kanti-tasyonu, “in house” PCR’da ürünü görüntülemek için uygulanan PCR sonras› ifllemleri ortadan kald›-r›r. Bu da daha duyarl› sonuçlar›n elde dilmesine olanak sa¤larken, ayn› zamanda kontaminasyon ris-kini azalt›r ve potansiyel hata kayna¤› olan PCR sonras› ifllemleri elimine eder. Di¤er yandan real-ti-me PCR, 108-101 gibi çok daha genifl bir dinamik
aral›¤› saptamaktad›r. Dinamik aral›¤›n geniflleme-si, kantitasyonun do¤rulu¤unu daha da artt›rm›flt›r. Tüm bu avantajlar›n› göz önüne alarak, çal›flma-m›zda HBV DNA’n›n saptanmas› ve kantitasyo-nunda real-time PCR yöntemini kullanmay› tercih ettik.
Çal›flmam›zda s›v› hibridizasyon yöntemiyle pozitif olarak saptanan 2 örnek, real-time PCR ile negatif olarak bulunmufltur. ‹statistiksel olarak anlaml› ol-mayan bu durumun ekstraksiyon s›ras›ndaki teknik bir sorundan kaynaklanabilece¤ini düflünmekteyiz. Çal›flmam›z ayn› zamanda ülkemizde real time PCR’›n sonuçlar›n›n hibridizasyon yöntemi ile kar-fl›laflt›r›ld›¤› ilk çal›flma olup, yurt d›fl›nda da bu ko-nu üzerinde yap›lm›fl az say›da çal›flma bulunmak-tad›r. Zanella ve ark (10) araflt›rmalar›nda HBV DNA pozitif 108 örne¤in, hibridizasyon yöntemi ile ancak 78 tanesini pozitif olarak belirlerlerken, real-time PCR ile örneklerin tümünü pozitif olarak sap-tam›fllard›r. Yine Pas ve ark (11) HBsAg pozitif 180 örne¤i, her iki yöntemle HBV DNA aç›s›ndan arafl-t›rm›fllar, PCR ile 114 örne¤i pozitif olarak tesbit ederlerken, hibridizasyon yöntemiyle ancak 47 ör-ne¤i pozitif olarak saptayabilmifllerdir. Her iki ça-l›flmada da, hibridizasyon ile negatif olup, PCR ile pozitif olarak tesbit edilen örneklerin virus miktar-lar›n›n, hibridizasyon testinin saptama s›n›r›n›n al-t›nda oldu¤u belirtilmektedir. Bizim çal›flmam›zda da real-time PCR yöntemiyle pozitif olarak sapta-nan 20 örne¤in HBV DNA düzeyleri, hibridizasyon yönteminin yakalama s›n›r› olan 1,4x106 kopyan›n
alt›nda bulunmufltur.
2003 y›l›nda yay›nlanan EASL (European Associ-ation for the Study of the Liver) raporunda kronik hepatitlerde antiviral tedaviye bafllama kriterleri olarak viral yükün 105 genom/ml’nin üstünde
sap-tanmas› ve 3-6 ayl›k izlemlerden sonra aminotrans-ferazlar›n persistan yüksekli¤inin devam etmesi kabul edilmektedir (12). Hibridizasyon yöntemle-rinde saptama s›n›r›n›n 106 genom/ml olmas›, bu
yöntemin Hepatit B virus infeksiyonu tan› ve
10. Zanella I, Rossini A, Domenighini D, Albertini A, Cariani E: Quantitative analysis of hepatitis B virus DNA by real-lime amplification. Eur J Clin Microbiol In-fect Dis 21:22 (2002).
11. Pas SD, Fries E, De Man RA, Osterhaus AD, Niesters HG: Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B Virus DNA and compari-son with two commercial assays. J Clin Microbiol 38:2897 (2000).
12. Valla D:Easl international consensus conference on Hepatitis B. J Hepatol 38:533 (2003).
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:199-202
