Endüstriyel mikrobiyoloji ve biyoteknoloji laboratuarının kurulması

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Sonuç Raporu

2011/03

Endüstriyel Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji Laboratuarının Kurulması

Doç. Dr. Bilge Hilal ÇADIRCI

Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Biyomühendislik Bölümü

Şubat, 2013

ÖZET(*)

Endüstriyel Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji Laboratuarının Kurulması

Mikroorganizmaların bulundukları ortam ve metabolik aktiviteleri göz önüne alınarak mikrobiyolojinin çeşitli bölümlerine “Tıbbi mikrobiyoloji”, “Veteriner Mikrobiyolojisi”,

“Tarım Mikrobiyolojisi”, Toprak Mikrobiyolojisi”, “Deniz Mikrobiyolojisi”, “Endüstriyel Mikrobiyoloji” gibi adlar verilmiştir. Endüstriyel mikrobiyoloji, mikroorganizmaların ve ürünlerinin endüstriyel alanlarda kullanılarak insanlara yararlı halde getirilmesi için çalışmaların yapıldığı bilim dalıdır. Çok geniş bir çalışma alanı olan endüstriyel mikrobiyoloji, mikrobiyolojinin ekonomik yönü olan her konu ile ilgilenir.

Üniversitemizde ve bölümümüzde bu tarz çalışmaların yapılabilmesi için kurulan Endüstriyel Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji Laboratuarında, Buzdolabı, Yatay jel elektroforezler, Termoblok- Modular Heating Block, Masaüstü shaker, Santrifüj, pH metre, Etüv, Pastör fırını, Vakum pompası alınarak mikroorganizmaların izolasyonu için temel ihtiyaçlar karşılanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Endüstriyel mikrobiyoloji, Biyoteknoloji, Enzimler, Mikroorganizmaların moleküler biyolojisi

(*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No: 2011-03).

ABSTRACT (*)

Construction of Industrial Microbiology and Biotechnology Laboratory

Taking into account of the environment and the metabolic activities of the microorganisms, microbiology is divided into “Medical Microbiology”, Veterinary Microbiology”, “Agricultural Microbiology”, “Soil Microbiology”, “Marine Microbiology”, “Industrial Microbiology”. Industrial microbiology is interested into increase the benefit of human being by usage of the microorganisms and their metabolites in industry. Industrial microbiology is interested in all economically relevant microbiology topics.

In the “Industrial Microbiology and Biotechnology Laboratory” which is constructed by this project, we have fundamental equipments like a refrigerator, two horizontal gel electrophoresis apparatus, thermoblock and modular heating blocks, desktop shaker, desktop microcentrifuge, pH meter, Incubator, Pasteur Oven, and a vacuum pump in order to conduct these kinds of studies in our university and in the department.

Keywords: Industrial microbiology, Biotechnology, Enzymes, Molecular biology of microorganisms

(*): This Project is supported by Gaziosmanpasa University Scientific Research Committee (Project No: 2011-03)

ÖNSÖZ

Yaşadığımız mikrobiyoloji çağında neredeyse hergün yeni enfeksiyonlar, yeni organizmalar ve keşifleri kolaylaştıracak yeni araçlar gibi, bu bilim dalında yapılmış yeni keşiflerin haberini alıyoruz. 19. yüzyıldan beri Bakteriler, buna ilaveten 19. yüzyılın son çeyreğinden itibaren de Archaea türleri, canlılıkla ilgili pek çok olayın (protein sentezi, DNA replikasyonu, alışılmadık fermantasyon tipleri vs) moleküler düzeyde anlaşılmasında model canlılar olarak kullanılmaktadır.

İnsanoğlu mikroorganizmaların, iyimser bir tahminle, ancak %2‟sini izole edebilmiş ve saf kültür halinde kültür koleksiyon merkezlerinde stok altına alabilmiştir. Bu düşük orana rağmen, bu canlılarda çok farklı yol izleri ve metabolik tipler ortaya konmuştur. Bunlara ilişkin çalışmaları gerçekleştiren bilim insanları da Nobel bilim ödülüne layık görülmüştür. Mikroorganizmalar model organizma olmaları dışında, primer ve sekonder metabolitlerin üretiminde de yoğun biçimde kullanılmaktadır. Bu süreç onları henüz tanımadığımız çok eski çağlardan beri devam etmektedir. Şüphesiz ki mikroorganizmalarda gerçekleşen metabolik olayları anlamak ve onları uygulama alanlarında kullanmak ekonomik büyümenin de önemli bir unsuru haline gelmiştir.

Bilimin pek çok alanında bir şekilde yararlandığımız endüstriyel öneme sahip mikroorganizmaların izole edilmesi ve bunların genetik modifikasyonlar ile biyoteknolojik öneminin arttırılmasına yönelik çalışmaları yapabilmemiz için kurduğumuz Endüstriyel Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji Laboratuarında aktif olarak çalışmakta ve çalışmaların sürdürülmesi için proje yazımları devam etmektedir. Laboratuarda şu an itibari ile çalışacak 2 doktora ve 5 yüksek lisans öğrencisi bulunmaktadır. Ayrıca lisans öğrencileri de çalışmalara katılabilmektedir. Ancak maalesef mekan kısıtlılığından dolayı laboratuarımız bir başka laboratuar ile ortaklaşa kullanılmaktadır. İleride bu sorunun çözüleceğini ümit etmekteyiz. Bu laboratuarın kurulmasında destek olan başta rektör olmak üzere Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri komisyonuna teşekkür ederim. Ayrıca laboratuarın aktif olarak çalışmasını sağlayan sevgili yüksek lisans ve doktora öğrencilerime de teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER Sayfa Özet ………...……… i Abstract …….……… ii Önsöz……….……… iii İçindekiler…..……… iv Şekiller Dizini ……….. v Giriş……….. 1 Materyal ve Yöntem ……… 2 Buzdolabı…….………. 2

Yatay jel elektroforezi ………. 3

Termoblok ve Modular Heating Block ……… 4

Masaüstü Shaker …….……… 5 Santrifüj……….……….. 6 pH metre……….. 7 Etüv………..……… 8 Pastör fırını………..………. 9 Vakum pompası ….……….. 10 Tartışma ve Sonuç ………….……….. 10 Kaynaklar ………..……….. 11

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 1. Buzdolabı………. 2

Şekil 2. Yatay jel elektroforezi …...………. 3

Şekil 3. Termoblok ve Modular Heating Block ..……… 4

Şekil 4. Masaüstü Shaker …….………...……… 5

Şekil 5. Santrifüj...….……….. 6

Şekil 6. pH metre …..……….. 7

Şekil 7. Etüv ..…...……… 8

Şekil 8. Pastör fırını.………. 9

Şekil 9. Vakum pompası ……….. 10

1. GİRİŞ

Mikrobiyal yolla kimyasal ürünlerin elde edilmesi besin maddeleri, içkiler, hayvan yemleri ve vitamin, antibiyotik gibi tıbbi maddelerin üretimi, muhafazası ve kalite kontrolü endüstriyel mikrobiyolojinin kapsamına girer. Tekstil ürünleri, jet yakıtları, kağıt gibi ürünlerin bozulmamasının sağlanması da diğer konularıdır. Son yıllarda endüstriyel önemi olan maddelerin üretiminde moleküler tekniklerin kullanımı ile bu alan oldukça popüler hale gelmiştir. Ülkemizin kendi kaynaklarını endüstride kullanması açısından konunun önemi açıktır. Bölümümüzde Endüstriyel Mikrobiyoloji laboratuarının kurulması milli çıkarlar açısından önem arz etmektedir.

Mikroorganizmaların topraktaki organik maddenin dekompozisyonundaki görevleri, atmosferik bileşenlerin düzenlenmesi, azot fiksasyonu ve fotosentez gibi dünyanın biyokimyasal sürecinin belirlenmesindeki rolleri onların önemini arttırmaktadır. Çöllerden

jeotermal kaynaklara kadar uygun olmayan çevrelerde yaşayabilen canlılara ekstremofiller denir (Stolp, 1988). Sıcak su kaynakları jeolojik aktivitenin bir sonucu olarak ortaya çıkar ve uçta kalan çevreler olarak kabul edilir. Termal alanlar ABD‟de bulunan Yellowstone Ulusal Park‟ında korunmaya alınmış ve mikrobiyal ekolojik çalışmaların pek çoğu bu alandan elde edilmiştir (Reysenbach ve ark., 2001). Ekstremofiller, özellikle termofillerden elde edilen proteaz, lipaz gibi enzimler, deterjan sanayi, deri sanayi, kağıt sanayi ve moleküler biyoloji ve biyoteknoloji gibi endüstriyel uygulamalarda önem taşımaktadır. Mikroorganizmalar metan, H2 gibi gazların üretimi ile enerji endüstrisinde de geniş kullanım alanı bulmaktadır (Cakin ve ark., 2006)

Standart izolasyon yöntemleri ile kültüre edilen mikroorganizmalar, asıl mikrobiyal çeşitliliğin ancak %1‟ini oluşturmaktadır. Dolayısı ile belli bir reaksiyonu katalizleyen enzimlerin çeşitliliği kısmen bilinmektedir. Çevresel örneklerdeki genetik çeşitlilikten yararlanmanın bir yolu da DNA kütüphanelerinin oluşturulmasıdır. Kütüphaneler oluşturmak için kullanılan DNA mevcut olan organizma kültüre edilmeden topraktan izole edilir (Henne ve ark., 1999). Bu yaklaşım, canlılarda kaynağı bilinmeyen enfeksiyonları tanımlamada kullanılmakla birlikte deniz suyu, atık sular, maden yatakları gibi sonuçların ekonomik değer yarattığı alanlarda daha sık kullanılmakladır.

Endüstriyel mikrobiyoloji ve biyoteknoloji laboratuarı ile yukarıda sözü edilen çalışmaların yapılabilmesi için bölümümüzde zemin hazırlanmıştır.

2. MATERYAL VE YÖNTEM

Şekil 1. Buzdolabı

Vestel Marka buzdolabı hacmi 454 litredir. Kullanılan kimyasalların ve enzimlerin korunması ve kültür koleksiyonlarından alınan veya topraktan izole edilen mikroorganizmaların saklanması için kullanılmıştır.

Şekil 2. Elektroforez tankları

Elektroforez, farklı büyüklükte, yükte ya da konformasyonda olan makromolekülleri, özellikle protein ve nükleik asitleri, ayırmak, saflaştırmak ve molekül ağırlıklarını saptamak amacıyla biyokimya ve moleküler biyolojide en yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Elektroforez, elektriksel bir alanda moleküllerin yüklerine, moleküler ağırlıklarına ve büyüklüklerine göre ayırt edildikleri bir tekniktir. Elektroforetik analizin temeli, moleküllerin elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Yüklü moleküller bir elektrik alanına maruz bırakıldığında, yüklerine göre ya pozitif (anod) ya da negatif (katot) kutba doğru göç ederler. Net negatif ya da pozitif yüke sahip olan proteinlerin aksine, nükleik asitler fosfat omurgaları iyonize olduğundan, negatif bir yüke sahiptirler ve bu yüzden anota doğru göç ederler. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jeldeki kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Sistemin ürettiği güç direnç ile akımın karesinin çarpımına eşittir. Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektoforez aygıtı, jelin sıcaklığını artırmaksızın ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Bu nedenle voltajın üst sınırı genellikle elektroforez aygıtının ısıyı dağıtma yeteneğine bağlıdır.

VWR marka Jel Elektroforezinde korozyona dirençli platin elektrotlar kullanılmıştır. Bu da ısı dağıtımının eş olması için oldukça önemlidir. Laboratuarımızda yapılan çalışmalarda jel elektroforezleri, izole edilen mikroorganizmaların tanılanması için DNA‟larının ve plazmitlerinin miktar ve ebatlarınının belirlenmesi için kullanılmıştır.

3. Termoblok ve Modular Heating Block:

Şekil 3. Termoblok ve 1,5 + 0,5 ml‟lik moduler ısıtma aparatı

Almış olduğumuz analog tek bloklu VWR marka Termoblok ve uygun Modüler Heating Bloklar, eşit ısı dağılımının sağlandığı aletlerdir. DNA‟nın jelden geri kazanımı sırasında jelin eritilmesi, sıcaklıkla çözünürleştiren bazı kimyasalların eritilmesi, enzimatik reaksiyonları stabil sıcaklıkta gerçekleştirmek için kullanılan termoblokta, 0,2-0,5- 1,5 ve 2 mililitre hacimlerinde ependorflar için uygun ısıtma bloğu taşımaktadır. Böylece hem PCR için ependorflara hem de standart 1.5 ml‟lik ependorflara uygundur. Bu alet hem kendi laboratuarımızda hem de Protein Mühendisliği Laboratuarında kullanılmaktadır.

4. Masaüstü Shaker:

Şekil. 4.Masaüstü Shaker

Kültür elde etmede (mikroorganizmaları belli bir besiyerinde üretmek) kullanılan ve sıcaklığı ayarlanabilen inkübasyon aletidir. Shakerlar da inkübatördür. Genellikle incelenen örnek veya mikroorganizma hangi sıcaklık derecesini gerektiriyorsa ona uygun olarak, 20°, 25°, 30°, 37° ve 55°C gibi çalışılacak sıcaklık derecesine ayarlanarak karıştırmalı olarak kullanılır. Etüvün bünyesindeki termostat shaker içinin belli bir sıcaklığa ulaşmasını ve bu sıcaklığın devamlılığını sağlar. Soğutmalı, rutubet ayarlı ve çalkalamalı tipleri de bulunmaktadır Sıcaklık ayarlama sınırları genel olarak 0-100°C'dir. Isıtmalı karıştırma sağlayan, 100 ml‟lik 250 ml‟lik 500 ml‟lik 1000 ml ve 2000 ml‟lik erlenlere uygun aparatları ile birlikte satın alınan SI-600 marka masaüstü shaker, izole edilen kültürlerin çalkalamalı olarak havalandırma prensibine göre inkübasyonunda kullanılmıştır.

Şekil 5. Masaüstü mikrosantrifüj

Santrifüj, belirli bir devir hızında molekül büyüklüğüne veya konsantrasyon gradiyentine bağlı olarak bir karışımda bulunan partiküllerin boyutlarındaki farklılıklarına göre ayırmada kullanılan bir alettir. Homojenat relatif santrifügal kuvvet (RCF) arttırıldıkça fraksiyonlarına ayrılmaktadır.

Laboratuarımızda, hücre dışı enzimlerin veya DNA‟nın eldesi esnasında hücrelerin uzaklaştırılması veya eldesi için kullanılan Hettich marka Mikro 120 Dijital Mikrosantrifüj, bir dakikada 14000 devirde dönerek amaca uygunluk sağlamıştır.

Şekil 6. Masaüstü pH metre

“pH”, „hidrojen iyonları konsantrasyonu‟ anlamına gelen latince “Potentia Hidrogenii” teriminin kısaltmasıdır. pH, bir çözeltinin hidrojen iyonu aktivitesinin kısa gösterimi olup hidrojen iyon konsantrasyonunun negatif logaritmasıdır.

pH = - log [H+] = log ] [H

1



pH skalası, 0-14 aralığında değişen bir skala olup, bir çözeltinin asidiklik veya baziklik özelliğini belirlemede kullanılan bir skaladır. Burada pH 0-6 arası asidik, pH 7 nötral, pH 8-14 arası ise bazik bölgeyi ifade eder. pH değeri, asitlerle bazları ayırdetmek ve kuvvetlerini ölçmek için bir ölçüdür. Su içeren herşeyin bir pH değeri vardır ve pH metre gibi elektronik aletlerle veya indikatörlerle belirlenebilir.

Mikroorganizmaların kültivasyonu için kullanılan ortamların tasarımı çok iyi biçimde ortaya konmuş besinsel ve fizyolojik verilere dayandırılmış olmasına karşın, ortam bileşenlerinin arasındaki girişim ve konsantrasyonun tahmin edilemeyen etkileri şaşırtıcı sonuçlar vermektedir. Büyümenin kontrolünde sıcaklık, pH, su aktivitesi ve oksijen önemli rol oynamaktadır. Belli bir pH ve konsantrasyonda kolayca kullanılabilen bir karbon ve enerji kaynağı, farklı bir pH ve konsantrasyonda inhibe edici olabilir. Bazı bileşenler, etkileşimsiz

olarak ortamda bulunabilir ancak başka bir bileşen ile beraber olduğunda büyümeyi inhibe edebilir veya durdurabilir.

pH metrelerde elektrotlar sıklıkla problem çıkartmakta, ölçümleri doğru yapamamaktadır. Güvenilir bir marka olan WTW İnolab bölümümüzde protein laboratuvarında bulunan diğer pH metre ile uyumludur. Böylece elektrotların ortak kullanılabileceği düşünülerek bu marka seçilmiş ve kullanılan çözeltilerin, tamponların ve besiyerlerinin pH‟larının ölçülmesinde kullanılmıştır.

7. Etüv:

Şekil 7. Etüv

Etüvler, kültür elde etmede (mikroorganizmaları belli bir besiyerinde üretmek) kullanılan ve sıcaklığı ayarlanabilen inkübasyon dolaplarıdır. Genellikle 20°, 25°, 30°, 37° ve 55°C gibi çalışılacak sıcaklık derecesine ayarlanarak kullanılır (incelenen örnek veya mikroorganizma hangi sıcaklık derecesini gerektiriyorsa ona uyulmalıdır). Etüvün bünyesindeki termosta etüv içinin belli bir sıcaklığa ulaşmasını ve bu sıcaklığın devamlılığını sağlar. Soğutmalı, rutubet ayarlı ve çalkalamalı tipleri de bulunmaktadır Sıcaklık ayarlama sınırları genel olarak 0-100°C'dir. Mikroorganizmaların sabit sıcaklıkta istenilen ortamlarda büyütülmesi ve izolasyonunda kullanılmıştır.

8. Pastör Fırını:

Şekil 8. Pastör fırını

Kuru sıcak hava ile sterilizasyon amacıyla kullanılan sterilizatörlerdir. İçi boş, temizlenmiş ve sterilizasyona hazırlanmış cam ve metal kaplar ile malzemeyi sterilize etmede kullanılır. Sterilizasyon için malzemenin 160-180°C'de 2-1.5 saat tutulması yeterlidir. Pastör fırınından çıkan steril malzeme soğutulduktan sonra kullanılmalıdır. Pastör fırınının (kuru sterilizatör) sıcaklık ayarlama sınırları genel olarak 0-300°C'dir.

Mikroorganizmaların izolasyonunda kullanılan cam kapların sterilizasyonunda kullanılmıştır.

Şekil 9. Vakum pompası

Vakum pompası sıvı örneklerden mikroorganizmaların yoğunlaştırılarak izole edilmesi, ısı ile bozulabilecek ortamların filtrasyonla sterilizasyonunda kullanılmıştır.

3. TARTIŞMA VE SONUÇ

Bölümümüzde kurulan Endüstriyel Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji laboratuarı, çeşitli araştırmalarda kullanılmıştır. Bunlar arasında;

1. Topraktan izole edilen toluene toleran mikroorganizmaların izolasyonu çalışmasında, 2. Zile‟de bulunan bir kablo temizleme firmasının kablolardan yağların temizlenmesi

esnasında yağlarla çözgenlerin doyması nedeniyle yaşadıkları maddi kaybın giderilmesi için yapılan ön çalışmada,

3. Topraktan izole edilen ve ksiloz oluşturan ksilanaz üreticisi mikroorganizmanın aranması çalışmasında

4. Ayrıca biyomühendislik öğrencilerinin uygulama derslerini yürütebilmeleri için de bu laboratuardan yararlanılmıştır.

Laboratuarımızda çalışılması planlanan 1 Avrupa İkili İş Birliği, IntenC projesi Almanya ile sunulmuş, iki proje de BAP‟a sunulmuştur. Proje sonuçları beklenmektedir. Bir proje de

TUBİTAK 1001 Araştırma Projelerine sunmak üzere hazırlanmaktadır. Laboratuarımızda 2 yüksek lisans bir doktora öğrencisi düzenli olarak çalışmaktadır. Bu dönemde iki iki yüksek lisans bir doktora öğrencisi daha çalışmalara katılacaktır. Ayrıca lisans öğrencilerinden de ilgi duyan öğrenciler laboratuar çalışmalarına katılmaktadır.

4. KAYNAKLAR

Cakin, A., Kutluca, A.K. and Cadirci, B.H., 2006. Jeotermal Uygulamaların Fiziksel, Kimyasal, Biyolojik ve Sosyo-ekonomik Etkileri, III. Ege Enerji Sempozyumu, 25-27 Mayıs 2006, Mugla.

Henne, A., Daniel, R. Schmitz, R. A. and Gottschalk, G., 1999. Construction of Environmental DNA Libraries in Escherichia coli and Screening for the Presence of Genes Conferring Utilization of 4-Hydroxybutyrate. Applied and Environmental Microbiology, 65/ 9, 3901–3907.

Reysenbach, A.L. and Cady, S.L., 2001. Microbiology of Ancient and Modern Hydrothermal Systems. Trends Microbiology. 9, 78-85.

Stolp, H., 1988. “Microbial Ecology: Organisms, Habitats, Activities”. Cambridge University Press. Cambridge.