Başlık: EGREL Tt OTU İLE BESLENEN İNEKLERDEN ELDE EDİLEN ~ÜTÜNMUT AJENtK AKTİVİTESİ ÜZERİNDE ÇALIŞMALARYazar(lar):İSTANBULLUOĞLU, Ersin;PAMUKÇU, Taner;PAMUKÇU, MAHİRCilt: 28 Sayı: 1.4 DOI: 10.1501/Vetfak_0000000913 Yayın Tarihi: 1981 PDF

i A. O. Vet. Fak. De;g.

Fac. Vet. Med., Univ. Ankara 28, (1-4): 137-143, 1981.

EGREL Tt OTU İLE BESLENEN İNEKLERDEN ELDE EDİLEN

~ÜTÜNMUT AJENtK AKTİVİTESİ ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR

Ersİn İstanbulluoğlu

*

Taner Paınukçu

* *

Mahir Pamukçu

* * *

Studies on Mutagenic Activity ofMilk from Cows Fed Bracken

Fern

Summary: Mutagenicity of the milk of brocken fem fcd cows were determined by two di{ferent bacterial test systems using SalmoniIlla typhimurium (TAgS, TAıoo) and Baciliussubtilis (I7A, 45T) strailis.

Four orgaııic solvent extraet fractions oj milk were pıepared from brru:ken fem or normal diet fed cows and testedfor mutagenicity.

Tlze ch/orojorm-methaııol fractioı. from brackenfem fed cows deınonstrated mutagenıc acivity for both TA i00 aııd 4.5T straiM.

Özet ~ Eğ~elti ot~ ve normal yemle beslenmiş ineklerden-elde edjleıı sütlerin

mutajenik aktiviteleri Salmoneıla typhimurium (TAgS, TA i00) ve Bacillus

sub-ti/is (I7A, 45 T) suşlarından )'ararlanılarak ikifarklı test sistemi ile incelendi. Süt örneklerinin çıkartımında dört farklı ol;l{anik eritici kullanıldı.

r.,g-relti otu ile beslenen hayvanların sütlerinin kloroform-metal101 çıkartımı hem

TA i00 hemde 45 T için mutajenik bulundu.

Giriş

Mutajenik ve dolayısı ilc karsinojcnik karakterdeki kimyasal

maddelerin (organik veya inorganik) tanımlanmasında veya

tarari-• Doç.Dr. A.O. Veteriner Fakültesi, Bakteriyoloji ve Salgınlar Birimi. Ankara-Türkiye .

•• Kimya Mühendisi, A.O. Veteriner Fakültesi, F.K.B. Birimi Araştırma Görevlisi, Ankara-Türkiye.

133 E.İstanbulluoğlu- T.Pamukçu-M .Pamukçu

masında çeşitli bakt~riycl test sistemleri son yıllarda ÇOK yaygın olarak

kullanılmaktadır (ı, 5, 7, ır). Bu yöntemlerin basit ve ekonomik

ol-ması, kısa zamanda sonuç vcrmesi klasik yöntemlere (y:cdirme

deney-leri gibi) tercih edilmedeney-lerinin baılıca nedenleridir. Bakteriyel muta-j.;:;nitc test sistemlerinin ilki r 97 ı yıLında Ames ve ark. (r) tarafından

geliştirilmiş olup yöntem, histidin ve biotin oksotrof olan çeşi~li

Sal-monella typhimurium mutantlarının mutajenik maddeler taı'afından

prototrofik suşlar haline dönüştürülmesi esasına dayanmaktadır. Ames

ve arkadaşları daha sonraki yıllarda yaptıkları çalışmalarda düşük

konsantrasyonlardaki mutajenik maddelere bıle duyarlı olan SaL.

typhimurium mutantları elde etmişlerdir (4). Ayrıca, besi yerlerine

memeli karaciğer enzim sistemleri ilave edilerek kendileri değilde

metabolizma ürünleri mutajenik olan maddeleri saptamak mümkün

olmuştur (2,_ 4.).

SaL' typhimurium mutantlarının y,mı sıra tiriptofan oksotrof

olan E.coli ve Rcc-BaciIlus subtilis suşlarıda aynı amaç için çeşitli

araştırmacılar tarafından kullanılmıştır (6, 7, ır).

Bakteriyel mut<ıjenite test sistemlCl'i ilc gen yapısında kimyasal

maddeler (organik ve inorganik) tarafindan olu~turulabiIcn "Base

paır subtitutian"~ "Frame shijt", "biser/ian ve de/etian", tipi mutasyonlar kolaylıkla saptanılabilir (S).

EğrcIti otu (Brackcn fer-!1, Pteridium aquilinum) ülkemizin

bil-hassa Karadeniz bölgesinde yaygın olarak bulunan bir bitki türü olup

hayvanlar için -karsinojenik aktiviteye sahip olduğu çeşitli araştırma-cılar tarafında~ açıklanmıştır (r 2, 14). Pamukçu ve ark. (ı 3) eğrclti otu ilc beslenen inekıCı'den elde edilen sütlerin karsinojenik ve

muta-jenik maddeler taşıdıklarını deneysel çalışmalarla ortaya

koymuştu'-dır.

Bu çalışmanın amacı, eğrcIti otu

iıc

beslenmiş inckleı'den elde

edile; sütlerin mutajcnik aktivitelerini iki farklı bakteriyel test sistemi ilc incelemektir.

Materyal ve Metod

Bakteri su~-ları: SaL. typnimuriuın T A98 veTA i00 suşları Dr.

M.Pamukçu (Wisconsin, U.S.A.) ve B.subtilis ı 7A ve 4ST suşları Dr.

Kada (Mishima,Japonya)'dalı sağlandı. Salmoneıla suşları

%1

maya

ç.ıkartımı içeren nutrient broth (Difco, C.S.A.) besi yerinde üretildik-ten sonra n.B mLmiktarında ağzı ,'ida kapaklı steril şişekrc dağıtıldı;

Eğrelti Otu ile Beslenen İneklerdcn Elde Edilen Sütün... H'J

ve üzerlerine 0.07 mL. Dimethylsulfoxide (Aldrich Chemical,

u.s.K)

ilave edilerek kullanılıncaya kadar -70°C de muhafaza edildi. B.

subtilis suşları içeriğinde

%

i ct çıkartıml(Difco, U .S.A.),

%1

neopcp-ton (Difeo, U.S.A.) ve

%

0.5 tuz bulunan sıvı besi yerinde

üretildik-.ten sonra 3 mL.m~ktarında içinde i mL.

%

so'lik gliserin bulunan steril

vidakapaklı şişelere dağıtılarak kullanılıneaya kadar -io

cc

de

sak-landı.

Test ortafr}ları,' SaLtyphimurium T Ag8 ve 'fA i00 suşları için

.test ortamları Ames ve ark. (4) göre hazırlandı. B.subtilis suşları için

test ortamları ise K,ada (LO) tarafından bildirilen yönteme göre:

ha-zırlandı.

Mutajenite testleri,' TAg8 ve TAıoo SaL. typhimurium suşları

Ames ve ark. (4) bildirdiği yönteme göre mutajenite testlerine tabi

tutuldu. Üst katmanında TAg8 ve 'fAı 00 suşlarını iç~ren çift katmanh

agar plaklarına süt çıkartım örnekleri otomatik pipet yardımı ilc

damlatma (50 mikro.I. miktarında) şeklind~ uygulandı. İnoküle

edi-len petri kutuları 37

cc

de '36 saat etüvde bırakıldı. Negatif kontrol

olarak eğrelti otu yedirilmemiş hayvanların sütlerinden elde edilen

çıkartırnlar kullanıldı. Pozitif test kontrololarakta

%

o.i lik 2

(2-FurYl)-3-(s-Nitro-2-Furyl) Acrylamide cmdirilmiş kağıt disH~rden

yararlanıldı. İnkübasyon süresinin, sonunda gerek test, gercks'~ kontrol plaklarında oluşan his+ revertant kolonilerin sayıları ayrı ayrı

sayıla-rak belirlendi. Kontrollere oranla 2 kat veya daha fazlahis+ kolon i

oluş~muna neden olan çıkartırnlar mutajenik olarak kabul edildi; Ree Assay testlerinde, Ree+ ve Rec'- B.subtilis su~laıının 24

s'aat-lik buyyon kültürlerinden sıeril iğne uçlu özele!' yatdımı ilc' agar

plakları üzerine aralarında 45 derecelik bir açı oluşacak ~ckilde (kesi-şen uçlar birbirine değmeyecek şekilde) ayrı ayrı ekimler yapıldı. İki

.arklı suşun oluşturduğu açı köşesine süt çıkartım örneklerinin

emdi-rildiği (So mikro.!. miktarında) kağıt diskler (6 mm. çapında) ayrı

ayrı yerleştirildi. Tüm agar plakları

+4

oC de 6 "saat bcklctildiktcn sonra 37°C de 12-ı8 saat inkübasyona bırakıldı. Bu sürenin sonunda teşekkül eden 'inhibisyon zonları ölçülerek değerlendirildi .. Rcc Assay

testlerinde kontrololarak yine

%

0.1 lik

2-(2-FurYl)-3-(s-nitro-2-Furyl) Aerylamide kullanıldı (8, g, ıo).

Süt çıkartırnlarının hazırlanması: Gerek eğrclti otu gerekse normal yemle beslenmiş ineklerden elde edilen sütler liyofilize edilerek (Virtis,

HO E.İ stanbuııuO~llI- T. Pamukçu- M .Pamukçu

g. 500 mL. steril distile su içinde 37

oc

de ı o dakika devamlı karıştırı-larak eritildi. Elde edilen sıvıya r.5

ı.

metanol (Merek) ilave edilerek iyice karıştırıldıktan sonra, karışım r 500 dev. fdak r 5 dakika santriıüj edildi. Her örneğin santriıüj çökeltileri (üst sıvıları atıldıktan sonra) ayrı ayrı 50o mL. lik balonlara toplanıp metanol ile iki dCıa yıkandı. İkinci yıkamadan sonra çözelti kaba filitre kağıdından. süzülerek par-tikül kısmı ayrıldı. Elde edilen süzüntü sıvısı birinci metanol çıkartım

sıvısı ilc birleştirilerek 4°° mL. miktarına düşüneeye kadar düşük

ba-sınç altında evapore edildi. Konsantre sivı pentan (Merck) ile 3 dCıa

çıkartıma tabi tutuldu. Su fazı ayrılarak kalm pentan rezidüleri düşük

f)asınç altında uçuruldu. Elde edilen sıvı dictil eter (Merek) ilc 3 defa

çıkartıma tabi tutuldu (Çıkartım- r). Son çıkartırndan sonra su fa?ı

ayrılarak pH sı 9,5 oluncaya kadar NH40H ilave edildi; daha sonra

da ikinci bir etcr çıkartımına tabi tutuldu (Çıkartım-2). Her iki çıkar-tım sıvısı ayrı ayrı silikajcl (Sigma, U.S.A.) doldurulmuş kolanlardan

(r,5 X 40) geçirildi. Eritici olarak klorofom ve klorofom-metanol

(r : ı) kullanıldı.

Bulgular ve Tartışma

Test sonuçları Tablo - r ve Tablo - 2 de özetlenmiştir.

Farklı etcr çıkartırnlarından kloföfom ve klorofom-metanol

eritkcnleri ile elde edilen 4 süt fraksiyonunun mutajenik aktiviteleri

TAg8, TAroo ve ı 7A, 45T bakteriyel test suçları ile ölçülq.ü. Bütün

fraksiyonlar SaL.typhimirium T Ag8 ve B.subtilis ı i A için rı.egatif

bulundu. Eğrelti otu ile beslenmiş ineklerden elde edilen sütlerin her

iki çıkartımmdaki CHCI3/ MeOH fraksiyonları TAroo ve 45T suş.

Tablo i. Bakteriyel mutajenite tcst sonuçları.

Test Materyali S.typh. B.subt.

TAg8 TAıoo 17A 4ST

.

--Eğrelti otu yedirilmiş inek sütü Çıkartım-ı a) Eter-I,CHCl,

_-

_-

_-

-b) Eter-I,CHCl,/MeOH i i. _{3S -}

₊

Çıkartım-2 a) Eter-II,CHCI, 14 38 - ₊ b) Eter-II,CHCI,/MeOH 13 20S

-

₊₊₊

2-(2-FurYl)-3-(s-nitro--2-Furyl)Aerylamide 200 _3°5 _L.

₊₊₊

./

Eğ~elti Otu ile Beslenen ineklerden Elde Edilen Sütün ...

Tablo 2. Normal ycmle beslenmiş inı:klerden elde edilen süt çıkartımlarının bakteriyel mutajenite test sonuçları.

HI

Test .Materyali

S.typh. B,subt. TAg8

ı

TA100 17A 45T

-

----Kormal yem yedirilmiş inek sütü Çıkartım-ı a) Eter-I,CHCl,

-

-

-b) Eter-I,CHC},1 MeOlI 6 ₇ -Çıkartım-2 a) Eter-II,CHCl, 7 6 -b) Eter-II,CHCl,/MeOH 8 H

-larına karşı mutajenik aktivite gösterdiler. Kloroform fraksiyonlarında

çok düşük sayıda his+ koloni elde edilmesi ve aynı durumun

Rec-Assay denemelerinde de görülmesi, aktif maddenin bir kısmının

kio-roformla yıkama sırasında kolondan dışarı atıldığı. izleniminı

ver-• mektedir. 2 nolu eter çıkartımının ı.den daha kuvvetli mutajenik

aktivite göstermesi ~ıkartımın yüksek pH da (9,5) daha iyi olduğunu

ortaya koymaktadır. Yaptığımız ön çalışmalar sırasında mikrosomal

aktvatöre (S-g) gereksinim olmadanda mutajenik aktivitenin

mey-dana geldiğini saptadığ'ımız için, test ortamlarına S-g ilave

edilm~-l1ıİştir. •

SaL. typhimurium testlerinden elde ettiğimiz sonuçlar Pamukçu

ve ark. (12, ıg) bulgularını doğrulamaktadıı:. Rec Assay sist~mi SaL.

typhimurium sistemi kadar mutajcnik aktiveteye karşı duyarlı

bulun-muştur. Ree Assay sistemi ııazırlanış bakımından daha kolay SaL.

typhimurium sistemi ise daha kantitatif sonuçlar veren sistemler

ola-rak belirlenmiştir.

Ekosistem'dcki mutajen maddelerin ıiücre DNA'sı üLerine olan

zararlı etkileri sonucu ins;m ve hayvanlarda. çeşitli tür kanscrlerIc tc-_~ ratoJcnik bozukl~klar meydana gelmektedir. Çeşitli bitkilerin, sente-tik maddelerin (polycylic hydrocarlJon'lar gibi .. ), endüstriyel artık-ların, kozmetiklerin, bazı. ilaçların (nitrofuran'lar) mutajenik ve tera-tojenik etkiye sahip oldukları son yıllarda yapılan araştırmalar sonucu

ortaya konmuştur (g, ıo). "

İnsan ve hayvanlar daha genel bir deyimle memeliler için

muta-jenik ve karsinomuta-jenik olan maddelerin tanımlanmasında son yıllara

kadar çeşitli güçlüklerle karşılaşılmıştır. Ycdir~ne deneylerinin 'pahalı ve zaman alıcı olması nedeniyle mutajcnik veya karsinojel1ik

özellik-EJstanbul1uoğlu- T.Pamukçu-M.Pamukçu

lcre sahip maddeler hakkındaki bilgiler çoğunlukla epidemiyolojik

çalışmalardan elde edilmekte idi; fakat son on yıl içinde bilhassa Ames

ve arkadaşlarının öncülük ettiği çalışmalarla hem ucuz hemde kısa

zamanda sonuç veren çeşitli yöntemler geliştirilmiştir (5). Tarama

testleri olarak kullanılan sistemlerle, ortaya konan mutasyon türleri

Tablo-3'de gösterilmiştir.

Bu testlerde mutajenik maddeler veya bunların metabolitleri

prokaryotik hücrelerin veya eukaryotik hücre1cı-in kromozomlarında

yaralama veya onarım işlemleri ile mutasyonlara neden olmaktadırlar.

f Tablo 3. Mutajenik aktivitenin saptanmasında kuııanılan test sistemleri.

Nokta DNA veya ho- Kromozomal Ol'ganizma Itest sistemi mutasyonlar mozom onarımı mutasyonlar

-_o A) Prokaryoti"kler SaL' typhimurium -+ -+ E.colİ _{-+ -+} B.subtilis _{-+ -+}

-S.cerevisiae --f- -+ B) Eukaryotikler _=ı= Fungi -+ -+ Drosoplıila _{-+ -+} Mikronüklous test --;-

,-Sperm morı.lojisi -+ -+

Bugün birçok ülkede kurulan mutajenite test

laboratuvarların-da ekosistemde bulunan, insan ve hayvanlar için büyük olasılıkla

mu-tajenik ve karsinojenik olan maddeler Tablo - 3'de gösterilen testlerin

biri veya birkaçı ile incelenmekte ve bu testlerde müsbet sonuç veren

örnekler yedirme deneylerine tabi tutularak karsinojenik karakterleri

incelenmektedir. Ülkemizde de bu tür çalışmalar yapacak bir

labora-tuvarın vakit geçirilmeden kurulmasının ins;:ın ve hayvan sağlığı

yö-n.ünden faydalı olacağı kanısındayız.

Literatür

1- Ames, B.N. (1971): The detection of chemical mutager,s with ente-ric bacteria. In A.Hollaender (Ed). Chemical Mutagens: Principle

and Mcthods for Thcir Detection. Acad.Press. New York, U.S.A.

I:267.

2- Ames, B.N., Lee, F.D., and Durston, W.E. (1973): An impro-:

ved bacteria! test system for the detection and classification of mutager,s and carcinogens. Proc.NatL.Acad.Sci.U.S.A. 70:782.

/

Eğrelti Otu ile Beslenen İneklerden Elde Edilen Sütün... 1<1:1

3- Ames, B.N. (I 979): Ideııtijjing emiromeııtal chemicals causııı/!,

mutatiolls and cancer. Scİencc, 204:587.

1.- Ames, B.N., MeCann, J., and Yamasaki, E. (1975): AletllOds for detecting carcinogens and mutagens with the salmonella Imammalian

microsome mutageııicity test. Mutation Res. 31 :347.

5- Anon. (I 978): Mutagenicity screening, general principle and minimal crileria. Report of a Committce of the European Envİromenta!

Mutagen Sodet)'.

6- Bridges, D.A. (1972): Simple bacterial S)ıstems for detecting

muta-genic agents. Lab.Pract. 21: 413.

7- Birano, K., Narui, K., Sadaie, Y., and Kada, T. (I978) :

Same improvements in the mutagenicity testing of chemicals with Bacillııs subtilis, Salmonella 0Phimurium ar.d Escherichia coli,o results with 500

chemicals. Mutation Res. 53 :200.

8- Kada, T., Tutikawa, K., and Sadaie, Y. (1972): In vitro mid

hosl mediated "Rec-Assay" procedure for screening chemicals mutagens and.phloxine, a mııtagenic reidj1edetected. Mutatİon Res. 16:165. 9- Kada, T. (I976): Rec-Assay with cold inCllbaıion with artd wiıhout

metabolic reocıivation in vitro. Mutation Res. 38 :340.

10- Kada, T., Birano, K., and Shirasu, Y. (1980): Screening of

eıwiroml'1llal elzemical mutagens hy ıhe Rec-Assay S)'stem with Bacillus subtilis. In Chemical Mutagens, Vo1.6.In Serres,

J.

F., and

Hol-laendel'; A. (Eds). Pknum Puhl. Col'p.New York, U.S.A. 149.

11- Pamukçu, A.M., Price, J.M., and Bryan, G. T. (1976a):

Natural!)ı occuring and hracken fem induced bovine bladder tumors. Vet.

Path. 13:1 ıo.

12- Pamukçu, A.M., Ertürk, E., Yalçmer, Ş., Milli, Ü., and Bryan, T.G. (1976b): Carcinogeı.ic acthity Qf milk .Fom brocken fan fed cows. Proc.Am.Assoc. Caneel' Res. 17:iıJ.

13- Pamukçu, A.M., Ertürk, E., Yalçmer, Ş., Milli, Ü., and

Bryan, T.G. (I978): Carcinogertic and mutagenic activity of milk .' from cows fed bracken fem. Caneel' Res. 38: 1.156.

, 14- Price, J.M., and Pamukçu, A.M. (1968): The inducıion of

neoplasms of the urinar.y blo£Ider of the cow and sınal! iıdesıine of the rat hyfeedirtg brackenfem. C ancer Res. 28: 224-7.