13. 206 (1983) 13. 206 (1983)
N i k o t i n a m i d A d e n i n D i n ü k l e o t i d İ n h i b i s y o n u n u n K o l e s t e r o l M e t a b o l i z m a s ı İ l e İ l i ş k i s i I . T o t a l K a n K o l e s t e r o l
S e v i y e s i n e E t k i s i
T h e Relation Between the Inhibition of Nicotinamide Adenin Dinucleotide a n d the Cholesterol M e t a b o l i s m I. Effects on
the B l o o d Cholesterol L e v e l Bilge (Uzalp) G Ö N Ü L *
G İ R İ Ş
B u n d a n önceki ç a l ı ş m a m ı z d a fare ve sıçanlarda nikotinamid adenin dinükleotid ( N A D ) inhibisyonu için 6-amino nikotinamid (6-AN) ile 6 - A N A D türevi oluşturma yöntemleri seçimi ve kontrolü gerçekleştirilmişti (16). B u ç a l ı ş m a m ı z d a N A D inhibisyonunun total k a n kolesterol miktarında ne gibi değişiklik yaptığı araştırılmış, N A D P m bedende kolesterol y a p ı m ve yıkımında oynadığı rol göz önüne alı-narak sonuçlar tartışılmıştır.
DENEYSEL K I S I M MATERYAL ve YÖNTEM
Deneylerde 15-25 g r a m ağırlığında yetişkin erkek fareler ( I C R ) ve 180-250 g r a m ağırlığında yetişkin erkek sıçanlar (Wistar rat) kul-lanıldı. Deney hayvanları onar ve beşerlik gruplar halinde 23 °C de
12 s a a t ışıklı, 12 saat karanlık tutulan havalandırmalı o d a d a pelet y e m ve suyla serbest olarak beslendiler.
Redaksiyona verildiği tarih: 6 Temmuz 1983
Deney hayvanları kontrol, mısır yağı, klofibrat, klofibrat-f 6-AN, 6-AN, nikotin a m i d ( N A ) , N A D , heksobarbital ve heksobar-bital + 6-AN g r u p l a r ı n a ayrılarak aşağıdaki d o z l a r d a u y g u l a m a yapıldı.
Farelere 200 mg/kg, sıçanlara 10,15 m g / k g d o z d a 6-AN ( S i g m a ) (3) ve 0.5 m m o l / k g klofibrat ( D İ F ) (9), çözücü olarak 1.2 ml/kg mısır yağı (Wako), kontrol a m a c ı y l a 13.25 m g / k g nikotinamid ve 72 m g / k g nikotinamid adenin dinükleotid IP yolla uygulandıktan 2 saat ve 20 s a a t sonra kan toplanarak Zak-Henly metodu (12) ile total kan kolesterolleri saptandı.
Bu a r a d a 6 - A N A D o l u ş u m u n u n kontrolü D o w e x kolondan ge-çirilen nükleotidlerin 260 nm deki UV absorbansına göre seçilen ör-nekleri ile n-propanol-amonyak-su ( 3 0 : 6 0 : 1 0 ) solvan sistemiyle ay-rılan ince t a b a k a k r o m a t o g r a m l a r ı n d a n , fluoresans aktiviteleri (4, 6, 12, 15, 16) ve alkol dehidrogenaz enzimi aktivitelerinin s a p t a n m a s ı ile yapılmıştır ( 1 , 13).
Ayrıca farelerde heksobarbital ( T K S ) u y u m a süresinin uzayıp u z a m a d ı ğ ı n a bakılarak (10, 11) diğer bir kontrol yöntemi de uygu-lanmıştır.
Deney sonuçları istatistiksel olarak "t testi" ile değerlendiril-miştir.
BULGULAR
D e n e y sonuçları 4 tablo halinde gösterilmiştir. T a b l o l a r d a veri-len kan kolesterol değerleri g r u p l a r a ait aritmetik ortalamalardır. Ç ö z ü c ü u y g u l a n a n gruplar kontrol grubu olarak kabul edilmiştir.
T a b l o I. K o n t r o l l a r ve çözücülerle 10 m g / k g 6-AN ile N A D inhibisyonu yapılmış yetişkin erkek sıçanlarda, u y g u l a m a d a n 20 saat sonraki total kan kolesterollerini ve istatistik değerlendirmelerini göstermektedir.
T a b l o I I . çözücü ve kontroller 2 saat, 6-AN ve N A D etkilerinin görülebilmesi için 20 s a a t önce uygulandığında yetişkin erkek sıçan-ların total kan kolesterol seviyelerini göstermektedir. Bu g r u p t a 6-AN 15 m g / k g olarak d a h a yüksek d o z d a uygulanmıştır.
Tablo I. NAD İnhibisyonunun Sıçanlarda Total Kan Kolesterol Miktarlarına Etkisi.
Grup
Denek Sayısı
Total Kan Kolesterol Miktarı mg/100 ml. A. Kontrol 4 104.5 B. Mısır yağı 1.2 ml/kg 4 89.75 0.02 > P > 0.01 (A-B) C. Klofibrat 0.5 mmol/kg 4 76.75 0.05 > P > 0.02 (B-C) D. Klofibrat + 6-AN 4 103.75 0.05 > P > 0.02 (B-D) E. 6-AN 10 mg/kg 4 111 0.1 > P > 0.05 (A-E) F. NA 13.25 mg/kg 5 102 0.3 > P > 0.2 (A-F)
Tablo II. NAD inhibisyonunun Sıçanlarda Total Kan Kolesterol Miktarlarına Etkisi.
Grup Denek Sayısı
Total Kan Kolesterol Miktarı mg/100 ml. A. Kontrol 7 105.9 B. Mısır yağı 9 137.44 P < 0.001 (A-B) C. Klofibrat 6 88.8 0.001 < P < 0.01 (B-C) D. Klofibrat + 6-AN 8 85.4 0.01 < P < 0.001 (A-D) P < 0.001 (B-D) E. 6-AN (15 mg/kg) 9 150.77 P < 0.001 (A-E) F. NAD 7 137.14 P < 0.001 (A-F) T a b l o I I I . K o n t r o l v e çözücülerle, 200 m g / k g d o z d a 6 - A N ile N A D inhibisyonununun 2 0 s a a t u y g u l a m a s o n u n d a yetişkin erkek farelerin k a n kolesterol seviyelerine etkilerini ve istatistik değerlendir-melerini göstermektedir.
T a b l o I V . 1 5 m g / k g d o z d a 6-AN u y g u l a m a s ı n ı n s ı ç a n l a r d a hek-sobarbital u y u m a z a m a n ı n a v e d o k u l a r d a k i hekhek-sobarbital miktarları-na etkileriyle istatistik değerlendirmelerini göstermektedir.
Tablo III. NAD İnhibisyonunun Farelerde Total Kan Kolesterol Miktarlarına Etkisi.
Grup Denek
Sayısı Total Kan Kolesterol Miktarı mg/100 ml.
A. Kontrol 5 140.2 B. Mısır yağı (12ml/kg) 6 143.83 C. Klofibrat 6 136.5 P = 0.6 (B-C) D. 6-AN 6 168.83 0.2 > P > 0.1 (A-D)
Tablo IV. NAD İnhibisyonunun Sıçanlarda Heksobarbital Uyuma Süresi ve Heksobar-bital Doku Seviyelerine Etkisi.
Kan
Hekso-Barbital Doku Heksobarbital Miktarı
Uyuma za- Miktarı Mg/gr
Grup manı (dk) Mg/ml Beyin Karaciğer Böbrek
12 46.5 17 41 43 Heksobar- 11 48 17.5 55 32 bital* 14 52.7 16 62 49 15 48 13 48 34 25 52.2 41 Ortalama 15.4 49.48 15.87 51.5 39.8 40 63.2 37.3 53 33 Heksobarbi- 21 56 40 61 32 tal-6-AN** 26.5 48 25 51 29 20.5 46 23 61 35 29 40 22 48 34 26 23 29 Ortalama 27.16 50.64 28.38 54.8 32 T test 0.02 > P > 0.7 0.02 > P > 0.5 0.05 > P > 0.01 P > 0.01 P > 0.02
* 100 mg/kg intraperitoneal tek doz uygulandı.
** 100 mg/kg IP heksobarbital ve bundan 18 saat önce 15 mg/kg dozda 6—AN, IP yoldan uygulanmıştır.
TARTIŞMA ve S O N U Ç
T a b l o l a r d a n da izlenebileceği gibi 6-AN uygulaması s o n u n d a N A D in inhibisyonu total k a n kolesterol seviyesini istatistiksel a ç ı d a n anlamlı olarak yükseltmektedir. Bu yükselme N A D inhibisyonu ile doğru orantılıdır ( T a b l o I , I I ) . B u etkinin o r g a n i z m a d a N A D v e N A D P sentezinde kullanılan nikotin a m i d yerine 6-AN gibi bir ana-loğu verilince N A D veya N A D P yerine 6 - A N A D v e 6 - A N A D P ile redükte formlarının oluşumu ve kolesterol biyosentez ve yıkımı olaylarında kullanılan N A D P 1ar yerini kompetitif a n t a g o n i z m a ile a l a rak hidrojen a t o m u akseptörü olarak görev y a p a m a y ı p bu b a s a m a k -l a r d a o-layı b-loke etmesi şek-linde o-labi-leceği ak-la yatkın gözükmek-tedir.
Deneylerde kontrol a m a c ı ile u y g u l a n a n klofibrat ve nikotina-mid beklendiği gibi uzun ve kısa sürelerde kan kolesterolünde d ü ş m e yapmıştır. 6-AN ile birlikte u y g u l a m a s o n u n d a N A D inhibisyonuna bağlı sonuçlara benzer yüksek bulgular kolesterol miktarındaki değiş-melerin bedendeki sentez veya yıkımın enzimatik inhibisyonla dur-ması nedeniyle diyetle alınan kolesterol birikimine bağlanabileceğini düşündürmektedir. N A D u y g u l a m a s ı n d a k i yükselme ise b a z ı neden-lerle yıkımdan çok sentez mekanizmasındaki artışa bağlı olabilir.
T a b l o I, I I , I I I de görüldüğü gibi klofibrat kan kolesterol se-viyesinde beklenildiği gibi d ü ş m e yapmıştır. Bir çok araştırıcının klo-fibratın etki mekanizması üzerine birbirine zıt görüşleri vardır. Örne-ğin; C A Y E N klofibratın o r g a n i z m a d a klofibrik aside dönerek etki gösterdiğini ve bu etkinin serbest y a ğ asitleri ve triasil gliserol y a ğ asitleri için V L D L sekresyonunu a z a l t m a şeklinde o l d u ğ u n u ileri sü-rerken, L A K E R diyetle uygulanan klofibratın klofibrik asitten d a h a etkili o l d u ğ u n u s a v u n m a k t a d ı r (2, 8 ) . W H İ T E ' a göre klofibrat, mik-rozomal H M G - C o A nın m e v a l o n a t reaksiyonunu önleyerek karaci-ğerdeki kolesterol biyosentezini inhibe eder (17). A n c a k yine L A K E R ' e göre klofibratla sıçan ve farelerde 18-24 s a a t içinde peroksizomal pro-liferasyon olur. Yanısıra mitokondrilerde de artış görülmektedir ( 8 ) . Peroksizom proliferasyonu oksitlenmiş p a h m t o i l - C o A artışıyla bera-berdir, bu da mitokondrial protein artışı ile birlikte olursa oksitlenmiş y a ğ açili-CoA, serbest y a ğ asitlerinin CO2 e oksitlenmesi ve resiprok olarak V L D L salınım ve csterifikasyonu ile ilgilidir. K a r a c i ğ e r d e
serbest y a ğ asiti esterifikasyonu azalmasıyla V L D L salınımındaki a z a l m a , bu yapının integral parçası olan kolesterolde de d ü ş m e ya-pacaktır. İşte L A K E R ' e göre klofibrat, serbest y a ğ asitlerinin karaci-ğer hücrelerine girip serum seviyesinin düşmesini s a ğ l a m a k t a d ı r .
Bu a r a d a klofibratın uzun ve kısa süreli u y g u l a m a sonuçlarının farklı olduğu da tesbit edilmiştir.
20 s a a t süreli deney sonuçlarımızdan da görülebileceği gibi N A D inhibisyonu klofibrat etkisini kaldırmaktadır. B u n a karşılık 2 s a a t süreli u y g u l a m a d a klofibrat etkisi ortaya çıkmaktadır. O r a l olarak klofibrat uygulamasını takiben birçok d o k u l a r d a 48 saate k a d a r iz-lenmiş ve genel olarak klofibrat seviyesinin 6 saatten sonra düşmeye başladığı, 12 saatte m i n i m u m a ulaşıp, 24 saatten sonra başlangıç de-ğerine ulaşarak yükselmeye d e v a m ettiği gözlenmiştir. (2) T a b l o I ve II ve klofibrat ve 6-AN birlikte u y g u l a m a sonuçlarında görülen fark önceden N A D inhibisyonu yapılmış deney hayvanlarında serum ve dokulardaki klofibrat seviyesi değişmelerinin de etkisiyle ortaya çıkabilir. Z i r a kontrollarda ve klofibrat deney g r u b u n d a süreye bağlı bir değişiklik gözlenmemektedir.
B u a r a d a T a b l o I V den d e görüldüğü gibi 6-AN uygulanmış h a y v a n l a r d a heksobarbital u y u m a süresi uzamış, beyin heksobarbi-tal seviyesi yüksek bulunmuştur. Bu güne k a d a r barbitüratlarla ya-pılmış a r a ş t ı r m a l a r a bakılırsa bu ilaçların sedasyon ve hipnoz oluş-turması kateşolamin d ö n g ü hızının a z a l a r a k biyojenik aldehit biri-kimine bağlanabilir. Bu da merkezi sinir sisteminde aldehit redük-tazların inhibisyonu ile sağlanabilir (9, 10, 14) S a t o h ve çalışma ar-kadaşlarına göre 6-AN ve hcksobarbitalin birlikte u y g u l a n m a l a r ı n d a oluştuğu varsayılan 6 - A N A D H (redükte 6-amino nikotinamid ade-nin diriükleotid), N A D H e bağımlı aldehit redüktazların inhibisyonu-na neden olmakta ve barbitürat inhibisyonuinhibisyonu-na eklenerek u y u m a resini uzatmaktadır. O halde T a b l o IV de görüldüğü gibi u y u m a sü-resinin istatistiksel a ç ı d a n anlamlı olarak u z a m a s ı ve yine beyin hek-sobarbital seviyesinin anlamlı olarak artmış olması, inhibisyonun ger-çekleştiğine dair bir kanıttır.
B u n u n yanısıra 6-AN u y g u l a n a n h a y v a n l a r d a paralizi ve v ü c u d ısısında d ü ş m e görülmüştür, bu gözlemler de diğer araştırıcıların
Sonuçların tümü birlikte değerlendirilecek olursa klofibratlı g r u p l a r d a dahil olmak üzere 6-AN u y g u l a m a s ı n d a oluşan hiperko-lesteroleminin nedeni 6 - A N A D ve 6 - A N A D P sentezlenerek koleste-rol biyosentez ve yıkımındaki b a s a m a k l a r d a N A D P lerin yerini kom-petitif a n t a g o n i z m a ile almasıdır, denilebilir. Z i r a bu şekli ile kofak-tör hidrojen a t o m u aksepkofak-törü olarak görev y a p a m a d ı ğ ı n d a n olay bu b a s a m a k l a r d a bloke olmaktadır. L i t e r a t ü r d e nikotinik asit veya ni-kotinamidin u y g u l a n m a s ı n d a serum kolesterol miktarının düştüğü-ne dair yayınlanmış bulgular da açıklamamızı desteklemektedir ( 5 ) .
Sıçanlar ve farelere ait sonuçlardaki doz-yanıt farklılıkları bu 2 türe ait enzimatik değişiklikler o l d u ğ u n u düşündürmektedir.
ÖZET
Yetişkin erkek sıçanlarda ve farelerde 6-aminonikotinamid uy-g u l a n a r a k Nikotinamid Adenin Dinükleotid ( N A D ) inhibisyonu ya-pılmıştır. D a h a sonra bu deneklerde inhibisyon olup olmadığı hek-sobarbital u y u m a z a m a n ı ve hekhek-sobarbital doku seviyeleri kontrol edilerek saptanmıştır. U y u m a z a m a n ı n ı n u z a m a s ı ve beyin hekso-barbital seviyesi artışı ile 6 - A N A D oluşumu gösterilen deney hayvan-larında klofibrat kontrol g r u b u ile karşılaştırılarak kan kolesterol se-viyeleri saptanmıştır. S o n u ç olarak N A D inhibisyonu yapılan deney hayvanlarında hiperkolesterolemi geliştiği görülmüştür. A n c a k bu a r a d a fare ve sıçanların N A D inhibisyonu sırasında doz-yanıt açı-sından farklılık gösterdikleri saptanmıştır.
SUMMARY
N i c o t i n a m i d e adenine dinucleotide ( N A D ) h a d been inhibited by the 6-amino nicotinamide (6-AN) administration to the adult m a l e rats a n d mice. T h e inhibition was controlled by the longering the sleeping time which was caused by hexobarbital and by the inc-reasing the hexobarbital level in the brain tissue. Meanwhile the blood cholesterol levels of the normal, clofibrate treated a n d 6-AN treated experimental animals groups were measured.
It has been demonstrated that the blood cholesterol levels were increased by N A D inhibition depending species.
L İ T E R A T Ü R
1- Bergmeyer, H.U., Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 4, 2. Ed., Verlag Chemie Weinheim Academic Press, Berlin, 1974.
2- Cayen, M.N., Ferdinandi, E.S., Greselin, E., Robinson, W.T., Dvornik, D.,
J.of Pharm.and Exp.Ther., 2oo, 1, 33, 1976.
3- Dietrich, L.S., Frieland, I.M., K a p l a n , L.A., J.Biol.Chem., 233: 4, 964-968, 1958. 4- Ewing, G.W., Instrumental Methods of Chemical Analysis, 4.Edit., Mc Graw-Hill
Book Comp., New York, 1975.
5- Hansten, P.D., Drug Interactions, 3. Edit., Lea and Febiger, Philedelphia, 1975. 6- Harvey, H., Anal.Biochem., 2g, 58, 1969.
7- Herken, H., Lange, K., Kolbe, H., Biochem.and Biophy.Research Com., 36: 1, 93-100, 1969.
8- Laker, M.E., Mayes, P.A., Biochem.Pharmacol., 28, 2813-2817, 1979.
9- M a y e r s , F., J a n e t z , E., Goldfien, A., Review of Medical Pharmacology, Lange Medical Publications, Los Altos, 1978.
10- Minegishi, A., Fukumori, R., Satoh, T., K i t a g a w a , H., Yanaura, S., Research
Com.in Chem.Path. and Pharm., 24; 2, May, 273, 1979.
11- Minegishi, A., Satoh, T., K i t a g a w a , H., Fukumori, R., J. Pharm.Dyn. 5, 42, 1982. 12- N a k a y a m a , M., Methods in Medical Chemistry, Tokyo University Press, Tokyo,
1978.
13- Roodyn, D.B., Automated Enzyme Assays, North Holland Publishing Coop., Ams-terdam, 1970.
14- Satoh, T., Fukumori, R., Minegishi, A., K i t a g a w a , H., Yanaura, S., Research
Com.in Chem.Path.and Pharm., 23: 2, February, 1979.
15- Udenfriend, E., Fluorescence Assay in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1962.
16- Uzalp, B., Ankara Ecz.Fak.Mec, 11: 2, 1981.
ve 358 sayılı Kararı ile Fakülte Mecmuasında yayınlanacak yazılar için tesbit edilen esaslar
1) Dergide, başka bir mecmuada aynı isimle ve aynı tarzda neşredilmemiş orijinal çalışmalar yayınlanır.
2) Yazılar Komisyona verildiği tarih sırasıyla yayınlanır.
3) Metin 15 daktilo sayfasını geçmemek üzere Türkçe veya yabancı dilde yazılabilir. Metin başlığı ve özeti Türkçe ve yabancı dilde yazılacaktır.
Yabancı dilde yazılmış başlık, metin ve özetlerin dil kurallarına uygun olmasının temini, yazara aittir.
4) Yazılar, kâğıdın bir yüzüne, daktilo ile ve normal aralıkla yazılmalı, italik yazı-lacak kelimelerin altı çizilmeli, klişesi yapıyazı-lacak grafik, şema, formül gibi şekiller, çini mürekkep ile, aydinger kâğıdına çizilmeli; fotoğraflar parlak kâğıda ve kontraslı olarak çekilmelidir. Şekillerin her biri ayrı kâğıtlarda olmalı ve kâğıdın üzerinde yazarın adı, kaçıncı şekil olduğu, resim altı yazılması istenen ibare kaydedilmelidir.
5) Yazı plânı aşağıdaki şekilde olmalıdır: Konunun takdimi, bulgular, denel kısım, münakaşa, Türkçe özet, yabancı dilde özet, literatür.
Konunun takdimi 2 daktilo sahifesini geçmemeli; materyal, metot ve yapılan ame-liyeler "denel kısım" da yer almalı, "münakaşa" kısmı, gerekli ise konmalıdır.
Literatür, metinde parentez içindeki numaralarla belirtilmesi ve metin sonunda bu numaralara uygun olarak sıralanmalıdır. Sırasıyla yazarın soyadı, adının ilk harfi, mec-muanın milletlerarası kullanılan kısaltılmış ismi, cilt numarası (italik), sayfa ve parentez içinde tarih yazılmalıdır.
6) Tashihler yazar tarafından yapılacaktır. 7) Yazara 50 ayrı baskı verilir.
