Cumhuriyet Üniversitesi, Di Hekimli i Fakültesi, A z, Di , Çene Hastal klar ve Cerrahisi Anabilim Dal , S%VAS. Erciyes Üniversitesi, Di Hekimli i Fakültesi, A z, Di , Çene Hastal klar ve Cerrahisi Anabilim Dal , KAYSER%. Gazi Üniversitesi, Di Hekimli i Fakültesi, A z, Di , Çene Hastal klar ve Cerrahisi Anabilim Dal , ANKARA.
EKTOP K OLARAK UYGULANAN DÜ ÜK DOZ REKOMB NANT
NSAN KEM
MORFOGENET K PROTE N -2’N N KEM K OLU UMUNU
BA LATICI ETK S N N DE ERLEND R LMES
EVALUATION OF OSTEOINDUCTIVE EFFECTS OF
LOW DOSE RECOMBINANT HUMAN BONE MORPHOGENETIC
PROTEIN-2 AT AN ECTOPIC SITE
lker ÖZEÇ Erdem KILIÇ Mustafa ÖZTÜRK Fahrettin GÖZE ÖZET
Amaç: Kas içine lokal olarak uygulanan 0.2µg rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2’nin kemik olu umunu ba lat c etkisinin de erlendirilmesi.
Gereç ve Yöntem: Çal mada sekiz adet Wistar albino rat kullan lm ve masseter kas içerisine 0.2µg rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2 jelatin sünger ta y c kullan larak implante edilmi tir. &mplantasyondan sonra birinci haftadan ba layarak 8 hafta boyunca osteoindüktif etki radyolojik ve histolojik olarak de erlendirilmi tir. Bulgular: Histolojik de erlendirme sonucunda rekombinant insan kemik morfogenetik protein-2/jelatin implant n kas dokusu içinde kemik olu umu sa lad görülmü tür. Ektopik olarak olu an kemik dokusu birinci ve ikinci haftalarda histolojik olarak gösterilebilirken, takip eden haftalarda gösterilememi tir. Radyolojik incelemede de kemik varl n n göstergesi olan radyoopak görüntüye sekiz hafta boyunca rastlanmam t r. Sonuç: Lokal olarak kas içine 0.2µg dozda uygulanan rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2’nin ektopik olarak yeterli osteoindüktif etkiyi gösteremedi i sonucuna var lm t r.
Anahtar kelimeler: Doku mühendisli i, rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2, ektopik kemik olu umu
SUMMARY
Purpose: To observe the osteoinductive effect of 0.2µg recombinant human bone morphogenetic protein-2 at an ectopic site.
Material and Methods: Gelatin sponge carrier with 0.2µg of recombinant human bone morphogenetic protein-2 was implanted into the masseter muscle in eight rats. The bone induction capacity was histologically and radiologically analyzed weekly for eight weeks after the implantations.
Results: Histologic examinations showed that recombinant human bone morphogenetic protein-2/gelatin implant resulted in active bone formation at the intramuscular site at 1 and 2 weeks, but no signs of bone formation was detected between 3 and 8 weeks. On radiological examination, there was no sign of opacity indicative of bone formation during eight weeks.
Conclusion: Recombinant human bone morphogenetic protein-2, at a 0.2µg dosage failed to show enough osteoinductive effect intramuscularly.
Key words: Tissue engineering, recombinant human bone morphogenetic protein-2, ectopic bone formation
G R
Kemik olu umu için morfogenetik uyar , kemik hücresine dönü ebilme kapasitesine sahip kök hücreler ve yeni olu an kemi e çat görevini yapacak
uygun ta y c matriks gereklidir.1Hücresel büyüme
faktörleri ve biyolojik yollar kullan larak kemik
olu turulmas doku mühendisli inin önemli bir
parças d r. Bu olay in vitro olarak serum, ta y c ve hücre kullan larak olu turulabilece i gibi in vivo olarak da konak dokusu, ta y c ve hücre kullan larak
olu turulabilmektedir.2
Rekonstrüksiyon uygulamas nda otojen greft kullan lmas , günümüzde alt n standart olarak kabul edilmektedir. Fakat otojen greft uygulamalar n n problemlerinden birisi baz vakalarda kar la lan verici saha yetersizli idir. Günümüzde bu problemin de çözümü olabilecek; doku mühendisli i ile ektopik olarak olu turulan kemi in rekonstrüksiyon uygulamalar nda
kullan labilmesi için çal malar yap lmaktad r.3
Kemik morfogenetik proteini ilk olarak 1965 y l nda Urist taraf ndan tan mlam t r. Kemik morfogenetik proteinler, transforming growth factor-D ailesi üyeleri
içinde bulunan büyüme ve farkl la ma faktörleridir. Günümüzde 15 adet kemik morfogenetik proteini tan mlanm t r. Bu proteinler aras nda osteoindüktif özelli i en fazla olan kemik morfogenetik proteini-2’dir.4-6
D ar dan organizmaya kemik morfogenetik proteini-2 uygulanarak, kemik olu umunun
tetiklenmesi ile kök hücrelerin ço almas ve
farkl la mas sa lanarak, yeni kemik hücreleri
olu turulabilmektedir. D ar dan uygulanan farkl la ma faktörü ile ba lat lan kemik olu turma i lemini, organizmada olu an yeni kemik hücreleri taraf ndan sal nan kemik morfogenetik proteinlerinin ve di er büyüme ve farkl la ma faktörlerinin devam
ettirdi i dü ünülmektedir.7-9
Kemik defektlerinin rekonstrüksiyonu için klinik kullan mda kemik morfogenetik proteini en umut verici biyomateryallerden birisidir. Bundan dolay osteoindüktif özelli i en güçlü olan kemik morfogenetik proteini-2’nin çe itli bölgelerde ve çe itli dozlarda kemik olu umunu
ba lat c özelliklerinin aç a ç kar lmas
önemlidir. Bu çal man n amac 0.2µg kemik morfogenetik proteini-2’nin jelatin sünger
ta y c kullan larak ektopik uygulanmas ile
olu an kemik olu umunu ba lat c özelliklerinin de erlendirilmesidir.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çal ma protokolü yerel etik kurul taraf ndan incelenmi ve onaylanm t r. Çal ma için 8 adet yakla k 10 haftal k ortalama 250 gram a rl nda Wistar albino rat kullan lm t r.
Kemik morfogenetik protein-2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.) tampon fosfatl serum fizyolojik kullan larak mikrolitrede 0.01µg rhBMP-2 konsantrasyonunda olacak ekilde haz rlanm t r. Jelatin sünger (Curaspon, Absorbable Gelatin Sponge, Netherlands) ta y c olarak kullan lm t r. Kemik morfogenetik protein-2 jelatin sünger implant n olu turulabilmesi için, 10x5x5mm boyutlar nda haz rlanan jelatin sünger üzerine haz rlanan solüsyondan 20µl eklenmi tir.
Deney hayvanlar n n anestezisi intramuskuler
ketamin (Ketalar, Eczac ba -Warner Lambert, %stanbul, Türkiye) 35mg/kg ve xylazine (Rompun 2%, Bayer, %stanbul, Türkiye) 5mg/kg kullan larak
sa lanm t r. Angulus mandibula bölgesinde bulunan deri t ra edilmi ve betadin kullan larak dezenfekte edilmi tir. Mandibulada 1cm uzunlu unda cilt insizyonu yap ld ktan sonra künt diseksiyon ile kas içerisinde jelatin sünger yerle tirilebilmesi için bir yer haz rlanm t r. Deney grubunda kemik morfogenetik protein-2/jelatin sünger masseter kas içerisine yerle tirilirken kontrol grubuna sadece jelatin sünger yerle tirilmi tir. Her hayvanda mandibula sa taraf deney grubunu olu tururken sol taraf kontrol grubunu olu turmu tur.
Operasyondan itibaren sekiz hafta boyunca her hafta bir deney hayvan sodyum pentobarbital overdoz olarak
uygulamas ile sakrifiye edilmi ve radyovizyografi
(CDR, Schick Technologies INC, New York, USA) kullan larak implantasyon yap lan bölgeden radyografiler elde edilmi tir. Takiben implantasyon yap lan bölge çevre doku ile birlikte ç kar larak %10 formalin ile fikse edilmi ve dekalsifiye edildikten sonra eksize edilen örnekler rutin prosedürler kullan larak parafin içerisine gömülmü tür. Seri olarak elde edilen kesitler hematoksilin eosin kullan larak boyanm ve k mikroskopu ile incelenmi tir.
BULGULAR
Genel olarak deney hayvanlar n n iyile mesinin sorunsuz oldu u görülmü tür. Postoperatif olarak beslenme zorlu u, infeksiyon veya kanama ile kar la lmam t r.
Resim 1. Birinci hafta; mezen imal hücre ço almasi ile birlikte baz
alanlarda olgunla mam kemik ve k k rdak dokusu (HE X 25)
Histolojik inceleme sonucunda deney grubunda birinci ve ikinci haftalarda yap lan de erlendirmelerde
ektopik kemik olu umu tespit edilmi tir. Üçüncü ve sekizinci haftalar aras nda yap lan de erlendirmede ektopik kemik olu umu gösterilememi tir. Birinci haftada yap lan de erlendirmede implant yerle tirilen bölgede mezen imal hücre ço almas ile birlikte baz alanlarda olgunla mam kemik ve k k rdak dokusu tespit edilmi , osteoblast ve kondroblast hücreleri görülmü tür (Resim 1). %kinci haftada yap lan de erlendirmede osteoblastlar ile çevrili trabeküler kemik olu umu ve k k rdak doku varl gözlenmi tir. Kemik olu umunun implant yerle tirilen bölgede birinci haftaya göre daha geni bir alan kapsad belirlenmi tir (Resim 2,3). Kontrol grubunda yap lan incelemede ektopik kemik olu umu tespit edilmemi tir. Yap lan de erlendirmede her iki grupta da yerle tirilen implantlara kar yabanc cisim reaksiyonuna rastlanmam ve ta y c olarak kullan lan jelatin süngerin rezorbe oldu u görülmü tür.
Resim 2. &kinci hafta; kas içi yeni kemik olu umu (HE X 25)
Resim 3. &kinci hafta; osteoblastlar ile çevrili trabeküler kemik
olu umu (HE X 50)
Sekiz hafta süresince yap lan radyolojik inceleme sonucunda deney grubunda ve kontrol grubunda radyolojik olarak bulguya rastlanmam t r (Resim 4).
TARTI MA
Kemik morfogenetik proteini-2 bütün kemik
morfogenetik protein ekilleri aras nda en yüksek osteoindüktif etkiye sahiptir. Bu çal mada da bu nedenden dolay kemik morfogenetik proteini-2 kullan lm t r. Kemik olu um miktar uygulanan kemik morfogenetik proteini-2 dozuna ba l d r ve farkl dozlar ile yap lan çal malar sonucunda; yüksek dozda uygulamalarda, dü ük doza göre
daha fazla yeni kemik olu tu u tespit edilmi tir.10-13
Resim 4. Radyografik görüntü; ikinci haftaya ait implant uygulanan
bölgede kemik olu umuna dair opasite görülmedi
Büyüme ve farkl la ma faktörleri günümüzde rekombinant teknoloji kullan larak istenilen miktarlarda
üretilebilmektedir, fakat fiyatlar pahal d r. Bundan
dolay minimal dozda faktör kullanarak, optimal etkinin elde edilmesi önemlidir ve optimal etkinin elde edilebilmesi için gerekli olan en dü ük miktara e ik doz ad verilmektedir. Kemik morfogenetik proteini-2'nin ektopik uygulamas nda optimal etki ise, istenilen miktarda kemi in minimal dozda faktör kullan larak olu turulmas d r. Bu çal mada elde edilen verilerden; 0.2µg rekombinant insan kemik morfogenetik proteini-2’nin osteoindüktif etkisinin, optimal etki elde etmek için gerekli olan e ik dozdan daha dü ük oldu u sonucu ç kar lm t r. Bu etki 8 hayvandan sadece 2’sinde (1/4 oran nda) olu turulabilmi tir.
Çal mam zda yap lan histolojik de erlendirme ile birinci ve ikinci haftalarda yeni kemik olu umu tespit
edilmi tir. Üçüncü haftadan sekizinci haftaya kadar olan dönemde 6 rat için kemik varl gözlenmemi tir.
Alpaslan ve ark.14ektopik olarak 20µg rekombinant
insan kemi i morfogenetik proteini-2 implante etmi ler ve 7-9 hafta içerisinde tam olarak olgunla m kemik olu umu tespit etmi lerdir.
Kusumato ve ark.15 intramuskuler olarak 50µg
rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2 kullanm ve histolojik olarak 4. haftada kemik ili i ihtiva eden yeni kemik olu umu görmü lerdir. Bu çal malarda kullan lan rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2 dozu bizim çal mam zda kulland m z doza göre 100 kat ve 250 kat daha fazlad r. Bu sonuçlara göre çal mam zda
uygulad m z rekombinant insan kemi i
morfogenetik proteini-2 miktar (0.2µg) optimum kemik olu umunu ba lat c etkisini 1/4 oran nda göstermi tir.
Kemik olu umu için d ar dan uygulanan kemik
morfogenetik proteini-2 bir süre sonra ortamdan uzakla makta ve kemik olu umu kök hücrelerden farkl la an yeni osteojenik hücreler taraf ndan, organizman n kendi salg lad proteinler ile devam
ettirilmektedir. Çal mam zda üçüncü ve sekizinci
haftalar aras nda kemik olu umunun gösterilememesi; d ar dan uygulanan kemik morfogenetik proteini taraf ndan yeterli derecede osteoindüktif etki olu turulamamas na ba l olarak yeterli osteojenik hücre farkl la mas n n olu mamas ve bundan dolay da organizmadan sal nan büyüme ve farkl la ma faktörlerinin kemik olu um basamaklar n n devam
ettirilmesi için yeterli olamamas olarak
aç klanabilir.16-18
Kemik morfogenetik proteini solüsyon olarak etki gösterebilmektedir, fakat ta y c ile birlikte uyguland zaman daha az miktarda kemik morfogenetik proteini kullan larak daha fazla miktarda kemik elde edilebilmektedir. Kemik morfogenetik proteini için birçok materyal ta y c olarak kullan lm ve yap lan çal malar sonucunda kollagenin ta y c olarak iyi özellikler gösterdi i belirlenmi tir. Jelatin kollagen yap s ndad r, kollagenin parsiyel olarak hidrolize edilmesi ile elde edilmektedir ve kemik morfogenetik proteini
uygulamalar nda ta y c olarak kullan lmaktad r.3,19-22
Bu çal mada da ta y c olarak jelatin sünger kolay elde edilebilmesi, rezorbe olabilmesi ve sitotoksik
olmamas ndan dolay tercih edilmi tir. Kollagen
osteokondüktif özelli i olan bir materyaldir ve kemik morfogenetik protein ile birlikte uyguland bölgede bu özelli i ile kemik olu umuna kat lmaktad r. Ektopik bölgede osteoindüktif özellik olmadan sadece osteokondüktif özelli i olan bir materyalin ektopik kemik olu turmas mümkün de ildir. Kontrol grubunda
kemik olu umuna rastlanmamas da bu bilgiyi
do rulamaktad r.
SONUÇ
Sonuç olarak, 0.2µg rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2’nin ektopik bölgede kemik dokusu olu turacak yeterli osteoindüktif etkisinin ratlar n ancak 1/4’ünde ortaya ç kt görülmü tür. Ektopik olarak kemik olu turulabilmesi için gerekli olan minimal d ar dan uygulanacak rekombinant insan kemi i morfogenetik proteini-2 miktar n n belirlenmesi üzerine ba ka çal malar n da yap lmas gerekmektedir.
KAYNAKLAR
1. Reddi AH. Symbiosis of biotechnology and biomaterials:
Applications in tissue engineering of bone and cartilage. J Cell Biochem 1994; 56: 192-5.
2. Ahsan T, Nerem RM. Bioengineered tissues: The science, the
technology, and the industry. Orthod Craniofac Res 2005; 8: 134-40.
3. Inoda H. rh-BMP2-induced ectopic bone for grafting critical size
defects: A preliminary histological evaluation in rat calvariae. Int J Oral Maxillofac Surg 2006; doi: 10.1016/j.ijom. 2006.07.011.
4. Schilephake H. Bone growth factors in maxillofacial skeletal
reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg 2002; 31: 469-84.
5. Özeç %, Öztürk M, K l ç E, Yeler H, Göze F, Gümü C. Effect of
recombinant human bone morphogenetic protein-2 on mandibular distraction osteogenesis. J Craniofac Surg 2006; 17: 80-3.
6. Özeç %, Yeler H. Bone morphogenetic proteinler ve
osteoindüksiyon. CÜ Di Hek Fak Derg 2003; 6: 31-6.
7. Okubo Y, Bessho K, Fujimura K, Konishi Y, Kusumoto K, Ogawa
Y, Lizuka T. Osteoinduction by recombinant human bone morphogenetic protein-2 at intramuscular, intermuscular, subcutaneous and intrafatty sites. Int J Oral Maxillofac Surg 2000; 29: 62-6.
8. Groeneveld EH, Burger EH. Bone morphogenetic proteins in
human bone regeneration. Eur J Endocrinol 2000; 142: 9-21.
9. Peel SA, Hu ZM, Clokie CM. In search of the ideal bone
morphogenetic protein delivery system: In vitro studies on demineralized bone matrix, purified, and recombinant bone morphogenetic protein. J Craniofac Surg 2003; 14: 284-91.
10. Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, Cordes P,
Harada T, Israel DI, Hewick RM, Kerns KM, LaPan P. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 2220-4.
11. Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, Wozney JM, Yamashita K. Bone
morphogenetic protein-2 stimulates in cultured osteoblastic cells, MC3T3-E1. Biochem Biophys Res Commun 1991; 174: 96-101.
12. Fujimura K, Bessho K, Kusumoto K, Ogawa Y, Lizuka T.
Experimental studies on bone inducing activity of composites of atelopeptide type I collagen as a carrier for ectopic osteoinduction by rhBMP-2. Biochem Biophys Res Commun 1995; 208: 316-22.
13. Aspenberg P, Turek T. BMP-2 for intramuscular bone
induction: effect in squirrel monkeys is dependent on implantation site. Acta Orthop Scand 1996; 67: 3-6.
14. Alpaslan C, Irie K, Takahashi K, Ohashi N, Sakai H, Nakajima
T, Ozawa H. Long-term evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 induced bone formation with a biologic and synthetic delivery system. Br J Oral Maxillofacial Surg 1996; 34: 414-8.
15. Kusumoto K, Bessho K, Fujimura K, Ogawa Y, Lizuka T.
Intramuscular osteoinduction and bone marrow formation by the implantation of rhBMP-2 with atelopeptide type I collagen. Br J Oral Maxillofac Surg 1997; 35: 433-7.
16. Reddi AH, Ma SS, Cunningham NS. Induction and
maintenance of new bone formation by growth and differentiation factors. Ann Chir Gynaecol 1988; 77: 189-92.
17. Canalis E, McCarthy TL, Centrella M. The role of growth
factors in skeletal remodeling. Endocrinol Metab Clin North Am 1989; 18: 903-18.
18. Reddi AH, Muthukumaran N, Ma S, Carrington JL, Luyten FP,
Paralkar VM, Cunningham NS. Initiation of bone development by osteogenin and promotion by growth factors. Connect Tissue Res 1989; 20: 303-12.
19. Peel SA, Hu ZM, Clokie CM. In search of the ideal bone
morphogenetic protein delivery system: In vitro studies on demineralized bone matrix, purified, and recombinant bone morphogenetic protein. J Craniofac Surg 2003; 14: 284-91.
20. Bessho K, Kusumoto K, Fujimura K, Konishi Y, Ogawa Y, Tani
Y, Lizuka T. Comparison of recombinant and purified human bone morphogenetic protein. Br J Oral Maxillofac Surg 1999; 37: 2-5.
21. Urist MR, Lietze A, Dawson E. Beta-tricalcium phosphate delivery
system for bone morphogenetic protein. Clin Orthop 1984; 187: 277-80.
22. Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, Cordes P,
Harada T, Israel DI, Hewick RM, Kerns KM, LaPan P. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 2220-4.
Yaz<=ma Adresi:
Yard. Doç. Dr. %lker ÖZEÇ Cumhuriyet Üniversitesi Di Hekimli i Fakültesi
A z, Di , Çene Hastal klar ve Cerrahisi Anabilim Dal 58140 Kampüs / S%VAS
Tel: 0 346 2191010 / 2784 Faks: 0 346 2191237
