Gen Kaynaklarının ve Biyoçeşitliliğin Korunması Kapsamında Yerli At
Irklarının Genetik Karakterizasyonu
Soner AKSU Diğdem AKTOPRAKLIGİL Evren KOBAN Özgür ASLAN
Melis DENİZCİ Koray BALCIOĞLU Aylin ÖZDEMİR BAHADIR Berrin ERDAĞ
Haydar BAĞIŞ Sezen ARAT*
TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü, Gebze/Kocaeli, TÜRKİYE
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 12.12.2009
e-posta: sezen.arat@mam.gov.tr Kabul Tarihi : 18.01.2010
Özet
Hayvan genetik kaynaklarımız günümüz çevresel ve ekonomik koşulları nedeniyle hızla azalmaktadır. Sahip olduğumuz genetik çeşitliliğin korunması amacıyla TÜRKHAYGEN-I projesi ile yerli evcil hayvan genetik kaynaklarının moleküler karakterizasyonu ve in vitro korunmasına yönelik çalışmalar başlatılmıştır. Projede yer alan Hınıs’ın Kolu Kısası, Canik, Çukurova, Malakan ve Ayvacık Midillisi at ırkları için 12 ilde 11 saha çalışması gerçekleştirilmiştir. Örneklenen at ırkları mtDNA D-loop bölgesi dizi analizi ve 21 otozomal mikrosatelit DNA işareti kullanılarak genetik olarak karakterize edilmiştir. mtDNA dizi analizi sonucunda 68 polimorfik bölge tespit edilmiş olup, 151 haplotip (Haplotip çeşitliliği, Hd: 0,9866±0,0017, nükleotid çeşitliliği, Pi: 0,021±0,00036, ve ortalama nükleotid farklılığı, k: 8,006) belirlenmiştir. Median-Joining network analizi, tespit edilen haplotiplerin ırka özgü dağılım göstermeyen 54 haplogrup oluşturduğunu göstermiştir. Benzer olarak Kimura 2-parametre kullanılarak çizilen komşu birleştirme (NJ) ağaç çiziminde de ırka özgü dallanma belirlenememiştir. Hesaplanan Fıs değerleri ise tüm populasyonlar için Hardy-Weinberg dengesinden anlamlı bir sapma olmadığını göstermiştir. Diğer çiftlik hayvanlarına göre at populasyonlarının daha serbest olması, yayılım alanlarının hızlı değişkenlik göstermesi, kontrolsüz hayvan hareketleri at ırklarımızın genetik olarak birbirleri ile karışmasına neden olmaktadır. Mevcut durum, çevresel ve sosyo-ekonomik baskılara karşı yerli at ırklarımızın korunabilmesi için bilinçli bir koruma programının gerekliliğini ortaya koymaktadır.
Anahtar Kelimeler: Genetik karakterizasyon, genetik çeşitlilik, mtDNA, mikrosatelit DNA işareti, TÜRKHAYGEN-I
Abstract
Nowadays, animal genetic resources are rapidly decreasing due to environmental and economic conditions. In order to protect genetic diversity that we have, the molecular characterization of domestic animal genetic resources and in vitro conservation studies have been initiated by the TURKHAYGEN-I project. During this project, 11 fieldwork was carried out in 12 different geographical regions for selected horse breeds, which are Hınıs, Malakan, Canik, Çukurova Horses and Ayvacık Pony. Sampled individuals have been characterized by using 21 autosomal microsatellite markers and mtDNA D-loop region seqeuence analysis. According to mtDNA sequence analysis, 68 polymorphic sites and 151 haplotypes (haplotype diversity (Hd)): 0,9866±0,0017, nucleotide diversity (Pi): 0,021±0,00036 and average number of nucleotide differences (k): 8,006) were identified among populations. Median-Joining network analysis revealed 54 different haplogroups having non-breed-specific distribution profile. Similarly, breed-specific branching on neighbor joining (NJ) tree drawing by Kimura 2-parameter have not been observed. Calculated Fıs values did not indicate the meaningful deviation from Hardy-Weinberg equilibrium for any populations. More dynamic population structure of horse breeds compared to other livestock animals, highly changable territories and uncontrolled animal movements cause genetic mixing of Anatolian native horse populations. Current status shows the requirements of a conscious conservation programs to protect our native horse breeds against the environmental and socio-economic pressures.
Keywords: Genetic characterization, genetic diversity, mtDNA, microsatelllite markers, TURKHAYGEN-I
GİRİŞ
İnsanoğlunun ihtiyaçlarını karşılamak için çevresindeki varlıkları fark etmesi ve onlardan yararlanmaya çalışması toplumsal ve sosyal evrimi harekete geçiren en önemli etkenlerden birisidir. Bu çerçeveden bakıldığında insanların yaklaşık 12.000 yıldan beri atadan kalma evrimsel mirasa bilinçli bir şekilde yön verdikleri söylenebilir [1]. Bu sürecin en önemli sonucu ise günümüzde çiftlik hayvanları olarak adlandırdığımız hayvanların evcilleştirilmesi olarak kabul edilebilir. Atlar ise bu süreç içerisinde en erken
evcilleştirilen hayvanlardan birisi olup insanlık ve medeniyet tarihinde önemli bir rol üstlenmişlerdir [2].
Avrasya bozkırlarında 6000 yıl öncesine tarihlenen arkeolojik alanlarda at kalıntılarına sıkça rastlanması atın evcilleştirilme yeri ve zamanı olarak bu verilerin kabul görmesine neden olmaktadır [3,4,5]. Bununla birlikte atların yaban populasyonlarından evcilleştirilmesine dair iki hipotez öngörülmektedir. Sınırlı köken hipotezi, evcil atların az sayıda odak için seçici yetiştiricilikten köken aldığını önerir. Sonrasında, evcil atlar diğer bölgelere yayılmıştır. Diğer çoklu köken senaryosunda ise atlar çeşitli yaban populasyonlardan bağımsız
olarak ele geçirilerek artan şekilde tutsak olarak yetiştirilmiş ve bu süreçte yaban at sayısı azalmıştır. Bu iki hipotez maternal kalıtım gösteren mitokondriyal DNA (mtDNA)’daki genetik varyasyonlar açısından belirgin tahminlerde bulunur. Sınırlı köken hipoezine göre, mitokondriyal çeşitlilik az sayıda kurucu hatla ve bunlara eklenen mutasyonlarla sınırlıdır. Aksine çoklu köken hipotezi genetik çeşitliliğin tipik olarak tek bir yaban populasyonunda bulunandan daha fazla olması gerektiğini önerir [6].
Günümüzde ise artık insanoğlunun farklı ihtiyaçlarına cevap verecek şekilde programlı ıslah stratejileri ile geliştirilmiş ve farklı karakterler açısından üstün özelliklere sahip çok sayıda ırk ortaya konmuştur. Bilindiği üzere bir canlının belirli bir özellik açısından yapay seçilime tabi tutulması o ırkın sahip olduğu genetik çeşitliliğin azalmasına ve genetik homojeniteye neden olmaktadır [7]. Bu ise istenen özellik dışında diğer önemli karakterler açısından söz konusu ırkın zayıflanmasına, özellikle değişen çevresel şartlar ve hastalık dirençliliği gibi konularda önemli bir tehdit altında kalmasına neden olmaktadır. Günümüzde yaşanan küresel iklim değişikliği ise ekonomik ve tarımsal öneme sahip hayvan ırklarının adaptasyonu ve verimliliklerinin korunması açısından durumu daha da kritik bir hale getirmektedir. Aksine tek bir karakter açısından programlı seçilime tabi tutulmamış yerli ırklar ise sahip oldukları ve korunan genetik çeşitlilik ile bir gen havuzu vazifesini görmektedir. Bu havuz hem günümüz hem de ileri ki yıllarda ortaya çıkacak çevresel şartlar karşısında avantaj sağlayabilecek hayati varyasyonları barındırır. Bu varyasyonların tamamen kaybedilmesinin hayvan varlığı ve hayvancılık açısından telafi edilemez sonuçları olabileceği ve bundan dolayı yerli ırkların mevcut genetik yapıları ile korunmasının gerekliliği son yıllarda tüm dünyada kabul gören güncel bir konudur. Bu bağlamda pek çok ülkede uzun vadeli stratejik çalışmalar hayata geçirilmiştir [8]. Ülkemizde ise bu çerçevede 2007 yılından itibaren Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, TÜBİTAK ve çeşitli üniversitelerin katılımıyla TÜBİTAK KAMAG tarafından desteklenen TÜRKHAYGEN-I projesi ile yerli evcil hayvan genetik kaynaklarının moleküler karakterizasyonu ve in vitro korunmasına yönelik çalışmalar başlatılmıştır. Bu kapsamda, sığır, keçi, koyun, manda türlerinin yanı sıra, Hınıs’ın Kolu Kısası (HKK), Canik (CNK), Çukurova (ÇKR), Malakan (MLK) ve Ayvacık Midillisi (AMD) yerli at ırklarımız projeye dahil edilmiştir. Anadolu sahip olduğu coğrafik konum nedeniyle pek çok medeniyete ev sahipliği yapmış olup, tarih boyunca hem insanların hem de diğer canlıların göç hareketlerine maruz kalmıştır. Dolayısıyla Anadolu coğrafyası medeniyet tarihi boyunca populasyonların kesişip kaynaştığı nadir bölgelerden birisidir. Bu nedenle Anadolu atlarının genetik açıdan mozaik bir yapıya sahip olduğu ve önemli bir genetik miras taşıdıkları düşünülmektedir.
Bu çalışmada, söz konusu yerli at ırklarının
mikrosatelit lokus ve mtDNA D-loop dizilerine dayanarak ilk defa genetik açıdan karakterize edilmesi amaçlanmıştır. Bu moleküler belirteçler ile elde edilen bilgiler, yerli ırklarımızın sahip olduğu genetik çeşitliliğin ortaya konmasına, atların evcilleştirilmesi sürecinin aydınlatılmasına ve bilinçli koruma programlarının ortaya konmasına katkıda bulunacaktır. Genetik karakterizasyon koruma çalışmaları kapsamında ırkların bütünlüğünün sağlanması için önemli olup, genetik kaynakların yönetiminde bir gerekliliktir [9]. DNA belirteçleri bu amaca hizmet etmek üzere sıkça kullanılan araçlardır. Maternal kalıtım gösteren mtDNA’nın, çekirdek DNA’sına kıyasla yüksek mutasyon oranına sahip olması ve genetik varyasyonun çoğunlukla tek baz değişikliklerine dayanması, mtDNA’yı filogenetik çalışmalar için oldukça yararlı kılmaktadır. mtDNA genomunun D-loop bölgesi (kontrol bölgesi) en çok varyasyon gösteren kısım olup, filogenetik ve populasyon genetiği çalışmalarında yoğunlukla bu bölgeye odaklanılmaktadır. Bundan dolayı, D-loop bölgesi evcil atların kökeninin ve çeşitliliğinin anlaşılmasında [6,10] ırk içi ve ırklar arasındaki genetik ilişkilerin incelenmesinde [11,12,13,14,15,16] önemli bir araç olarak kullanılmıştır. Aynı şekilde mikrosatelit lokuslar da yüksek düzeyde değişkenlik gösterirler ve buna ilave olarak tüm genoma dağılmış halde bulunurlar. Bu iki özellik de onları populasyonların sahip oldukları evrimsel geçmiş ve ilişkilerin ortaya konmasında cazip hale getirmektedir. Bu nedenlerden dolayı anne-baba ilişkilerinin ortaya konmasında ve atların genotiplendirilmesinde [11,17] mikrosatelit DNA analizi standart bir tekniktir ve at popülasyonlarının evrimsel ilişkilerinin ortaya konmasında artarak kullanılmaktadır [18,19,20,21,22,23].
MATERYAL VE YÖNTEM
Saha Çalışmaları ve At Irkları
TÜRKHAYGEN-I projesi kapsamında 5 at ırkının genetik karakterizasyonu ve korunmasına yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Çalışmaya dahil edilen ilk beş at ırkı Hınıs’ın Kolu Kısası, Malakan Atı, Çamardı Kulası, Uzunyayla Atı ve Canik Atı şeklinde belirlenmiştir. Fakat yapılan ilk saha çalışmaları sonucunda Çamardı Kulası ve Uzunyayla Atı’nı temsil eden yeteri kadar birey bulunamadığından bu ırklar projeden çıkarılarak yerlerine Ayvacık Midillisi ve Çukurova Atı dahil edilmiştir. Söz konusu ırklara ait bireylerin toplanması için toplam 11 saha çalışması gerçekleştirilerek her ırk için en az 50 birey örneklenmiştir. Yapılan ön çalışma ile projede yer alan atların bulunma olasılıkları en fazla olan coğrafik bölgeler tespit edilmiş ve saha çalışmaları bu alanlarda köy köy gezilerek gerçekleştirilmiştir. Arazi çalışmaları Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’nın adı geçen bölgelerdeki İl ve İlçe Tarım Müdürlükleri ile iş birliği çerçevesinde gerçekleştirilmiştir. Saha çalışmalarının yerleri il ve ilçe bazında olmak üzere Çizelge 1’de verilmektedir.
DNA İzolasyonu
Örneklenen her bireyden 10 ml’lik EDTA’lı tüpler kullanılarak kan örnekleri toplanmıştır. DNA izolasyonu sırasında olabilecek herhangi bir olumsuzluğa karşı her bireyden en az 2 tüp kan örneği alınmıştır. Kan örneklerinden DNA izolasyonu standart fenol:kloroform:isoamil alkol ekstraksiyonu ile gerçekleştirilmiştir [24]. İzole edilen DNA örnekleri %1’lik agaroz jelde yürütülüp görüntülenmiştir (Ingenius jel dökümantasyon sistemi, Syngene, Maryland. USA). NanoDrop 1000 spektrofotometre (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) kullanılarak DNA örneklerinin miktar ve kalite tayinleri gerçekleştirilmiştir.
mtDNA Dizi Analizi
Elde edilen DNA örnekleri kullanılarak mtDNA D-loop bölgesinin 479 bç’lik kısmı ileri
(5’-CCCAAGGACTATCAAGGAAG-3’) ve geri
(5’-GGAATGGCCCTGAAGAAAGA-3’) primerler
kullanılarak PZR ile çoğaltılmıştır. Bunun için toplam 25 µl hacim içinde olmak üzere 2,5 µl 10X PCR Buffer, 2,5 µl MgCl2 (25 mM), 0,5 µl dNTP mix
(10 mM), 1 µl F ve R primer karışımı (10 pmol), 50-100 ng kalıp DNA, 0,1 µl Taq DNA polimeraz (5 U/ µl) kullanılmıştır. Uygulanan PZR protokolü ise şu şekildedir; 94ºC’de 3 dakika denatürasyon; 94ºC’de 20 saniye, 58ºC’de 20 saniye ve 72ºC’de 1 dakika olmak üzere ardışık 30 döngülük çoğaltım safhası ve 72ºC’de 10 dakika son uzama safhası. PZR ürünlerinin bir kısmı yeterli çoğaltımın olup olmadığının kontrolü için %1’lik agaroz jele yüklenerek görüntülenmiştir. Yeterli çoğaltım sağlanan örneklerin tamamı %1’lik agaroz jelde yürütülerek dizi PZR işleminde kalıp olarak kullanılmak üzere agaroz jelden saflaştırılmıştır. Bunun için “Agarose Gel Extraction Kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany)” kullanılmış olup, kitin kullanım kılavuzunda tavsiye edilen protokol uygulanmıştır. Saflaştırılmış PZR ürünleri kalıp olarak kullanılarak floresan işaretli nükleotidler kullanılmak suretiyle dizi PZR işlemi gerçekleştirilmiştir. Dizi reaksiyonları “Beckman Coulter GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)” kullanılarak kurulmuş ve kit ile önerilen PZR protokolü
uygulanmıştır. Yine aynı kitin kullanım kılavuzunda tavsiye edilen protokol doğrultusunda dizi PZR ürünleri temizlenip çöktürülmüştür. Son olarak örnekler 40 µl “Sample Loading Solution (SLS)” ile çözüldükten sonra Beckman Coulter CEQ 8800 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) kullanılarak ileri ve geri primerler ile her iki yönden DNA dizi okumaları gerçekleştirilmiştir.
Mikrosatelit DNA Analizi
Mikrosatelit DNA işaretleri kullanılarak gerçekleştirilen genotiplendirme çalışmalarında toplam 21 otozomal lokus analiz edilmiştir. Bu lokusların hepsi literatürde yoğun olarak kullanılan ve atlar için International Society of Animal Genetics (ISAG) tarafından önerilen ebeveyn test listelerinde yer alan lokuslardır. 21 lokus 3 çoklu PZR grubu oluşturularak kullanılmıştır. 9’lu grup I18, AHT4, LEX33, COR02, HMS5, HMS6, ASB2, HTG6, HMS3 ve 5’li grup ASB43, AHT33, HMS2, NEVHEQ79, UCDEQ425 lokuslarından oluşmaktadır. Bu iki çoklu PZR grubu için uygulanan PZR protokolü ise şu şekildedir; 25 μl toplam hacim içerisinde olmak üzere, 30-50 ng genomik DNA, 0,2-0,8 pmol ileri ve geri primer, 1X PZR Buffer, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs ve 0,3U Taq DNA polimeraz. 7’li
grup ise ASB17, ASB23, TKY301, HMS7, HTG4, VHL20, COR58 lokuslarından oluşup, bu grup için uygulanan PZR protokolü ise şu şekildedir; 15 μl toplam hacim içerisinde olmak üzere 30-50 ng genomik DNA, 0.1-1 pmol ileri ve geri primer, 0,2 µl BSA, 1X PCR buffer, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs ve 0,2U Taq
DNA polimeraz. Birinci ve ikinci çoklu PZR grupları için uygulanan PZR programı, 95°C ‘de 2 dakika denatürasyon, 30 döngü olmak üzere 94°C ‘de 30 saniye, primerlere özgü bağlanma sıcaklığında 45 saniye bağlanma aşaması ve 72°C’de 1 dakika uzama aşaması, 72°C’de 20 dakika son uzama şeklinde gerçekleştirilmiştir. Üçüncü çoklu PZR grubu için uygulanan PZR programı ise; 95°C’de 3 dakika denatürasyon, 35 döngülük çoğaltım aşaması için 94°C’de 20 saniye, 1 dakika primerlere özgü bağlanma sıcaklığında bağlanma aşaması, 50 saniye 72°C’de uzama ve 1 döngü olmak üzere 72°C’de 20 dakika son uzama şeklinde gerçekleştirilmiştir.
Irk İl İlçe/Belde
Hınıs’ın Kolu Kısası Erzurum Hınıs, Çat
Malakan Atı Kars Arpaçay, Susuz
Ağrı Aşkale, Tutak
Iğdır Melekli, Karakoyunlu
Ardahan Göle
Van Çaldıran, Saray, Özalp
Canik Atı Samsun Çarşamba, Terme, Ayvacık, Salı Pazarı
Çukurova Atı Adana Ceyhan, Kozan, Feke, Saimbeyli
Osmaniye Merkez
Ayvacık Midillisi Çanakkale Ayvacık
Elde edilen örnekler Beckman Coulter CEQ8800 Genetic Analysis System kullanılarak fragman analizine tabi tutulmuştur. Bunun için floresan işaretli 1 µl PZR ürünü 0,2 µl “CEQ Size Standart 400” ve 30 µl SLS ile karıştırılarak sisteme yüklenmiş ve okuma sonuçları fragman analiz modülü kullanılarak analiz edilmiştir.
BULGULAR
Gerçekleştirilen saha çalışmaları ile örneklenen 64 adet Canik atı, 58 adet Hınıs’ın Kolu Kısası, 47 adet Ayvacık Midillisi, 60 adet Çukurova atı ve 33 adet Malakan atına ait mtDNA dizi ve fragman analizi sonuçları farklı populasyon genetiği analiz programları kullanılarak analiz edilmiştir. mtDNA dizi analizi sonucunda tüm populasyonlar arasında toplam 68 polimorfik bölge tespit edilmiş olup, 151 haplotip (Haplotip çeşitliliği, Hd: 0,9866±0,0017, nükleotid çeşitliliği, Pi: 0,021±0,00036, ve ortalama nükleotid farklılığı, k: 8,006) belirlenmiştir. Tüm ırklar genelinde hiçbir populasyonda ırka özgü sabitlenmiş mutasyona rastlanmamıştır. Fakat, populasyonların ikili karşılaştırmalarında AMD ve HKK arasında 21, AMD ve CKK ile AMD ve MLK
ırkları arasında ise 20’şer adet ırka özel mutasyon tespit edilmiş olup, bunlar tüm ikili karşılaştırmalar arasında tespit edilen en yüksek rakamlardır. Buna bağlı olarak, yine ırklar arası ikili karşılaştırmalar sonucu ortalama nükleotid farklılığının (k) 9,150 ile yine en yüksek AMD ile MLK ırkları arasında olduğu belirlenmiştir (Çizelge 2). Elde edilen mikrosatelit veriler, çalışmaya konu olan ırklar düzeyinde 21 farklı alel sayısı ile ASB17’nin en fazla, 6 alel sayısı ile HMS5 ve COR2 lokuslarının en düşük alel sayısına sahip olduklarını göstermiştir. Bunun yanı sıra incelenen lokuslar için tespit edilen alel ortalamasının 4,4 ile 13,0 arasında, tüm lokuslar dahilinde populasyonlar için gözlenen ortalama alel sayılarının ise 8,8 ile 9,7 arasında değiştiğini göstermektedir.
Nei’nin heterozigotluk tahminine göre hesaplanan gözlenen (Ho) ve beklenen (He) heterozigotluk değerleri incelenen hiçbir lokus için anlamlı derecede Hardy-Weinberg dengesinden sapmayı işaret etmemektedir. Hesaplanan Fıs değerleri ise Nei’nin heterozigotluk değerleri ile uyumlu olarak populasyonlar seviyesinde Hardy-Weinberg dengesinden anlamlı bir sapmanın olmadığını göstermektedir (Çizelge 3).
İncelenen populasyonlar için hesaplanan Fst değerleri
Populasyon 1 Populasyon 2 Mutasyon Sayısı Populasyonlar Arası Ortalama Nükleotid Farklılığı (k)
CNK HKK 49 8,169 CNK AMD 51 8,571 CNK ÇKR 51 8,100 CNK MLK 53 8,050 HKK AMD 53 9,034 HKK ÇKR 50 8,648 HKK MLK 54 8,624 AMD ÇKR 53 8,981 AMD MLK 53 9,150 ÇKR MLK 54 8,684
Çizelge 3. Lokus düzeyinde hesaplanan heterozigotluk ve Fıs değerleri.
Nei’nin Heterozigotluk Değeri Popülasyon Fıs Değerleri
Lokus Ho He HKK CNK MLK AMD ADL
HTG6 0,670 0,666 -0,096 0,035 -0,188 0,118 0,082 HMS3 0,760 0,807 0,021 0,005 0,150 0,103 0,008 HMS5 0,684 0,659 0,038 0,042 -0,020 -0,203 -0,047 HMS6 0,729 0,757 -0,073 -0,079 0,185 0,063 0,095 ASB2 0,811 0,857 0,015 0,002 0,202 -0,046 0,089 I18 0,753 0,801 -0,057 0,065 0,179 0,034 0,077 AHT4 0,851 0,846 0,014 -0,055 0,085 -0,067 -0,007 LEX33 0,793 0,794 -0,107 -0,053 0,097 0,038 0,032 COR2 0,652 0,688 0,122 -0,009 0,035 -0,039 0,147 ASB43 0,727 0,767 -0,003 0,065 0,124 0,074 0,008 AHT33 0,844 0,886 0,091 -0,019 0,107 0,048 0,009 NEV79 0,736 0,756 0,048 -0,030 0,124 -0,022 0,019 HMS2 0,786 0,832 -0,002 0,083 0,172 0,055 -0,034 CA425 0,739 0,769 0,053 -0,039 0,056 -0,063 0,200 ASB17 0,823 0,855 0,084 0,045 0,039 -0,000 0,019 TKY301 0,779 0,817 0,140 -0,007 0,063 0,023 0,012 ASB23 0,854 0,848 -0,086 0,127 0,005 -0,067 -0,011 VHL20 0,819 0,856 0,022 -0,003 0,189 0,027 -0,015 HTG4 0,734 0,701 -0,020 -0,079 -0,103 0,026 -0,062 HMS7 0,785 0,802 0,057 -0,036 0,006 -0,002 0,079 COR58 0,858 0,880 0,053 -0,028 0,183 -0,081 -0,005 Toplam 0,771 0,793 0,016 0,002 0,087 0,001 0,033
ırklar arasındaki genetik farklılığın düşük seviyede olduğunu ortaya koymuştur. Hesaplanan p değerleri ise sadece Malakan X Ayvacık Midillisi ile Canik X Hınıs’ın Kolu Kısası ve yine Canik X Ayvacık Midillisi at ırkları arasında düşük de olsa tespit edilen genetik farklılığı anlamlı bulmuştur (Çizelge4).
İncelenen beş ırk için oluşturulan Median-Joining Network toplam 54 haplogrup belirlemiş olup, elde edilen network ırklar arası evrimsel bir bağı gösteren merkezi bir haplotip varlığına veya ırka özgü dağılıma işaret etmemektedir (Şekil 1). Bu sonucu doğrular şekilde Kimura 2-parametre kullanılarak çizilen komşu birleştirme (NJ) ağaç çiziminde de ırka özgü dallanma belirlenemediği gibi ortaya çıkan dallanmanın çöz-bağla yöntemi ile test edilen istatistiksel güvenilirliği de düşük olarak tespit edilmiştir.
İncelenen beş ırkın bireyler düzeyinde bir birlerinden net bir şekilde ayrılıp ırk bazında gruplaşma gösterip göstermediklerinin anlaşılması için GENETIX programı [25] kullanılarak Faktöriyel Birleşim Analizi (Factorial Correspondance Analysis - FCA) gerçekleştirilmiştir. Bu analiz yöntemi ile ırklara ait tüm bireylerin üç boyutlu ortam içinde dağılımları incelenmiştir. Şekil
2’de gözlendiği üzere genel olarak ırka bağlı olmaksızın bireylerin çoğu ortada yer alan grup (B) içinde dağılım göstermektedir. Irklardan Ayvacık Midillisi (A) ve Canik Atı (C) kısmen de olsa diğerlerinden ayrılarak ırk bazında ayrı bir küme oluşturmaktadır. Bunun dışında bu üç ana kümenin etrafında yer alan çevreye dağılmış durumda bireylerde gözlenmektedir. Dolayısıyla FCA analizinin sonuçlarına göre ırkları temsil edecek tam bir ayrım tespit edilememiştir. Buna ilave olarak PCAgen 1.2.1. [26] programı ile Temel Bileşen Analizi (Principle Component Analysis - PCA) gerçekleştirilmiştir (Şekil 3). Böylelikle incelenen populasyonların ırk bazında iki boyutlu ortamda (X ve Y ekseni boyunca) göstermiş oldukları dağılım incelenmiştir. Y eksenine göre sadece Malakan Atı diğer ırklardan ayrı gözükmektedir. X eksenine göre ise yine Malakan Atı ve Ayvacık Midillisi diğerlerinden ayrı fakat birbirlerine çok yakın yer almaktadır. Dolayısıyla hem FCA hem PCA analizleri ırkların fenotiplerine paralel olarak genetik açıdan da birbirlerinden beklendiği kadar farklılık göstermediklerine işaret etmektedir. Söz konusu sonuçlar bireyleri ırk bazında olduğu kadar coğrafik olarak da anlamlı bir şekilde gruplandırmamaktadır.
TARTIŞMA VE SONUÇ
MLK CNK HKK ÇKR CNK Fst 0,01089 --p 0,11816 HKK Fst 0,00734 0,01610 --p 0,19824 0,03809* ÇKR Fst 0,01992 0,01097 -0,00569 --p 0,06250 0,07617 0,73926 AMD Fst 0,03598 0,02761 0,00559 0,00032 p 0,02344* 0,01067* 0,20898 0,10527Çizelge 4. İncelenen ırkların ikili karşılaştırmalarına dayanan Fst değerleri ve anlamlılık
dereceleri (* p < 0,05)
Şekil 1. İncelenen beş ırk için Median-Joining Network
Bu çalışmada yerli beş Anadolu at türüne ait toplam 262 birey genetik karakterizasyona tabi tutulmuş olup, birbirleri ile aralarında var olabilecek evrimsel ve genetik ilişkiler ortaya konmaya çalışılmıştır. mtDNA D-loop bölgesi dizi analizi sonucuna göre incelenen hiçbir türde türe özgü mutasyona rastlanmamıştır. Tespit edilen polimorfizmler farklı ırklar tarafından paylaşılmaktadır. Populasyonların ikili olarak birbirleri ile karşılaştırılmalarında da yüksek düzeyde ve anlamlı sayılabilecek bir farklılık ortaya konamamıştır. Populasyonlar arası mutasyon sayısı 49-54, ortalama nükleotid farklılığı ise 8,050-9,150 arası değişim göstermekte olup, dar bir varyasyon göstermektedir. Tüm bu veriler ırklar arası genetik farklılaşmanın beklendiği kadar yüksek olmadığına işaret etmektedir.
Tüm populasyonlar genelinde incelenen lokusların tespit edilen toplam alel sayıları 6-21 arasında değişmektedir. Fakat bir ırkta rastlanan alel sayısının o lokus için tespit edilen toplam alel sayısına oranı en az 0,46’dır. Buna ilave olarak hesaplanan Fıs değerleri ve Nei’nin heterozigotluk
tahminlerine göre herhangi bir lokus için Hardy-Weinberg dengesinden anlamlı derecede sapma gözlenmemiştir. Bu sonuçlar ışığında söz konusu ırklarda belli bir karakter ya da avantaj sağlayacak bir özellik açısından herhangi bir genetik seçilim izine rastlanmamıştır. Yerli at ırklarımız düşünüldüğünde ülkemizde sistematik anlamda at yetiştiriciliğinin veya ıslah çalışmalarının yürütülmekte olduğu söylenemez. Bu çalışmaya konu olan yerli at ırklarımız temel olarak halkın elinde tarımsal üretimdeki ihtiyaçlarını karşılamak üzere hane başına
Şekil 2. İncelenen beş ırkın üç boyutlu ortamda dağılımını gösteren Faktöriyel
Birleşim Analizi (Factorial Correspondance Analysis - FCA). Gri: Ayvacık Midillisi, Mavi: Canik atı, Pembe: Çukurova atı, Beyaz: Malakan atı, Sarı: Hınıs’ın Kolu Kısası.
Şekil 3. Beş ırkın X ve Y olmak üzere iki boyutlu ortamda dağılımını
az sayıda olmak üzere muhafaza edilmektedir. Bazı bölgelerde ise genellikle ekonomik nedenlerden dolayı halk elinde kullanılan atlar tarımsal aktivitelerin durduğu aylarda serbest bırakılmakta, ihtiyaç duyulan dönemlerde ise tekrar yakalanarak kullanılmaktadır. Ayrıca diğer çiftlik hayvanlarına göre atların bir bölgeden başka bir bölgeye taşınması veya kendi başlarına hareketleri çok daha kontrolsüz ve kolaydır. Söz konusu koşullardan dolayı yerli at ırklarımızın genetik olarak saflıklarının korunması ve tür özelliklerini kaybetmeden muhafaza edilmesi güç gözükmektedir. Aynı zamanda, ifade edilen koşullar analiz sonuçlarının ortaya koyduğu türler arası düşük genetik farklılığın ve genetik karışımın birincil nedeni olarak düşünülmektedir. İfade edilen bu sonuçlar ile uyumlu olarak hesaplanan Fst değerleri de ırklar arasındaki genetik farklılığın oldukça düşük olduğuna işaret etmektedir. Irkların ikili karşılaştırmalarından Malakan X Ayvacık Midillisi, Canik X Hınıs’ın Kolu Kısası ve yine Canik X Ayvacık Midillisi arasında tespit edilen Fst değerleri ne kadar düşük olsa da (sırasıyla 0,0359-0,0161-0,0276) istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Genetix [25] programı kullanılarak yapılan faktöriyel birleşim analizi kısmen olmakla beraber Ayvacık Midillisi ve Canik Atı’nı diğer yerli at ırklarından ayırmaktadır. PCAgen 1.2.1 [26] programı ile yapılan temel bileşenler analizi ise benzer olarak sadece tek düzlem üzerinde Canik atı, Malakan atı ve Ayvacık Midillisi’ni diğerlerinden kısmen ayırmıştır. Fenotipik açıdan çalışmada yer alan at ırklarımız değerlendirildiğinde Malakan atı ve Ayvacık Midillisi’nin günümüzde de en farklı ve belirgin fenotipik özelliklere sahip olan yerli at ırklarımız olduğu gözlenmektedir. Malakan atı Ukrayna’dan Türkiye’ye göç eden ve Kars bölgesine yerleşen ve aynı isim ile anılan bir topluluk tarafından ülkemize getirilmiştir [27]. Bu atın kökeninde Orlof, Biçuk, Perşeron ve Cleydestal isimli türlerin yattığı bilinmektedir [28,29]. Fakat Malakan atının esas temelini bir Rus ırkı olan Biçuk Atı oluşturmaktadır [30]. Malakan atı sahip olduğu köken itibari ile bu çalışmaya konu olan beş at ırkı içinde tek “soğukkanlı” olarak nitelendirilebilecek at türüdür [31]. Malakan atla-rı geniş, kaba, derin, kitle ve kuvvetli kemik yapısına sahip olup genellikle ağır işlerde koşum atı olarak kullanılmıştır. Bu nedenle 1900’lü yılların başlarında askeriyenin sahip olduğu top arabalarında Malakan atı yoğun olarak kullanılmıştır [27]. Dolayısıyla, söz konusu atın sahip olduğu köken ve atasal geçmiş göz önüne alındığında düşükte olsa tespit edilen genetik farklılığın beklenen ve anlamlı bir sonuç olduğu ifade edilebilir. Günümüzden yıllar öncesine dayanan yanlış ve tamamlanamayan ıslah çalışmaları, rastgele damızlık hayvan kullanımı ve bilinçli besicilik uygulamalarının
eksikliği gözlenen genetik farklılığın beklenen seviyeden daha düşük olmasına neden olan temel etkenler olarak değerlendirilebilir [30]. Ayvacık Midillisi ise Malakan atı gibi fenotipik olarak kolaylıkla tanımlanabilecek bir diğer yerli at ırkımızdır. Oldukça düşük cidago yüksekliği (116-120 cm) ile belirgin olarak kendini ortaya koyar [27]. Ayrıca Ayvacık Midillisi yaşam alanı olarak da diğer dört at ırkından en uzakta bulunan ve dar bir coğrafik alanda yayılım gösteren yerli at ırkımızdır. Dolayısıyla diğer ırklar ile genetik bilgi akışının göreceli olarak en düşük seviyede olması beklenebilir. Söz konusu unsurlar Ayvacık Midillisi’ni genetik olarak az da olsa diğerlerinden ayrılmasına neden olan temel etkenler olarak düşünülebilir. Bu çalışmada incelenen bir diğer yerli at ırkımız Canik atı, Samsun İli’nde bulunmaktadır. Elde edilen bilgilere göre bu atların kökeninde Türkmen ve Çerkez atları bulunmaktadır [27]. Başka bir kaynakta ise Canik atları bölgeye gelen muhacirlerin beraberinde getirdikleri yabancı at ırklarının tesiri altında kalmış mahalli bir tip olarak betimlenmektedir [30]. Üstü kapalı olarak ifade edilen muhacirler, ilk kaynakta belirtilen Çerkez ve Türkmen toplulukları olabilir. Bu vesile ile Canik atının sahip olduğu bu farklı köken onu genetik açıdan da farklı bir yapıya sahip kılmış olabilir. Faktöriyel Birleşim ve Temel Bileşenler analizleri sonucunda Canik atının diğerlerinden kısmen de olsa ayrılmış olması bu etkenlere bağlanabilir.
Sonuç olarak geçmişten günümüze doğru bakıldığında yerli ırklarımızın sahip oldukları türe özgü karakterlerini giderek kaybettikleri görülmektedir. Fenotip olarak gözlenen bu kayıba görüldüğü üzere genetik yapı da eşlik etmektedir. Bu ise çevresel şartlara uyum ve hastalık dirençliliği gibi pek çok açıdan önem arz eden karakterleri belirleyen genetik çeşitliliğin yitirilmesi anlamına gelmektedir. Ayrıca günümüz Türkiye’sindeki sosyo-ekonomik durum ve tarımsal üretimde makineleşme gibi endüstriyel faktörler var olan durumu daha da kritik bir hale getirmektedir. Diğer taraftan at populasyonlarının diğer çiftlik hayvanlarına göre daha serbest olması, yayılım alanlarının hızlı değişkenlik göstermesi ve kontrolsüz hayvan hareketleri her geçen gün yerli at ırklarımızın genetik olarak birbirleriyle karışmasına neden olmaktadır. Söz konusu mevcut durum, çevresel ve sosyo-ekonomik baskılara karşı yerli at ırklarımızın korunabilmesi için bilinçli ve uzun soluklu koruma programlarının bir an önce oluşturularak hayata geçirilmesini zorunlu kılmaktadır.
Teşekkür
Bu çalışma TUBİTAK-KAMAG 106G005 No’ lu TÜRKHAYGEN-1 Projesi çerçevesinde desteklenmiştir.
KAYNAKLAR
[1] Driscoll CA, Macdonald WD, O’Brien SJ. 2009. From wild animals to domestic pets, an evolutionary view of domestication. PNAS. 106: 9971-9978. [2] Wade MC ve ark. 2010. Genome Sequence,
Comparative Analysis, and Population Genetics of the Domestic Horse. Science: 865-867.
[3] Anthony DW. 1996. In: Horses Through Time (ed. Olsen, LS), pp. 57-82. Carnegie Museum of Natural History, Boulder, CO.
[4] Clutton-Brock J. 1999. In: A Natural History of Domesticated Mammals, ed.2. Cambridge Univ. Press, Cambridge, UK.
[5] Bennett D, Hoffmann RS. 1999. Equus caballus. Mamm. Species 628: 1-14.
[6] Vila` C, Leonard JA, Götherström A, Marklund S, Sandberg K, Lidén K, Wayne RK, Ellegren H. 2001. Widespread Origins of Domestic Horse Lineages. Science, 291: 474-477.
[7] Gama LT, Smith C., 1993. The role of inbreeding depression in livestock production systems. Livestock Science, 36(3): 203-211.
[8] ERFP 2003. Guidelines for the constitution of National Cryopreservation Programmes for Farm Animals (ed. Hiemstra SJ.), Publication No. 1 of the European Regional Focal Point on Animal Genetic Resources.
[9] Bjornstad G, Roed KH., 2001. Breed demarcation and potential for breed allocation of horses assessed by microsatellite markers. Animal Genetics, 32(2):59-65.
[10] Jansen T, Forster P, Levine M, Oelke H, Hurles M, Renfrew C, Weber J, Olek K, (2002). Mitochondrial DNA and the origins of the domestic horse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 10905–10910. [11] Luis C, Cothran EG, Oom MM, (2002).
Microsatellites in Portuguese autochthonous horse breeds: usefulness for parentage testing. Genetics and Molecular Biology 25, 131–4.
[12] Mirol PM, Peral Garcia P, Vega-Pla JL, Dulout FN, (2002). Phylogenetic relationship of Argentinean Creole horses and other South American and Spanish breeds inferred from mitochondrial DNA sequences. Animal Genetics 33: 356–63.
[13] Lopes MS, Mendoca D, Cymbron T, Valera M, Costa-Ferreira J, (2005). The Lusitano horse maternal lineage based on mitochondrial D-loop sequence variation. Animal Genetics 36: 196–202. [14] Royo LJ, Alvarez I, Beja Pereira A, Molina M,
Ferna´ndez I, Jordana J, Go´mez E, Gutierrez JP, Goyache F, (2005). The origins of Iberian horses assessed via mitochondrial DNA. Journal of Heredity 96: 663–669.
[15] Iwanczyk E, Juras R, Cholewinski G, Cothran EG, (2006). Genetic structure and phylogenetic
relationships of the Polish Heavy horse. Journal of Applied Genetics 47: 353–359.
[16] McGahern AM, Edwards CJ, Bower MA, Heffernan A, Park SD, Brophy PO, Bradley DG, MacHugh DE, Hill EW, (2006). Mitochondrial DNA sequence diversity in extant Irish horse populations and in ancient horses. Animal Genetics, 37: 498–502. [17] Dimsoski P, (2003). Development of a 17-plex
microsatellite polymerase chain reaction kit for genotyping horses. Croatian Medical Journal, 44: 332–335.
[18] Vega-Pla JL, Calderon J, Rodrı´guez-Gallardo PP, Alcaide B, Sereno FTPS, Costa MR, Perez-Pineda E, Martinez AM, Delgado JV, Rico C, (2005). The Retuertas horse: the ‘missing link’ in the Iberoamerican horse breeds origin. In: Conservation Genetics of Endangered Horse Breeds (Ed. by I. Bodo, L. Alderson & B. Langlois), pp. 167–176. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, The Netherlands.
[19] Tozaki T, Takezaki N, Hasegawa T, Ishida N, Kurosawa M, Tomita M, Saitou N, Mukoyama H, (2003). Microsatellite variation in Japanese and Asian horses and their phylogenetic relationship using a European horse outgroup. Journal of Heredity, 94: 374–380.
[20] Glowatzki-Mullis M.L, Muntwyler J, Pfister W, Marti E, Rieder S, Poncet P.A, Gaillard C, (2005). Genetic diversity among horse populations with a special focus on the Franches-Montagnes breed. Animal Genetics, 37: 33–39.
[21] Iamartino D, Fidotti M, Miraglia N, Pilla F, (2005). Genetic characterization of Petro young horses by microsatellite markers. In: Conservation Genetics of Endangered Horse Breeds (ed. Bodo I, Alderson L, Langlois B.), pp. 163–166. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, The Netherlands.
[22] Solis A, Jugo BM, Meriaux JC, Iriondo M, Mazon LI, Aguirre AI, Vicario A, Estomba A, (2005). Genetic diversity among four South European native horse breeds based on microsatellite DNA analysis: implications for conservation. Journal of Heredity , 96: 670–678.
[23] Zabeck T, Nogag A, Radko A, Nogag J, Slota E, (2005). Genetic variation of Polish endangered Bilgoraj horses and two common horse breeds in microsatellite loci. Journal of Applied Genetics, 46: 299–305.
[24] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, USA.
[25] Belkhir K, Borsa P, Chikhi L, Raufaste N, Bonhomme F, 2004. GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II,
Montpellier.
[26] Goudet J. 1999. PCA-GEN for Windows. Ver. 1.2. University of Lausanne, Lausanne, Switzerland. [27] Güleç E., 2005. Türk At Irkları. s: 45-74. Anadolu
At Irklarını Yaşatma ve Geliştirme Derneği. Ankara. [28] Vetulani, 1937. Zeitschrift für die züchtung und
Züchtungbiology, 39. Editör: Paul Parey, Berlin. [29] Batu S., 1951. Türk Atları ve At Yetiştirme Bilgisi.
s: 5-230. Üniversite Basımevi, Ankara.
[30] Arıtürk E., 1956. Türkiya Atçılığının Bugünkü Durumu, Meseleleri ve Yerli Atlarımızın Morfolojik Vasıfları Üstünde Araştırmalar. s: 35-38. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları, No:86. Yeni Desen Matbaası, Ankara.
[31] Hendricks LB., 1995. International Encyclopedia of Horse Breeds. s: 273. University of Oklahoma Pres. Norman and London, USA.
