T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
P14
ARFMET LASYONUNUN
NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL
HASTALIKTAK ROLÜ
Uzm.Dr. ZÜBEYDE ERBAYRAKTAR
T
T
E
E
M
M
E
E
L
L
O
O
N
N
K
K
O
O
L
L
O
O
J
J
P
P
R
R
O
O
G
G
R
R
A
A
M
M
I
I
DOKTORA TEZ
T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
P14
ARFMET LASYONUNUN
NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL
HASTALIKTAK ROLÜ
T
T
E
E
M
M
E
E
L
L
O
O
N
N
K
K
O
O
L
L
O
O
J
J
P
P
R
R
O
O
G
G
R
R
A
A
M
M
I
I
DOKTORA TEZ
Uzm.Dr. ZÜBEYDE ERBAYRAKTAR
Dan man Ö!retim Üyesi: Prof. Dr. H. NUR OLGUN
Bu ara t rma Türk Pediatrik Onkoloji Grubu taraf ndan “TPOG 2008 Ara t rma Projelerini Destekleme Program ” kapsam nda 08/535 say ile desteklenmi tir.
Dokuz Eylül Üniversitesi Sa!l k Bilimleri Enstitüsü, Temel Onkoloji Doktora Program ö!rencisi Uzm.Dr. Zübeyde Erbayraktar’ n “P14ARF Metilasyonunun Nöroblastom Minimal Rezidüel Hastal2ktaki Rolü” isimli doktora tezi ………. tarihinde taraf m zdan
de!erlendirilerek Ba5ar2l2 bulunmu tur.
JÜR BA7KANI
Prof. Dr. H. NUR OLGUN
Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal Pediatrik Onkoloji Bilim Dal
JÜR ÜYELER
Prof. Dr. MÜN R KINAY Prof. Dr. GÜLDAL KIRKALI
Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dal T bbi Biyokimya Anabilim Dal
Prof. Dr. NAZAN ÇET NGÜL Prof. Dr. SAVAF KANSOY Ege Üniversitesi T p Fakültesi Ege Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal
Ç
Ç
N
N
D
D
E
E
K
K
L
L
E
E
R
R
S
SaayyffaaNNoo
çindekiler ………. i
Tablo listesi ………... iii
Fekil listesi ………... iv K saltmalar ………... v Te ekkür ……… vi ÖZET ……… 1 ABSTRACT ………. 3 1. G R 7 VE AMAÇ ……… 5 2. GENEL B LG LER ……… 7
2.1 Nöroblastom: Tan m ve Özellikleri .………... 7
2.1.1 Nöroblastom Tedavi Protokolünde zlenen Stratejiler Nelerdir? ……….. 12
2.1.2 TPOG-NB-2003 Riske Dayal Tedavi Yakla m ………..……….... 14
2.2 Metilasyon ve Kanser …….……….. 15
2.2.1 p14ARF Metilasyonunun Kanser Olu um Sürecindeki Önemi ...…...……... 17
3. GEREÇ ve YÖNTEMLER ….……… 19
3.1 Hücre Kültürü ………..………. 20
3.1.1 Hücrelerin Ço!alt lmas ………. 20
3.1.2 n Vitro Minimal Rezidüel Hastal k Modelinin Olu turulmas …………. 20
3.1.3 Tripan Mavisi ile Hücre Canl l ! Testi ………. 22
3.2 MYCN ve p14ARF Gen fadelerinin Analizi ...………... 23
3.2.1 Total RNA zolasyonu ………... 23
3.2.3 Komplementer DNA (cDNA) Sentezi ……....……….... 24
3.2.4 Real time-PCR ile Gen Ekpresyon Analizleri ………... 24
3.2.5 DNA Metilasyon qPCR Analizleri ... 25
3.3 Protein Düzeylerinin Ölçümü ……….…. 28 3.3.1 Nüklear Ekstraksiyon ……….……. 28 3.3.2 EL SA Deneyi ……….…… 28 3.4 statistiksel Analiz ………... .29 4. BULGULAR ……….. 30 5. TARTI7MA ………... 43
6. SONUÇ VE ÖNER LER ……….49
7. KAYNAKLAR ………..… 51
TABLO L STES
Tablo 1. Uluslararas Nöroblastom Patoloji S n flamas (INPC) Tablo 2. Uluslararas Nöroblastom Evreleme Sistemi (INSS)
Tablo 3. Çocuk Onkoloji Grubunun (COG) kabul etti!i ve TPOG NB 2003 Protokolünde
kullan lan Nöroblastom Risk S n flamas
Tablo 4. MYCN Onkogen Analizi Yap lmam Olgular n TPOG NB 2003 Protokolündeki
Nöroblastom Risk S n flamas
Tablo 5. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
Tablo 6. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
Tablo 7. MYCN (+) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri Tablo 8. MYCN (-) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
7EK L L STES
7ekil 1. S n fland rma (International Neuroblastoma Pathology Comittee-1999) 7ekil 2. Nöroblastomun hücresel ve moleküler belirleyicilere göre s n flamas 7ekil 3. Kanser tan s , risk belirleme ve tedavisinde epigenetik hedefler
7ekil 4. p14ARF geninin, p53 tümör bask lay c gen yola! n aktivasyon mekanizmas
7ekil 5. Çal mada kullan lan yöntemlerin genel ak emas . 7ekil 6. TPOG-NB-2009 protokolü yüksek risk grubu tedavi emas
7ekil 7. MYCN (+) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri 7ekil 8. MYCN (+) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 9. MYCN (-) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri 7ekil 10. MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 11. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda protein düzeylerinin kar la t r lmas 7ekil 12. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni promotor bölgesinin
demetilasyon yüzdelerinin kar la t r lmas
7ekil 13. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 14. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR s cakl k e!rileri
7ekil 15. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas 7ekil 16. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas 7ekil 17. MYCN (+) kontrol grubu
7ekil 18. MYCN (-) kontrol grubu
7ekil 19. MYCN (+) 5-aza-CdR grubu 7ekil 20. MYCN (-) 5-aza-CdR grubu
K
K
I
I
S
S
A
A
L
L
T
T
M
M
A
A
L
L
A
A
R
R
NBL : Nöroblastom
MRD : Minimal Rezidüel Hastal k TPOG : Türk Pediatrik Onkoloji Grubu FBS : Fetal Bovine Serum
RT : Real Time
RT-PCR : Real Time – Polimeraz Zincir Reaksiyonu GADPH : Gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenaz CDKN2A: Siklin ba! ml kinaz 2A
T
T
E
E
7
7
E
E
K
K
K
K
Ü
Ü
R
R
Projenin mali kayna! n sa!layan Türk Pediatrik Onkoloji Grubu Yönetim Kurulu’na,
Bu çal man n planlanmas , yürütülmesi ve sonuçlar n yorumlanmas a amalar nda bilimsel görü lerini ve deste!ini hiçbir zaman esirgemeyen dan man m Prof.Dr. H. Nur OLGUN’a, Laboratuar çal malar n n planlanmas ve deneylerin gerçekle tirilmesi a amalar nda bilimsel deneyim ve birikimini her zaman payla an Prof.Dr. Güldal KIRKALI’ya,
Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji Laboratuvar olanaklar n n kullan lmas n sa!layan Onkoloji Enstitüsü Müdürü Prof.Dr. Münir KINAY’a
Moleküler çal malar n planlanmas ve gerçekle tirilmesinde bilgi ve deneyimlerini payla arak destek olan Zeynep ZADEO LULARI’na, Ö!r.Gör. Uzm.Dr. Serpil T. AKH SARO LU’na ve Doç.Dr. Ataç SÖNMEZ’e,
statistiksel analizlerin yap lmas ve de!erlendirilmesindeki katk lar için Doç.Dr. Hülya ELL DOKUZ’a,
Bütün çal malar m boyunca deste!ini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili e im Doç.Dr. R. Serhat ERBAYRAKTAR’a ve çal malar mdan dolay benimle geçirmek istedikleri zamanlar ndan çald ! m can m k z m Duygu ERBAYRAKTAR ile can m o!lum Fad l Alp ERBAYRAKTAR’a sonsuz te ekkürlerimi bir borç biliyorum.
Ö
Ö
Z
Z
E
E
T
T
P14ARF MET LASYONUNUN NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL HASTALIKTAK ROLÜ
Zübeyde ERBAYRAKTAR
Dokuz Eylül Üniversitesi, Onkoloji Enstitüsü, Temel Onkoloji AD, zmir.
Nöroblastom, primordial nöral krest hücrelerinden köken alan ve tüm çocukluk ça! kanserlerinin %8-10’unu olu turan bir tümördür. Bir ya alt ndaki çocuklar n en s k görülen tümörüdür. Tümörün biyolojik davran ndaki de!i kenlik nedeniyle, nöroblastom spontan regresyonlar, benign transformasyon ya da agresif seyir gösterebilmekte, bu durum hastal ! n prognozunu belirlemede ve tedavisinde sorunlara yol açmaktad r.
Epigenetik de!i iklikler, tümörün olu umunda ve progresyonunda önemli rol oynamaktad r. Bu de!i ikliklerin sonucunda görülen malign hücre genomu, spesifik histon modifikasyonlar n n azalmas ve baz genlerin metilasyonu veya demetilasyonu ile karakterizedir. p14ARF metilasyonunun olu turdu!u tümöral etki, N-Myc gibi onkogenler taraf ndan aktive olduktan sonra p53 tümör bask lay c gen ekspresyonunu bloke ederek hücre ço!almas n negatif yönde düzenleyen faktörleri inhibe etmek eklindedir.
Bu çal mada, Kelly (Nöroblastik, N-Myc +) ve SH-SY5Y (Nöroblastik, N-Myc -) insan nöroblastom hücre hatlar nda p14ARF geni demetile edici bir ajan ile bloke edilerek Türk Pediatrik Onkoloji Grubu (TPOG) kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlar n tümör hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri de!erlendirilmi tir. Ayr ca, p14ARF geninin N-Myc amplifikasyonu olan ve olmayan hücre hatlar ndaki etkisi de!erlendirilerek tümörün prognozunu ne yönde etkiledi!i ve sitotoksik etki de!i ikli!i ile prognoz aras nda bir ili ki bulunup bulunmad ! ara t r lm t r. laçlar n hücre canl l ! ve hücre hasar na etkisi tripan mavisi boyamas ile de!erlendirilmi tir. Nöroblastom hücre hatlar nda sitotoksik etki farkl l ! saptanm , bu etkinin mekanizmalar n incelemek için p14ARF geninin metilasyon ve ekspresyon düzeyleri ile birlikte N-Myc expresyon düzeyleri hedef olarak seçilmi tir. p14ARF ve N-Myc mRNA ekspresyonu real-time PCR ile, protein ekspresyonu ELISA yöntemi ile de!erlendirilmi tir.
Projemizde, nöroblastomdaki minimal rezidüel hastal k modelinde p14ARF geninin N-Myc amplifikasyonu ile olan ili kisi ve bu ili kinin rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlarla olan etkile iminde demetilasyonun rolü, bugüne kadar henüz incelenmeyen epigenetik tedavi yakla m s n rlar nda geni kapsaml olarak ara t r lm , metilasyon ili kili tedavi ile tümörün prognozu aras nda bir ili ki olup olmad ! na dair önemli ipuçlar elde edilmi ve bu ili kinin yönü ortaya konmu tur.
Sonuç olarak, bu öncü çal mada nöroblastomda minimal rezidüel hastal ! n önlenmesinde; gerek tedavinin kesilmesinden sonra kar m za ç kan erken ya da geç dönemdeki relapslar n tedavisine yönelik yeni bir yakla m önerisi elde edilmi , gerekse de rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlar n p14ARF gen düzeyleri üzerindeki etkileri geni bir perspektifte incelenmi tir. leriye yönelik olarak, p14ARF gen düzeyleri ile ili kili transkripsiyon faktörlerinin prognostik öneminin ara t r lmas uygun bir yakla m olacakt r. Yine ekspresyon düzeyinin yüksek oldu!u hücre serilerinde bu faktörlere kar geli tirilmi inhibitörlerin etkinli!i de tedavide bu ekspresyonlar n önemini ortaya koyacakt r.
A
A
B
B
S
S
T
T
R
R
A
A
C
C
T
T
THE ROLE OF P14ARF METHYLATION IN NEUROBLASTOMA MINIMAL RESIDUAL DISEASE
Zübeyde ERBAYRAKTAR
Dokuz Eylül University, Institute of Oncology, Department of Basic Oncology, Izmir. Neuroblastoma originating from primordial neural crest cells constitutes 8-10 % of whole childhood cancers. It is the most frequently diagnosed tumor of infancy. Because of the variations in its biological behavior, neuroblastoma may show spontaneous regression, benign transformation or agressive progression and this uncertainity leads to difficulties in predicting prognosis and treatment.
Epigenetic changes has a significant role in the occurence and progression of the tumor and the resultant malignant cell genome is characterized by the reduction of specific histone modifications and methylation or demethylation of genes. Tumorigenesis effect of
p14ARF methylation depends upon inhibiting factors that impairs cell proliferation via
blocking p53 gene expression due to its N-Myc mediated activation.
In the present study, cytotoxic effects of blocked p14ARF by demethylating agent on
Kelly (Neuroblastic, N-Myc +) and SH-SY5Y (Neuroblastic, N-Myc -) human neuroblastoma cell lines assigned according to whether Turk Pediatric Oncology Group (TPOG) chemotherapy protocol drugs are added. Moreover, with the evaluation of the effects of p14ARF gene on cell lines with or without N-Myc amplification a probable change in prognosis and any relation between cytotoxic effects and prognosis were investigated. Drug induced effects on cell viability, cell damage and apoptotic cell death ratio were assessed with trypan blue dying. The difference of cytotoxic effects were observed in neuoroblastoma cell lines. For to investigate the mechanisms of this effect, p14ARF gen methylation and expression levels, and N-Myc expression levels were targeted. Expressions of mRNA and protein will be determined with real-time PCR and ELISA, respectively.
So that, in this project relationship between p14ARF gene and N-Myc amplification, as well as the role of gene methylation on chemoterapeutic agents in epigenetic treatment approach which has not been studied yet in minimal residual disease model of neuroblastoma, were investigated in detail and a possible relation between this treatment model and the prognosis and its direction were demonstrated.
In conclusion, in this pioneering study we have demonstrated that not only new therapeutic approach for early or late relapses following the ending of treatment were found but also effects of chemoterapeutic agents on p14ARF gene on this model were investigated in
detail. Regarding our results, investigation of transcription factors with related p14ARF gene
levels may help to determine prognosis in neuroblastoma. Moreover, development of targeted therapies against these transcriptional factors may be a therapeutic approach in the near future.
1
1
.
.
G
G
R
R
7
7
V
V
E
E
A
A
M
M
A
A
Ç
Ç
Nöroblastom, çocukluk ça! n n en yayg n olarak görülen solid tümörlerinden birisidir. Günümüzde özellikle ileri evre nöroblastom hastalar n n tedavisinde uygulanan yo!un kemoterapi protokolleri ile hastan n ya am süresi uzayabilmektedir. Ancak ya am süresinin uzamas ile birlikte, tüm dünyada önemli bir problem olan geç relapslar n görülme s kl ! da artmaktad r. Tedavinin kesilmesinden özellikle birinci y ldan sonra ortaya ç kan relapslar n (geç relaps) sorumlusu olarak minimal rezidüel hastal k varl ! dü ünülmektedir. Dolay s yla minimal rezidüel hastal ! ortadan kald rmaya yönelik idame tedavileri giderek önem kazanmaktad r (1, 2, 3).
Son y llarda üzerinde oldukça aktif bir ekilde çal lan epigenetik de!i ikliklerin, onkogenlerin aktivasyonu, genomik instabilite ve tümör supresör genlerin transkripsiyonunun azalt lmas yoluyla karsinogenez sürecini ba latt klar bilinmektedir (4). Kanser olu umunda ve progresyonunda rol oynayan epigenetik de!i ikliklerin önemi anla ld kça yeni terapötik hedefler ortaya ç kmaktad r.
Onkolojik tedavide amaç, etkin ancak daha az yan etkili tedavi protokolleri ile hastan n ya am süresini uzatmak ve kaliteli bir ya am sa!layarak en iyi sonuçlar elde etmektir. Özellikle geli mekte olan ülkelerde, hasta ailesinin ve devletin sosyoekonomik dengesini koruyacak, hastan n hayat kalitesini yüksek tutacak, uygulaman n kolay oldu!u ve hasta takibini kolayla t ran tedavi yöntemlerini seçmek gerekmektedir. Nöroblastomda özellikle ileri evre hastalarda katedilen mesafe, uygulanan multimodal tedavi protokolleri ve alternatif tedavilere ra!men çok azd r. Dolay s yla, acilen yeni tedavi yakla mlar n n geli tirilmesi gerekmektedir (5, 6, 7).
Ara t rmam z n amac , nöroblastom hücre kültürlerinde in vitro minimal rezidüel hastal k modelini olu turmak, bu modelde epigenetik tedavi yakla m n irdelemek, bunun için de, p14ARF genini demetile edici bir ajan olan 5’-Aza-2-deoxycytidine (5-aza-CdR) uygulayarak N-Myc ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkilerini incelemek, e!er varsa bu ili kinin rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlarla olan etkile iminde p14ARF geni
demetilasyonunun rolünü incelemektir. Kanser hücrelerinde proliferasyonu durdurucu, diferansiyasyonu artt r c ve apoptozisi uyar c etkileri olan tedavi protokollerine, antitümöral etkinlikte de sinerjizm gösterecek yeni mekanizmalar n ayd nlat lmas na ihtiyaç bulunmaktad r.
Bu hipotezi s namak amac yla çal mam zda, Kelly (Nöroblastik, MYCN+) ve SHSY5Y (Nöroblastik, MYCN-) insan nöroblastom hücre hatlar nda ve minimal rezidüel hastal k modelinde, p14ARF gen metilasyonunun ve demetile edici ajan (5’-aza-CdR) ile demetilasyonunun rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlarla (Vinkristin, Dakarbazin,
fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid, Etoposid, Sisplatin) olan etkile imi ve tümör hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin de!erlendirilmesi ile p14ARF gen metilasyonunun,
tümörün prognozunu ne yönde etkiledi!i ve sitotoksik etki ile prognoz aras nda bir ili ki bulunup bulunmad ! n n ara t r lmas planlanm t r.
Ara t rmam z, nöroblastom minimal rezidüel hastal k modelinde bugüne kadar henüz incelenmemi olan, tümörün regresyon ya da progresyon yapma karar nda kritik bir rol oynayabilece!ini dü ündü!ümüz p14ARF gen ekspresyon düzeylerini, p14ARF gen metilasyonunun N-Myc ekspresyonu üzerindeki etkisini ilk kez inceleyecek olmas , olas etkilerinin hücresel ve moleküler mekanizmalar ile birlikte irdelenmesi, yeni tedavi yakla mlar n n ve prognostik belirteçlerin öngörülmesini sa!layacak olmas aç s ndan literatürde öncü çal ma olacakt r.
2
2
.
.
G
G
E
E
N
N
E
E
L
L
B
B
L
L
G
G
L
L
E
E
R
R
2.1 NÖROBLASTOM: Tan2m ve Özellikleri
Nöroblastom, çocukluk ça! n n en s k görülen ekstrakraniyal solid tümörüdür. Primordial nöral krest hücrelerinden köken al r. Tüm çocukluk ça! kanserlerinin %8-10’unu olu turur. Bir ya alt ndaki çocuklar n en s k görülen tümörü olan nöroblastom, çocukluk ya grubunda santral sinir sistemi tümörlerinden sonra ikinci s kl kta kar m za ç kmaktad r (8).
Periferal Nöroblastik Tümörler (PNT), nöroblastom (NB), ganglionöroblastom (GNB) ve ganglionörom (GN)’dan olu an bir tümör grubudur (Fekil 1). Bu tümörler ba ta adrenal bezi olmak üzere, sempatik sinir sistemine ait dokulardan köken al rlar. PNT histolojik olarak nöroblastomatöz ve ganglionöromatöz komponentlerden meydana gelir (9):
• Nöroblastomtöz komponent, andifferansiye ya da differansiye nöroblastlar ve stromas nda nöropili içerir.
• Ganglionöromatöz komponent, ganglion hücrelerinden, fasiküler nörotik uzant lar olan Schwann hücrelerinden (Schwannian stroma) ve matür fibröz dokudan olu ur.
Nöroblastom gerek klinik davran , gerekse tümör hücrelerinde gözlenen genetik de!i iklikler bak m ndan heterojen özellik gösteren bir tümördür. Tümörün biyolojik davran ndaki de!i kenlik nedeniyle, nöroblastom spontan regresyonlar, benign transformasyon ya da agresif seyir gösterebilmekte, bu durum hastal ! n prognozunu belirlemede ve tedavisinde sorunlara yol açmaktad r (10). Hastal k olgular n % 40’ ndan fazlas nda letal olup çocukluk ça! tümörlerine ba!l ölümlerin yakla k % 15’ini olu turur. Nöroblastom olgular nda çe itli edinsel genetik de!i iklikler gözlenmektedir. Bu de!i iklikler aras nda MYCN onkogeninin amplifikasyonu, 1p36 ve 11q23 kromozom bölgelerinin delesyonu, 17 no’lu kromozomun uzun kolunda gözlenen dengesiz kopya say s art lar yeterince tan mlanm olup, bu de!i ikliklerin tümör davran ve tedaviye yan tla birliktelik gösterdi!i bilinmektedir (Fekil 2) (11).
2N
2N 2N/4N
2N/4N 2N/4N
T P1 : < 1ya ;
Hiperdiploid veya near triploid karyotip; TRKA ,
Lokalize hastal!k; Çok iyi prognostik grup
3N 3N Mitotik disfxn. Kromozomal bozukluklar TRKA TRKB 3p – , 11q – 17q + 17q + 1p –,17q + 1p –,17q + MYCN amplifikasyonu T P2A : 3p ve 11q delesyonu 17q kazan!m! TRKB ekspresyonu Ya daha büyük Daha ileri evreli hastal!k T P2: near diploid T P2B: MYCN amplifikasyonu 1p delesyonu 17q kazan!m! TRKB+ BDNF ekspresyonu 1 – 5 ya
leri evreli , h!zla progrese olan, S!kl!kla fatal hastal!k
7ekil 2. Nöroblastomun hücresel ve moleküler belirleyicilere göre s n flamas
Tümör davran n ve tedaviye yan t etkileyen bir di!er kriter, tümörün histopatolojik özelli!idir. Tümör hücre tipine göre nöroblastik (N-tip), stromal (S-tip) ve intermedier (I-tip) diye ba l ca üç s n fa ayr l r. N-tip nöroblastom hücreleri, nöronal, dar stoplazmal , nöroflamanlar ve psödoganglion olu turmaya e!ilimli, granin ve nörotransmiter enzim
ekspresyonu yapabilen, malign hücrelerdir. S-tip nöroblastom hücreleri (substrate-adherent
cells), nöronal olmayan, geni stoplazmal , vimentin ve CD44 ekspresyonu yapabilen, malign
olmayan hücrelerdir. I-tip nöroblastom hücreleri (stem cells) ise hem N-tip hem de S-tip hücrelerin özelliklerine sahiptir, bu hücre tiplerinden daha malign karakterlidir. Tümörün ba lamas , proliferasyonu ya da differansiyasyonu ve spontan regresyonu ile yak ndan ili kilidir. I-tip hücrelerin potansiyeli ne yönde ise tümörün davran o yönde olmaktad r. leri evre nöroblastom hastalar nda ve rekürren nöroblastom hastalar nda I-tip hücrelerin varl ! gösterilmi tir. Ayr ca N-tip nöroblastom hücreleri, yüksek miktarda MYCN proteini eksprese ederler ve bunlar ço!unlukla yüksek risk ta yan tümör hücreleridir. Çünkü MYCN onkogeni transkripsiyonu aktive ederek proliferasyonu ve tümörün büyümesini artt r rken, differansiyasyonu azalt r (12).
Bu bilgilerin ! nda, uluslar aras arenada, prognostik s n f, ya , histolojik incelemede diferansiasyon ve mitoz karyoreksis indeksi (MKI) özelliklerini kapsayan Shimada’n n patoloji s n flama sistemi (International Neuroblastoma Pathology Classification, “INPC”) kullan lmaktad r (Tablo 1) (13).
Tablo 1. Uluslararas Nöroblastom Patoloji S n flamas (INPC)
Shimada Prognostik s2n2f2
Ya5 Diferansiasyon Mitoz Karyoreksis ndeksi (MKI)
KÖTÜ < 18 ay Andiferansiye Herhangi Y < 18 ay Az diferansiye veya Diferansiye Dü ük (<%2) veya Orta (%2-4) KÖTÜ < 18 ay Herhangi Yüksek (>%4) KÖTÜ 18 ay – 5 y l Andiferansiye veya Az diferansiye Herhangi Y 18 ay – 5 y l Diferansiye Dü ük (<%2)
KÖTÜ 18 ay – 5 y l Diferansiye Orta (%2-4) veya Yüksek (>%4)
KÖTÜ > 5 y l Herhangi Herhangi
Nöroblastom’un klinik evrelemesinde ise genel kabul gören, cerrahiye dayal uluslar aras nöroblastom evreleme sistemidir (International Neuroblastoma Staging System, “INSS”) (Tablo 2); tedavi protokollerinin olu turulmas nda yap lmas gereken nöroblastom risk
s n flamas nda Amerika Birle ik Devletleri’ndeki Çocuk Onkoloji Grubu (Children Oncology Group “COG”) nun sistemi (Tablo 3) kullan lmaktad r.
Tablo 2. Uluslararas Nöroblastom Evreleme Sistemi (INSS)
INSS Evre Tan2m
Evre 1 Tümör köken ald ! organda s n rl , makroskopik tam rezeksiyon. Mikroskopik tümör art ! olabilir veya olmayabilir. psilateral veya kontlateral lenf nodu tutulumu yok.
Evre 2a Unilateral tümör, tam olmayan makroskopik rezeksiyon. psilateral veya kontlateral lenf nodu tutulumu yok.
Evre 2b Unilateral tümör, tam veya tam olmayan makroskopik rezeksiyon. psilateral bölgesel lenf nodu tutulumu var, kontlateral lenf nodu tutulumu yok.
Evre 3 Orta hatt a an tümör ± bölgesel lenf nodu tutulumu Unilateral tümör + kontlateral lenf nodu tutulumu Orta hat tümörü +bilateral lenf nodu tutulumu
Evre 4 Yayg n hastal k, uzak metastazlar (kemik ili!i, kemik, uzak lenf nodu, karaci!er ve/veya di!er organlar )
Evre 4S Hastan nya <365 gün; Evre 1 ve 2 gibi lokalize primer tümör var; sadece karaci!er, cilt ve/veya kemik ili!i tutulumu (kemik ili!inde tümör hücrelerinin oran <%10 olmal ).
Avrupa Nöroblastom Grubu (International Society of Pediatric Oncology European Neuroblastoma Group, SIOPEN) ise, gerek cerrahi risk faktörlerine, gerekse sitogenetik, moleküler genetik, patolojik faktörlere dayal bir risk klasifikasyon sistemi olu turmaya çal maktad rlar. Bu klasifikasyon çal malar n n da tamamlanmak üzere oldu!u bildirilmi tir (14).
Nöroblastom olgular n n klinikte sitogenetik, moleküler genetik, patolojik de!erlendirme ve evreleme çal malar tamamland ktan sonra, uygun tedavi protokollerinin seçilmesi için risk s n flamas yap lmakta ve riske dayal tedavi protokolleri uygulanmaktad r.
Türkiye’de nöroblastom tan l çocuk hasta say s n , karakteristik özelliklerini belirlemek amac yla ilk kez, 1992’de Ege Bölgesi’nde zmir Pediatrik Onkoloji Grubu ( POG-1992) kurulmu tur. POG-1992 nöroblastom tedavi protokolüyle ba layan çal malar, daha sonra TPOG-NB-2003 (Türk Pediatrik Onkoloji Grubu - Nöroblastom - 2003) protokol çal mas yla devam etmi tir. TPOG-NB–2003 protokolü, Türkiye’deki 30 çocuk onkoloji merkezinde 01.10.2002 tarihinde uygulanmaya ba lanm ; 2009 y l nda ise, 2003 protokolü tamamlanm ve yeni protokole geçilmi tir. Bu protokollerin amac , Türkiye’deki nöroblastom tedavisinin standardize edilmesi ve yo!un tedavi protokollerinin ülkemiz
ko ullar nda uygulanabilirli!inin de!erlendirilmesidir. TPOG-NB-2009 tedavi protokolünde de yukar da sözü edilen risk klasifikasyonu (Tablo 3) kullan lmaktad r.
Tablo 3. Çocuk Onkoloji Grubunun (COG) kabul etti!i ve TPOG NB 2003 Protokolünde
kullan lan Nöroblastom Risk S n flamas
R SK Grubu INSS Evre Ya5 (y2l) MYCN
Amplifikasyonu
Shimada Histolojisi
DNA ploidi
1 0-21 herhangi herhangi herhangi
2A-2B <1 herhangi herhangi herhangi
2A-2B ] 1 (-) herhangi herhangi
2A-2B ] 1 (+) iyi herhangi
Dü5ük 4S <1 (-) iyi > 1 3 <1 (-) iyi >1 3 ] 1 (-) iyi herhangi Orta yi Histoloji 4 <1 (-) iyi >1 3-4 <1 (-) iyi 1 3-4 <1 (-) kötü >1 4S <1 (-) kötü herhangi Orta Kötü Histoloji 4S <1 (-) iyi 1 2A-2B ] 1 (+) kötü 3 0-21 (+) herhangi herhangi 3 ] 1 (-) kötü herhangi
4 >1 herhangi herhangi herhangi
4 <1 (+) herhangi herhangi
Yüksek
4S <1 (+) herhangi herhangi
Dokuz Eylül Üniversitesi T bbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dal ’nda tümör dokusu veya tutulu kemik ili!i örneklerinde MYCN onkogen amplifikasyonu çal lmakta ve MYCN için 10 kopyan n üzeri amplifikasyon olarak kabul edilmektedir. Hastalarda MYCN onkogen amplifikasyonu çal lmam ise, bu grup için ya , INSS evre ve INPC histolojik inceleme sonucu dikkate al narak risk s n flamas yap lmaktad r (Tablo 4).
Tablo 4. MYCN Onkogen Analizi Yap lmam Olgular n TPOG NB 2003 Protokolündeki
Nöroblastom Risk S n flamas
R SK Grubu INSS Evre Ya5 (y2l) Shimada Histolojisi
1 0 – 21 herhangi 2a – 2b 0 – 21 herhangi Dü5ük 4S <1 yi 3 0 – 21 yi 3 ] 1 yi Orta yi Histoloji 4 <1 yi 3 – 4 <1 Kötü Orta Kötü Histoloji 4S <1 Kötü 3 ] 1 Kötü Yüksek 4 > 1 herhangi
2.1.1 Nöroblastom Tedavi Protokolünde zlenen Stratejiler Nelerdir?
Bugün dünyada uygulanan multimodal tedavi protokolleri, sitogenetik ve moleküler genetik özellikler, MYCN amplifikasyonu, klinik evre, ya , DNA ploidisine göre haz rlanm olan risk s n flama sistemine dayanmaktad r. TPOG-NB-2009 protokolünde de bu sistem kullan lmaktad r (15).
Son y llarda tümör biyolojisi hakk nda bilgilerin artmas na, lokalize hastal kta kombine tedavi protokolleri ile ba ar sa!lanmas na ra!men, özellikle 1 ya üzeri ileri evre hastalar n (E3+E4) prognozunda belirgin bir iyile me sa!lanamam t r. As l problem evre 3 (E3) ve özellikle de evre 4 (E4)’dedir. Olgular n yar s ndan fazlas n n E3 ve E4’de tan ald ! göz önüne al n rsa, nöroblastomlu hastalar n büyük bir k sm nda bugünkü yo!un protokoller, kök hücre deste!i ve immünoterapi yakla mlar na ra!men halen istenen ba ar elde edilememektedir. ki y ll k hastal ks z ya am süresi (Progression-free survival, PFS) %30–35 düzeylerinde kalmaktad r. Özellikle ileri evre hastalarda (minimal rezidüel hastal k görülme s kl ! yüksek olan grup) ba ar s zl k nedenlerini aç !a ç karacak ve bunlar tedavi edebilecek yöntemlerin geli mesine olanak tan yan çal malara ihtiyaç bulunmaktad r (15, 16).
Nöroblastomda, Sisplatin’e dayal kemoterapi protokolleriyle ba layan çal malar bugün, Sisplatin, Siklofosfamid, Doksorubisin, Vinkristin, Dakarbazin, fosfamid ve Etoposid’den olu an çoklu kemoterapötik ajanlar n olu turdu!u tedavi protokolleriyle devam etmektedir. Ayr ca bu protokollere ek olarak primer tümör bölgesine ve metastazlara radyoterapi uygulanmakta ve cerrahinin de katk s yla birlikte yani, multimodal tedavi protokolleriyle hastal kta ba ar elde edilmeye çal lmaktad r. Bu tedavi yakla mlar na ek olarak, özellikle ileri evre yüksek risk hastalarda yüksek doz kemoterapi protokolleri, immünoterapi protokolleri, antianjiyogenik tedaviler, apoptotik tedavi yakla mlar , I123 -metaiyodobenzilguanidin (I123-MIBG) tedavi protokolleri gündemdedir (17).
Bu protokollerle olgular n ya am süreleri uzarken, beraberinde geç relapslar n da görülme s kl ! artmaktad r. Tedavi kesimini takiben 1 y ldan sonra ortaya ç kan relapslar, “geç relaps” olarak isimlendirilmektedir. Nöroblastomda geç relapslardan sorumlu olan en önemli faktör, minimal rezidüel hastal k (Minimal Residual Disease, MRD) t r. Bu nedenle MRD’yi kontrol etmeye yönelik idame tedavileri, son 15 y lda giderek önem kazanmaktad r (18).
dame tedavilerinde; dü ük doz kemoterapi (metronomik tedavi), sitotoksik ajanlar, diferansiye edici ajanlar (13-sisretinoik asit) ve immünoterapi yöntemleri (nöroblastom GD2 antijenine kar geli tirilmi monoklonal antikor tedavisi) denenmektedir (19).
Alman Pediatrik Onkoloji - Hematoloji Grubu (GPOH), tedavinin geç dönemlerinde tümör hücrelerinin sensitif faza geç girmeleri nedeniyle geç relapslar n olabilece!i ve bu nedenle hücre ölümünün gerçekle tirilebilmesi gerekti!i dü üncesinden yola ç karak ilk kez, 1982 nöroblastom tedavi protokolünde ileri evre olgularda idame tedavisi protokolünü olu turmu lard r (19).
Bugün Amerika Çocuk Onkoloji Grubu, yüksek doz kemoterapi protokollerinin ard ndan 13-sisretinoik asit ya da monoklonal antikor gibi ajanlar idame tedavisi olarak kullanmaktad r. Avrupa Nöroblastom Grubu (SIOPEN) da nöroblastomda idame tedavisi kullanmaya ba lam t r (19).
TPOG taraf ndan 1992 y l nda haz rlanm olan nöroblastom tedavi protokolüne göre tedavi edilen hastalarda da, geç relapslar (61. ayda) görülmektedir (20). TPOG-1992
nöroblastom tedavi protokolünden elde edilen deneyimlerle haz rlanan 2003 protokolünde, özellikle yüksek riskli hasta grubuna idame tedavisi eklenmi tir.
2.1.2 TPOG-NB-2003 Riske Dayal2 Tedavi Yakla52m2
Dü ük risk grubunda (DRG); evre 1’de sadece cerrahi, evre 2’de cerrahiye ek 3 kür
kemoterapi (sisplatin, vinkristin, ifosfamid), evre 4S’de cerrahiye ek 4 kür kemoterapi (vinkristin, siklofosfamid) verilmektedir.
Orta risk grubunda (ORG); cerrahiye ek 2 – 4 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid,
dakarbazin, adriamisin / sisplatin, siklofosfamid, etoposid) verilmektedir. dame tedavi ve 13 cis-retinoik asit 10 hafta verilmektedir. Rezidüel hastal !a radyoterapi uygulanmaktad r.
Yüksek risk grubunda (YRG); hastalar tan sonras sorumlu hekimin karar na göre
konvansiyonel kemoterapi (KKT) veya yüksek doz kemoterapi(YDKT)+otolog kök hücre nakli(OKHN) ile tedavi edilmektedirler.
YRG-KKT kolunda 4 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid, dakarbazin, adriamisin /
sisplatin, siklofosfamid, etoposid), ard ndan geciktirilmi cerrahi, 6 ay idame kemoterapi verilmektedir.
YRG-OKHN kolunda 3 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid, dakarbazin, adriamisin /
sisplatin, siklofosfamid, etoposid), geciktirilmi cerrahi ve haz rlama rejiminden (karboplatin, etoposid, melfalan) olu ur. Primer tümör bölgesine radyoterapi uygulan r.
2.2 MET LASYON VE KANSER
Metilasyon, memeli DNA’s nda gerçekle ti!i bilinen tek kovalan olayd r ve sadece CG (CpG) dinükleotidlerinde bulunan sitozinlerde meydana gelir. 1950 y l ndan beri varl ! bilinen 5-metilsitozin (5 mC), modifiye bir bazd r ve genomdaki bazlar n yakla k %4’ünü olu turur. Metile CpG dinükleotidlerinin ço!u; sentromerik tekrarlar, satellit dizileri ve tekrarlayan genler gibi dizilerde yer al r. Tüm genomun yakla k %2’sini ve CpG’lerin yakla k %15’ini olu turan CpG adac klar ise; 0,2-1 kb uzunluktad r ve insan genomundaki genlerin yakla k %50’sinin promotor bölgelerinde bulunur (21).
DNA metilasyonu memeli genomunda transkripsiyonel bask lama, kromatin yap n n de!i tirilmesi, X kromozomu inaktivasyonu, genomik imprinting, tekrarlayan ve parazitik DNA dizinlerinin bask lanmas gibi önemli etkilere sahiptir. Normal hücreler de ekstragenik DNA (CpG dinükleotidleri) metileyken, gen promotorlar nda bulunan CpG adac klar demetiledir, bunun istisnas X inaktivasyonuna ve genomik imprintinge u!rayan genlerdir; bunlar, normal hücrelerde de tek alelden ekspresyonun sa!lanmas için sadece bir alelde metiledir. Normal dokularda imprintinge ve X inaktivasyonuna u!rayan genler d nda da ender olarak CpG adac k metilasyonu gözlenir ve s kl kla genin susturulmas na yol açar. Promotor bölgeden çok gen içindeki CpG adac klar nda saptan r, promotorda olmas durumunda ise; CpG içeri!i az olan promotor bölgelerde CpG yo!un olanlara göre daha fazla gözlenir. Promotor, bir genin 5’ ucunda bulunan ve transkripsiyon faktörleri ile RNA polimeraza ba!lanma bölgesi olu turan DNA dizisidir ve gen ekspresyonunun kontrolünde önemli role sahiptir. Normal hücrelerde gözlenen promotor bölge metilasyonunun hücre farkl la mas nda, dokuya özgü genlerin ekspresyonunu düzenleyerek etkili oldu!u dü ünülmektedir (22).
Epigenetik, en basit ekliyle çevre ve genetik aras ndaki etkile imdir; ayn genotipin nas l olup da farkl fenotiplere yol açt ! n n en iyi aç klamas n sunar. Gen nükleotid dizisinde de!i iklik olmaks z n, gen ifadesinde kal t labilir de!i imler gözlenmesi olarak tan mlanabilir. Epigenetik mutasyon olarak adland r labilen CpG adac klar ndaki metilasyon kal b de!i ikli!i; her hücre bölünmesinde pasif olarak kal t lan mutasyonlar n aksine, aktif olarak kal t l r ve gen ifadesini de!i tirebilir (22, 23). Epigeneti!in gen ifadesi kontrolündeki en
temel etkisi transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya ula mas n engelleyecek mekanik de!i iklikler yaratmas d r. Bu mekanik etki, geri dönü lü olmas aç s ndan DNA dizisinde gözlenen mutasyonlardan farkl l k gösterir (23).
Kanser olu umu; bir hücrenin, genetik yap s nda ard ard na olu an kal t labilir de!i ikliklerin birikmesi sonucu, büyüme avantaj kazanmas ile aç klanabilir. Bu süreçte etkili iki s n f gen vard r, bunlar onkogenler ve tümör bask lay c genlerdir. Bu genlerin nükleotid dizisini de!i tirerek hatal protein yap m na neden olan, genin kopya say s n de!i tiren ya da transkripsiyonunu artt ran/azaltan de!i iklikler kansere yol açabilir. Onkogenlerde gözlenen de!i iklikler onlar n normalden fazla ifade bulmas na neden olurken, tümör bask lay c genlerde gözlenenler s kl kla ekspresyon azalmas na yol açar. Kanser olu umunda bir di!er hipotez de Knudson’un iki vuru hipotezidir. Bu hipoteze göre, malign dönü ümün olu abilmesi için organizmada tümör baskl lay c genlerin iki alelinin de i lev kaybetmesi gereklidir. Bugün, bu iki vuru un birinin genetik (nokta mutasyonu, delesyon, çerçeve kayma mutasyonu …), di!erinin epigenetik (promotor metilasyonu) ya da her ikisinin de genetik veya epigenetik olabilece!i bilinmektedir (24).
Antikanser tedaviler, sitotoksik etkilerini ba l ca tümör hücrelerinde proliferasyonu durdurarak, diferansiyasyonu artt rarak ve apoptozisi uyararak gerçekle tirirler. Kanser tedavisinde son y llardaki geli meler; kanser tan s risk belirleme ve tedavisinde epigenetik yakla mlar n önemini vurgulamaktad r (Fekil 3).
2.2.1 p14ARF Metilasyonunun Kanser Olu5um Sürecindeki Önemi
Ba lang çta yüksek risk nöroblastomlar n ço!unda, sitotoksik tedavilere ve lokal radyoterapiye iyi yan t al n yor iken son zamanlarda, relaps s kl ! n n giderek art gösterdi!i izlenmektedir. Bunun da nedenleri aras nda, tedavinin yo!unlu!u ile korele bir ekilde geli en ilaç direncinin önemli rol oynad ! bildirilmi tir (25). Tümör hücrelerindeki intrensek kemorezistans n en önemli mekanizmas , p53/MDM2/p14ARF yola! ndaki anormalliklerdir. p53 geni, 17. kromozomun k sa kolunda (17p13) lokalize olup tümör bask lay c olarak fonksiyon görür. Kanserlerin büyük bir ço!unlu!unda p53 geninde mutasyon oldu!u bilinmektedir. Onkojenik bir uyaran nedeniyle p53 geninin aktivasyonu sonucunda, hücre döngüsü duraklat l p apoptoz ili kili çok say da genin transkripsiyonu tetiklenir ve hasara u!ram olan hücre apoptoz yoluyla ortadan kald r l r (Fekil 4).
7ekil 4. p14ARF geninin, p53 tümör bask lay c gen yola! n aktivasyon mekanizmas
INK4a/ARF loküsü, 9 nolu kromozomun k sa kolunda (9p21-22) lokalize olup, siklin-ba! ml kinaz inhibitörü p16INK4a ve p14ARF olmak üzere, yap sal olarak iki farkl gen ürününü kodlar. p16INK4a geni retinoblastomda, p14ARF geni p53 yola! nda önemli ve aktif rol oynarlar. Bu nedenle, heriki genin hücre ço!almas n n kontrolünde etkin görevleri bulunmaktad r. Dolay s yla, bu genlerin inaktivasyonuna neden olabilecek herhangi bir durumda, hücre ço!almas ndaki kontrol ortadan kaybolarak kanser geli imi ba layabilmektedir. p14ARF ve p16INK4a ekson 2 ve 3 için ortak kodlay c diziler içerirler, ancak promoter ve ekson 1
bölgeleri farkl d r. p14ARF geni, p53 geninin proteozom arac l degradasyonu yoluyla genin inaktivasyonuna neden olan MDM2’nin ubikitin ligaz aktivitesini inhibe ederek, p53 tümör bask lay c yola! aktive eder ve hücre döngüsünü durdurur. Delesyon veya metilasyon nedeniyle p14ARF geninin inaktivasyonu sonucunda, MDM2 düzeylerinin artmas yla p53 geni inaktive olur (26). Tüm bu mekanizmalardan da anla ld ! üzere, p53/MDM2/p14ARF yola! n n, normal hücre döngüsünün kontrolünde kanser olu umunda kritik bir öneme sahip oldu!u belirgindir.
Nöroblastomda, p53 mutasyon oran olgular n %2’sinden az nda gözlenmektedir. Relaps ile gelen olgular n yap lan analizlerinde ise, sitotoksik tedavi sonras nda bu tedaviyle do!rudan ili kili bir ekilde, p53 mutasyon oranlar n n artt ! n bildiren çal malar vard r (27). Di!er yandan, baz nöroblastom hücre hatlar nda yap lan çal malarda, tedavi sonras nda, p14ARF gen delesyonu veya MDM2 amplifikasyonu gibi çe itli mekanizmalar ile p53 geninin fonksiyonel inaktivasyonunun meydana geldi!i gösterilmi tir (28).
Nöroblastomda, minimal rezidüel hastal ! n ortaya ç kmas ndaki ba l ca nedenlerden
biri olan kemoterapi direncinin geli iminde rol oynayan en önemli mekanizmalardan biri
p-glikoproteini kodlayan MDR-1 (multidrug resistance gene) geni, di!eri de
p53/MDM2/p14ARF yola! ndaki fonksiyon bozukluklar d r (29).
Sonuç olarak; p14ARF geninin metilasyon ile inaktivasyonunun, hem nöroblastom olu um sürecinde hem de tedavi verildikten sonra kar m za ç kan minimal rezidüel hastal kta oldu!u gibi relaps geli iminde çok önemli bir rol oynad ! bildirilmektedir (30). n vitro ve in vivo yap lan çal malar sonucunda, özellikle kemoterapi sonras nda ortaya ç kan relaps olgular nda, taksol, temozolamid ve arsenik trioksit gibi p53 yola! ndan ba! ms z etki gösterebilecek tedavi yakla mlar n n denenmesi gerekti!i vurgulanmaktad r (31).
Bütün bu bilgilerin ! nda, kanser olu umunda ve progresyonunda rol oynayan epigenetik de!i ikliklerin önemi anla ld kça yeni terapötik hedefler ortaya ç kmaktad r.
3
3
.
.
G
G
E
E
R
R
E
E
Ç
Ç
V
V
E
E
Y
Y
Ö
Ö
N
N
T
T
E
E
M
M
L
L
E
E
R
R
nsan nöroblastom MYCN (+) hücre dizisi KELLY (ACC 355) ve MYCN (-) hücre dizisi SH-SY5Y (ACC 209), Almanya DSMZ hücre kültürü koleksiyonundan al nd . Ara t rma için yap lan çal malar n ak emas Fekil 5’te verilmektedir.
(
( : ayn gün çal lan örnekler), (( : s v azotta ar ivlenen örnekler)
7ekil 5. Çal mada kullan lan yöntemlerin genel ak emas .
Kelly ve SH-SY5Y Hücre Dizileri
Kemoterapötik ilaçlarla 12 saatlik inkübasyon
Minimal Rezidüel Hastal2k Modelinin
Olu5turulmas2
Total RNA ve DNA izolasyonu
cDNA sentezi
Gen fadesinin Analizi
HÜCRE KÜLTÜRÜ
Hücrelerin s v azotta saklanmas
S v azotta saklanan hücrelerin çözünmesi
Sonuçlar2n statistiksel Analizi
Hücre Say m
Demetile edici ilaçla 72 saatlikinkübasyon
3.1 HÜCRE KÜLTÜRÜ
3.1.1 Hücrelerin ÇoNalt2lmas2
S v azotta dondurulan hücrelerin çözündürülmesi için; s v azot ar ivinden ç kar lan hücreler, h zla 37ºC su banyosunda hafifçe sallayarak çözüldü. Hücre süspansiyonunda küçük buz kristalleri olu tu!u anda su banyosundan ç kar ld . Fi enin d alkolle silindikten sonra hücreler 10 ml’lik steril dibi konik tüpe aktar ld . ki dakika içinde hafifçe tüpü sallayarak damla damla so!uk (+4ºC) RPMI-1640 (Gibco) ilave edildi. Hücre süspansiyonu 200 x g’de 10 dakika so!utmal santrifüjde döndürüldü. Süpernatant dikkatli bir ekilde uzakla t r ld . Hücreler, uygun besi ortamlar ile süspanse edildi.
KELLY hücreleri, %10 FBS (Sigma-Aldrich), %1 L-Glutamin (Sigma-Aldrich), %1 Penisilin-Streptomisin (Sigma-Aldrich) ilavesiyle haz rlanan RPMI ortam nda 75 cm2’lik kültür flask na ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . Her 3 günde bir ortam
de!i tirilerek yakla k %90 yo!unlu!a gelmesi sa!land . Daha sonra 1:3 oran nda pasaj yap ld (P2).
SH-SY5Y hücreleri ise, %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin ilavesiyle haz rlanan DMEM (Gibco) ortam nda 75 cm2’lik kültür flask na ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li
inkübatöre kald r ld . Her 4 günde bir ortam de!i tirilerek yakla k %90 yo!unlu!a gelmesi sa!land . Yo!unluk sa!land ktan sonra 1:3 oran nda pasaj yap ld (P2).
Hücre kültürü ortamlar n n de!i tirilmesi ve hücrelerin pasajlanmas eklindeki a amalar, kemoterapötik ilaç eklenebilmesi için yeterli hücre say s na ula ncaya kadar tekrarland . laç eklendi!inde 1x106 canl hücre kalabilmesi için öngörülen hücre say lar n n eldesi yakla k 2 ayl k bir süreçte gerçekle ti.
3.1.2 n Vitro Minimal Rezidüel Hastal2k Modelinin Olu5turulmas2
Nöroblastomda minimal rezidüel hastal k modelini olu turabilmek için, ba lang çta flaska ekilen hücre say s , kemoterapötik ilaç eklenmesiyle %90 hücre ölümünden sonra 1x106 canl hücre kalacak ekilde hesapland . Bunun için, 32 ayr 75 cm2’lik kültür flask na 1x108 hücre ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . Sonuç olarak; 16 tane
MYCN (+) grup, 16 tane MYCN (-) grup olu turuldu.
Toplam 32 hücre grubu için kemoterapötiklerin dozlar , TPOG-NB-2009 nöroblastom tedavi protokolünde, 1 ya ve üzerindeki yüksek risk grubu hastalar için düzenlenmi olan A9
ve A11 bloklar ndaki ilaç dozlar na göre, 75 cm2’lik kültür flasklar na uygun olarak hesapland (Fekil 6).
Yüksek Risk Grubu
Konvansiyonel Kemoterapi
OP A9 OP VGPR, PR
CR 13 cis RAdame tedavi
Rezidü Hastal&k (+) OP
De+erlendirme
NR, PD Protokol d&,& De+erlendirme Metastaz RT** E+er gerekiyorsa kemik metastazlar&na palyatif RT
A11 x 3 A9 A11
Pri tm •MIBG (+) veya •Oktreotid (+) RT Primer tm
Hastan&n ya,& < 6 ay ise A7 kürü kemoterapi uygulanacak.
De+erlendirme VGPR, PR Pri tm •Canl& tümör varsa veya •MIBG (+) veya •Oktreotid (+) •RT Primer tm dame tedavi 13 cis RA De+erlendirme
7ekil 6. TPOG-NB-2009 Protokolü Yüksek Risk Grubu Tedavi Femas
A9 KÜRÜ
Vinkristin 1,5 mg/m2/doz/gün, V pu e, 1. ve 5. günler
DTIC (Dakarbazin) 200 mg/m2/doz/gün, 30 dakikal k V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Ifosfamid 1500 mg/m2/doz/gün, 20 saatlik V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
+ %100 MESNA 1500 mg/m2/doz/gün, 20 saatlik V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
A11 KÜRÜ
Siklofosfamid 300 mg/m2/doz/gün, 1 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
MESNA 3 x 60 mg/m2/doz, 10 dakikal k V infüzyon,
MESNA siklofosfamidin 0., 4. ve 8. saatlerinde, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Etoposid 80 mg/m2/doz/gün, 5 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, ve 4. günler
Sisplatin 30 mg/m2/doz/gün, 18 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Yakla k %90 hücre yo!unlu!una ula m flasklara, %90 hücre ölümünü sa!layacak dozlarda Vinkristin (1 mg/mL, Orna: 0,01125 mg), Dakarbazin (10 mg/mL, Aventis: 1,5 mg), fosfamid (40 mg/mL, Eczac ba : 11,25 mg), Doksorubisin (2 mg/mL, Farmar: 0,225 mg), Siklofosfamid (100 mg/mL, Eczac ba : 2,25 mg), Etoposid (20 mg/mL, Atafarm: 0,6 mg) ve Sisplatin (0,5 mg/mL, Koçak Farma: 0,225 mg) eklendi ve 12 saatlik inkübasyon için 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . 12 saat sonra, tripan mavisi hücre canl l k testi ile
toma lam nda say m yap ld . Kemoterapötik ilaçlarla inkübasyon sonras canl kalabilen %10 oran ndaki hücreler ya at l p ço!alabilmeleri için 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre
kald r ld . Minimal rezidüel hastal k modelini temsil eden hücre grubu %90 yo!unlu!a ula t ! nda, kontrol gruplar d ndaki tüm flasklara 5’-aza-CdR (5µmol/L; Sigma, St. Louis, MO: 0,18 mg) eklendi. 72 saatlik inkübasyon sonras nda hücreler flasklardan kald r ld ve total RNA izolasyonlar yap ld .
3.1.3 Tripan Mavisi ile Hücre Canl2l2N2 Testi
Hücre süspansiyonunda bulunan hücrelerin % 0,4’lük tripan mavisi ile canl l klar kontrol edildi (32). Test, canl hücrelerin boyay membranlar ndan içeri geçirmeme prensibine dayanmaktad r. K saca, bire bir oran nda hücre süspansiyonu örne!i ile tripan mavisi lam üzerinde hafifçe kar t r ld . Yakla k 2-3 dakika bekletildikten sonra k mikroskobunda canl ve ölü hücrelerin tümü say ld . Tripan mavisi ile boyanmayan hücrelerin yüzdesi hesapland . Canl l k testi % 10’un üzerinde ç kan hücre süspansiyonlar seçildi.
Tripan-Blue Solüsyonu:
0,04 g Trypan-blue stain 10 ml distile suda çözüldü. 3 ml Trypan blue solüsyonuna 19 ml PBS ilave edildi. 0,2 µm’lik filtreden geçirilerek kullan ma haz r hale getirildi.
3.2 MYCN ve p14ARF GEN FADELER N N ANAL Z
3.2.1. Total RNA zolasyonu
Total RNA ekstraksiyonu, MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar ndan “High Pure RNA Isolation Kit“ (Roche Diagnostic GmBH, Mannheim, Cat # 11 828 665 001) kullan larak yap lm t r. Yöntem üretici firman n önerdi!i ekilde gerçekle tirilmi tir.
Tripsin/EDTA ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Hücreler 200 bl fosfat tampon solusyonunda (PBS) resüspanse edildi. 400 bl lizis/ ba!lay c (lysis/binding buffer) tamponu eklendi ve 15 saniye vortekslendi. Örnekler filtreli tüpe aktar ld ve 8000 x g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama tüpüne geçen alt k s m at ld ve her bir örnek için 90 bl Dnase inkübasyon tamponu (Dnase incubation buffer) ve 10bl Dnase I eklendi. 15 dakika oda s s nda inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 500 bl y kama tamponu I (wash buffer I) eklendi 8000 x g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama tüpüne geçen alt k s m at ld . 500 bl y kama tamponu II (wash buffer II) eklendi 8000 x g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama tüpüne geçen alt k s m at ld .Tekrar 200 bl y kama tamponu II (wash buffer II) eklendi, 13000 x g’de 2 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpleri at ld ve filtreler 1,5 ml’lik ependorflara aktar ld , 100 bl elüsyon tamponu (elution buffer) eklenip 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Ependorfa geçen k s mda RNA elde edilmi oldu. Filtreli tüpler at ld ve total RNA örne!inin bulundu!u tüplerdeki RNA kalitesi spektrofotometrik yöntem (PG Instrument T 80 + UV/VIS) ile de!erlendirildi ve daha sonra kullan lmak üzere -80ºC’de sakland .
3.2.2 DNA zolasyonu
DNA izolasyonlar , MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar ndan “High Pure PCR Template Preparation Kit” (Roche Diagnostic GmBH, Mannheim, Cat # 11 796 828 001) kullan larak yap lm t r. Yöntem üretici firman n önerdi!i ekilde gerçekle tirilmi tir.
Tripsin/EDTA ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Hücreler 200 bl fosfat tampon solusyonunda (PBS) resüspanse edildi. Her bir örne!e 200 bl ba!lay c tampon (binding buffer) ve 40 bl proteinaz K eklendi. 70 C0’de 10 dakika inkübe edildi.
nkübasyon sonras nda 100 bl izopropanol eklendi ve iyice kar t r ld . Filtreler toplama tüplerine geçirildi ve örnekler filtrelere aktar ld . 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü yenisi ile de!i tirildi. 500 bl inhibitör ayr m tamponu (inhibitor removal buffer) eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü yenisi ile de!i tirildi. 500 bl
y kama tamponu (wash buffer) eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü yenisi ile de!i tirildi. Yeniden 500 bl y kama tamponu (wash buffer) eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü içindeki s v at ld , 13000 x g’de 10 saniye santrifüj edildi. Filtreler ependorfa aktar ld . Her bir örne!e 200 bl elüsyon tamponu (elution buffer) eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Ependorfa geçen k s mda DNA elde edilmi oldu. DNA kalitesi spektrofotometrik yöntem (PG Instrument T 80 + UV/VIS) ile de!erlendirildi.
3.2.3 Komplementer DNA (cDNA) Sentezi
Elde edilen RNA’lardan 12’ er bl total RNA örne!i kal p olarak kullan larak cDNA sentezi, “SABiosciences’s RT2 First Strand Kit” (Cat # C-03) ile gerçekle tirildi. 8 bl’sinde 20 ng RNA olan örneklere genomik DNA eliminasyonu yapmak için 2 bl 5X gDNA eliminasyon tamponu eklendi, iyice kar t r ld , Thermal Cycler (Eppendorf AG, Hamburg, Germany)’da 42 C0’de 5 dakika inkübe edildi. nkübasyon sonras nda buz üzerine al nd . Her bir örnek için a a! da gösterilmi miktarlarda RT kokteyl haz rland :
RT kokteyl Miktar 5X RT tampon 3 4 bl Primer ve eksternal kontrol miks 1 bl RT enzim miks 3 2 bl Rnaz içermeyen H2O 3 bl Toplam hacim 10 ,l
Haz rlanm RT kokteyl, genomik DNA eliminasyonu yap lm ve buz üstüne al nm örneklere eklendi, iyice kar t r ld . Termal Cycler’da 42 C0’de 15, 95 C0’da 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra örnekler -20 C0’ye kald r ld .
3.2.4 Real time-PCR ile Gen Ekpresyon Analizleri
RT-PCR gen ekspresyon analizleri SABiosciences’s RT2 qPCR Master Miksleri ile gerçekle tirildi. MYC-N (NM-005378), P14ARF (CDKN2A) (NM-000077) genleri için uygun primerler kullan ld . “House keeping” gen olarak ise GADPH (NM-002046) seçilmi tir.
Her üç gen için PCR miksleri ayr ayr u oranlarda haz rland : RT2qPCR master miks 12,5 bl
ddH2O 10,5 bl
Dilue edilmi cDNA 1,0 bl
RT2qPCR primerler 1,0 bl
Toplam hacim 25 ,l
PCR miksi 96 kuyucuklu örnek küvetine yüklendi ve Roche Light Cycler® 480 cihaz nda u protokolde reaksiyon gerçekle tirildi:
Siklus Süre S2cakl2k
1 10 dakika 95 C0
15 saniye 97 C0
Roche Light Cycler®480 45
1 dakika* 72 C0
* Her 45 siklusun sonundaki uzama evresinde SYBR Green floresan ölçüldü. Erime e!risi analizi yap ld :
Süre S2cakl2k 65 C0’den 95 C0’ye s2cakl2k art252/dakika
1 dakika 95 C0
Roche Light Cycler®480
2 dakika 65 C0
2 C0/ dakika
Veri analizleri 5u 5ekilde yap2ld2: Herbir gen Cp (Crossing point) de!erlerinin ortalamas
al narak GADPH referans geni ortalama Cp de!erine göre fark hesapland . Daha sonra herbir genin kontrol GADPH genine göre R (ratio) ekspresyon katlar hesapland .
3.2.5 DNA Metilasyon qPCR Analizleri
p14ARF geninin metilasyon durumu ”Methyl-Profiler DNA Methylation qPCR Assays” (SABiosciences’s DNA methylation enzyme kit, Cat # MeA-03; RT2 SYBR Green qPCR Master Mix, Cat # PA-010) ile incelendi.
Testte demetile ya da metile DNA’y kesmek için DNA metilasyonuna duyarl ve ba! ml enzimler kullan ld . DNA kesiminden sonra p14ARF geninin primerleri (NM-058195) kullan larak qPCR analizleri Roche Light Cycler®480 cihaz nda gerçekle tirildi.
Hipermetile, orta dereceli metile ve demetile DNA relatif konsantrasyonlar “mock digest (sahte kesim)” yap lm DNA miktarlar ile kar la t r larak hesapland .
DNA kesimi için herbir örnek ba na dört ayr tüp u ekilde haz rland :
a) Mock Digest (Mo): RT-PCR deneyi için gerekli olan tüm genomik DNA’y içeren tüp.
b) Metilasyon duyarl2 kesim (Ms): Demetile ya da k smen metile DNA’n n metilasyona
duyarl enzim ile kesilip, hipermetile DNA’n n RT-PCR deneyi için bulundu!u tüp.
c) Metilasyon baN2ml2 kesim (Md): Metile DNA’n n metilasyona ba! ml enzim ile kesilip,
demetile DNA’n n RT-PCR deneyi için bulundu!u tüp.
d) Çift kesim (Msd): Metilasyona duyarl ve metilasyona ba! ml enzimlerin bulundu!u
enzimatik kesim ba ar s n n ölçüldü!ü tüp. Herbir örnek için kokteyl u ekilde haz rland :
Bile5enler Miktar
Çift distile su 89 bl
5X kesim tamponu ( 5X RM buffer) 26 bl
0,5 bg örnek DNA 5 bl
Toplam hacim 120 ,l
Haz rlanan kokteyl vortekslendi ve u ekilde dört ayr tüpe bölündü:
Farkl2 i5lemlenmi5 PCR tüpleri
Bile5enler Mo Ms Md Msd Çift distile su 2 bl 1 bl 1 bl - bl Kesim kokteyli 28 bl 28 bl 28 bl 28 bl Enzim A (Metilasyona duyarl2 enzim) - bl 1 bl - bl 1 bl Enzim B (Metilasyona baN2ml2 enzim) - bl - bl 1 bl 1 bl Toplam 30 ,l 30 ,l 30 ,l 30 ,l
Tüpler vortekslendi ve iyice kar t r ld . Termal Cycler’da 37 C0’de bir gece inkübasyona b rak ld . nkübasyon sonras nda enzimlerin inaktive olmas için, 65 C0’de 20 dakika inkübe edildi. Daha sonra örnekler qPCR analizleri için -20 C0’ye kald r ld .
Herbir örnek için u ekilde PCR reaksiyon kokteylleri haz rland :
PCR reaksiyon kokteylleri Mo Ms Md Msd Çift distile su 9.5 bl 9.5 bl 9.5 bl 9.5 bl PCR master miks 12.5 bl 12.5 bl 12.5 bl 12.5 bl PCR primer miks 1 bl 1 bl 1 bl 1 bl Mokesim 2 bl Mskesim 2 bl Mdkesim 2 bl Msd kesim 2 bl Toplam 25 ,l 25 ,l 25 ,l 25 ,l
PCR miksi, 96 kuyucuklu örnek küvetine yüklendi ve Roche Light Cycler®480 cihaz nda u protokolde reaksiyon gerçekle tirildi:
Siklus Süre S2cakl2k
1 10 dakika 95 C0
15 saniye 97 C0
Roche Light Cycler®480 40
1 dakika* 72 C0
* Her 40 siklüsün sonundaki uzama evresinde SYBR Green floresan ölçüldü.
Veri analizleri 5u 5ekilde yap2ld2:
www.sabiosciences.com/dna_methylation_data_analysis.phpadresinden tek gen metilasyon analizi için uygun program seçildi, veri giri i yap larak analiz gerçekle tirildi.
3.3 PROTE N DÜZEYLER N N ÖLÇÜMÜ
3.3.1 Nüklear Ekstraksiyon
Nüklear ekstraksiyon “Aktive Motif Nuclear Extract Kit” (Active Motif, Cat # 40010) ile gerçekle tirildi. Hücre kaz ma aleti ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonras üst faz at ld , hücreler 500 bl 1X Hipotonik tampon ile resüspanse edildi. 15 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Her bir örne!e 25 bl deterjan eklendi, 10 saniye vortekslendi, 14000 x g’de +4 C0’de 30 saniye santrifüj edildi. Üstte kalan k s m, yani sitoplazmik fraksiyon at ld . 50 bl lizis tampon ile nüklear pellet resüspanse edildi, 10 dakika vortekslendi. Sal n ml çalkalay c da 150 rpm’de buz üzerinde 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra 30 saniye vortekslendi. 14000 x g’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatandaki nüklear ekstrakt yeni bir ependorfa al nd ve -80 C0’ye kald r ld .
3.3.2 EL SA Deneyi
Elisa testi “Active Motif p53 Transcription Factor Assay Kits” (Active Motif TransAM p53, Cat # 41196), standart e!ri çizimi için gerekli olan rekombinant p53 proteini 5000 ünite (Active Motif TransAM, Cat # 31103) olarak kullan ld . Herbir kuyucu!a 40 bl ba!lay c tampon eklendi. Örnek kuyucuklar na örnekler, 10 bl’de 10 bg nüklear ekstrakt olacak ekilde eklendi. Pozitif kontrol kuyucuklar na, lizis tampon ile dilüe edilmi MCF-7 nüklear ekstraktlar ndan 10 bl eklendi. Negatif kontrol kuyucuklar na, 10 bl lizis tampon eklendi ve lizis tampon kullan larak dilüe edilmi standart proteinlerden 10’ar bl eklendi. Sal n ml çalkalay c da 100 rpm’de oda s s nda, 1 saat inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 3 kere 200 bl 1X y kama tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a 1X antikor ba!lay c tampon ile 1:1000 oran nda dilüe edilmi p53 antikoru 100 bl eklendi. 1 saat oda s s nda inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 3 kere 200 bl 1X y kama tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a 1X antikor ba!lay c tampon ile 1:1000 oran nda dilüe edilmi HRP antikorundan 100 bl eklendi. 1 saat oda s s nda inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 4 kere 200 bl 1X y kama tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a önceden oda s s na getirilmi olan reaksiyon solüsyonundan 100 bl eklendi. Direkt ktan korunarak oda s s nda 10 dakika inkübe edildi.
nkübasyon sonras nda 100 bl durdurma solüsyonu eklendi. Spektroforometrik olarak 450/ 655 nm’de absorbans ölçümü yap ld .
3.4 STAT ST KSEL ANAL Z
statistiksel analizler SPSS software versiyon 15.0 kullan larak gerçekle tirildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, MYCN ve p14ARF gen ekspreyon düzeyleri Mann-Whitney U testi kullan larak kar la t r ld . P <0.05 de!eri, istatistiksel olarak anlaml kabul edildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, p14ARF gen metilasyon düzeyleri Mann-Whitney U testi kullan larak kar la t r ld . P <0.05 de!eri, istatistiksel olarak anlaml kabul edildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, 5-aza-CdR’nin MYCN ve p14ARF gen ekspreyon düzeylerine etkisi T testi kullan larak kar la t r ld . P <0.05 de!eri,
4
4
.
.
B
B
U
U
L
L
G
G
U
U
L
L
A
A
R
R
Çal mam zda, MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF gen (CDKN2A) ekspresyon düzeyleri ve p14ARF metilasyon yüzdeleri ölçülmü tür (Tablo 5 ve 6). Ayr ca, MYCN ve p14ARF gen protein miktarlar n n de!erlendirilmesi için, p53 protein düzeyleri ölçülmü tür (Tablo 7 ve 8).
Tablo 5. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
p14ARF Metilasyon Oranlar2 (%)
KELLY
MYCN gen ekspresyon düzeyi p14ARF gen ekspresyon düzeyi Hipermetile Demetile ntermedier Metile Kontrol 0,810 1,060 72,08 27,92 0 5-aza-CdR 0,847 1,053 0,07 99,93 0 Vinkristin 0,807 1,070 0,14 99,86 0 Vinkr.+5-aza 0,907 1,063 0,02 99,98 0 Dakarbazin 0,827 1,090 0,15 99,85 0 Dakar.+5-aza 0,850 1,027 0,07 99,93 0 fosfamid 1,00 1,093 0,08 8,6 91,31 fosfa.+5-aza 0,923 1,017 0,2 99,8 0 Doksorubisin 0,753 1,007 0,22 30,63 69,14 Dokso.+5-aza 0,817 1,030 0,05 99,95 0 Siklofosfamid 0,740 1,030 0,09 33,25 66,66 Siklof.+5-aza 0,853 1,033 0,14 99,86 0 Etoposid 0,847 1,143 0,1 3,54 96,36 Etopo.+5-aza 0,787 1,063 0,05 54,37 45,58 Sisplatin 0,833 1,097 0,08 99,92 0 Sisp.+5-aza 0,903 1,063 0,05 99,95 07ekil 7. MYCN (+) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
Tablo 6. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
p14ARF Metilasyon Oranlar2 (%)
SH-SY5Y
MYCN gen ekspresyon düzeyi p14ARF gen ekspresyon düzeyi Hipermetile Demetile ntermedier Metile Kontrol 1,073 1,190 2,05 62,38 35,57 5-aza-CdR 1,113 1,170 0,42 99,58 0 Vinkristin 1,163 1,227 1,78 98,22 0 Vinkr.+5-aza 1,130 1,153 0,46 99,54 0 Dakarbazin 1,137 1,210 0,49 99,51 0 Dakar.+5-aza 1,083 1,093 0,87 99,13 0 fosfamid 1,130 1,177 0,7 99,3 0 fosfa.+5-aza 1,077 1,173 0,6 99,4 0 Doksorubisin 1,033 1,100 0,15 99,85 0 Dokso.+5-aza 1,100 1,133 0,27 99,73 0 Siklofosfamid 1,037 1,140 1,26 98,74 0 Siklof.+5-aza 1,107 1,123 0,44 99,56 0 Etoposid 1,040 1,193 0,07 48,67 51,26 Etopo.+5-aza 1,097 1,187 1,15 98,85 0 Sisplatin 1,050 1,127 0,18 99,82 0 Sisp.+5-aza 1,037 1,070 0,33 99,67 0MYCN (+) hücre gruplar nda, MYCN gen ekspresyonlar n n 15. siklustan itibaren ba lad ! , p14ARF gen ekspresyonlar n n ise 20. siklustan itibaren ba lad ! gözlenmi tir. Burada, ilgili genin ekspresyon düzeyi ne kadar yüksek ise o kadar erken siklusa girmektedir (Fekil 7 ve 8).
MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF genlerinin ekspresyonlar , 30. siklusa kadar gözlenmemi tir. Bu çal mada, 30. siklustan sonra gözlenen ekspresyon de!erleri dikkate al nmam t r (Fekil 9 ve 10).
7ekil 9. MYCN (-) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
Tablo 7. MYCN (+) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
KELLY
PROTE N (ng) PROTE N (ng)Kontrol 2,612 Doksorubisin 2,555 5-aza-CdR 0,532 Dokso.+5-aza 1,016 Vinkristin 1,502 Siklofosfamid 2,138 Vinkr.+5-aza 0,450 Siklof.+5-aza 0,426 Dakarbazin 0,788 Etoposid 1,389 Dakar.+5-aza 0,728 Etopo.+5-aza 0,450 fosfamid 1,512 Sisplatin 0,768 fosfa.+5-aza 0,511 Sisp.+5-aza 0,453
Tablo 8. MYCN (-) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
SH-SY5Y
PROTE N (ng) PROTE N (ng)Kontrol 0,383 Doksorubisin 0,387 5-aza-CdR 0,360 Dokso.+5-aza 0,301 Vinkristin 0,254 Siklofosfamid 0,362 Vinkr.+5-aza 0,324 Siklof.+5-aza 0,298 Dakarbazin 0,322 Etoposid 0,458 Dakar.+5-aza 0,232 Etopo.+5-aza 0,368 fosfamid 0,251 Sisplatin 0,486 fosfa.+5-aza 0,299 Sisp.+5-aza 0,556 PROTE N DÜZEYLER 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 KELLY SHSY5Y Gruplar P ro te in (n g )
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF genlerinin etki yola! ndaki ölçülebilen tek protein p53 genine ait oldu!u için p53 protein düzeyleri ölçülmü tür. Sonuçta, MYCN ve ve p14ARF gen ekspresyon düzeyleriyle uyumlu protein düzeyleri (ng) elde edilmi tir.
MYCN (+) hücre gruplar n n protein düzeyleri, MYCN (-) hücre gruplar n n protein düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0.001) (Fekil 11).
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, p14ARF geni promotor bölgesinin demetile edici ajan ile gerçekle tirilen demetilasyon yüzdeleri, MYCN (-) hücre grubunda anlaml bir
ekilde yüksek bulunmu tur (p=0.034) (Fekil 12).
MYCN (+) kontrol hücre grubunda, p14ARF geni promotor bölgesinin %72,08 hipermetile, %27,92 demetile oldu!u; 5-aza-CdR eklenmesiyle demetilasyon oran n n %99,93’e yükseldi!i bulunmu tur.
MYCN (-) kontrol hücre grubunda, p14ARF geni promotor bölgesinin %2,05 hipermetile, %62,38 demetile oldu!u, 5-aza-CdR eklenmesiyle demetilasyon oran n n %99,58’e yükseldi!i bulunmu tur.
DEMET LE p14ARF GEN DÜZEYLER
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 KELLY SHSY5Y Gruplar D em et il as yo n Y ü zd es i (% )
7ekil 12. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni promotor bölgesinin demetilasyon yüzdelerinin kar la t r lmas
7ekil 13. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR amplifikasyon e!rileri
MYCN (+) hücre gruplar ndaki MYCN ve p14ARFgen ekspresyon düzeyleri, RT-PCR sonuçlar a a! daki grafikte verilmi tir (Fekil 15).
KELLY GEN EKSPRESYON DÜZEYLER N N KARCILACTIRILMASI
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Gruplar G e n A m p li fi ka s y o n u MYCN p14ARF
7ekil 15. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas
MYCN gen ekspresyon düzeylerinin kar52la5t2r2lmas2:
• KELLY kontrol grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y kontrol grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,003). • KELLY 5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y 5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY Vinkristin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Vinkristin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,003).
• KELLY Vinkristin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Vinkristin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,003).
