HİSTOLOJİK DEĞİŞİKLİKLERİN IŞIK MİKROSKOBU DÜZEYİNDE
ARAŞTIRILMASI DİLEK KARADUMAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BETA-GLUKAN VE TAKSOL ETKİSİYLE FARE (Mus musculus) KARACİĞERİNDE OLUŞAN HİSTOLOJİK DEĞİŞİKLİKLERİN
IŞIK MİKROSKOBU DÜZEYİNDE ARAŞTIRILMASI
DİLEK KARADUMAN
YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI
DANIŞMAN
YRD. DOÇ. DR. BANU EREN
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Bu çalışma jürimiz tarafından 07.09.2006 tarihinde yapılan sınav ile BİYOLOJİ Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. Adem GÜLEL
Üye: Prof. Dr. Sancar BARIŞ
Üye: Yrd. Doç. Dr. Banu EREN
Onay:
Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım.
…/…/2006
Prof. Dr. A. Nur. ONAR Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü
BETA-GLUKAN VE TAKSOL ETKİSİYLE FARE (Mus musculus) KARACİĞERİNDE OLUŞAN HİSTOLOJİK DEĞİŞİKLİKLERİN IŞIK
MİKROSKOBU DÜZEYİNDE ARAŞTIRILMASI
ÖZET
Bu çalışmada, antineoplastik bir ajan olan taksol ile güçlü bir antioksidan ve immünomodülatör olduğu bilinen beta-D-glukanın karaciğerde oluşturduğu histolojik değişiklikler araştırılmıştır.
Bu amaçla beta-D-glukan, taksol, taksol+beta-D-glukan ve kontrol grubu olmak üzere 4 grup hayvan kullanılmıştır. Hayvanlar enjeksiyondan önce 24 saat süre ile aç bırakılmıştır. Laboratuvar farelerine (Mus musculus) taksol ve beta-D-glukan intraperitonal enjeksiyonla verildikten sonra 6., 12., 24., 48., saatlerde ve 7., 14., günlerde servikal dislokasyonla öldürülerek karaciğeri çıkarılmıştır.
Karaciğerlerin fiksasyonu %10 tamponlanmış nötral formaldehit ile yapıldıktan sonra rutin histolojik işlemler uygulanmış. Preparatlar hematoksilen-eosin, Masson’un üçlü boyaması, periodik asit-schiff (PAS) ve Gomori’nin gümüş impregnasyon teknikleri ile boyanmıştır.
Çalışmamızdan elde edilen sonuçlara göre; taksolün etkisiyle karaciğerde vakuoler dejenerasyon, sinüzoidlerde genişleme, nekroenflamatuvar odaklar tespit edilmiştir. Sadece beta-D-glukan verilmesinin karaciğerde belirgin bir değişikliğe neden olmadığı görülmüştür. Taksol ve beta-D-glukanın birlikte verildiği gruplarda, taksol gruplarından daha az histolojik değişiklik gözlenmiştir. Ayrıca, taksol+beta-D-glukan 14. gün gruplarındaki histolojik görünümün, taksol+beta-D-glukan 7. gün gruplarındaki ile karşılaştırıldığında normale daha yakın olduğu görülmüştür.
Bu bulgular, bir serbest radikal süpürücüsü olan beta-glukanın, taksolün serbest radikal oluşumunu indükleyerek karaciğerde meydana getirdiği oksidatif hasarı azalttığını göstermektedir.
LIGHT MICROSCOPY INVESTIGATION OF HISTOLOGICAL CHANGES IN LIVER INDUCED BY BETA-GLUCAN AND TAXOL
IN MICE (Mus musculus)
ABSTRACT
In this study, histologic changes induced by taksol which is an anti-neoplastic agent and β-D-glucan which is known as a strong antioxidant and immunomodulator, were investigated.
For this purpose, four groups of animals were used as β-D-glucan, taxol, taxol+ β-D-glucan and control groups. Animals (Mus musculus) were kept hungary for 24 hours before injection, then taxol and β-D-glucan were injected via intraperitonally, they were killed by servical dislocation at 6 th, 12 th, 24 th, 48 th hours, 7 th, 14 th days and their livers were removed.
After isolated livers were fixed in % 10 buffered neutral formalin, routin histological processes were applied and sections were stained by hematoxilen-eosin, Masson’s trichrome, Periodic asit-Schiff (PAS) and Gomori’s silver impregnation methods.
According to results obtained in our study; histologic changes such as granular degeneration, dilation at sinuzoids and necroinflumatuar focuses induced by taxol were determined. It was seen that using only β-D-glucan didn’t cause any obvious differentiation on liver. When taxol and β-D-glucan were given together, the degree of histological changes induced by taxol and β-D-glucan, was less than taxol alone. It was seen that the histological picture was more close to normal in the taxol+ β-D-glucan 14 th day groups when compared with taxol+ β-D-glucan 7 th day groups.
These findings show that β-D-glucan, as a free radical sweeper, decreases the oxidative damage that taxol makes in liver by induced free radical formation.
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca, her türlü çalışmalarımda hiçbir zaman ilgi ve desteğini esirgemeyen, bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım değerli hocam, Genel Biyoloji Ana Bilim Dalı Öğretim Üyesi Sayın Yrd. Doç. Dr. Banu EREN’ e,
Çalışmalarımda her zaman desteğini hissettiğim değerli hocam, Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Zafer EREN’ e,
İhtiyaçlarımızı ilettiğimizde daima yardımcı olan Bölüm Başkanı Sayın Prof. Dr. Arif Gönülol olmak üzere biyoloji bölüm hocalarına ve bölüm sekreterimiz Hatice Özdemir’e,
Laboratuvar çalışmalarımda bana yardımcı olan ve desteğini esirgemeyen Araş. Gör. Sevcan Tülek’e, Biyolog Ayşe Başardı’ya, Araş.Gör. Gülhan Akşimşek’e, Araş. Gör. Gönül Akbal’a Araş. Gör. İrem Gürkanlı’ya, Araş. Gör. Yeliz Miroğlu’na,
Çalışmalarım sırasında ilgi, yardım ve anlayışlarından dolayı Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Ana Bilim Dalı öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Sancar Barış’a, diğer öğretim üyelerine ve tüm asistan arkadaşlarıma, Laboratuar çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan ve desteğini esirgemeyen Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Ana Bilim Dalı laboratuar çalışanlarından Talip Saygıcı, Ebru Önder ve Kadriye Coşkunsu’ ya,
Çalışmamız sırasındaki katkılarından dolayı Aygün Cerrahi Aletler A.Ş’ye Her zaman olduğu gibi, tez dönemimde de büyük fedakarlık ve anlayışla, maddi ve manevi beni destekleyen aileme; sevgili annem ve babam Ayşe ve Turgut Karaduman’a ve canım kardeşlerim Utku ve İrem Karaduman’a teşekkürler ederim.
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 4
2.1. Hücre zedelenmesi 4
2.2. Hücre Zedelenme Şekilleri ve Morfolojisi 5 2.2.1. Geri Dönüşümlü (Reversible) Hücre Zedelenmesi 5 2.2.2. Geri Dönüşümsüz (Irreversible) Hücre Zedelenmesi 7
2.2.2.1. Nekroz 7
2.2.2.2. Apoptozis 9
2.3. Toksik Kimyasal Hasar 12
2.4. Hücre Zedelenmesinde Serbest Oksijen Radikalleri 13 2.4.1. Serbest Radikal Kaynakları Ve Verdiği Hasarlar 14 2.4.2. Reaktif Oksijen Türleri Ve Diğer Serbest Radikallere
Karşı Antioksidan Savunma Sistemleri 16
2.5. Karaciğer 18
2.5.1. İlaç Ve Toksine Bağlı Karaciğer Hasarları 23
2.6. Kanser 24
2.7. Taksol 25
2.7.1. Taksolün Etki Mekanizması 28
2.7.2. Taksolün Yapı-Aktivite İlişkisi 30
2.8. Beta-Glukan 31
2.8.1. β-Glukanın Biyolojik Aktiviteleri 33
2.8.1.1. İmmün Sistem Regülasyonu 33
2.8.1.2. Kanserle İlişkili Aktiviteleri 35 2.8.1.3. Patojen İlişkili Aktiviteleri 36 2.8.1.4. Vücut Sağlığını Desteklemesi 37
3. MATERYAL Ve METOT 39 3.1. Deneylerde Kullanılan Hayvanların Sağlanması 39
3.2. Farelere Uygulanan Maddeler 39
3.3. Çalışmalarda Kullanılan Kimyasal Maddeler 40
3.4. Çalışmalarda Kullanılan Aletler 40
3.5. Deney Protokolü 41
3.5.1. Araştırma Grupların Oluşturulması 41
3.5.2. Enjeksiyon 41
3.5.3. Fare Karaciğerlerinin Perfüzyonu, Çıkarılması Ve
Fiksasyonu 42
3.5.4. Doku Takibi ve Dokuların Parafine Gömülmesi 43 3.5.5. Parafin Bloklardan Kesit Alınması 43
3.5.6. Kesitlerin Boyanması 43
4. BULGULAR 47
4.1. Deney Süresince Gözlenen Değişiklikler 47 4.2. Kontrol Grubunun Karaciğer Histolojisi 47 4.3. Taksolün Karaciğer Üzerindeki Histolojik Etkileri 48 4.4. Beta-D-Glukanın Karaciğer Üzerindeki Histolojik Etkileri 49 4.5. Taksol+Beta-D-glukan’ın Karaciğer Üzerindeki Histolojik
Etkileri 49
5. TARTIŞMA VE SONUÇ 74
6. KAYNAKLAR 79
ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa No
Şekil 2.1. Hepatositlerde hidropik dejenerasyon 6
Şekil 2.2. Karaciğerdeki koagülasyon nekrozu 8
Şekil 2.3. Rat testisinde apoptotik hücrelerin yarım ay şeklindeki
çekirdekleri, koyu eozinofilik sitoplazmalı apoptotik hücreler 11 Şekil 2.4. Hepatositlere yakın endotel hücreleriyle sinüzoid kapillerini
gösteren karaciğer kesiti. 20
Şekil 2.5. Normal karaciğerin üç boyutlu görünümü 22 Şekil 2.6. Paklitaksel’in kimyasal yapısı (Taksol) 27 Şekil 2.7. Paklitaksel’in (taksol) üç boyutlu yapısı 28 Şekil 2.8. Mikrotübülün yapısının şematik gösterimi 28
Şekil 2.9 Taksolün Yapı-Aktivite İlişkisi 30
Şekil 2.10. Beta-glukanın moleküler yapısı 31
Şekil 2.11. Makrofajlar, beta glukanları tanıyan ve onlara bağlanan
reseptörlere sahiptirler 34
Şekil 2.12. Makrofajlar beta-glukanların etkilerine aracılık ederler 34 Şekil 3.1. Swiss albino tipi laboratuar faresi (Mus musculus) 39
Tablo3.1 Araştırma gruplarının oluşturulması 41
Şekil.3.2. A) Fare karaciğerinin perfüzyondan önceki görüntüsü.
B) Fare karaciğerinin perfüzyondan sonraki görüntüsü. 42 Resim 1. A) Kontrol grubuna ait bir fare dalağının makroskobik görüntüsü
B)Beta-D-glukan 7. gün grubuna ait bir fare dalağının
makroskobik görüntüsü. 51
Resim 2. Kontrol grubunda karaciğerin histolojik görünümü (H&E) 52 Resim 3. Kontrol grubunda karaciğerin histolojik görünümü (Masson’un üçlü
boyaması) 53
Resim 4. Kontrol grubunda karaciğerin histolojik görünümü (PAS) 54 Resim 5. Kontrol gurubunda karaciğerin histolojik görünümü (Gümüş) 55 Resim 6. Taksol 48. saat grubunda karaciğerin histolojik görünümü (H&E) 56
Resim 7. Taksol 7. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü (H&E) 57 Resim 8. Taksol 14. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü (H&E) 58 Resim 9. Taksol 14. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü (H&E) 59 Resim 10. Taksol 14. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü (PAS) 60 Resim 11. Taksol 24. saat grubunda karaciğerin histolojik görünümü (Gümüş)
61 Resim 12. Beta-D-glukan 48. saat grubunda karaciğerin histolojik görünümü
(H&E) 62
Resim 13. Beta-D-glukan 14. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü
(H&E) 63
Resim 14. Beta-D-glukan 7. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü
(Masson’un üçlü boyaması) 64
Resim 15. Beta-D-glukan 7. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü
(PAS) 65
Resim 16. Beta-D-glukan 14. gün grubunda karaciğerin histolojik görünümü
(Gümüş) 66
Resim 17. Taksol + Beta-D-glukan 6. saat grubunda karaciğerin histolojik
görünümü (H&E) 67
Resim 18. Taksol+ beta-glukan 48. saat grubunda karaciğerin histolojik
görünümü (H&E) 68
Resim 19. Taksol+Beta-D-glukan 7. gün grubunda karaciğerin histolojik
görünümü. (H&E) 69
Resim 20. Taksol+Beta-D-glukan 7. gün grubunda karaciğerin histolojik
görünümü (H&E) 70
Resim 21. Taksol+Beta-D-glukan 14. gün grubunda karaciğerin histolojik
görünümü (H&E) 71
Resim 22. Taksol+Beta-D-glukan 14. gün grubunda karaciğerin histolojik
görünümü (H&E) 72
Resim 23. Taksol+Beta-D-glukan 14. gün grubunda karaciğerin histolojik
1.GİRİŞ
Normal dokuyu aşan ve onunla koordine olmayan, değişime yol açan, uyarı durduktan sonra bile aynı şekilde aşırı büyümeye devam eden anormal doku kütlesine tümör (neoplazm) denir. Neoplastik hücreler belirgin derecede normal hücre büyümesini kontrol eden düzenleyici etkilerden bağımsız çoğalmaya devam ettiğinden, değişime uğrar. Örneğin; zar yapısında bazı glikoproteinlerin sentezi tamamlanamadığı için kontak inhibisyon yok olur, bu nedenle büyüme kontrolsüz olarak gerçekleşir (Kumar ve ark., 1999). Neoplastik hücreleri öldürmek veya yok etmek için çeşitli kombinasyonlar halinde kimyasallar kullanılarak gerçekleştirilen tedavi yöntemine kemoterapi denir. Bu tedavi yönteminde tek bir ilaç kullanıldığı gibi çeşitli ilaç kombinasyonları da kullanılabilir. Kemoterapi, kanserle savaşta en etkili silahlardan biridir. Bu amaçla kullanılan ilaç veya kimyasallara kemoterapötikler denilir. Kemoterapötik ajanlar sentetik veya semisentetik olabildiği gibi geniş oranda doğadan izole edilenleri de vardır. Kemoterapötik kullanımındaki en olumsuz belirtilerden biri, kemoterapötik maddenin kanserli hücre üzerine etkili olmasına karşın normal hücrelere de zarar vermesidir (Baloglu, 2001).
Kemoterapötik ajanlar altı ana gurup altında değerlendirilir. Taksol bunlardan mitotik inhibitörler grubuna girmektedir.
Doğal ürünler antikanser ilaç bileşiklerinin önemli bir kaynağını oluşturmaktadır. Doğal ürünlerden izole edilen ve klinik olarak kullanılan antikanser ajanlarının en önemli üyesi paklitaksel (taksol)’ dir. Taksol porsuk ağacının (Taksus brevifolia) kabuğundan izole edilmektedir. Taksolün yapısı oldukça farklıdır ve bir β-fenilsoserin yan zinciriyle köprülenmiş olan tetrasiklik hücre iskeletinden oluşmaktadır. Kimyasal olarak taksan diterpenoidler olarak bilinen kompleks doğal ürünlerin geniş bir ailesi içerisinde yer almaktadır (Baloglu, 2001).
Taksol, mikrotübüllerdeki tubulinleri stabilize ederek ve onların sekonder depolimerizasyonunu yani mitozu engelleyerek, spesifik bir mekanizma ile antineoplastik aktivite göstermektedir (Krol, 1998).
Taksolün over, meme, baş, boyun ve akciğerin küçük hücreli dışı kanserlerini kapsayan çeşitli kanserlere karşı etkili olduğu rapor edilmiştir (Sakai ve ark., 1984; AOCTG, 1991; Perez ve ark., 2001; Dunphy ve ark., 2001).
Çok sayıdaki çalışma; taksol gibi potansiyel antineoplastların kemoterapide kullanıldığını, taksolün bir ilaç olarak aktivite gösterdiğini ve toksinlerin neden olduğu yan etkilere benzer yan etkilere sebep olduğunu desteklemektedir. Bu antineoplastların etkisinin bir sonucu olarak hücrede zarar görmüş yapılar birikebilmektedir (Keller, 2000).
Krol, (1998) yapmış olduğu çalışmada; taksolün karaciğerdeki bazı lizozomal enzimlerin aktivitesinde değişikliklere neden olduğunu ve bu biyokimyasal değişikliklere bağlı olarak karaciğerin ultra strüktürel yapısında histolojik değişikler meydana getirdiğini göstermiştir. Ayrıca; Varbiro ve ark. (2001) yapmış oldukları çalışmada taksolün, direkt olarak mitokondriyonal geçirgenliği ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) salınımını anlamlı bir şekilde arttırdığını saptamışlardır. Bu değişikliklerin ilacın toksik etkisine bağlı olarak meydana gelen biyokimyasal değişiklikler olduğunu ve bunların ilacın dozuna bağlı olduğunu göstermişlerdir.
Reaktif oksijen türleri (ROS) hücresel hasardan sorumlu ana etmenlerdir. Aktif oksijen türlerinin ve serbest radikallerin, lipid peroksidasyonunu, protein modifikasyonunu, enzim inaktivasyonunu, DNA zincir kırıkları ve baz modifikasyonlarını uyardıkları ve oksidatif hasara neden oldukları gösterilmiştir (Camougrand, 2001). Dolayısıyla, bu indirgenmiş oksijen türlerinin hücreden süpürülmesi gerekmektedir (Imlay, 2003).
Hücrelerde, oksidanları inaktif hale getirerek, oksidatif hasarı önleyen, yok eden veya kısmen azaltan maddelere antioksidanlar adı verilmektedir (Onat ve ark., 2002). Bir antioksidan olan Beta–1,3-D-glukanlar (glukanlar) mayaların, fungusların ve tahılların hücre duvarlarında yapısal bir element olarak bulunan glikoz polimerlerinin heterojen bir grubudur (Cleary ve ark., 1999). Tsiapali ve ark., (2001) yapmış oldukları çalışmada, glukanların serbest radikal süpürücü aktiviteye sahip olduklarını göstermişlerdir. Ayrıca beta–1,3-D-glukan kemoterapi ve radyoterapi alan kanser hastalarında, kemoterapötik ilacın ve radyasyonun meydana getirdiği yan etkileri engellemek için verilmektedir.
Örneğin; meme kanseri hastalarına tamoksifenin yan etkilerini engellemek için beta–1,3-glukanın verilmesi tercih edilmiştir. Böyle hastalarda beta–1,3-glukan beyaz kan hücrelerinin sayısını uygun düzeyde tutabilmek için ve immün sistem hücrelerinin hasarını hafifletmek için verilmektedir (Keller, 2000).
Tüm bu bilgiler ışığında, bu çalışmada, kemoterapide kullanılan antineoplastların diğer doku ve organlarda meydana getirdiği hücresel hasarı ve bir antioksidanın bu hasarı ne yönde ve ne derece etkilediğini araştırmak ve bu alanda yapılan çalışmalara katkıda bulunmak amacıyla; over, meme, baş, boyun gibi birçok kanserin tedavisinde yaygın olarak kullanılan taksol ile serbest radikal süpürücüsü olarak doğada önemli bir antioksidan olan beta–1,3-D-glukan verilmiş farelerin (Mus musculus) karaciğerinde meydana gelen histolojik değişikler ayrı ayrı ve birlikte karşılaştırmalı olarak araştırılmıştır.
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Hücre Zedelenmesi
Hücreler hayati olayların sürekliliğini sağlayan karmaşık birimlerdir ve bunların normal olarak iş görmeleri, birçok metabolik reaksiyonun duyarlı bir şekilde bütünleşmesine bağlıdır (Anderson ve ark., 1997).
Değişen gereksinimler ve hücre dışı streslere uymak için sürekli yapı ve fonksiyonlarını ayarlayan hücreler bulundukları ortamlarında aktif katılımcılardır. Hücre, oldukça dar olan fizyolojik değişken sınırlar içerinde iç ortamını koruyarak normal dengesini sürdürür. Fizyolojik stresler veya patolojik uyaranlarla karşılaştığında bu duruma adapte olabilir ve yeni bir denge oluşumu ile yaşama yeteneğini korur. Başlıca adaptif cevaplar; atrofi, hipertrofi, hiperplazi ve metaplazidir. Eğer hücrenin adaptasyon yeteneği aşılırsa hücre zedelenmesi gelişir. Bir noktaya kadar hücre zedelenmesi geri dönüşümlüdür; bununla birlikte şiddetli veya kalıcı zorlamalarla hücre geri dönüşümsüz olarak zedelenir ve sonunda ölür (Kumar ve ark., 1999).
Hücre zedelenmesinin nedenleri şu şekilde gruplandırılır: Hipoksi
Fiziksel etkenler
Kimyasal etkenler ve ilaçlar Mikrobiyolojik etkenler İmmünolojik reaksiyonlar Genetik bozukluklar Beslenme dengesizlikleri Yaşlanma
Spesifik bir stres şekli ister adaptasyon oluştursun isterse reverzibl ya da irreverzibl zedelenmeye neden olsun, sonuç sadece stresin özelliğine ve şiddetine değil aynı zamanda hücrenin yaralanmaya karşı hassasiyetine, diferansiyasyonuna, kan ihtiyacına, beslenmesine ve önceki durumu gibi diğer birçok hücreye özel değişkenlere bağlıdır (Kumar ve ark., 1999).
2.2. Hücre Zedelenme Şekilleri Ve Morfolojisi
Tüm stresler ve zararlı etkiler, etkilerini önce moleküler düzeyde gösterirler. Hücresel adaptasyon, zedelenme ve ölümün morfolojik değişiklerinin olabilmesi için gereken süre, bu değişiklikleri tespit etmek için kullanılan metotların duyarlılığına bağlı olarak değişir. Histokimyasal veya ultrastrüktürel tekniklerle bu değişiklikler, saatler ya da günler sürse bile iskemik zedelenmeden dakika ya da saatler sonra, ışık mikroskobu ve gözle muayenede görülebilmesinden önce gösterilebilir.
Hücre zedelenmesi şekilleri ve morfolojik bulgular şu şekilde sıralanabilir: Reversible (geri dönüşümlü) akut hücre zedelenme şekilleri
Nekroz olarak adlandırılan irreversible (geri dönüşümsüz) zedelenme sonrası ‘hücre intiharı ile hücre ölümü’ şekli
Daha kronik veya kalıcı zedeleyici uyaranlara cevap olarak meydana gelen organel değişiklikleri
Lipit, karbonhidrat, proteinler gibi bir grup maddenin, hücre metabolizması bozukluğu veya aşırı depolanma gibi sebepler sonucunda hücre içi birikimleri (Kumar ve ark., 1999).
2.2.1. Geri Dönüşümlü (Reversible) Hücre Zedelenmesi:
Işık mikroskobunda geri dönüşümlü zedelenme ile ilişkili hücresel şişme ve yağlı değişme olmak üzere iki morfolojik şekil tanınabilir. Patogenezi yukarıda belirtilen hücresel şişme hücrelerin iyon ve sıvı homeostazını sürdürmede yetersiz kaldığı zaman ortaya çıkar. Hipoksik zedelenme ile toksik veya metabolik zedelenmenin çeşitli şekillerinde oluşan yağlı değişme sitoplâzmada lipit vakuollerinin ortaya çıkması ile belirir. Daha az görülen bir reaksiyondur. Hepatosit ve myokardiyal hücreler gibi yağ metabolizmasına katılan hücrelerde saptanır.
Hücresel şişme; zedelenen hücrelerin hemen hepsinde hücrelerde ortaya çıkan ilk belirtidir. Mikroskobik olarak, sitoplazmada küçük, berrak vakuoller görülebilir. Bunlar endoplazmik retikulumun şişen parçalarını gösterir. Bu tip öldürücü olmayan reverzibl zedelenme bazen hidropik değişiklik veya vakuoler dejenerasyon olarak adlandırılır (Şekil 2.1) (Kumar ve ark., 1999).
Şekil 2.1. Hepatositlerde hidropik dejenerasyon
(http://www.meddean.luc.edu/lumen/MedEd/orfpath/images/fig92x.jpg).
Reverzibl hücre zedelenmesinin ultrastrüktürel değişiklikleri:
1- Mikrovillusların kabarcıklaşması, küntleşmesi veya bozulması, hücreler arası bağların gevşemesi gibi plazma membran değişikliklerini,
2- Şişme ve fosfolipitten zengin şekilsiz yoğunlukların belirmesi gibi mitokondriyonal değişiklikleri,
3- Polizomların ayrılması ve ribozomların ayrıldığı endoplazmik retikulumun genişlemesini,
4- Granüler ve fibriler elemanların dağıldığı nükleer değişiklikleri kapsar (Kumar ve ark., 1999).
2.2.2. Geri Dönüşümsüz (İrreversible) Hücre Zedelenmesi
Yaşamakta olan hücreler iki farklı geri dönüşümsüz zedelenmeye uğrarlar:
• Nekroz • Apoptozis
2.2.2.1. Nekroz
Nekroz yaşayan dokuda hücre ölümünü izleyen morfolojik değişiklikler dizisini ifade eder. Nekroz; genellikle irreverzibl ekzojen zedelenmeden oluşan hücre ölümünün makroskobik ve histolojik karşılığı olarak kullanılmaktadır. En sık görüleni koagülasyon nekrozudur. Hücre şişmesi, sitoplazmik proteinlerin niteliklerinin değişmesi ve hücre organellerinin yıkımı ile karakterlidir.
Nekrozun morfolojik görünümü aslında aynı zamanda meydana gelen iki olayın sonucudur:
1- Hücrenin enzimatik sindirimi 2- Proteinlerin niteliklerinin değişmesi
Sindirim ölü hücrelerden kaynaklanan hidrolitik enzimlerle oluşursa otoliz, nekroz alanına gelen lökositlerin lizozomlarından kaynaklanırsa heteroliz adı verilir. Bu olayların gelişmesi için saatler gereklidir (Kumar ve ark., 1999).
Nekroz sonucunda piknozis, karyolizis ve karyorheksiz şeklinde nükleer değişiklikler ortaya çıkar. Piknozis, kromatinin yoğunlaştığı, çekirdeğin büzüldüğü, yoğun miktarda bazofilik bir hal aldığı durumdur. Piknotik çekirdeğin daha sonra çok sayıda küçük bazofilik partiküllere parçalanması karyorheksiz, ya da piknotik çekirdeğin lizozomal deoksiribonükleaz etkisiyle lizise maruz kalması karyolizisdir. Hızlı bir şekilde meydana gelen nekrozda piknotik durum görülmeksizin çekirdek lizise uğrar (Chandrasoma ve Taylor, 1995).
Ölü hücrede tanımlanan bu erken değişiklikler bir kez meydana gelince, nekrotik doku kitlesi, enzim katabolizması ile proteinlerin niteliklerinin değişmesi arasındaki baskınlığın hangi tarafta olduğuna bağlı olarak farklı morfolojik değişiklikler gösterir. Denatürasyon primer şekilde olduğunda koagülasyon
nekrozu denilen nekroz gelişir. Enzim sindiriminin hakim olduğu örneklerde sonuç litefaksiyon nekrozudur. Özel durumlarda kazeöz nekroz veya yağ nekrozu gelişebilir (Kumar ve ark., 1999).
Koagülasyon nekrozu; bu nekroza ait dokular, meydana gelişlerinden beri geçen süreye bağlı olarak makroskobik açıdan farklı görünümlere sahiptir. Henüz meydana gelmiş bir koagülasyon nekrozu odağı soluk renkli sert ve hafifçe şişmiş durumdadır. Zaman geçtikçe iltihabi hücrelerin toplanması nedeniyle rengi sarıya çalar ve otoliz nedeniyle de kıvamında bir yumuşama görülür. Mikroskobik olarak ise erken dönemde koagülasyon nekroz odağındaki hücreler hafifçe daha fazla eozinofil karakterdedir; hücresel ayrıntılarda ya hiç değişiklik yoktur ya da belli belirsiz bir değişiklik meydana gelmiştir. Zaman geçtikçe eozinofil durumu şiddet kazanır, hücreler şişer ve daha önceden tanımlanan değişiklikler ortaya çıkmaya başlar. Sonunda nekroz odağı iltihabi hücreler tarafından istila edilir ve nekrotik hücreler eriyerek geriye yalnızca hücre kırıntıları kalır (Şekil 2.2) (Anderson ve ark., 1997).
Şekil 2.2. Karaciğerdeki koagülasyon nekrozu.
Kazeifikasyon nekrozu çoğunlukla tüberküloz enfeksiyonunun odağında saptanan nekrozun karakteristik bir şeklidir. ‘Kazeöz’ terimi santral nekrotik alanın beyaz, peynirimsi görünümünden kaynaklanmıştır. Mikroskobik olarak nekrotik odak karakteristik bir granülamatöz iltihap halkası ile kuşatılan belli yapısı olmayan, şekilsiz, granüler artıktan oluşur. Doku yapısı koagülasyon nekrozundan farklı olarak tamamen silinmiştir (Kumar ve ark., 1999).
Litefaksiyon nekrozu; hızla yumuşayan ve eriyen dokudaki odaksal yıkıma verilen addır. Bir atardamarın primer olarak tıkanmasına bağlı iskemik hasar’dan veya şiddetli beyin travmalarından sonra en sık merkezi sinir sisteminde görülür. Makroskobik olarak nekroz bölgesi yumuşaktır ve merkezi erimiş durumdadır. Zamanla, çeperleri nekrotik olmayan dokuyla sınırlı kistik bir boşluk gelişir. Histolojik olarak bu kistik boşluğun içeriği nekrotik hücre kırıntılarından ibarettir (Anderson ve ark., 1997).
Yağ nekrozu; aslında spesifik bir nekroz şekli değildir. Daha çok, pankreas zedelenmesi sonrasında tipik olarak oluşan yağ yıkım alanlarını tanımlar. Aktifleşen pankreas enzimlerinin bitişik parankim veya periton boşluğuna patolojik sızıntısı sonucu meydana gelir. Aktifleşen pankreatik enzimler asiner ve duktal hücrelerden çıkarak yağ hücre membranlarını eritir ve hücre içinde bulunan trigliserit esterlerini hidrolize eder. Serbestleşen yağ asitleri kalsiyumla birleşerek makroskobik olarak görülebilen tebeşirimsi beyaz alanlar meydana getirir (Robbins, 1996). Histolojik olarak nekrotik yağ hücrelerinin yalnızca bazofilik kalsiyum birikintili gölgeli hatları ve çevrelerinde bulunan iltihabi reaksiyon izlenebilir (Kumar ve ark., 1999).
2.2.2.2. Apoptozis
Apoptozis, organizmanın ihtiyaç duymadığı, biyolojik görevini tamamlamış veya hasarlı hücrelerin zararsız bir biçimde ortadan kaldırılmasını sağlayan ve genetik olarak kontrol edilen programlı hücre ölümüdür. Apoptozis veya programlı hücre ölümü, çok hücreli organizmaların gelişiminin normal bir sürecidir. Homeostazinin ve organ büyüklüklerinin korunmasında, konak savunmasında embriyogenez, metamorfoz, yaşlanma da oldukça önemlidir (Öztürk, 2002).
Apoptozis hücre içinden veya dışından gelen sinyallerle başlatılan ve birbirini takip eden olaylar zinciri olarak seyreder. Bu aşamalar:
1. Apoptozisin başlaması
2. Hücre içi proteazların (kaspazların) aktivasyonu
3. Hücrede çeşitli biyokimyasal ve morfolojik değişikliklerin oluşması 4. Fagositoz olarak özetlenebilir (Vaux ve Strasser, 1996; Öztürk,
2002).
Hücre içinden veya dışından gelen sinyaller proteazları aktive eder. Aktive olan proteazlar hedef proteinleri yıkarak hücre içi değişikliklere neden olur. Sonuçta hücre parçalanarak apoptotik cisimlere ayrılır. Apoptotik cisimler fagositoz yoluyla yok edilirler (Öztürk, 2002).
Apoptozis tipik morfolojik ve biyokimyasal özelliklere sahiptir. Göze çarpan morfolojik değişimler hücre küçülmesi, nükleer kromatinin yoğunlaşması ve çekirdeğin parçalanmasıdır (Göncü ve Pehlivan, 2001).
Hücreler özelleşmiş yüzeysel yapılarını ve diğer hücrelerle olan temas yüzeylerini kaybederler su kaybederek küçülürler ve büzüşürler. Sitoplazmanın yoğunlaştığı, organellerin birbirine yakınlaştığı gözlenir. Membranlar bütünlüklerini korurlar. Sitoplazmada yüzeye paralel olarak yerleşmiş mikrofilament kümeleşmeleri ve endoplazmik retikulumda geçici genişlemeler görülür. Bu genişlemelerin sitoplazmadaki suyun endoplazmik retikuluma geçmesi ile oluştuğu düşünülmektedir. Mitokondriyonlar genellikle normal yapılarını korurlar (Strasser ve ark., 2000).
Apoptoziste en önemli morfolojik değişiklikler çekirdekte görülür. Kromatin, çekirdek membranına yakın kısımlarda yoğunlaşarak değişik şekil ve büyüklüklerde çöker (Reiter, 1997). Yarım ay, at nalı, orak gibi tipik şekiller gösterir. Daha sonra çekirdek yıkıma uğrar. Bu durum karyorheksiz olarak bilinir (Şekil 2.3) (Kumar ve ark., 1999). Apoptotik süreç ilerledikçe sitoplazmik çıkıntılar oluşur. Hücre daha sonra membranla çevrili küçük parçalara bölünür. Bunlara “apoptotik cisim” adı verilir (Öztürk, 2002).
Şekil 2.3. Rat testisinde apoptotik hücrelerin yarım ay şeklindeki çekirdekleri, koyu eozinofilik sitoplazmalı apoptotik hücreler (Öztürk, 2002).
Apoptotik hücreler, makrofajlar ve doğal öldürücü hücreler tarafından tanınır ve fagosite edilir (Vaux ve Strasser, 1996). Eğer hücreler fagosite edilmezlerse ikincil nekroz olarak adlandırılan indirgenmeye uğrarlar (Göncü ve Pehlivan, 2001).
Apoptozis sırasında hücre yüzey moleküllerinde spesifik değişiklikler gözlenir. Örneğin fosfatidilserinin (PS) ve belirli proteinlerin ekspresyonu, glikolipit ve glikoproteinlerin şeker zincirlerinde değişimler gibi. Bu değişimler farklı biyolojik fonksiyonları özellikle fagositik tanıma ve apoptotik hücrelerin fagositozunu destekler (Azuma ve ark., 2002).
Apoptozisin en önemli biyokimyasal işareti, DNA’nın nükleozomal bölgelerden yaklaşık 180–200 baz çifti veya bunun katları şeklinde DNA parçaları oluşturacak şekilde parçalanmasıdır. Bu durum agaroz jel elektroforezinde merdiven görüntüsünün ortaya çıkmasına neden olur. Apoptotik hücrelerde görülen diğer önemli değişiklik, normalde plazma membranının iç yüzeyinde bulunan fosfatidilserinin apoptozisin erken evresinde membranın dış yüzeyine transloke olmasıdır. Bu mekanizma apoptotik hücrelerin komşu hücreler ve makrofajlar tarafından tanınmasını sağlar (Göncü ve Pehlivan, 2001).
Apoptozis ışık mikroskobik seviyede gözlenebilir. Hematoksilen-eosin boyama tekniğiyle boyanmış kesitlerde, koyu eozinofilik sitoplâzmalı, bir veya birkaç parçalı piknotik çekirdekli olarak görülür. Kromatinin çekirdek membranının iç yüzüne lokalize olması nedeniyle çekirdek, yarımay şeklinde gözlenir (Kumar ve ark., 1999; Öztürk, 2002).
2.3. Toksik Kimyasal Hasar
Kimyasal maddeler iki genel mekanizmadan biri ile hücre zedelenmesi oluşturur:
1- Bazı kimyasal maddeler önemli moleküler elemanlar veya hücresel organeller ile birleşerek doğrudan doğruya etki ederler. Örneğin civa klorür zehirlenmesinde, civa, hücre membranı ve diğer proteinlerin sülfidril gruplarına bağlanarak ATPaz’a bağımlı taşınmanın engellenmesine ve membran geçirgenliğinin artmasına neden olur. Birçok antineoplastik kemoterapötik ajanlar ve antibiyotikler de benzer direkt sitotoksik etkilerle hücre hasarı oluşturur. Bu gibi örneklerde, en büyük hasar bu bileşikleri kullanan, absorbe eden hücre dışına atan veya yoğunlaştıran hücrelerde görülür.
2- Diğer birçok toksik kimyasal madde aslında biyolojik olarak aktif değildir. Ancak, reaktif toksik metabolitlere çevrildikten sonra hedef hücreleri etkilemektedir. Bu değişiklik genelde karaciğer ve diğer organların granülsüz endoplazmik retikulumundam (SER) P-450 fonksiyonlu oksidazlarla gerçekleşir. Metabolitler her ne kadar protein ve lipitlerle direkt kovalent bağlanarak
membran hasarı ve hücre zedelenmesine neden olurlarsa da hücre zedelenmesinin en önemli mekanizması reaktif serbest radikallerin oluşumudur. Kuru temizleme sanayinde yaygın olarak kullanılan karbon tetra klorür (CCl4) ve asetaminofen bu sınıfa aittir. Örneğin CCl4, toksik serbest radikali olan CCl3’e esas olarak karaciğerde dönüştürülür. Serbest radikaller otokatalitik membran fosfolipit peroksidasyonu ile endoplazmik retikulum hızla yıkımına neden olur. 30 dakikadan daha az bir sürede hem enzim hem de plazma proteinlerinin karaciğerdeki protein sentezi azalır. 2 saat içinde düz endoplazmik retikulum (SER) şişer ve ribozomlar granüllü endoplazmik retikulumdan ayrılır. Trigliseritler ile birleşen ve böylece lipoprotein sekresyonunu sağlayan apoprotein sentezindeki yetersizlik hepatositlerden lipit atılımını azaltır. CCl4 zehirlenmesinin sonucu ‘yağlı karaciğer’ dir. İzleyen mitokondriyon zedelenmesinin sonucu olarak ATP stoklarının azalması, iyon taşınmasında bozukluklara ve ilerleyici hücre şişmesine neden olur. SER’ de lipit peroksidasyonu sonucu oluşan yağlı aldehitlerle plazma membranları daha fazla zedelenir. Sonuç, hücre içine yoğun kalsiyum girişi ve hücre ölümüdür (Kumar ve ark., 1999).
2.4. Hücre Zedelenmesinde Serbest Oksijen Radikalleri
Serbest radikaller, dış orbitallerinde bir veya daha fazla paylaşılmamış elektron içeren ve diğer biyolojik materyallerle reaksiyona girme eğilimi taşıyan kimyasal türlerdir. Çekirdekteki negatif yüklü elektron sayısı, pozitif yüklü proton sayısına eşit olmadığından kararlı yapıya sahip değillerdir ve bu nedenle reaktif özellik taşıyan moleküllerdir. Tek elektronunu bir başka moleküle verebilen bu radikaller, kendileri kararlı hale geçebilmek için bir başka molekülden elektron alarak elektron çifti oluşturabilirler. Böylece, radikal olmayan bir yapının da radikal hale dönüşmesine neden olurlar (Bay, 2001; Başaran, 2002; Mercan, 2004; Akyol, 2004).
Organizmalarda birçok tipte serbest radikal oluşabilir, ancak bunlar içerisinde serbest oksijen radikalleri en yaygın olanlarıdır (Bay, 2001).
Oksijen molekülü, aerobik çok hücreli organizmalarda temel ihtiyaç olan ATP’nin sentezlenmesi için önemli bir moleküldür. Çünkü metabolizmada son elektron akseptörü olarak moleküler oksijen kullanılmaktadır (Gözükara, 2001). Mitokondriyonal zincir reaksiyonları sırasında oksijenin %95-98’i metabolik amaç doğrultusunda kullanılırken %2-5’i organizma için zararlı olan reaktif oksijen türlerine (ROS) dönüşür (Reiter, 1997). Reaktif oksijen türleri, pek çok toksik madde ve patolojik şartlara yanıt olarak oluşan hücre ölümünde genel bir aracı olarak rol oynayabilirler (Gültekin ve ark., 2000).
Oksijen radikallerinin fazla yapımının neden olduğu etkilerin toplamı ‘oksidan stres’ olarak adlandırılır. Oksidatif hasar ise, süper oksitten kaynaklanan radikaller ile nitrik oksidin reaktif türlerinin neden olduğu hasarların bir toplamıdır (Kılınç, 1985). Beyin oksidatif hasara en duyarlı bölgedir. Serbest radikaller santral sistemin patolojik durumlarının pek çoğunda, direk olarak doku hasarı meydana getirirler (Mercan, 2004).
Oksijenin reaktif türleri; süperoksit radikali (O2-), hidroksil radikali (OH-), alloksi radikali (RO-), peroksil radikali (ROO-)’ dir (Reiter, 1998).
Oksijen radikalleri içinde en reaktif olanı deoksiriboz ve DNA bazları ile hızlı bir şekilde reaksiyona giren hidroksil radikalidir (Ashok ve Ali, 1999). Hidroksil radikali, DNA’yı da içeren birçok biyomolekülü hasara uğratan son derece reaktif bir moleküldür (Mandavilli ve ark., 2002). Yarılanma ömrü çok kısa olan bu radikal, oluştuğu yerde oksidatif hasara sebep olduğu gibi yeni radikalleri de oluşturabilir (Meram ve Aktaran, 2002).
2.4.1. Serbest Radikal Kaynakları Ve Verdiği Hasarlar
Serbest radikaller, hücrelerde endojen ve ekzojen kaynaklı etmenlere bağlı olarak oluşurlar (Mercan, 2004).
Serbest radikallerin endojen kaynakları, hücrenin etrafında serbest radikallerin oluşturulması ve hücre içinde serbest radikal meydana getirilmesidir. İntraselüler serbest radikaller, redükte flavinler ve thioller gibi küçük molekülerin ardı sıra inaktivasyonu ve otooksidasyonundan, belirli oksidazların, siklooksijenazların, lipooksijenazların, dehidrogenazların ve peroksidazların
aktivasyonlarından üretilir. Oksidazlar ve elektron taşıma sistemleri, reaktif oksijenlenmiş serbest radikallerin sürekli intraselüler kaynaklarıdır. Oksijen içeren moleküllere demir gibi geçiş metallerinden elektron transferi, serbest radikal reaksiyonlarını başlatabilir. Serbest radikal üretim bölgeleri; sitosolik bölge, nüklear bölge, endoplazmik retikulum ve plazma membranları, mitokondriyonlar, lizozomlar ve peroksizomları içeren tüm hücresel öğeleri kapsar (Akbal, 2002).
Ekzojen kaynaklı etmenler arasında parakuat, alloksan gibi kimyasalların etkisi altında kalma, karbon tetraklorür, parasetamol gibi ilaç toksikasyonları, iyonize ve ultraviyole radyasyon, hava kirliliği yapan fitokimyasal maddeler, sigara dumanı, solventler gibi çevresel faktörler, nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin gibi antineoplastik ajanlar, alkol ve uyuşturucular gibi alışkanlık yapıcı maddeler bulunması nedeniyle serbest radikaller toksikolojik açıdan da önemlidir (Mercan, 2004).
Serbest radikaller özellikle de aktive oksijen türevleri ile oluşturulan zedelenme, hücre hasarının önemli bir mekanizmasıdır.
Serbest radikaller hücrelerde oluştuğu zaman özellikle nükleik asitler ve yanı sıra çeşitli membran molekülleri ile etkileşerek onları parçalarlar. Serbest radikaller ayrıca otokatalitik reaksiyonları başlatır. Serbest radikallerle reaksiyona giren moleküller sıra ile serbest radikallere dönüşerek, hasar zincirini ilerleterek yayarlar (Kumar ve ark., 1999).
Serbest radikaller aracılığı ile gelişen hücre zedelenmesinde özellikle üç reaksiyon ilgilidir:
1- Membranların Lipit Peroksidasyonu: Membranda çift bağlı poliansatüre lipitler oksijen türevi serbest radikallerin etkisi ile kolayca zedelenir. Lipit-radikal etkileşmeleri değişken ve reaktif olan peroksitleri oluşturarak otokatalitik zincir reaksiyonları meydana gelir.
2- Deoksiribonükleik Asit (DNA) Lezyonları: Timinle serbest radikal reaksiyonları nükleer ve mitokondriyonal DNA’da tek iplik kırılmaları oluşturur. Bu gibi DNA hasarı hem hücre ölümü hem de hücrelerin malign değişiminde rol alır.
3- Proteinlerin Çapraz Bağlanması: Serbest radikaller sülfidril aracılı protein çapraz bağları oluşturarak parçalanmanın artmasına veya enzimatik aktivitenin kaybına neden olur. Serbest radikal reaksiyonları direkt olarak polipeptit parçalanmasına da yol açabilir (Kumar ve ark., 1999).
Serbest radikal oluşumu, kimyasal ve radyasyon zedelenmesi yanı sıra, solunum, rutin hücresel aktiviteler ve mikrobiyolojik savunmada da yer alır. Bu nedenle buradan hücrelerin serbest radikalleri parçalayarak herhangi bir zedelenmeyi minimal seviyede tutacak mekanizmalar oluşturmuş olacağı anlamı çıkar.
Serbest radikallerin değişken tabiatlı ve genellikle kendiliğinden yok olması bir şanstır. Örneğin: Süperoksit, su varlığında hızla oksijen ve hidrojen perokside dönüşür. Bu dönüşümün oranı birçok hücre tipinde bulunan süperoksit dismutazların (SODs) etkisi ile anlamlı bir şekilde arttırılır. Glutatyon peroksidaz (GSH) gibi diğer enzimler de serbest radikal yıkımı katalize ederek zedelenmeye karşı koyucudur. Peroksizomlarda bulunan katalaz, hidrojen peroksitin parçalanmasını sağlar. Ayrıca vitamin E ve seruloplazmin gibi endojen veya ekzojen antioksidanlar ya serbest radikal oluşumunu engelleyebilir ya da oluştuklarında onları yok edebilirler (Kumar ve ark., 1999).
2.4.2. Reaktif Oksijen Türleri Ve Diğer Serbest Radikallere Karşı Antioksidan Savunma Sistemleri
Organizmalar evrimleri süresince serbest radikalleri inaktive etme zorunluluğu ile yüz yüze gelmişlerdir. Bu nedenle kendilerini oksidatif ataklardan korumak için çeşitli yollar geliştirmişlerdir (Leutner ve ark., 2001).
Organizmalarda, serbest radikallerin zararlı etkilerini ortadan kaldıran güçlü savunma sistemleri bulunmaktadır. Serbest radikallerin oluşum hızı, bu savunma sistemlerinin etkisizleştirme hızı ile dengede olduğu sürece organizma oluşan radikallerden etkilenmemektedir. Denge bozulur, zararlı bileşiklerin oluşum hızı sistemin savunma gücünü aşarsa ya da sistemin savunma gücü azalırsa serbest radikaller zararlı olmaya başlarlar. Bunun sonucunda oksidatif hasar ortaya çıkar (Sen, 2001; Meram ve Aktaran, 2002).
Hücrelerde, oksidanları inaktif hale getirerek, oksidatif hasarı önleyen, yok eden veya kısmen azaltan maddelere antioksidanlar adı verilmektedir. Tüm antioksidanlar etkilerini başlıca dört farklı şekilde gerçekleştirmektedir;
1- Enzimler antioksidanları tutarak daha zayıf bir moleküle dönüştürürler 2- Vitaminler ve flavonoidler gibi bileşikler oksidanlara bir hidrojen aktararak
etkisiz hale getirirler.
3- Oksidanların oluşturduğu hasarı onaran antioksidanlar bulunmaktadır. 4- Ağır metaller, hemoglobin, serloplazmin, E vitamini oksidanları
bağlayarak fonksiyonlarını engellerler (Onat ve ark., 2002).
Normal şartlar altında, antioksidan savunma mekanizmaları reaktif oksijen metabolitlerini zararsız seviyelerde tutar. Ancak, serbest radikallere uzun süre maruz kalınması hücresel hasarı önlemede yetersizlikle sonuçlanır (Matés ve Jiménez, 1999; Camougrand ve Rigoulet, 2001).
Antioksidan koruma sistemleri endojen ve ekzojen antioksidanlar olarak sınıflandırılabilir. Süperoksitdismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPX) gibi antioksidan enzimler endojen antioksidanlar, vitamin E, asetilsalisilik asit, selenyum, melatonin gibi antioksidanlar ise ekzojen antioksidanlardır.
Antioksidan enzimlerden SOD, süperoksit radikalinin, moleküler oksijen ve daha az reaktif olan hidrojen peroksite dönüşümünü katalizlemektedir (Rojkind ve ark., 2002). Süperoksit dismutaz, oksijeni metabolize eden bütün hücrelerde bulunur, vücut tarafından üretilen en güçlü antioksidandır ve antioksidan savunmasının belirteci olarak kullanılır (Bagis ve ark., 2003). Katalaz enzimi hidrojen peroksiti su ve moleküler oksijene dönüştürmektedir (Alberts ve ark., 2002). Hücrenin özellikle peroksizom partikülleri ve mitokondriyonlarında, daha az yoğunlukta ise sitoplazma ve endoplazmik retikulumunda bulunur (Akyol, 2004). Bir diğer antioksidan enzim Glutatyon peroksidaz (GPX) enzimi; vücutta hidrojen peroksitin (H202) detoksifikasyonunda ve ayrıca lipit hidroperoksitlerin detoksifikasyonunda görev alır. Bu nedenle bu enzim hücreleri lipit peroksidasyonuna karşı korumada önemli bir role sahiptir (Rojkind ve ark., 2002; Akyol, 2004).
Eğer bir kanser kemoterapötik ajan tarafından reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu veya ilacın serbest radikal ara ürünü, ilacın sitotoksisitesinde rol oynuyorsa, antioksidanlar ilacın antineoplastik aktivetesini engelleyebilirler. Bununla beraber, eğer reaktif türler sadece ilacın yan etkilerinden sorumlu ise, antioksidanlar ilacın antineoplastik aktivitesini engellemeksizin yan etkilerin şiddetini indirgeyebilirler. Bu yüzden eğer ROS veya serbest ara ürünler ilacın hareket mekanizmasında rol alıyorsa, ilacın biyolojik sistemlerde oksidatif strese yol açma yeteneği ve rolü arasındaki ayırımı yapmak önemlidir (Conklin, 2004).
2.5. Karaciğer
Karaciğer insanda yaklaşık 1500 gr olup, vücuttaki en büyük bezdir (Gartner ve Hiatt, 1997). Karın boşluğunun sağ üst bölümünde, diyaframın altında, mide ve barsakların üstünde yerleşmiştir. Karaciğer kostaların arkasında korunmuş konumda olup çok az bir bölümü karın ön duvarı ile doğrudan ilişkidedir (Karaöz, 2003). Karaciğerin dolaşım sistemindeki konumu, metabolitlerin bir araya getirilmesi, dönüştürülmesi, biriktirilmesi ve toksik maddelerin nötralize ve elimine edilmesi için çok uygundur. Bu eliminasyon karaciğerin lipit sindirimi için önemli bir ekzokrin salgısı olan safrada gerçekleşir (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Karaciğer hem duedonuma safra salgılayarak bir ekzokrin bez olarak görev yapar, hem de direkt olarak kan dolaşımına salınan çeşitli maddeleri sentezleyen bir endokrin bez olarak görev yapar (Fawcett, 1986).
Karaciğer hilumdan kalınlaşan ince bir bağ dokusu kapsülü ile örtülüdür. Hilumda, organa portal ven ve hepatik arter girer, sağ ve sol hepatik kanallar ve lenfatikler çıkar. Bu damarlar ve kanallar, klasik karaciğer lobülleri arasında sonlandıkları portal alanlara dek bağ dokusu ile çevrilmiştir. Bu noktadan itibaren karaciğer lobüllerindeki hepatositlere ve sinüzoidal endotel hücrelerine destek sağlayan ince bir retiküler lif ağı oluşur (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Karaciğerin temel fonksiyonel hücreleri hepatositlerdir. Oldukça fazla sayıda metabolik, endokrin ve salgı fonksiyonlarını gerçekleştirirler. Kabaca karaciğer kütlesinin % 80 ‘ nini teşkil ederler (Smith ve ark., 1988). Hepatositler
büyük poligonal hücrelerdir ve her birinin çapı 20-30 mikrometre arasında değişir (Ross ve ark., 1995). Hepatositlerin yaklaşık % 75’i tek, geri kalanı çift çekirdeklidir. Çekirdek boyutları değişmektedir (Gartner ve ark., 1995). Çekirdekler büyük, yuvarlak ve merkezi yerleşimlidir. Hepatosit sitoplâzması genellikle asidofiliktir. Sitoplâzmalarında çok sayıda mitokondriyon ve düz endoplazmik retikulum bulunur (Ross ve ark., 1995).
Karaciğerin fonksiyonel birimi lobüldür. Lobüllerin ortasında santral ven bulunur ve hepatositler ışınsal olarak bu santral venlerin çevresinde düzenlenme gösterirler. Lobüller birbirleriyle yakın temasta oldukları için kesin sınırları belirlemek zordur, bazı bölgelerinde bağ dokusuyla çevrelenmiş portal üçgenler yer alır. Her bir portal üçgende portal venin bir dalı, hepatik arterin bir dalı, safra kanal sisteminin bir parçası olan safra kanalı ve lenfatik damarlar bulunur (Fawcett,1986). Venül genellikle bu yapıların en büyüğüdür, süperior ve inferiör mezenterik ve splenik venlerden gelen kanı içerir (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Hepatositler, karaciğer lobülü içinde ışınsal olarak dizilmişlerdir. Hücreler bir duvarın tuğlalarına benzer biçimde bir ya da iki hücre kalınlığında bir tabaka oluştururlar. Bu hücre plakları lobülün periferinden merkezine doğru yönlenmişlerdir, labirent şeklinde ve sünger benzeri bir yapı oluşturacak biçimde serbestçe anastomozlaşmışlardır. Bu plaklar arasındaki boşlukta kapilerler bulunur ve bu kapilerlere “karaciğer sinüzoidleri” denir (Şekil 2.5) (Gartner ve ark., 1997). Sinüzoidal kapilerler sadece kesintili bir pencereli endotel tabakasından oluşan düzensiz olarak genişlemiş damarlardır. Pencereler yaklaşık 100nm çapındadır ve eleğe benzer bir görüntü oluşturan kümeler halinde toplanmışlardır (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Endotel hücreleri, altında bulunan hepatositlerden disse aralığı adı verilen subendotelyal bir boşlukla ayrılmıştır (Şekil 2.4). Bu aralıkta hepatositlerin düzensiz mikrovillusları bulunur. Hepatositlerin bu bazal yüzeyindeki mikrovilluslar, yüzey alanını genişleterek hepatositler ve plazma arasındaki madde değişimini 6 kat arttırırlar (Ross ve ark., 1995).
Sonuç olarak kan sıvısı endotel duvarından kolayca geçer ve hepatosit yüzeyi ile temas eder. Böylece sinüzoid lümeniyle karaciğer hücreleri arasında makromoleküllerin alışverişi kolaylıkla sağlanır. Bu geçiş sadece çok sayıda makromoleküllerin (Örn: lipoproteinler, albumin, fibrinojen) hepatositler tarafından kana verilmesi nedeniyle değil, aynı zamanda bu makromoleküllerin çoğunun hepatositlerce alınıp katabolize edilmesi nedeniyle de fizyolojik önem taşır. Sinüzoid ince bir retiküler lif kılıfıyla sarılıp desteklenmiştir (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Endotel hücrelerine ek olarak, sinüzoidler mononükleer fagositik serilerinin fagositik hücrelerini de içerir. Kupffer hücreleri adı verilen bu hücreler endotel hücrelerinin lümene bakan yüzeyinde bulunur (Jungueria ve Carneiro, 2003). Bu hücreler kan monositlerinden köken almaktadır (Akay, 2001). Kupffer hücreleri sinüzoid damarlarının bir parçası olarak yapıya girerler. Ancak komşu endotel hücreleri arasında bulunan kanal yapıları, bu hücrelerde yoktur (Ross ve ark., 1995). Kupffer hücreleri tipik makrofajlardır. Başlıca fonksiyonları yaşlı eritrositleri metabolize etmek, hemoglobini sindirmek ve immünolojik olaylarla ilgi proteinleri salgılamaktır.
Şekil 2.4. Hepatositlere yakın endotel hücreleriyle sinüzoid kapillerini gösteren karaciğer kesiti.
Yağ depolayıcı hücreler (Ito hücreleri) disse aralığına yerleşmiş yıldızsı hücrelerdir. Bu hücreler dışarıdan verilen A vitamini lipid damlaları içinde retinil esterler halinde biriktirme kapasitesine sahiptir, ancak bu hücrelerin A vitamini metabolizmasındaki rolü tam olarak bilinmemektedir (Jungueria ve Carneiro, 2003).
Karaciğer iki kaynaktan kan alır. Organa kanın yaklaşık %70-80’i portal venden gelir, geri kalan kısmı hepatik arterle sağlanır (Jungueria ve Carneiro, 2003). Hepatik arter, oksijen bakımından zengin kan ile karaciğere girer. Hepatik portal ven, dalaktan ve sindirim sisteminden kan taşır. Dalaktan alınan kan hemoglobin parçalanma ürünleri bakımından, barsaklardan alınan kan, aminoasitler, lipitler, karbonhidratlar bakımından zengindir (Stevens ve Lowe, 1993; Noyan, 1995).
Karaciğerin yapısında fonksiyonel olarak kabul edilen bir başka birimde portal lobüldür. Bu lobülün merkezinde portal üçgen yer alır, lobülün her köşesinde bir sentral ven bulunur ve birbirine bitişik üç hepatik lobül parçası içerir. Hepatik lobül poligonal olmasına karşın portal lobül üçgen şeklindedir. Bu lobülde safra lobülün merkezindeki portal üçgende bulunan safra kanalı içine boşaltılır (Fawcett, 1986; Jungueira ve ark., 2003).
Rappaport ve ark. hepatik asinüs olarak isimlendirilen karaciğer lobüllerini fonksiyonel birim olarak kabul ederler. Hepatik asinüste, iki farklı hepatik lobülün bitişik bölgelerinde yerleşmiş, merkezinde portal ven dallarının yanı sıra hepatik arter dalları ve safra kanalı bulunmaktadır (Fawcett, 1986). Hepatik asinüste dağıtıcı venlere olan yakınlığına göre hücreler zonlara ayrılmaktadır. I. Zondaki hücreler damarlara en yakın konumda olan ve bu nedenle gelen kanla ilk karşılaşan hücrelerdir. II. Zondaki kana ikinci olarak yanıt oluşturan hücrelerdir. III. Zondaki hücreler I. Ve II. Zondaki hücrelerden sonra kan ile karşılaşırlar (Jungueira ve Carneiro, 2003).
Salgı yapma fonksiyonundan başka, yaşamla ilgili çok çeşitli işlevleri yerine getiren bir organdır. Sindirim kanalı ile vücudun diğer kısımları arasında kalan tam bir kesişme noktasında yer alan karaciğer, vücudun metabolik dengesini sağlamada görevlidir.
Bunlar, sindirilen aminoasitlerin, karbonhidratların, lipitlerin ve vitaminlerin işlenmesi, serum proteinlerinin sentezi, endojen atık ürünlerin ve zararlı ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ve safra ile atılmasıdır (Kumar ve ark., 1999).
Şekil 2.5. Normal karaciğerin üç boyutlu görünümü (Jungueria ve Carneiro, 2003).
2.5.1. İlaç Ve Toksine Bağlı Karaciğer Hasarları
Vücutta ilaçları metabolize detoksifiye eden başta gelen organ olan karaciğer, terapötik ve çevresel kimyasal maddelerin potansiyel hasarına son derece açıktır. Başlıca hasar nedenleri şunlardır:
1- Direk toksisite
2- Ksenobiyotik bir toksinin karaciğer tarafından aktif toksine dönüştürülmesi
3- Bir ilaç ya da bir metabolitin bir proteini bir immünojene dönüştürmesi gibi immün mekanizmalar (Kumar ve ark., 1999).
İlaca bağlı karaciğer hasarının tanınması birkaç nedenden dolayı zordur. İlaca bağlı karaciğer hasarı doğal veya taklitçi karaciğer hastalığı oluşturabilir ve bu tüm ilaç sınıfındaki bileşenlerden oluşur.
Aşırı duyarlı bir reaksiyonun klinik işaretleri tüm durumlarda oluşmayabilir ve bir hastanın ilaç kullanma hikâyesi fazla güvenilir değildir. Ayrıca bu, çoklu ilaç terapisi alan hastalarda buna sebep olan ajanı belirlemek için imkânsızdır. Aynı ilaç farklı hastalarda farklı karaciğer hasar örneklerine neden olabilir. Karaciğer hasar etkisi, diğer farmakolojik ajanların verilmesiyle uyarılmış olabilir. Tanıyı koyacak olan histopatolojistin ilaca bağlı olarak oluşan lezyonların tipini ve bunların ilacın neden olmadığı lezyonların özelliklerinden farkını iyi bilmesi gerekmektedir (Damjanov ve Linder, 1996).
Ayırım; beklenen toksik etkiler ve beklenmeyen reaksiyonlar arasında yapılmıştır. Beklenen reaksiyonlar molekülün gerçek hepatotoksisitesinden kaynaklanır, doza bağlıdır ve kısa latent periyotta oluşurlar (Damjanov ve Linder, 1996). Belirli bir dozu depolayan herhangi bir kişide meydana gelebilir. Beklenmeyen reaksiyonlar ise; kişinin antijenik bir uyarıya karşı artmış bir bağışıklık yanıt verme eğilimine ve kişinin ajanı metabolize etme hızına bağlıdır (Kumar ve ark., 1999). Beklenmeyen reaksiyonların doz ilişkisi belirgin değildir, latent periyodu hayli uzun olabilir (haftalar ve aylar) (Damjanov ve Linder, 1996).
Tahmin edilebilen reaksiyonların çoğunun kaynağı asetaminofen (fenasitin olarak adlandırılır), tetrasiklin, antineoplastik ajanlar, Amonita falloids toksini, karbon tetraklorid ve belirli noktaya kadar alkol olarak kabul edilir (Kumar ve ark., 1999).
Karaciğerdeki ilaca bağlı reaksiyonlar organın hücresel elemanlarında yapısal ve fonksiyonel değişikliklere neden olabilir ve çeşitli örnekler oluşturabilir (Damjanov ve Linder, 1996).
2.6. Kanser
Normal dokuyu aşan ve onunla koordine olmayan, değişime yol açan, uyarı durduktan sonra bile aynı şekilde aşırı büyümeye devam eden anormal doku kütlesine tümör (neoplazm) denir. Neoplastik hücreler belirgin derecede normal hücre büyümesini kontrol eden düzenleyici etkilerden bağımsız çoğalmaya devam ettiğinden, değişime uğrar. Örneğin; zar yapısında bazı glikoproteinlerin sentezi tamamlanamadığı için kontak inhibisyon yok olur, bu nedenle büyüme kontrolsüz olarak gerçekleşir (Kumar ve ark., 1999).
Onkolojide neoplazmlar benign ve malign olmak üzere 2 kategoriye ayrılır. Bir tümör mikroskobik ve makroskobik özellikleri ile nispeten sessiz kabul edildiğinde, yani lokalize kalacağı, diğer bölgelere yayılmayacağı ve bu nedenle lokal cerrahi çıkarılma ile hastanın sağ kalacağı düşünülürse, “benign” olduğu söylenir. Malign tümörler ise topluca “kanser” olarak adlandırılır. Malign olarak değerlendirilen neoplazm, komşu yapılara yayılan, onları harap eden ve uzak bölgelere yayılarak (metastaz) ölüme yol açan lezyondur (Kumar ve ark., 1999).
Neoplastik hücreleri öldürmek veya yok etmek için çeşitli kombinasyonlar halinde kimyasalların kullanılarak gerçekleştirilen tedavi yöntemine kemoterapi denir. Bu tedavi yönteminde tek bir ilaç kullanıldığı gibi çeşitli ilaç kombinasyonları da kullanılabilir. Kemoterapi, kanserle savaşta en etkili silahlardan biridir. Bu amaçla kullanılan ilaç veya kimyasallara kemoterapötikler denilir. Kemoterapötik ajanlar sentetik veya semisentetik olabildiği gibi geniş oranda doğadan izole edilenleri de vardır. Kemoterapötik kullanımındaki en
olumsuz belirtilerden biri, kemoterapötik maddenin kanserli hücre üzerine etkili olmasına karşın normal hücrelere de zarar vermesidir (Baloglu, 2001).
Birçok kemoterapötik ilaç, etki mekanizmaları temel alınarak 6 sınıfa ayrılır:
1- Alkilleyici Ajanlar: Bunlar hücre ölümüne sebep olan, DNA sarmalının açılmasını engelleyerek hücre bölünmesini, DNA replikasyonunu bloke ederler.
2- Antimetabolitler: Bunlar ya DNA/RNA’nın biyosentetik öncüllerinin yerine geçerek ya da normal öncül biyosentezini inhibe ederek nükleik asit sentezini bozarlar.
3- Karsinolitik antibiyotikler: Bunlar DNA’ya bağlanarak DNA-RNA sentezini engellerler.
4- Hormonal ajanlar: Over, meme ve prostat tümörleri östrojen ve/veya androjenik hormonlara bağlıdır. Kanseröz durum bu hormonların kaynakları minimize edildiğinde tedavi edilebilir.
5- Mitotik inhibitörler: Mitoz için oldukça önemli olan mikrotübüllerin oluşumunu engellerler. Doğal ürünlerden izole edilen, klinik olarak kullanılan taksol anti-kanser ajanlarının en önemlisidir ve bu grubun bir üyesidir. Ancak bu gruptaki kolşisin ve vinka alkoloidler gibi antimikrotübül ajanlarınkinden farklı bir etki mekanizmasına sahiptir. 6- Misellenöz kemoterapötik ajanlar (Baloglu, 2001).
2.7. Taksol
Kompleks bir doğal ürün olan paklitaksel (taksol) ilk olarak Taxus
brevifolia (porsuk ağacı)’ dan sentezlenmiştir. Taksol, fonksiyonel bir amid
grubu olarak nitrojen atomunu içeren tetrasiklin bir alkoldür (Król, 1998).
Paklitaksel; solid tümörlerin, özellikle de meme ve over tümörlerinin tedavisinde kullanılır. Taksol kemoterapide kullanılan ilaç sınıflarından mitotik inhibitör sınıfına girer ve etki mekanizması kolşisin ve vinka alkoloidler gibi antimikrotübül ajanlarınkinden farklıdır (Baloglu, 2001). Diğer antimükrotübül ajanları mikrotübül dağılımını uyarırken, taksol oluşan mikrotübülü stabilize
ederek dağılmasını engeller, yani bu ajanlara zıt yönde aktivite gösterir (Atas ve ark., 2006).
Taksol; stabil mikrotübüllerin bireysel gruplarının oluşumunu arttırıcı tek mitotik inhibitördür. Taksolün polimerizasyon ve depolimerizasyon için yetenekli olduğu düşünülür. Araştırmacılar, ortamda saflaştırılmış tubulinin polimerizasyonu için gerekli miktarda GTP bulunmadığında, taksolün mikrotübüler proteinleri polimerizasyon için uyardığını bulmuşlardır (Król, 1998).
Taksol, over kanseri için en aktif ajandır. Bir platinum ajanıyla kombine olan taksolün; ilerleyen over kanserinde en yardımcı kemoterapi rejimlerinden biri olduğu düşünülür (AOCTG, 1991). Taksolün, pediatrik yaş grubunda olduğu gibi yetişkin popülasyonda da akciğer non-small cell karsinoma meme, baş, boyun kanserini kapsayan çeşitli kanserlere karşı etkili olduğu rapor edilmiştir (Perez ve ark., 2001; Sakai ve ark., 2001; Dunphy ve ark., 2001).
Diğer antineoplastik ajanlara benzer olarak taksol nötrofeni (kanda nötrofil sayınsın ileri derecede azalması), nötropati (sinirsel hastalık) gibi bazı yan etkilere sahiptir (Atas ve ark., 2006). En genel gastro intestinal yan etkiler; bulantı, kusma, ishal, mukoza iltihabı ve ağız iltihabıdır. İlacın hastaya parental (kas, damar veya deri altı enjeksiyonu) olarak verilmesi direk histamin salınımından dolayı A tip I hipersentivite oluşturabilir. O yüzden taksolün antihistaminik ve kortikosteroid kombinasyonuyla hastaya verilmesi tavsiye edilir (Rowinsky ve ark., 1992).
Taksolün klinik doz kullanımı 130 ve 275 mg/m2 arasındadır. Yavaş infüzyonla tek bir doz verilir. Taksolün farmakodinamikleri; hem metabolizma hem de safra kesesi eliminasyonu ekstrarenal mekanizmalara bağlıdır ve yarı ömrü 2–5 saattir. Terapi 3 haftalık bölümlerle 6–9 doz tekrarlanır. Genellikle platin bir ajanla birlikte verilir (Atas ve ark., 2006).
Taksol sadece bir ilaç gibi aktivite göstermez, aynı zamanda bir toksin gibi bölge defektleri oluşturmaktadır. Bu da hücrede anormal olarak değişen veya bozulan organellerin toplanmasına neden olmaktadır (Król, 1998).
Król, (1998) yapmış olduğu çalışmada, taksolün 3 farklı dozunu (0,75 mg/kg, 1,25 mg/kg ve 2,5 mg/kg) farelere enjekte etmiş ve karaciğerdeki lizozomal enzimlerin aktivitesindeki değişimleri biyokimyasal olarak
değerlendirmiştir. Elde edilen verilere göre taksolün proteolitik aktiviteyi arttırdığı ve bu artışın proteolitik enzimlerin sentezindeki artışla gerçekleştiği rapor edilmiştir. Ayrıca karaciğer dokusunu elektron mikroskobu düzeyinde incelemiş ve lizozom sayısında artış, çok sayıda vezikül tarafından çevrelenmiş birçok golgi cisimciği, çok sayıda otofajik vakuoller ve anormal mikrotübüller gözlemiştir. Ayrıca bu değişiklerin doz artışına bağlı olduğunu belirlemiştir.
Varbiro ve ark. (2001) sıçanlarla yapmış oldukları çalışmada taksolün, direk olarak mitokondriyonal geçirgenliği ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) salınımını anlamlı bir şekilde arttırdığını saptamışlardır. Bu değişikliklerin ilacın toksik etkisine bağlı olarak meydana gelen biyokimyasal değişiklikler olduğunu ve bunların ilacın dozuna bağlı olduğunu göstermişlerdir.
Taksolün yapısı oldukça farklıdır. Bir β-fenilsoserin yan zinciriyle köprü oluşturmuş tetrasiklik hücre iskeletinden oluşur (Şekil 2.6) (Baloglu, 2001).
Şekil 2.6. Paklitaksel’in kimyasal yapısı (Taksol) (Baloglu, 2001).
Taksolün 3 boyutlu yapısı, “ters kupa” olarak adlandırılır. Kimyasal olarak; taksan diterpenoidler olarak bilinen kompleks doğal ürünlerin geniş bir ailesi içerisindedir (Şekil 2.7) (Baloglu, 2001).
Şekil 2.7. Paklitaksel’in (taksol) üç boyutlu yapısı (Baloglu, 2001).
2.7.1. Taksolün Etki Mekanizması
Tüm ökaryotik hücreler hücre iskeleti denilen bir iç iskelete sahiptir. Bu iskelet hücrenin şeklini belirler, hem hücrenin kendisine hem de sahip olduğu organellere hareket yeteneği sağlar. Hücre iskeleti oldukça dinamik bir yapıdadır ve protein filamentlerinin bir ağından oluşur. Bu protein flamentleri; aktin filamentleri, ara filamentler ve mikrotübüllerdir
( http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/cytoSkeleton.html).
Mikrotübüller; uzun, içi boş silindirlerdir ve tubulin moleküllerinden oluşurlar. Dış çapı 25nm ve iç çapı yaklaşık olarak 15nm’dir ve aktin filamentlerinden daha serttirler (Kleinsmith ve ark., 1988).
Şekil 2.8. Mikrotübülün yapısının şematik gösterimi
Mikrotübülün duvarı tubulin moleküllerinin linear polimerlerinden oluşan protofilamentlerden oluşur. Tubulin, heterodimerik bir proteindir ve 2 benzer fakat ayrı polipeptit alt ünitesinden, α ve β-tubulinden oluşur. Bu alt ünitelerin her biri diğerine sıkıca bağlanmıştır. Bu polipeptitlerin her biri yaklaşık 4-5nm çapındadır ve moleküler ağırlığı 50.000’dir (Şekil 2.8) (Karol ve ark., 1995).
Mikrotübüller tubulin dimerlerinin geri dönüşümlü polimerizasyonundan oluşur. α ve β alt üniteleri ayrı polipeptitler olarak sentezlenir ve sonra bunlar tubulin moleküllerini oluştururlar. Dimerler polimerize olurlar, bir tabaka içinde yan yana birleşirler ve halkaları oluştururlar. Tabaka giderek büyür ve silindir oluşmaya başlar; lateral olarak sıralanan protofilamentlerin sayısı 13’e ulaştığında 1 mikrotübül oluşumu sağlanmış olur. Bu süreç sonunda dimerlerin protofilamentlerin uçlarına eklenmesiyle mikrotübül uzar (Karaöz, 2003).
Mikrotübüller hücre içi transportda, sil ve flagellanın hareketinde, mitoz sırasında kromozomların ayrılmasında, hücre şeklinin belirlenmesinde ve korunmasında işlev görür.
(http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/cells/cytoskeltypes.jg).
Mikrotübüller; spesifik olarak antimitotik ilaçlara hassas olan, yüksek derecede değişken yapılardır (Salmon ver ark., 1984). Spesifik antimitotik ilaçların hedefi (bu ilaçlar mikrotübüller ve serbest tubulin arasındaki tubulin alt ünitelerinin değiş tokuşunu engelleyerek aktivite gösterirler) mitotik iğdir. Bu ilaçlardan biri kolşisindir. Kolşisin çayır safranından izole edilen bir alkoloiddir. Kolşisin tubuline bağlanır ve bu molekülün mikrotübüle polimerize olmasını engelleyerek mitotik iğin yok olmasına neden olur. İğin geçici dağılımından dolayı, anormal olarak bölünen birçok hücre ölür. Kolsemid gibi antimitotik ilaçlar, kolşisin, vinblastin ve vinkristin ile yakından ilişkilidir. Etkileri kolşisininkilere benzerdir. Bu nedenle bunlar sitotoksik ajanlardır.
Horwitz ve çalışma arkadaşları, taksolün zıt yönde çalıştığını belirlediler (Shiff ve ark., 1979). Taksol tubulin dimerlerinden ziyade, vinblastin, kolşisin ve podofilotoksinden farklı bölgelerde mikrotübüllere bağlanır (Sackett ve Fojo, 1997).
Taksol varlığında, mikrotübül hücre iskeleti yeniden düzenlenir ve mikrotübüllerin stabil bantları oluşur. Taksol, hücre döngüsünün G2/M fazında
hücreleri bloke eder. Replikasyon inhibe edilir veya çok yavaş ilerler. Taksol bu özelliğinden dolayı çok ilginçtir.
Taksol; polimerizasyon için gerekli olan kritik tubulin konsantrasyonunu düşürerek düzenleme merkezlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır (tubulinlerin düzenleme merkezlerine birkaç bölgeden bağlanması polimerizasyonla sonuçlanır) (Baloglu, 2001).
2.7.2. Taksolün Yapı-Aktivite İlişkisi
Bileşenlerin yapı-aktivite ilişkisi üzerindeki çalışmalar, molekülün etki tarzı, molekülün aktivitesindeki konformasyonlar, belirli fonksiyonel grupların rolü gibi biyolojik aktivitenin devam etmesi için esasi yapısal ihtiyaçları ile ilgili yararlı bilgi sağlar (Baloglu, 2001).
Taksolün yapı-aktivite ilişkisi 20 yıldan fazla bir süredir araştırılmaktadır. Taksolün yapı aktivite ilişkisi şekil 2.9’ da gösterilmektedir. Taksolün yapı- aktivite ilişkisinin bilinmesi; onun fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikleriyle yeni analoglarının sentezine ve düzenlenmesine yardımcı olacaktır.
