Türkiye doğal florasında yetişen papaver cinsi oxytona seksiyonuna ait gen havuzunun SSR tekniği ile genetik karakterizasyonu

(1)

TÜRKĐYE DOĞAL FLORASINDA YETĐŞEN

Papaver CĐNSĐ Oxytona SEKSĐYONUNA AĐT

GEN HAVUZUNUN SSR TEKNĐĞĐ ĐLE GENETĐK KARAKTERĐZASYONU

Đsmail BENLĐ

Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı

Yrd. Doç. Dr. Đskender PARMAKSIZ 2009

(2)

T.C.

GAZĐOSMANPAŞA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ

BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ

TÜRKĐYE DOĞAL FLORASINDA YETĐŞEN

Papaver CĐNSĐ Oxytona SEKSĐYONUNA AĐT GEN HAVUZUNUN

SSR TEKNĐĞĐ ĐLE GENETĐK KARAKTERĐZASYONU

Đsmail BENLĐ

TOKAT 2009

(3)

Başkan : Doç. Dr. Şaban TEKĐN Đmza:

Üye : Doç. Dr. Đsa GÖKÇE Đmza:

Üye : Yrd. Doç. Dr. Đskender PARMAKSIZ Đmza:

Yukarıdaki Sonucu Onaylarım

Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

(4)

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

(5)

i

TÜRKĐYE DOĞAL FLORASINDA YETĐŞEN Papaver CĐNSĐ Oxytona SEKSĐYONUNA AĐT GEN HAVUZUNUN SSR TEKNĐĞĐ ĐLE GENETĐK

KARAKTERĐZASYONU

Đsmail BENLĐ

Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Yrd. Doç. Dr. Đskender Parmaksız

Türkiye çok sayıda bitki türünün gen merkezi olup, bitki çeşitliliği bakımından dünyanın en zengin ülkelerinden birisidir. Dünya’da Papaver cinsine ait yaklaşık 110 türün tür ve tür altı kategoriler dâhil toplam 50 taksonun ülkemizde bulunduğu bilinmektedir. Đnsanların doğrudan uyuşturucu olarak kullanamayacakları

P.somniferum’ a alternatif tebain ve kodein kaynağı olan diğer Papaver türlerinin

kültüre alınması ve geliştirilmesi yönünde girişimler Birleşmiş Milletlerin de desteğiyle başlamıştır. Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan Papaver bracteatum, P.

pseudo-orientale ve P. pseudo-orientale türleri ise ülkemiz doğal florasında bulunmaktadır.

Ülkemizde bulunan bu türlere ait populasyonların taranarak yüksek alkaloit içerikli olanları belirlenmeye çalışılmıştır. Ayrıca, farklı bölgelerde bulunan Oxytona seksiyonundaki bitki populasyonlarının tür teşhisinde de önemli karışıklıklar yaşanmaktadır. Bu karışıklıkları gidermek ya da varlığını tespit etmek için; bazı önemli morfolojik karakterler, tebain varlığı, kromozom sayıları ve moleküler sonuçlar ilişkilendirilmiştir. 12 SSR primeri kullanılmış olup tamamı polimorfik olan 60 bant vermiştir. Ortalama genetik mesafe 0.41, Shannon indeksi 0.53 dür. SSR verileri dikkate alındığında p.bracteatum olarak bilinen bitkiler genetik olarak birbirlerine çok yakınken diğer türler için aynı durum söz konusu değildir.

2009, 53 sayfa

Anahtar Sözcükler: SSR, genotiplendirme, Papaver, Oxtona, P. bracteatum, P. orientale, P. pseudo-orientale

(6)

ii

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF GENE POOL OF Papaver GENUS

Oxytona SECTION GROWN in WILD FLORA OF TURKEY BY SSR TECHNIC

Đsmail BENLĐ

Gaziosmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Deparment of Biology

Supervisor: Asst. Prof. Dr. Đskender Parmaksız

Turkey is a center of origin for many plant species and one of the richest countries in plant diversity. Turkey has approximately 50 taxa including sub-species out of 110 species in Papaver genus. Studies on cultivation of other Papaver species which can be an alternative to P. somniferum as tebain and kodein source and cannot be used directly as drug has been started by the support of UN. P. bracteatum, P. Pseudo-orientale and P. Orientale species of Oxytona section in Papaver genus were found widely in native flora of Turkey. The species populations found in our country have been scanned to determine for high alkaloid content containing ones. Moreover, the identification of the plant populations of Oxytona section are located in different regions is in turmoil. To resolve this confusion, or to determine the existence; some important morphological charecters, tebaine content, chromosome number and molecular results were associated. In this study 12 SSR primers have been studied and 60 polymorphic bands were obtained. Avarage genetic distance was found to be 0.41, and Shannon index is 0.53. SSR data, taking into account the accesions of

P. bracteatum species have been found gentically related but for the other species

the same is not the case. 2009, 53 pages

Key words: SSR, phylogenetic relation, Papaver, Oxtona, P. bracteatum, P. orientale, P. pseudo-orientale,

(7)

iii

çalışmalarım için gerekli imkânları sağlayan Danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. Đskender PARMAKSIZ’a, çalışmalarım süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER’e, laboratuvar çalışmalarımda büyük emekleri geçen değerli arkadaşlarım Gülşen BOZTEPE’ye, Elif KAYMAK’a, Tuğba GÜRKÖK’e, Eda DAŞTAN’a ve Leyla AYDOĞAN’a, son olarak hayatım boyunca benim dertlerimle dertlenen, sevincimle sevinen, manevi desteklerini her zaman yanımda hissettiğim annem ve kardeşime en içten teşekkürlerimi sunuyorum.

Bu tez çalışması TÜBĐTAK-TOVAG (Tarım Ormancılık Veterinerlik Araştırma Grubu) 105 O 501 no’lu proje “Türkiye Doğal Florasında Yetişen Papaver cinsi Oxytona seksiyonuna ait Gen Havuzunun RAPD ve SSR Teknikleriyle Genetik karakterizasyonu, Morfolojik ve Alkaloit Kompozisyonlarının Kromozom Sayılarıyla Đlişkilendirilmesi” ve Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri 2008/09 nolu “Türkiye Doğal Florasında Yetişen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna ait Gen Havuzunun SSR Tekniği ile Genetik Karakterizasyonu” projeleri tarafından desteklenmiştir.

Đsmail BENLĐ Ağustos 2009

(8)

iv ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ iii ĐÇĐNDEKĐLER DĐZĐNĐ iv SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ viii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ ix 1. GĐRĐŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERĐ 2

2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri 2

2.2. Oxytona seksiyonun Genel Özellikleri 2

2.3. Morfolojik Markörler 4

2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri) 5

2.5. DNA Markörleri 6

2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DNA (RFLP) Markörleri 7

2.5.2. RAPD (Rastgele Arttırılmış Polimofik DNA) 7

2.5.3. AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi) 9 2.5.4. CAPS (Kesilip Çogaltılmıs Polimorfik Diziler) 10 2.5.5. SCAR (Belirlenmiş ve Çogaltılmış Polimorfik Diziler) 11

2.5.6. ISSR (Basit Đç Dizi Tekrarları) 12

(9)

v

2.5.8.2. Genetik Haritalamada SSR’ların Kullanımı 15

3. MATERYAL VE YÖNTEM 19

3.1. Materyal 19

3.2.Yöntem 19

3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuar Çalışmaları Đçin Hazırlanması 20

3.2.2. DNA Đzolasyonu 20

3.2.3. PCR Uygulaması 21

3.2.4. Çalışmada Kullanılan SSR Primerleri 22

3.2.5. Elektroforez Đşlemi 22

3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi 23

3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi 23

4. BULGULAR 24

5. TARTIŞMA VE SONUÇ 41

5.1. Sonuç 43

KAYNAKLAR 46

(10)

vi

bp Base pair (baz çifti =bç)

kb kilo base

mM milimolar

ng nanogram

rpm Revolutions per minute (dakikadaki devir)

µg mikrogram

µl mikrolitre

µM mikromolar

UV Ultraviole

Kısaltmalar Açıklama

AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi cDNA Komplementer deoksiribonukleik asid CAPS Kesilip Çogaltılmıs Polimorfik Diziler dNTP deoksinükleotidtrifosfat

DNA deoksiribonükleik asid EDTA Ethilendiamintetraasetik asid ISSR Basit Đç Dizi Tekrarları

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Moleküler Evrim Genetik Analizi)

PCR Polymerase Chain Reaction (polimeraz zincir reaksiyonu)

PAGE Polyacrilamide Gel Electrophoresis (poliakrilamid jel elektroforezi) POPGENE Population Genetic Analysis (Populasyun Genetik Analizi

RAPD Randomly Amplified Polymorfic DNA (rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (kesilmiş parçaların uzunluk polimorfizmi)

(11)

vii

polimorfizmi)

SSR Simple Sequence Repeat (basit dizi tekrarı) STS Sequence target site (dizisi etiketlenmiş bölge) Taq Thermus aquaticus

TBE Tris/borat/EDTA (Buffer) TE Tris/EDTA (Buffer)

(12)

viii

Şekil 4.1. SSR VRZAG14 primerinin %8 poliakrilamid jel

görüntüsü………... ………24 Şekil 4.2. SSR VRZAG14 primerinin %8 poliakrilamid jel

görüntüsü………... ………24 Şekil 4.3. SSR primerlerinin oluşturduğu, bitkiler arasında filogenetik

(13)

ix

Çizelge 3.1. Oxytona seksiyonuna ait Papaver türlerinin toplandıkları bölgeler

ve rakım değerleri………. …...19 Çizelge 3.2. PCR mix bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları…………. …...21 Çizelge 3.3. PCR protokolü……….. …...21 Çizelge 3.4. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri……… …...22 Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik

(14)

1. GĐRĐŞ

Türkiye birçok bitki türü için gen merkezi durumunda olup, bitkilerin çeşitliliği bakımından dünyanın en zengin ülkelerinden birisidir. Bunun en önemli nedeni ise; iklim farklılıkları, topografik çeşitlilikler, jeolojik çeşitlilikler ve ekolojik farklılıklardır (Atalay 1994, Çelik 2003). Örneğin dünyada Papaver cinsine ait yaklaşık 110 türün (Kapoor 1997) 50 taksonunun ülkemizde bulunduğu bildirilmiştir (Davis 1965-1988, Seçmen vd 1995, Güner vd 2000). Bu cinse ait türlerde yapılacak olan genetik karakterizasyon ya da etken ve ekonomik yönden önemli madde olan alkaloitlerin belirlenmesine yönelik bir çalışma, ıslah çalışmalarına basamak oluşturması ve aynı zamanda genetik materyalin değerlendirilmesi açısından son derece önem taşımaktadır.

PCR ile spesifik DNA parçacıkları çoğaltılarak DNA polimorfızmi belirlenebilmektedir. Protein veya DNA markörlerine dayanan haritalar "moleküler haritalar" olarak bilinmektedir. Günümüzde birçok bitkide genetik uzaklık, moleküler, kimyasal ve morfolojik özellikler kullanılarak belirlenebilmektedir. Canlılar arasındaki genetik çeşitliliğin daha iyi anlaşılabilmesi için, bu yöntemlerin tamamına ihtiyaç duyulmaktadır. DNA dizinindeki polimorfızmin belirlenebilmesi için yaygın olarak kullanılan; RFLP, AFLP, SSR, SRAP ve RAPD gibi moleküler markör teknikleri geliştirilmiştir.

Bu tez çalışmasının amacı ülkemiz doğal florasındaki değişik bölgelere ait Papaver cinsi Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan 3 türe ait toplam 183 adet bitki üzerinde SSR yöntemiyle genetik karakterizasyon araştırması yapmaktır. Çalışmamızın sonunda elde edilecek verilerin; oxytona seksiyonu ile ilgili yapılacak olan moleküler alanda ve diğer alanlardaki çalışmalara yardımcı olacağına inanmaktayız.

(15)

2. KAYNAK ÖZETLERĐ

2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri

Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve subtropik

bölgelerinde yayılış göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaşık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995).

2.2. Oxytona Seksiyonun Genel Özellikleri (Syn: Macrantha)

Oxytona Bernh., Linnaea 8:843. 1833. Macrantha Elk. Tant. Monog, Papaver 13.1839. Oxytona seksiyonu Papaver cinsine ait olup, çok yıllık türleri içermektedir. Yayılım

olarak Orta ve Doğu Türkiye, Kuzey ve Kuzey batı Đran, Kafkas ve Trans Kafkas bölgelerinde bulunmaktadır. Bu familyaya ait monograflar Fedde (1909) ve Medwedev (1918) ile başlamış en son Goldblatt (1974) tarafından yapılmıştır.

Papaver bracteatum Lindl., Coll. Bot., t. 23 (1821)

Syn : P. lasiothrix Fedde.

P. bracteatum 1818’de Avrupa’ya Fischer tarafından Kraliyet Botanik Bahçesi

(Imperial Botanical Garden)’ne muhtemelen Kafkaslardan tohum kolleksiyonu ile götürülüp, Batı Avrupa’ya dağıtılmış ve Lindley tarafından 1821’de tanıtılmıştır.

Oxytona seksiyonunun en büyük bitkisidir. Aynı lokalitede her zaman var olan önemli

taksonomik özellikleri ile uniformdur. Bir metreye kadar boylanabilir. 15 kadar çiçek açan gövdesi vardır. Yapraklar 45 cm kadar uzayabilir. Somatik kromozom sayısı 2n = 14’dür (Goldblatt, 1974).

1700-2500 m arasında açık, yarı kuru yamaçlarda, nadiren gölgeli derelerde, sel yatakları ya da sulama bendlerinin çevresinde çok yoğun Astragalus, Thymus, dikenli bitkiler ve Ferula türleri ile beraber bulunurlar (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

(16)

Erzurum Kop dağı. Bayburt Aşkale arası 2050-2100 m. Kars, Kayseri Erciyes dağı, Sivas, Ulaş, Erzincan Karadağ 1960 m. Van, Çatak, Ağrı, Büyük Ağrı dağı, Niğde, Pertek 2000 m alanlarında yayılış gösterirler. (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

Papaver orientale L., Sp. Pl. 508 (2753). Ic. Bot. Mag., 2: t. 57 (1794).

Syn: P. paucifoliatum (Trautv) Fedde; P. orientale var. paucifoliatum Trautv.; P.

orientale. var. parviflora Busch.

Kuzey batı Đran ve kuzey doğu Türkiye de yayılış gösteren ince narin bitkidir. P.

orientale 1800 m’nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazan altında da Türkiye

ve Đran’da bulunabilmektedir. P. bracteatum’a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneşi az alan kuytularda bulunmaktadır. Somatik kromozom sayısı 2n = 28’dir (Golldblatt, 1974).

Türkiye’ de 1800 m’nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazan altında da bulunabilmektedir. P. bracteatum’a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneşi az alan kuytularda bulunmaktadır (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

Orta ve Doğu Anadolu, Ağrı, Erzurum, Erzincan, Kars, Kayseri, Sivas, Tunceli ve Van çevresinde yayılış gösterirler. (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

Papaver pseudo-orientale (Fedde) Medw.

Syn: P. intermedium DC.; P. bracteatum var. pseudo-orinale Fedde.

Genel olarak Đran ve Türkiye’nin nemli yerlerinde bulunmaktadır. Literatürde yaygın olduğu bildirilmektedir. Bu tür arazide kendini belirgin bir şekilde göstermektedir. Bitkide diğer iki türe kıyasla değişiklik vardır. Bunlar; dik tomurcuk, ince narin yayılmış kaliks tüyleri, koyu kiremit kırmızısı petaller, koyu siyahımsı lekeler ve brakteli çiçeklerdir. 1600-2200 m arasında nemli yerlerde bulunmaktadır. Genel olarak akarsu kenarlarında, tabandan su çeken ıslak zeminlerde ya da bol miktarda yeşil olan bölgelerde bulunmaktadır. Kurak bölgelerde bitki boyu küçülmektedir. Kuzey Batı Đran

(17)

ve Batı Türkiye de bol miktarda bulunmaktadır.Somatik kromozom numarası 2n=42’dir (Golldblatt, 1974).

1600-2200 m yükseklikte nemli yerlerde, nemli kayalar arasında ya da küçük akarsu kenarlarında rastgele dağılmış ve P. orientale ve P. bracteatum gibi kalabalık şeklinde olmayan populasyonlardır (Golldblatt, 1974).

Çoruh, Erzincan, Erzurum, Muş, Ağrı, van, Niğde, Hakkâri çevresinde dağılım göstermektedir (Golldblatt, 1974).

2.3. Morfolojik Markörler

Akar (2002), morfolojik karakterlerin günümüzde de kullanılan çok yararlı bir yöntem olduğunu belirtmiştir. Ancak, incelenen özelliklerin çevre koşullarından etkilenmeleri, her tür için morfolojik varyasyonun yeterli düzeyde olmayışı, çalışılan karakterlerin bir lokusla sınırlayıcı oluşu ve bazı karakterlerin ortaya çıkması için generatif döneme kadar beklenmesi bu yöntemi genetik varyasyonu ortaya koymada çoğu kez başarısız kıldığını belirtmektedir.

Morfolojik markörlerin yararları:

• Genellikle dominanttırlar. Dominant bir geni resesif genden ayırmada kullanılır. • Sayı bakımından çok azdırlar. Herbir çaprazlamada birkaç tane bulunur.

• Herbir lokusta 2 allel bulunur. • Analizleri çok kolaydır.

• Haritalama populasyonunda yapılacak bir gözlemle kolayca belirlenirler.

Morfolojik markörlerin sakıncaları: • Heterozigotları belirleyemezler • Mutasyonlarla oluşmuş olabilir • Çevresel faktörlerden etkilenirler

(18)

2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri)

Morfolojik karakterlerin çevreden etkilenmelerini ortadan kaldırmak için geliştirilen protein markörleri, doğrudan gen ürünleri oldukları için çok önemli üstünlüklere sahiptirler. Eşbaskın (ko-dominant) markör oluşları ve birim başına maliyetlerinin düşük olması kullanım alanlarını artırmıştır. Ancak üzerinde çalışılacak lokus sayısının azlığı ve varyasyon oranının düşük oluşu bu tekniğin kullanımını sınırlamaktadır (Parmaksız, 2004).

Tanksley (1983)’ e göre enzim markörleri gen ürünü oldukları için DNA markörlerine göre sayıca azdır, dokulara ve gelişme dönemlerine göre değişkenlik gösterirler ve çevre faktörlerinden etkilenmelerinden dolayı kullanımları sınırlıdır.

Bachmann (1993)’ a göre enzimler ile DNA markörleri arasındaki farklardan birisi DNA markörlerinin sayıca çok fazla olmasıdır. Teorik olarak DNA markörleri genomun tümünü kaplamaktadır. Bir başka deyişle, genom üzerinde kodlama yapan, kodlama yapmayan, tek kopya veya DNA dizi tekrarlarının da bulunduğu bölgelerin hepsinde DNA polimorfizmi meydana gelebilir. Oysa enzimi kodlayan lokuslar genom boyunca rastgele dağılım göstermemektedirler. Diğer bir ifadeyle, alloenzim markörleri genel olarak genlerin kodlama yapan dizilerindeki farklılıklarla ve fonksiyonel enzim gruplarıyla sınırlıdır. Bu nedenle de tüm genomu kaplamazlar.

Biyokimyasal Markörlerinin Avantajları: •Kodominant markörlerdir.

•Analizleri çabuk, ucuz ve güvenilirdir. •Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler.

Biyokimyasal Markörlerinin Dezavantajları: •Sayıları çok azdır.

•Bazı izoenzimlerin ancak özel dokularda ve belli bir gelişme peryodunda gözlemlenebilmesidir. Örneğin esteraz ve peroksidazlarda olduğu gibi. •Çok azda olsa bazen epistatik etki gösterirler.

(19)

2.5. DNA Markörleri

Günümüzde bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araştırılmasında moleküler markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. Son 20 yıl içerisinde hızla gelişen moleküler markör teknolojisi, çeşitlerin birbirleri arasındaki genetik farklılığın belirlenmesi, kromozom haritalamaları, gen kaynaklarının karakterize edilmesi, evrimsel gelişim analizi ve transformasyonda başarı düzeyinin belirlenmesinde yeni yöntemler ortaya koymuştur. Bu yöntemler klasik yöntemlere göre büyük avantajlar sağlamaktadır. Morfolojik ve biyokimyasal markörlerin uygulamadaki yetersizlikleri moleküler markörlerin uygulanmasıyla ortadan kalkmıştır. Moleküler teknikler, diğer tekniklere göre daha fazla avantajlara sahip olup, çevre faktörlerinden etkilenmezler ve polimorfizm oranları yüksektir. Aynı zamanda pleotropik (bir genin birden fazla fenotipik karakter üzerindeki etkisi) ve epistatik (bir karakterin ortaya çıkmasından sorumlu olan farklı genler arasında baskılayıcı etkilerin olması durumu) etki göstermeyip son derece stabildirler (Beckmann ve Soller, 1983; Tanksley, 1983; Avise, 1994; Bretting ve Widrlechner, 1995).

Moleküler belirteç, DNA’nın bir parçası diğer bir deyişle belirli bir genle beraber kalıtılan bir DNA parçasıdır. Aslında tanımlanan bir gendir ama genomun belirli bir parçasını ifade ettiği için belirteç denmiştir. Canlıların yapısını belirleyen şifre de DNA zincirlerinde oldugundan moleküler belirteçler, canlı populasyonundaki çesitlilik veya o populasyon içindeki canlı genotipleri arasındaki iliskilerin tespitinde %100’e yakın güvenilirlikle değerlendirilirler (Gülsen ve Mutlu 2005).

Moleküler belirteçlerin avantajları; 1. Çevre faktörlerinden etkilenmezler.

2. Genetik degisiklikleri daha fazla yansıttıkları için daha az pleiotrofiktir. 3. Her bir ebeveynden gelen farklı karakterler tespit edilebildigi için bitkilerin genetik orjini tespit edilebilir.

(20)

2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DNA (RFLP) Markörleri

Bu grupta yer alan belirteçler içerisinde en önemli olanı RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Enzimlerle Kesilen DNA Parçacıklarının Uzunluk Polimorfizmi) tekniğidir. Restriksiyon endonüklezlarla kesilen DNA’dan olusan parçacıkların, agaroz jel elektroforezi ile ayrılarak, ‘southern blot’ teknigi ile uygun bir membrana aktarılması ve radyoaktif isaretlenmis bir prob ile hibridizasyonunun yapılarak, bitki tür ve çesidine özgü kesimleme bantlarının belirlenmesi, yöntemin aşamalarını oluşturmaktadır (Ergül 2000).

RFLP belirteçleri izoenzim belirteçler bulunan bir çok dezavantaja sahip olmamasına rağmen, çok pahalı ve yoğun işgücü gerektiren bir teknik olması ve çoğunlukla cDNA (Bir mRNA ürünü kodlayan dizilere komplementer DNA) probları kullanılması nedeniyle, genomda kodlama bölgelerinin çoğunlukla sınırlı kalması ve radyoaktif madde kullanma zorunluluğu gibi dezavantajları vardır (Malyshev ve Kartel, 1997).

Bireyler arasındaki genomik farklılığın yanında, kesimleme bölgesinde meydana gelebilecek baz değişimleri (mutasyon vb.), metilasyonlar ile eşit olmayan krossing-over ve replikasyon kaymaları polimorfizme neden olan diğer sebeplerdir (Chao ve ark., 1989).

Teknigin en önemli aşaması probların seçilmesidir. Bu amaçla rastgele genomik veya cDNA kütüphanelerinden olusturulan homolog ve heterolog problar kullanılmaktadır (Striem ve ark., 1990; Gogorcena ve ark., 1993; Kochert, 1994).

2.5.2. RAPD (Rastgele Arttırılmış Polimofik DNA)

RAPD (Rastgele Arttırılmış Polimorfik DNA, Randomly Amplified Polimorphic DNAs) ilk defa 1990’ da rastgele seçilmiş primerlerin kullanıldığı ve Polimeraz Zincir Reksiyonu’ nu (PCR) temel alan bir teknik olarak ortaya çıkmıştır (Williams ve ark., 1990).

(21)

RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiş, tek bir 9-10 bp oligonükleotidin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak PCR ile çoğaltma yapmasıdır. Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir. Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990).

Genel olarak bu tekniklerle karşılaştırıldığında RAPD tekniğinin en büyük avantajı ilgilenilen taksonun genleriyle ilgili herhangi bir ön bilgi gerektirmemesidir (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990; Hillis, 1990; Başıbüyük ve ark., 2000). Çoğaltmada tüm organizmalar için aynı oligonükleotid primer seti kullanılabilmektedir ve bu oligonükleotid özgün bölgelere rastgele bağlanarak çoğaltma yapmaktadır (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990; Hillis, 1990; Welsh ve Petersen, 1991). Bir primerle, farklı bitkilerin genomik DNA’ ları farklı olacağından oluşacak RAPD belirteçler farklı olacaktır (Glick ve Pasternak, 1998). Bu farklılık organizmaların karşılaştırılmasını sağlamaktadır. Ayrıca radyoaktiviteye, Southern transferlere veya DNA hibridizasyonuna gerek duyulmamaktadır. RAPD karakterlerinin sayısı ihtimal olarak sınırsızdır. Kullanılan primer sayısı arttırıldıkça elde edilen bant sayısı da artacaktır. Bu açıdan yakın türleri ayırmada izozimden daha duyarlıdır (Mathieu-Daudé ve ark., 1997). Farklı araştırıcılar tarafından kodominant veriler gerektirmeyen sistematik problemlerin çözümünde RAPD belirteçlerin kullanımı güçlü bir şekilde savunulmaktadır (Rafalskı ve ark., 1994; Halldén ve ark.,1994).

Bununla beraber metodun sınırlılıkları da vardır. RAPD kullanım açısından kolay olmasına karşılık, belirteçleri dominanttır ve heterezigotları teşhis etmek zordur (Mathieu-Daudé ve ark., 1997). Çalışmalar sonucunda elde edilen verilerin tekrarlanabilirliği, reaksiyona giren tüm değişkenlere bağlı olduğundan düşük olabilmektedir. Bunun için diğer karşılaştırmalı analizlere girmeden evvel yöntemin optimize edilmesi oldukça önemlidir (Tingey ve Del Tufa, 1993; Halldén, 1998).

Shoyama ve ark., (1998), Papaver cinsine ait; Papaver somniferum, P. setigerum, P.

(22)

türlerinin hibritlerini parmak izi karakteri olarak RAPD analizi ile incelemişlerdir. F1 hibritlerin genetik olarak ana-baba bitki karakterinin ortasında olduğu tesbit edilmiştir. 18 primer kullanarak 14 DNA örneğinden 120 bant elde edilerek RAPD parmak izi gösterilmiştir. Değişik primerler kullanılarak ebeveynler ve hibritler arasındaki genetik mesafe hesaplanmıştır. Nei ve Li yöntemleriyle her tür arasındaki mesafe matrisi hesaplanarak gösterilmiştir. Her iki ana-baba arasında genetik mesafe 0.427 ancak F1 hibrit ve ana-baba arasındaki mesafe 0.338 ve 0.215 olarak belirlenmiştir. Bundan dolayı F1’lerin ana-baba arasında olduğu belirlenmiştir. Elde edilen dendogram

Papaver setigerum ve P. somniferum’u diğer tür ve hibritlerden ayırmaktadır.

2.5.3. AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi)

Restriksiyon enzimleri ile kesilmiş DNA fragmentlarının seçici amplifikasyonu temeline dayanır. Çoklu bantlar, tesadüfî bölgelerde DNA markörleri içeren amplifikasyon reaksiyonunda oluşturulur. DNA analizleri, her örnekten 50 ile 100 bant elde edilecek şekilde sonuçlanır. AFLP analizleri ile heterozigot ve homozigot bireyler arasındaki farklılık tespit edilebilmektedir (Parmaksız, 2004).

Yee ve ark., (1999), Vigna angularis’ de yaptıkları çalışmada iki farklı gen havuzundaki bireylerin genetik benzerliğini tesbit için AFLP ve RAPD markör sistemlerini kullanmışlardır. 58 birey arasında 214 AFLP ve 57 RAPD bantı genetik farklılığı belirlemiştir. RAPD primerleri ile ortalama 3.2 polimorfik bant belirlenirken, AFLP primerleri ile reaksiyon başına ortalama 11.3 polimorfik bant tesbit edilmiştir. AFLP değerleri RAPD değerlerinden daha önemli ve kesin sonuçlar vermiştir.

Ergül (2000)’e göre AFLP tekniği RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir. Bu teknikte DNA önce birisi 6, diğeri 4 taban taşıyan iki kesim enzimi tarafından kesilir. Kesilen parçaların ucuna nükleotid dizilişi bilinen sentetik DNA’lar eklenir. Bu sentetik DNA’nın nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA’ların kullanımı ile kısmen spesifik olan DNA çoğaltılır. Bu çoğaltma işlemi iki aşamada gerçekleşir. I: Her iki uçdan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltımın yapıldığı ön üretim. II: Asıl üretimde ön üretimden

(23)

elde edilen parçaların kullanımı ile kesim enzimi tanıma yerinden sonraki 2. ve 3. nükleotidler için seçici üretim yapılır. Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid dizisini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik şartlarda gerçekleşmiş olur. Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğunun farkını dahi ayırt edebilen poliakrilamid jelde yürütülerek farklılık gösteren parçacıklar tesbit edilmiş olur.

AFLP tekniği aşamaları kısaca aşağıdaki gibi sıralanabilir (Ergül, 2000);

• DNA'nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi (EcoRI / Mse I) ve biyotinle işaretlenmiş 2 adaptör kullanılarak restriksiyon fragmentlarının uygun bir DNA ligaz ile birleşmesi, •Birleştirilen bu adaptörlere uygun primer ile restriksiyon fragmentlerinin preamplifikasyonu,

•Bu fragmentlerin özel oluşturulan ve radyoaktif işaretlenmiş primerlerle gerçek amplifikasyonu ve poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) de koşturulması.

AFLP tekniğinin avantajları:

• RAPD’den daha yavaş RFLP’den ise daha hızlıdır. • Güvenirlik açısından RAPD ve RFLP arasındadır.

• Etkili bir şekilde tarama yapması nedeni ile parmak izi analizine çok uygundur. • Sayı olarak RAPD ve RFLP’den daha fazladır.

• DNA diziliminin bilinmesine gerek yoktur. • Polimorfizm oranı yüksektir.

AFLP tekniğinin dezavantajları:

• Genellikle dominant markör verirler.

• Farklı genetik haritalar arasında transferleri güçtür.

2.5.4. CAPS (Kesilip Çogaltılmıs Polimorfik Diziler)

Kesilmis çogaltılmıs polimorfik diziler olup, PCR ürünlerinin kesimlenmesi ile olusturulmus DNA parçalarının uzunlugundaki degisimlerle saptanan genetik varyasyondur. Kodominant belirteçlerdir (Staub ve ark., 1996). Bu teknik, PCR ürünlerinin restriksiyon enzimleriyle kesilmesi ve elektroforezle büyüklüklerine göre

(24)

ayrılan bu kesilmis fragmentlerin tespitini içerir. Primerler cDNA veya genomik DNA klonlarından, klonlanan ve DNA zincirleri tespit edilen RAPD, ISSR bantlarından elde edilir. Çok düsük miktarda kalıp DNA ancak, primer için DNA bilgisi gerektirir. Hem SCAR hem de CAPS primerleri gelistirebilmek için DNA zincir bilgisine ihtiyaç oldugundan bu iki yöntem de yaygın olarak kullanılmayıp daha çok RAPD, ISSR ve AFLP gibi spesifitesi düsük belirteçlerin spesifitesini arttırmak amacıyla kullanılırlar (Kabaoğlu, 2007).

2.5.5. SCAR (Belirlenmiş ve Çogaltılmış Polimorfik Diziler)

Belirli büyüklükteki bir RAPD bandının klonlanması ve uç bölgelerinden dizi belirlendikten sonra, bu fragmente yönelik orijinal RAPD primerini de içeren, primer çiftleri ile gelistirilen kodominant belirteçlerdir (Paran ve Michelmore, 1993).

RAPD ve ISSR gibi belirteç spesifitesi düsük olan belirteçlerin gücü, bu yöntemlerle elde edilen bantların jel üzerinden çıkarılarak 3’ sonlarındaki DNA zincirlerinin tespiti ve bunların daha uzun, dolayısıyla da daha özgül primerler olarak PCR reaksiyonlarında kullanılması ile arttırılır. Orjinali olan RAPD ve ISSR belirteçlerine göre daha üstün özelliklere sahiptirler, tekrarlanabilirlikleri yüksektir. Genellikle dominant belirteçler olusturmasına ragmen, tek tek bantların restriksiyon enzimleriyle kesilmesiyle kodominant belirteçlere dönüstürülebilir (Gülsen ve Mutlu, 2005).

Çok düsük miktarlarda kalıp DNA gerektirmesi, yüksek duyarlılıkta olması ve kolay ve hızlı kullanım sunan SCAR belirteçleri bu avantajlarının yanında primer gelistirmede DNA bilgisini gerektirir.

SCAR tekniğinin avantajları:

• Kodominant markörler olup sayıları fazladır. • Her bir lokusta çok sayıda allel vardır.

• SCAR’ların üretilebilirliği RAPD’den daha iyidir.

(25)

SCAR tekniğinin dezavantajları:

• RAPD bantları tekrarlanan DNA dizileri ile hibridize olma ihtimalinden dolayı spesifik bir klonu çıkarmak mümkün olmayabilir.

• Uzun zaman alır ve işçiliği fazladır (Parmaksız, 2004).

2.5.6. ISSR (Basit Đç Dizi Tekrarları)

Teknik 5’ ve 3’ sonda güçlendirilen kısa, tekrarlanan DNA zincirlerinin primer olarak kullanılmasını, PCR ürünlerinin elektroforez ile büyüklüklerine göre ayrılmasını ve jel üzerinde DNA’ların tespitini içerir. Primer olarak 2-4 farklı veya aynı nükleotidlerle sabitlestirilen, basit olarak tekrarlanan DNA zincirleri kullanılır. Bir reaksiyonda tekrarlanan zincir aynı kalmak kaydıyla, sabitlestirici DNA’ların farklı kombinasyonları primer olarak aynı reaksiyonda kullanılarak bir tek PCR reaksiyonunda güçlendirilen hedef DNA dizilerinin sayıları arttırılır. Böylece bir jel üzerinde yürütülecek bant veya belirteç sayısı arttırılmıs olur. Bu diger DNA belirteçlerinin üretebildigi sayılarla karsılastırıldıgında önemli bir avantaj saglar (Gülsen ve Mutlu, 2005).

2.5.7. STS (Dizini Etiketlenmiş Alanlar)

RFLP güvenilirliğini ile PCR kolaylığını birleştiren bir tekniktir. 16-24 nükleotid uzunluğunda nükleotid dizilimi bilinen RFLP problarından başlatıcı DNA’lar geliştirilmektedir. Elde edilen başlatıcı DNA’lar ile RFLP probuna karşılık gelen lokus çoğaltılmaktadır.

Farklı genotiplerden üretilen DNA’ların 4 nükleotid taşıyan bir seri kesim enzimi ile kesilmesi sonucu üretilen parçaların içindeki tek nükleotid değişikliği bile tanımlanabilmektedir.

STS tekniğinin vantajları:

• Çoğunlukla kodominant özellikte markör üretmektedirler. • Kullanımı RFLP’ye göre çok daha kolay, ucuz ve hızlıdır. • RAPD gibi az miktarda DNA yeterlidir.

(26)

• Başlatıcı DNA’ların iyi seçilmesi şartı ile farklı haritalar arasında transferi mümkündür.

• Teknik otomasyona uygundur.

STS tekniğinin dezavantajları:

• Đlgili RFLP probunun nükleik asit dizilişinin bilinmesini ve buna göre bir çift başlatıcı DNA geliştirilmesini gerektirmesidir.

• Polimorfizm oranı orta düzeydedir (Parmaksız, 2004).

2.5.8. SSR (Basit Dizi Tekrarları - Mikrosatellitler)

SSR markörleri 1-4 arasında tekrarlanan nükleotid motifleri içerir (Braaten ve ark., 1988; Vergnoud, 1989). Bu bölgeler "mikrosatellit" olarak adlandırılır (Litt ve Luty, 1989) ve PCR (Saiki ve ark., 1988) da bireysel olarak amplifiye olurlar. (GT)

n veya

(CT)

n gibi birbiri arkasına tekrar eden 2’ den 10’ a kadar tekrarlı olabilen dizinlerdir.

Tekrar edilen DNA’nın 3 alt grubu arasında (satelit DNA, minisatelitler ve mikrosatelitler) mikrosatelitler, tekrarın en alt derecesini yani en az tekrarı gösterir (Tautz, 1984). Tipik bir mikrosatelit dizi 1-6 nükleotitten (örneğin [(GA)n, (GATA)n] ibaret kısa basit dizilerin sayısı 5’ten yaklaşık 100’e kadar değişen tekrarını içerir. Ökaryotlarda, 104’ten 105’e kadar tahmin edilen mikrosatelit lokusları, genom boyunca rastgele bulunur. Ökaryot genomdaki mikrosatelit dizilerin bolluğu, genetik markör olarak değerlendirilebilecek polimorfik yerlerin neredeyse sınırsız bir kaynağını oluşturur. Mikrosatelitler bir kodlama bölgesi içinde veya yakınında olmadığı zaman “selektif olarak nötr” kabul edilirler (Sefc ve ark., 2001).

SSR ilk olarak insanlarda tanımlanmış (Litt ve Luty, 1989; Weber ve May, 1989) aynı bulgular hızlı bir şekilde memelilerden farelerde yapılan çalışmalar ile bunu izlemiş (Love ve ark., 1990) daha sonra domuzlarda (Johansson ve ark., 1992) ve sığırlarda (Kemp ve ark., 1993) yapılan çalışmalarla devam etmiştir. Bu potansiyel ile bitkilerde

(27)

birçok tür için oldukça önemli olan bu markörlerin başarılı olarak izole edilmesi ve uygulanması başlamıştır.

Bitki nükleer DNA’sında tekrarlanan basit dizi motiflerinin (örneğin CACACA...) varlığı Delseny ve ark. (1983) tarafından kanıtlanmıştır. Mikrosatelit olarak da adlandırılan basit dizi tekrarlarının, sonradan bitki genomu ve organel genomu içeren çoğu organizmalarda bolca bulunduğu görülmüştür (Lagercrantz ve ark., 1993). Bu diziler, bitki genetiğinin araştırılması için uygun olan genetik varyasyonun büyük bir kaynağını oluşturmaktadır (Tautz ve ark., 1986).

Bitkiler âleminde ilk çalışmalar tarla bitkileri ile olmuş; soya (Akkaya ve ark., 1992; Morgante ve Olivieri, 1993), pirinç (Wu ve Tanksley, 1993; Zhao ve Kochert, 1993), arpa (Saghai Maroof ve ark., 1994) ve buğday (Roder ve ark., 1995) gibi bitkiler ile oldukça yakın zamanda SSR'ların karakterizasyonu bahçe bitkileri türlerinde üzüm (Thomas ve Scott, 1993) ile meşe (Dow ve ark., 1995), okalüptüs (Byrne ve ark., 1996),

Swietenia humilis (White ve Powell, 1997) gibi orman ağaçlarında başlamıştır.

PCR’la çoğaltılmış mikrosatelit markörler, özel lokusa sahip ve yüksek miktarda polimorfik olmanın avantajına sahiptir. Allel büyüklüğünün belirlenmesi, yüksek çözünürlü elektroforez aracılığıyla elde edilir. Bu markörler kodominanttır ve bu sayede homozigot ve heterozigotların ayrımına izin verir. Mikrosatelit profili (analiz edilen lokusta belirlenen baz çifti), verilen allel büyüklüğüyle temsil edilir. Sonuçta, pratik açıdan mikrosatelit markörlerin, tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu çok kolaydır ve bu nedenle farklı laboratuvarlar arasındaki verilerin transferi ve karşılaştırılması olanağı mevcuttur (Sefcve ark., 2001).

SSR metodu, tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerin bu bölgeleri PCR’la çoğaltması ve agaroz jel, poliakrilamid jel aracılığı ile büyüklüklerine göre ayrılması üzerine kuruludur.

(28)

Mikrosatellit tekrarlarına sınırdaş olan PCR primer dizileri genellikle 17-22 nuklotid uzunluğunda, GC içeriği %50, Tm (erime sıcaklığı) değeri yaklaşık 60 oC olarak üretilir (McCouch ve ark., 1997).

SSR amplifikasyon ürünlerini ve polimorfizmin boyutunu belirlemek için agaroz jel elektroforezi, poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), denaturing PAGE ve kapiller elektroforezi kullanılır. Denature olmamış jellerde PCR ürünlerini aramak için etidium bromurle boyamak yaygın olarak kullanılır (Becker and Heun, 1995).

2.5.8.1. SSR Markörünün Diğer Markörlere Göre Avantaj ve Dezavantajları

SSR küçük miktarda DNA gereksinimi, yüksek polimorfizm ve otomasyon özelliğinden dolayı kullanım için RFLP’den daha kolaydır. SSR markörleri kolayca araştırıcılar arasında değiş tokuş edilebilir. Çünkü her lokus primer dizileri tarafından tanımlanmıştır. SSR, RAPD den daha sağlam bir analiz metodudur ve AFLP den daha çok transfer edilebilirdir. SSR tahıl bitkilerinin genetik haritalanmasında RFLP’nin yerini almaktadır. SSR’ların AFLP ile beraber kombinasyonu detaylı genetik haritalar oluşturmak için kullanlır. Aynı zamanda ko-dominant yapısı genetik haritalamada SSRların bir avantajıdır (Holton, 2001).

Mikrosatellitler genom boyunca dağılmıştır ve diğer markörlerden daha fazla seviyede polimorfizm gösterirler. Bu özellikler onların kolay tespit edilmesiyle birleştirilince onları faydalı moleküler markörler haline getirir. Diğer moleküler markörlerle karşılaştırıldığında , mikrosatellitlerin otomasyon potansiyeli ve ko-dominant tarzı halinde kalıtımı ek olarak avantajlarıdır (Holton, 2001).

2.5.8.2. Genetik Haritalamada SSR’ların Kullanımı

Bitkilerdeki SSR’ların geliştirilmesi hızlanmakta ve SSR bölgeleri önemli hububatların belirlenmiş genetik haritalarıyla birleştirilmektedir (Liu ve ark., 1996; Korzun ve ark.,1997 ; Smith ve ark., 1997; Stephenson ve ark., 1998). Dinükleotid tekrarları (AC)n

(29)

ve (AG)n tahıl bitkilerinde genetik haritalanmanın belirlenmesinde genel olarak

yaygınca kullanılır.

SSR’lar kültür bitkileri arasındaki farkı ayırt etmek için özellikle ilgi çekicidir. Çünkü SSR bölgesi üzerinde aranan polimorfzm seviyesi diğer moleküler markörlerden daha yüksektir (Saghai Maroof ve ark.,1994 ; Powell ve ark., 1996).

Olufowote ve ark. (1997)’ nın bir çalışması 6 SSR markör seçiminin pirinçlerde 71 ilişkili bölgeyi ayırt etmek için yeterli olduğunu göstermiştir.

Polimorfik RAPD ve SSR markörleri, ticari arpa kültür bitkilerini ayırt etmek için ve RAPD ve SSR tekniklerinin ayırt etme yeteneğini karşılaştırmak için kullanılmıştır (Kraic ve ark.,1998). 23 kültür bitkisinin hepsi bir diğerinden SSR markörleriyle ayrıldı. SSRların farlılık etkinliği RAPD ile karşılaştırıldığında 7 kat daha fazla olduğu görülmüştür.

Powell ve ark. (1996), soya germplazm analizi için RAPD, AFLP, RFLP ve SSR markörlerini bilgi içeriği (beklenen heterozigotluk) ve lokus numarası kullanarak faydasını incelemiştir. Aynı zamanda her deneyi (multiplex oran) ve etkinliği, artımların arasındaki ilişkiye değer vererek analiz etmiştir. SSR markörleri en yüksek beklenen heterozigotluğa sahipken (0,60), AFLP markörlerinin en yüksek etkin multiplex orana sahip olduğu görülmüştür.

Senior ve ark. (1998), 94 saf mısır hattını 70 SSR markör lokusu (toplam 365 allel) kullanarak karşılaştırmışlardır. Elde edilen genetik çeşitlilik deseninin bilinen pedigri desenleriyle aynı olduğu ortaya konulmuş ve grup (cluster) analizi sonucunda 9 ana grup oluşmuştur. Araştırıcılar her bir saf hattın kendine özgü parmak izinin (fingerprint) çıkarılması için 5 SSR lokusunun yeterli olabileceğini belirtmişler ve SSR’ların AFLP’ye göre daha avantajlı olduğunu belirtmişlerdir.

Vos ve ark. (1995)’ nın bildirdiğine göre; daha sonra RAPD-PCR metodun prensiplerinden yararlanılarak AFLP, SSR gibi bir çok moleküler metotlar ortaya

(30)

konmuştur. AFLP ve SSR tekniklerinin üretilebilirlikleri ve polimorfizm düzeyi RAPD-PCR metoduna göre daha yüksektir.

Zhang ve ark. (2005a), 31 acala pamuk çeşidini 63 SSR primeri ile analiz etmişler ve acala 1517 çeşitleri arasındaki genetik mesafe 0.06-0.38 olarak belirlenmiştir. Acala 1517 çeşitleri arasında önemli bir genetik varyasyonun tespit edildiği de bildirilmiştir.

Zhang ve ark. (2005b), Ticari pamuk çeşitlerini ve bazı transgenik pamukları tarla denemelerine almış ve ayrıca aralarındaki genetik ilişkiyi SSR markörleri kullanarak belirlemişlerdir. Yaptıkları çalışmada 88 SSR primeri kullanmışlar ve 177 bant üretmiştir. Kullandıkları 24 pamuk çeşidi arasında Jaccard’s genetik benzerlik katsayısını 0.69-0.94 arasında bulmuşlardır.

Bitkiler aleminde ilk çalışmalar tarla bitkileri ile olmuş soya, pirinç, arpa ve buğday gibi bitkiler ile oldukça yakın zamanda SSR’ların karakterizasyonu bahçe bitkileri türlerinde üzüm bitkisinde başlamıştır (Kaçar, 2001).

Carolan ve ark. (2006), ITS ribozomal DNA çalışmalarında Papaver cinsi ve cinse ait seksiyonların üzerinde yapmış oldukları çalışmada tek atadan geliştiklerini ifade etmişlerdir. Buna göre; morfolojik karakterlerin yeterli ayıraç olamayacağı vurgulanmıştır. Meconidium, Oxytona ve Pilosa seksiyonları morfolojik olarak heterojendir ve bu grup için sintiplerin tanımlanması zordur. Genomik ve floresans in

situ hibridizasyon çalışmaları sonucu diploid P. bracteatum’un hexaploid P. pseudo-orientale’nin atası olduğu ileri sürülmüştür.

Rajesh ve ark. (2008), hindistan’da 3 hindistan cevizi yetiştirme komünitesinden alınan, 10 yetiştiği bölgeden alınarak başka bölgeye adapte olarak yetiştirilen bitkileri temsil eden 102 bitkinin genetik çeşitliliği çalışılmıştır. 14 SSR markörü kullanılmıştır. Toplam 90 band oluşmuştur ve lokus başına ortalama 6.42 band belirlenmiş olup ortalama polimorfizm bilgi içeriği 0.61 dir. Lokal alanlara adapte olmuş, Hindistan cevizi bitkisinin değerli karakterlerinin genetik erozyona maruz kaldığını belirtmiş ve

(31)

bu çalışma Hindistan cevizinin genetik kaynaklarının değerlendirilmesi ve korunmasında zirai alanda pratik uygulamalara sahip olduğunu belirtmişlerdir.

Jain ve ark. (2006), indica x Basmati pirinci çaprazları ile non-Basmati (indica ve

japonica) pirinç türlerine ait temsilcilerden 33 pirinç genotipinin genetik çeşitliliği

RG28 lokusu için 26 adet özel SSR markörü (SCU-SSR1) kromozom 8 için değerlendirilmiştir. Sonuçlar SSR allelik verilerine dayalı olarak tüm genomla karşılaştırılmıştır. 24 tanesi polimorfik, 2 tanesi monomorfik olan 26 SSR markörü toplam 106 band oluşturmuştur; 21 band spesifik olarak belirlenmiştir. Bandların sayı ve büyüklükleri ayrıca polimorfizm bilgi içeriği sırasıyla 1-8, 87-312 ve 0-736 bp uzunluğundadır. Kromozom 8 veri-seti 30 SSR markörü için pozitif korelasyon göstermiştir.

(32)

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyal

Materyal olarak kullanılan örnekler; Türkiye’nin çeşitli yerlerinden toplanmış (bkz. Çizelge 3.1), Oxytona seksiyonu içerisindeki Papaver türlerine ait bitkilerdir. Bu bitkiler TÜBĐTAK projesi kapsamında GOP Üniversitesi deneme tarlasında yetiştirilmiştir. Her bir bitkiden üç sırada beşer bitki olacak şekilde 15 adet bitki deneme tarlasında yetiştirilmiştir. Araştırma materyali olarak kullanılan 183 adet bitkiden 22 Nisan 2006 tarihinde DNA izolasyonu amacıyla genç taze yapraklar alınmıştır.

Çizelge 3.1. Oxytona seksiyonuna ait Papaver türlerinin toplandıkları bölgeler ve rakım değerleri

Toplandığı Bölge Bitki Kod

Numarası

Bitki Adedi

Sivas / Yıldız Dağı 1 ve 5 arası 5

Sivas / Tecer Dağı 6 ve 10 arası 4

Erzincan-Refahiye ilçe sınırı / Sakaltutan, Değirmendere

Köprüsü 11 ve 20 arası 9

Tunceli / Ovacık Mercan Vadisi 21 ve 70 arası 23

Niğde / Fesleğen Köyü Göksun Yaylası 71 ve 277 arası 138

Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi 23-99-149 4

Toplam 183

3.2. Yöntem

Araştırmamızda kullanılan SSR tekniği DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve PCR ürünlerinin Poliakrilamid Jel ortamında yürütülerek jel göürüntüleme sisteminde görüntülenmesi işlemlerini içermektedir.

(33)

3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuvar Çalışmaları Đçin Hazırlanması

Moleküler analizlerde kullanılacak DNA materyalini izole etmek amacıyla bitkilerin genç yaprakları ilkbahar döneminde toplanmıştır. Bitkilerden toplanan yapraklar kuru buz içerisinde laboratuvara getirilerek -80 oC ye konulmuştur. Birkaç gün bekletildikten sonra sıvı azot ile beraber havanda dövülerek extrakt haline getirilmiştir. Extrakt haline gelen bitki örnekleri DNA izolasyonu yapılana kadar -80 oC de bekletilmiştir.

3.2.2. DNA Đzolasyonu

DNA izolasyonu için Fermentas marka Genomic DNA Purification DNA izolasyon kiti kullanılmıştır. DNA izolasyon işlemi şu basamaklardan oluşmaktadır.

• 50-100 mg bitki özütü üzerine 400 µl parçalayıcı solüsyon eklenmiştir. • 5 dakika 65 oC de inkübe edilmiştir.

• Üzerine 600 ml kloroform eklenmiş ve 3-5 kez alt üst edilmiştir. • 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir.

• Üst tarafta kalan kısım yeni bir tüpe alınmıştır. • 800 ml seyreltilmiş çökeltme solüsyonu eklenmiştir. • 1-2 dakika karıştırılmıştır.

• 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir. • Üst tarafta kalan kısım atılmıştır.

• Tüpün dibinde kalan DNA pelleti 100 ml NaCI solüsyonu ile çözülmüştür. • 300 ml soğuk etanol eklenmiştir.

• 10 dakika -20 oC de inkübe edilmiştir.

• 4 dakika santrifüj edilmiş ve üstte kalan kısım atılmıştır. • % 70’lik soğuk etanol ile DNA peleti yıkanmıştır.

(34)

3.2.3. PCR Uygulaması

PCR işlemi için Apollo Instrumentation ATC401 cihazı kullanılmıştır. PCR mix içerisine Çizelge 3.2’de belirtilen hacimlerde ve konsatrasyonlarda PCR bileşenleri katılmıştır.

Çizelge 3.2. PCR mix bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları

PCR öğeleri Final Konsantrasyon Kullanılan Miktar (µl)

Su 13,95

10x Buffer Mg free (BIOBASIC) 1X 2,5

20 mM MgSO4 (BIOBASIC) 2,8 mM 3,5

10 mM dNTP (Vivantis) 0,3 mM 0,75

Forward primer 0,4µM 0,4

Reverse primer 0,4 µM 0,4

Taq DNA polimeraz (BIOBASIC) 0,1U 0,5

DNA 30 ng 3

Toplam 25

Hazırlanan PCR mix için Çizelge 3.3’de gösterilen PCR protokolü uygulanmıştır.

Çizelge 3.3. PCR protokolü

Sıcaklık (oC) Süre (sn) Döngü Sayısı

Ön denatürasyon 95 300 1 Denatürasyon 95 30 30 Bağlanma 55-65 30 Uzatma 72 30 Son uzatma 72 300 1

(35)

3.2.4. Çalışmada Kullanılan SSR Primerleri

Çalışmada baz dizileri Çizelge 3.4’de belirtilen 12 adet IDT® marka SSR primer çifti kullanılmıştır.

Çizelge 3.4. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri

Primer Primerlere ait baz dizileri (5'-3') Erime Sıcaklığı (oC)

VRZAG7F GTGGTAGTGGGTGTGAACGGAGTGG 63 VRZAG7R AACAGCATGACATCCACCTCAACGG 61,3 VRZAG12F CTGCAAATAAATATTAAAAAATTCG 46,4 VRZAG12R AAATCCTCGGTCTCTAGCCAAAAGG 58,6 VRZAG14F ATCAAAGGCCTCCTTTATTGCCATC 57,6 VRZAG14R TAGTACCAACTACCAACAACCAAAG 54,8 VRZAG15F GGATTTTGGCTGTAGTTTTGTGAAG 54,9 VRZAG15R ATCTCAAGCTGGGCTGTATTACAAT 56,3 VRZAG21F TCATTCACTCACTGCATTCATCGGC 59,5 VRZAG21R GGGGCTACTCCAAAGTCAGTTCTTG 59,3 VRZAG25F CTCCACTTCACATCACATGGCATGC 60,4 VRZAG25R CGGCCAACATTTACTCATCTCTCCC 59,4 VRZAG29F ATAACCAGGACAAGTTATTCAAGCC 55,2 VRZAG29R ACCCAATTGACCATCTTTTATGCTG 55,9 VRZAG30F TGGTAAACCTAGAAAAATTCATCAA 51 VRZAG30R CATATGACCATGTCACTAAATTAAT 49,3 VRZAG47F GGTCTGAATACATCCGTAAGTATAT 51,8 VRZAG47R ACGGTCTGCTCTCATTGTCATTGAC 59 VRZAG62F GGTGAAATGGGCACCGAACACACGC 64,7 VRZAG62R CCATGTCTCTCCTCAGCTTCTCAGC 60,7 VRZAG64F TATGAAAGAAACCCAACGCGGCACG 61,9 VRZAG64R TGCAATGTGGTCAGCCTTTGATGGG 61,9 VR24G67F ACCTGGCCCGACTCCTCTTGTATGC 64,3 VRZ4G67R TCCTGCCGGCGATAACCAAGCTATG 62,8 3.2.5. Elektroforez Đşlemi

PCR ürünlerini elektroforez etmek için %8’lik poliakrilamid jel hazırlanmıştır. 12µl PCR ürünü üzerine 3µl yükleme solüsyonu eklenerek, elektroforez tankına yerleştirilen jel üzerine yüklenmiş ve 340 voltda ortalama 4,5 saat yürütülmüştür.

(36)

3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi

Elektroforez uygulaması bittikten sonra DNA’nın boyanması için etidium bromür ve su karışımına konulmuştur. DNA boyama sona erince KODAK Gel Logic 200 jel görüntüleme cihazı kullanılarak U.V. ışık altında resimler alınarak (bkz. Şekil4.1, Şekil 4.2) değerlendirilme yapılmıştır.

3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi

SSR bandları 1 ve 0 olarak kayıt edilmiş olup, ‘1’ bandın varlığını ‘0’ ise bandın yokluğunu göstermektedir. Materyaller arasındaki genetik mesafe POPGENE32 versiyon 1.32 (Population Genetic Analysis) ve MEGA 4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) programları ile analiz edilmiştir.

(37)

4. BULGULAR

Çalışmada 12 adet SSR primeri kullanılmış olup primerlerin hepsi polimorfiktir. Kullanılan primerler toplam 60 adet SSR bandı oluşturmuştur. Verilere göre en yakın genetik mesafe 0 , en uzak genetik mesafe 1 dir. Genetik mesafesi 0 olan bitkiler dışında en yakın uzaklık 0.02 dir ve bu uzaklık 11 çift bitki arasında görülmektedir. 10 çift bitki arasında ise genetik mesafe en uzaktır (genetik mesafe 1 dir). Ortalama değer ise 0,41 olarak bulunmuştur. Bu ortalama değer türlerin birbirlerine akrabalık derecesini göstermektedir. Shannon indeksi 0,53 (standart sapma: 0,16) olarak tespit edilmiştir.

Şekil 4.1. SSR VRZAG14 primerinin %8 poliakrilamid jel görüntüsü

(38)

Elde edilen verilere göre oluşturulan dendogram 2 ana gruptan oluşmaktadır (bkz. Şekil 4.3). Birinci grup 7 alt gruba ayrılmaktadır. Đkinci grup ise daha fazla populasyonu içine almakla beraber daha çok genetik çeşitliliği kapsamaktadır. Bu grubun uygun genetik mesafelerden ayrışımları dikkate alındığında 21 alt gruptan oluştuğu görülmektedir.

1 0 0 A 17 9 B 10 7A 10 7 D 10 7A 16 3B 13 0A 34 C 20 0D 10 3A 10 3A 22 1B 22 4B 23 0B 22 3B 22 9B 12 6A 21 5B 22 2B 23 2B 23 4B 23 8B 23 5B 23 6B 79 D 10 2A 10 2D 156A 159A 129A 168B 135B 137A 151A 156A 147D 231B 111A 111D 111D 146A 204D 186B 135D 204D 231D 9F 68F 170D 208E 57E 115A 194B 123A 35C 47C 123D 245B 65E 25C 132A 198B 50C 14_8A 13_4A 19_9B 15 3A 15 4A 16 5B 16 7B 11_F 2 03 B 1 9₉ D 3₁ C 1₃ 0 D 1₁ 9 A 1 1 9 D 1 1 6 A 1 2 0 A 1 3 3 A 2 7 7 B 1 2 4 A 1 4 4 A 1 4 5 A 1 2 8 A 1 2 8 D 1 1 3 A 5 1 C 4 0 C 1 2 5 A 2 1 9 B 1 2 1 A 1 2 1 D 1 4 7 A 1 4 F 1 4 1 D 8 3 F 1 0 1 D 12 F 16 F 1 6F 14 8D 18 F 19 F 12 5D 21 2D 15 5D 16 0A 16 7B 14 8A 16 2B 19 6B 19 0B 19 1B 20 1B 21 7B 20 4B 20 4B 20 2B 21 6B 21 8B 23 9B 192 B 207B 195B 181B 226B 142A 74E 69E 70E 70F 73E 60E 75E 226B 2F 183B 184B 206B 212B 200B 213B 240B 205B 149A 99A99D 23C 104D118A 118D157D 157A181D 190D82D 5F 10F1F 1F8F 1594_FD 9717_DE 677_E1F 1₃ 6 A 2₉ C 3₆ C 3 9 C 3 8 C 4 1 C 3 F 4 4 C 7 F 1 8 6 B 3 0 C 1 9 7 B 1 9 7 B 2 0 5 B 1 6 9 B A 0 5 10 15 20 25

Şekil 4.3. SSR primerlerinin oluşturduğu, bitkiler arasında filogenetik ilişkiyi gösteren dendogram

Elde edilen moleküler bulgular diğer çalışmalardan elde edilen morfolojik, kromozomal ve biyokimyasal veriler Çizelge 4.1’de karşılaştırılarak gösterilmiştir ve aşağıdaki şekilde yorumlanıştır;

(39)

A1 grubu;

Bu gruptaki bitkiler toplama yeri, kromozom sayısı ve petal rengi yönüyle aynıdır.

A2 grubu;

Bu gruptaki bitkiler kromozom sayısı, tomurcuk şekli, petal rengi yönüyle benzer özellikler taşımaktadır.

A3 grubu;

Kromozom sayısı, toplandığı bölge ve petal rengi yönüyle bitkiler aynıdır.

A4 grubu;

Bu gruptaki bitkiler kromozom sayısı ve toplandığı yer bakımından benzerdir.

A5 grubu;

Toplandığı bölge, tomurcuk şekli ve petalde leke durumu bu gruptaki bitkilerde aynıdır.

A6 grubu;

Kromozom sayısı, toplandığı yer, tomurcuk şekli, petal rengi ve petalde leke durumu aynıdır.

A7 grubu;

Bu grup tek bitkiden oluşmaktadır ve populasyonun genetik olarak en uzak akrabalarından birisini içermektedir.

(40)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi*

Grup No Bitki Sırası Krmzm

Sayısı Top. Yer Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) A1 100

1-3A 42 NĐĞDE dik 3 5

Kiremit kırmızı Ortada 2,202 179 2-3B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok 0,006 107

2-3A 42 NĐĞDE eğik 3 3 1 5

Kiremit kırmızı Ortada 0,375 107 2-3D 42 NĐĞDE dik 3 2 1 5 kiremit kırmızı Ortada - 107

3-1A 42 NĐĞDE eğik 3 3 1 6

Kiremit kırmızı Ortada 0,375 163 3-3B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar - A2 130

1-5A 28 NĐĞDE eğik 3 4 6

Kiremit kırmızı Ortada - 034 1-1C 28 TUNCELĐ eğik 2 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,137 200 1-1D 28 NĐĞDE eğik 2 4 Kiremit kırmızı Yok 0,069 A3 103

Kiremit

kırmızı Yok - 103

3-5A 42 NĐĞDE dik 3 2 6

Kiremit kırmızı Ortada - 221 1-1B 42 NĐĞDE dik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada az - 224 1-1B 42 NĐĞDE dik 3 4 Kiremit kırmızı Yok - 230 2-1B 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 6 Kiremit kırmızı Ortada - 223 1-1B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,059 229 1-2B 42 NĐĞDE - 126

Kiremit

(41)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi (devam)*

Grup No

Bitki Sırası

Krmzm

Sayısı Top. Yer

Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) A4 215 3-1B 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok - 222 1-1B 42 NĐĞDE eğik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 232 2-1B 42 NĐĞDE 0,069 234 1-1B 42 NĐĞDE 238 3-4B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok - 235 1-3B 42 NĐĞDE 0,057 236 1-5B 42 NĐĞDE dik 3 6 Koyu kırmızı Ortada 0,061 079 2-1D 42 NĐĞDE dik 3 3 1 6 Koyu kırmızı Ortada A5 102

1-4A 28 NĐĞDE eğik 3 4 1 6

Koyu

kırmızı Ortada 1,759 102

1-1D 28 NĐĞDE 1,759

156

Kiremit

2-2A 28 NĐĞDE eğik 2 4

Kiremit

2-2B 42 NĐĞDE

135

Kiremit

2-3A 28 NĐĞDE -

151

1-4A 42 NĐĞDE eğik 3 3 2 11

Kiremit

kırmızı Ortada 0,173

A6 156

Kiremit kırmızı Ortada 0,077 147 2-2D 28 NĐĞDE eğik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,07 A7 231 1-4B 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada çok az 3,047

(42)

Grup No

Bitki Sırası

Krmzm

Sayısı Top. Yer.

Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B1 111

2,4A 42 NĐĞDE dik 3 6

Kiremit kırmızı Ortada 0,092 111 1-1D 42 NĐĞDE dik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,092 111 1-1D 42 NĐĞDE dik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,092 146 3-1A 42 NĐĞDE 204 2-2D 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,058 186 2-1B 42 NĐĞDE dik 2 5 Kiremit kırmızı Ortada - 135 3-1D 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 2,647 204 3-2D 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,058 231 2-4D 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 009 1-5F 42 SĐVAS-TECER dik 3 5 1 6 Koyu kırmızı Ortada 1,53 068 2-1F 28 TUNCELĐ Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok 0,086 170 2-4D 42 NĐĞDE eğik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada - 208 3-5E 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,068 057 1-1E 42 TUNCELĐ Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada B2 115

Kiremit kırmızı Ortada 0,061 194 2-2B 28 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,067 123 1-4A 28 NĐĞDE Yarı Dik 2 1 3 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,089 035 1-5C 28 TUNCELĐ eğik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 047 1-1C 28 TUNCELĐ 0,073 123 3-2D 28 NĐĞDE Yarı Dik 2 1 3 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,089 245 1-2B NĐĞDE

065 E 28 TUNCELĐ eğik 2 4 Kiremit

kırmızı Ortada - 025

1-1C 28 TUNCELĐ dik 2 4 1 5

Koyu

(43)

Grup No Bitki Sırası Krmzm Sayısı Top.Yer Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B3 132

Kiremit kırmızı Ortada - 198 1-3B 28 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 050 2-1C 28 TUNCELĐ eğik 2 1 4 Kiremit kırmızı Ortada - 148

2-2A 42 NĐĞDE dik 2 1 1 4

Kiremit kırmızı Tabana kadar 0,205 134 2-1A 42 NĐĞDE 199 1-2B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 153 1-1A 28 NĐĞDE 0,075 154

1-4A 28 NĐĞDE eğik 3 4 1 5

Kiremit kırmızı Ortada 0,275 165 1-4B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 167 1-1B 42 NĐĞDE dik 2 5 Kiremit kırmızı Tabana kadar 0,088 011 1F 42 ERZĐNCAN dik 3 5 1 6 Koyu kırmızı Tabana kadar 2,006 203 3-2B 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 5 Kiremit kırmızı Ortada - 199 1-1D 42 NĐĞDE dik 2 5 Kiremit kırmızı Ortada 031 3-4C 42 TUNCELĐ 130 1-2D 42 NĐĞDE dik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada - B4 119

Kiremit kırmızı Ortada 0,066 119 2-1D 42 NĐĞDE dik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada -

(44)

Grup No Bitki Sırası Krmzm Sayısı Top.Yer Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B5 116

Kiremit

Kiremit kırmızı Ortada 0,067 133 1-1A 42 NĐĞDE Yarı Dik 3 9 Kiremit kırmızı Ortada 0,064 277 1-2B 42 NĐĞDE Yarı Dik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada - 124 1-1A 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 1 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,057 144

2-1A 42 NĐĞDE dik 3 3 1 6

Kiremit

2-2A 42 NĐĞDE dik 3 3 1 4

Kiremit

2-1A 42 NĐĞDE dik 2 3 4

Kiremit kırmızı Ortada 0,086 128 3-2D 42 NĐĞDE dik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,071 B6 113

Kiremit kırmızı Ortada - 051 1-2C 28 TUNCELĐ 040 3-1C 28 TUNCELĐ eğik 2 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar 0,086 125

3-2A 28 NĐĞDE dik 2 1 7

Kiremit kırmızı Ortada 0,121 219 1-1B 28 NĐĞDE eğik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - B7 121

Kiremit kırmızı Ortada - 121 1-4D 42 NĐĞDE dik 2 2 6 Kiremit kırmızı Ortada -

(45)

Grup No

Bitki Sırası

Krmzm

Sayısı Top. Yer

Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B8 147

Kiremit kırmızı Ortada 0,07 014 2-4F 28 ERZĐNCAN dik 3 3 2 5 Koyu kırmızı Tabana kadar - 141 1-2D NĐĞDE 083 3-1F 28 NĐĞDE dik 3 5 1 5 Koyu kırmızı Tabana kadar 2,465 101 3-1D 28 NĐĞDE dik 2 2 6 kiremit kırmızı Ortada - 012 1-1F 28 ERZĐNCAN dik 3 5 6 Koyu kırmızı Tabana kadar 2,012 016 1-1F 28 ERZĐNCAN 2,571 016 3-2F 28 ERZĐNCAN 2,542 B9 148 3-1D 42 NĐĞDE dik 3 1 6 Kiremit kırmızı Tabana kadar 3,164 018 1-1F 42 ERZĐNCAN dik 3 4 2 6 Koyu kırmızı Ortada 019 2-1F 42 ERZĐNCAN dik 3 5 1 6 Koyu kırmızı Ortada B10 125 1-1D 42 NĐĞDE dik 2 1 7 Kiremit kırmızı Ortada 1,674 212 1-1D 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok 1,979 155 3-1D 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 2,486 B11 160

Kiremit kırmızı Ortada 0,233 167 3-1B 28 NĐĞDE dik 2 2 5 Kiremit kırmızı Tabana kadar B12 148

1-1A 42 NĐĞDE dik 3 4 1 6

Kiremit kırmızı Ortada 0,116 162 1-2B 42 NĐĞDE dik 3 2 6 Kiremit kırmızı Ortada 196 1-1B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,072

(46)

Grup No Bitki Sırası Krmzm Sayısı Top. Yer Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B13 190 1-2B 42 NĐĞDE dik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,073 191 1-1B 42 NĐĞDE dik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 201 B 28 NĐĞDE Yarı Dik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada 217 1-3B 42 NĐĞDE dik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,069 204 1-3B 42 NĐĞDE eğik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada - 204 2-3B 42 NĐĞDE eğik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada - 202 3-2B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 216 2-3B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 218 2-3B 42 NĐĞDE dik 2 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,01 239 1-1B 42 NĐĞDE dik 3 6 Kiremit kırmızı Yok - 192 2-1B 42 NĐĞDE Yarı Dik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,06 207 1-1B 42 NĐĞDE dik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada - 195 2-4B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada -

(47)

Grup No

Bitki Sırası

Krmzm

Sayısı Top. Yer

Tom. Gör. Kaliks Sayısı Brakte Sayısı Kaolin Sayısı Petal Sayısı Petal Rengi Petal Leke Durumu Tebain Mik. (%) B14 181 1-1B 42 NĐĞDE eğik 2 4 Kiremit kırmızı Tabana yakın - 226 1-1B 42 NĐĞDE eğik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada - 142

Kiremit

kırmızı ortada - 074

1-2E 42 NĐĞDE dik 2 4

Kiremit

1-3E 42 TUNCELĐ dik 2 4

Kiremit

kırmızı Yok - 070

2-1E 42 TUNCELĐ dik 2 1 4

Kiremit kırmızı Ortada 0,395 070 2-3F 42 TUNCELĐ dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,117 073 E NĐĞDE - 060 1E 28 TUNCELĐ dik 2 5 Kiremit kırmızı Ortada 075 2-4E 28 NĐĞDE Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,099 226 2-1B 42 NĐĞDE Yarı Dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada - 002 1-2F 42 SĐVAS-YILDIZ B15 183 1-1B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar 0,065 184 1-3B 42 NĐĞDE Yarı Dik 3 7 Kiremit kırmızı Ortada 0,06 206 2-1B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar 212 2-2B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok - 200 2-2B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada 2,829 213 1-2B 28 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Ortada çok az 0,064 240 3-3B 42 NĐĞDE dik 2 5 Kiremit kırmızı Yok - B16 205 1-1B 42 NĐĞDE dik 2 4 Kiremit kırmızı Yok -