T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2010/99
Projenin Başlığı
p97/VCP (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin Spermlerinde İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi
Proje Yöneticisi Doç.Dr. Sevil ÇAYLI
Birimi
Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri
Doç.Dr. Fikret Erdemir Tıp Fakültesi Uroloji ABD
ÖZET*
p97/VCP (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin Spermlerinde İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi
Valosin-containing protein (p97/VCP), Ubiquitin proteasome system (UPS) substratlarının proteasomda parçalanmasını sağlayan şaperon bir proteindir. p97/VCP protein kompleklerinin birleşmesi, ayrılması ve onların gideceklere yönlere yerleştirilmesi için yardımcıdır. p97/VCP T hücre aktivasyonu boyunca tirozin fosforilasyonuna uğrar ve bu aktivasyon onun ATPaz aktivitesini değiştirmez. Tirozin fosforilasyonu p97/VCP’nin hücre içindeki lokalizasyonunu da düzenler. p97/VCP’nin ayrıca sperm kapasitasyonu boyunca tirozin fosforilasyonuna uğradığı da gösterilmiştir. p97/VCP’nin birçok hücresel yolakta farklı fonksiyon gördüğü bilinse de, erkek üreme sistemindeki varlığı ve önemi gösterilmemiştir.
Bu çalışmanın amacı fertil ve infertil bireylerin sperm hücrelerinde p97/VCP’nin lokalizasyonlarının belirlenmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile karşılaştırılmasıdır.
Fertil ve infertil bireylerin sperm örnekleri üzerinde immunositokimyasal teknikler uygulandı.
Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP’nin sperm baş, boyun ve kuyruk bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/VCP’nin fertil bireylere göre ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/VCP’nin erkek infertilitesi değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir.
Sonuç olarak, fertil ve infertil bireyler arasında p97/VCP’nin ekspresyonu arasında anlamlı derecede farklılıkların bulunması ve semen parametreleri ile p97/VCP arasındaki negatif ilişkinin saptanması, p97/VCP’nin erkek infertilitesinin değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir faktör olabileceğini göstermektedir.
Anahtar kelimeler: p97/VCP, Fertil, İnfertil, Sperm, İmmunositokimya
*Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir
ABSTRACT
The Determination of Localization of p97/Valosin-containing Protein (VCP) by Immunocytochemistry In The Sperm of Fertile and Infertile Men
Valosin-containing protein (p97/VCP), a member of the AAA family (ATPases Associated with various cellular Activities), has a role as a chaperone and aids in the assembly, disassembly, and functional operation of protein complexes. p97/VCP undergoes tyrosine phosphorylation during T cell activation, and although this phosphorylation did not alter its ATPase activity, tyrosine phosphorylation regulates the subcellular localization of this protein. p97/VCP has been shown undergo tyrosine phosphorylation during sperm capacitation. Although it is well known p97/VCP functions in several cellular pathways, it’s presence and importancy have not been demonstrated in male reproductive system.
The aim of the present study was to determine the cellular localization of p97/VCP and compare these expression with semen parameters in fertile and infertile men.
Immunocytochemical methods were applied for sperm cells of fertile and infertile men.
Our results showed that p97/VCP localized in the sperm head, midpiece and tail region. However, this localization was seen mostly in the head region of sperm, escpecially highly expressed in infertile men compared to fertile men. Additionally, p97/VCP was found to be negatively correlated with semen parameters such as sperm concentration, motility and morphology.
These results showing the different p97/VCP expression in fertile and infertile men and negative correlation between p97/VCP expression and semen parameters suggest that p97/VCP may be used one of the important factors for the evaluation of male infertility.
iv
Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder.
Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP yöneticilerine ve tüm çalışanlarına,
Uroloji ve Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD tüm öğretim üyeleri ve çalışanlarına,
İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ii ABSTRACT iii ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) iv İÇİNDEKİLER DİZİNİ v
SİMGELER VE KISALTMALAR vii
ŞEKİLLER DİZİNİ viii
ÇİZELGELER DİZİNİ ix
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1
1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi 1
1.1.1.İnfertilite nedenleri 2
1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri 3
1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler: 4
1.3. Endokrinolojik inceleme 4
1.4. Semen Analizi (Spermiyogram) 5
1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması 5
1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi 6
1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi 6
1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi 7
1.5. Protein Yıkımı 12
1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 12
1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS) 14
1.8. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü 15
1.9. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi 16
1.10. p97/VCP ve Patalojisi 17
1.11. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları 17 1.12. p97/VCP’nin İnsan Sperm Kapasitasyonu İle İlişkisi 18 1.13. p97/VCP’nin Testis ve Epididimis Dokusundaki Ekspresyonları 18
1.14. Çalışmanın amacı 19
MATERYAL VE METOD 13
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar 13
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları 13
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları 14
2.4. Kromojenler 14
2.5. Örneklerin Temini ve Gruplandırılması 14
2.6. Deneysel Çalışma Planı 16
2.7. Sperm Yıkama 16
2.8. İmmunositokimya 16
2.9. İmmunofloresan 17
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi 18
BULGULAR 19
4.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP ekspresyonun belirlenmesi 19 4.2. İnfertil ve fertil bireylerdeki p97/VCP pozitivite yüzdelerinin karşılaştırılması 19 4.3. p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile olan ilişkisi 20 4.4. p97/VCP ekspresyonunun sperm motilitesi ile olan ilişkisi 21 4.5. p97/VCP ekspresyonunun sperm morfolojisi ile olan ilişkisi 22
4.6. p97/VCP ekspresyonunun ve semen parametreleri 23
TARTIŞMA 24
SİMGELER VE KISALTMALAR
aa : Aminoasit
BSA : Sığır serum albumin
cDNA : Komplementer DNA
COP : Sürekli fotomorfogenez
DNA : Deoksiribonükleik asit
DTT : Ditiotereitol
DUB : Deübikütinaz
EDTA : Etil diamin tetraasetik asit
ERAD : Endoplasmik retikulum ilişkili yıkım
FCS : Fetal sığır serumu
HRP : Horse radish peroksidaz
JAB1 : c-Jun-aktivasyon domain-bağlayıcı protein 1
JNK : c-Jun N-terminal kinaz
kb : Kilo baz.
kD : Kilo Dalton
M : Molar
NaCl : Sodyum klorit
NCBI : Uluslarası Biyoteknoloji Bilgi Servisi
NHS : Normal at serumu
NP-40 : Nonidet P-40
PBS : Fosfat buferli tuz
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
PFA : Paraformaldehit
pH : -log c[H+]
PVDF : Polivinlidenflorit
RNA : Ribonükleik asit
rpm : Revolutions per minute
TE : Tris-EDTA
TEMED : N-N’-N’-Tetrametilendiamin
TNF-α : Tümor nekroz faktörü alfa
Tris : Tris (hidroksimetil)-amino-methan
UPS : Übikütin protazom sistem
UV : Ultraviolet
V : Volt
VCP : Valosin-içeren protein
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 1.4.4.1: Makler sperm sayım kamerası 7
Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması 8 Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü 9 Şekil 1.4.4.4: Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği 10 Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri 11
Şekil 1.6.1: VCP’nin yapısal domainleri 13
Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali 14
Şekil 1.11.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları. 18
Şekil 4.1.1: İnfertil bireye ait semen yaymasında p97/VCP
immunopozitif işaretli spermler. 19
Şekil 4.2.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP immunpozitivitesinin
karşılaştırılması. 20
Şekil 4.3.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm konsantrasyonu arasındaki
negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon. 21
Şekil 4.4.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm motilitesi arasındaki
negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon. 22
Şekil 4.5.1.p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm morfolojisi arasındaki
ÇİZELGELER DİZİNİ
Tablo Sayfa
1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri 4
1.10.1 p97/VCP ile İlişkili Patolojiler 17
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER
1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi
Infertilite, kontraseptif bir yöntem uygulamadan, düzenli bir cinsel yaşama rağmen (ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli cinsel yaşam olarak kabul edilir) bir yıl süreyle gebelik oluşmaması infertilite olarak tanımlanır. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda infertilite oranının % 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Lens ., 1996).
Kliniklere infertilite problemi ile başvuran çiftlerin % 48’inde erkeğe bağlı faktörün olması erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasını bir ön koşul olarak beraberinde getirmektedir. Reprodüktif yaştaki erkeklerin % 6’sında infertilite problemi ortaya çıkmaktadır. Bu olguların yaklaşık % 90’ında da bozulmuş spermatogenez vardır (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Irvine., 1996; Lens ., 1996).
Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon infertilite nedeni olabilir. İnfertilitede erkek faktörünün kesinlik kazanabilmesi için; öykü, genel fizik muayene, semen analizi ve hormonal tetkikler sırasıyla yapılmalı ve gereğinde testis biyopsisi; biyokimyasal ve fonksiyonel testlerle desteklenmelidir. Bu nedenle erkek faktörünü ortaya koyan en basit test spermiyogramdır. Dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesi ile aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Lens ., 1996).
Semen analizi makroskopik, biyokimyasal ve mikroskopik araştırmaları kapsar ve özellikle şu noktalar üzerinde durulur.
ejakülat hacmi ve semenin likefikasyonu semenin biyokimyasal özellikleri
semendeki spermatozoa konsantrasyonu hareketli spermatozoa yüzdesi
spermatozoanın morfolojisi
diğer hücrelerin tanımlanması (Lens., 1996).
Spermin tanımlanıp semen analiz tekniklerinin kullanıma girmesi özellikle infertilite araştırmaları konusunda önemli bir çığır açmıştır. 1970’li yılların sonlarından itibaren ortaya çıkan yeni teknolojiler ve bunların klinik kullanımları hem infertiliteye yol açan nedenlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamış hem de milyonlarca çiftin çocuk sahibi olabilme şansını artırmıştır.1978 yılında in vitro fertilizasyon (IVF) yöntemi ile ilk tüp bebeğin doğumu gerçekleştirilmiş ve daha sonra bu yöntem erkek infertilitesi, açıklanamayan infertilite gibi bir çok endikasyon için başarıyla kullanılmıştır. 1992’de intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yöntemiyle elde edilen ilk gebelikler ile ICSI, günümüzde şiddetli erkek infertilite tedavisinde çok önemli bir yer edinmiştir.
Daha öncede belirtildiği gibi, bir yıl içerisinde korunma yöntemi olmadan sürdürülen düzenli bir cinsel yaşama rağmen (ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli cinsel yaşam olarak kabul edilir) gebelik oluşmamasına infertilite adı verilir. Hiç gebelik oluşmaması durumu primer infertilite; daha önce mevcut bir gebeliğin ardından gebelik elde edilmemesi ise sekonder infertilite olarak tanımlanır. Gebelik için hiçbir şansa sahip olmama sterilite olarak ifade edilir. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda infertilite oranının % 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Duru., 1998; Delilbaşı., 1997). Erkek infertilitesi, infertil çiftlerin %10-30’unda tek neden, %15-30’unda ise kadındaki probleme ek olarak karşımıza çıkmakta, dolayısı ile vakaların yaklaşık %50’sinde görülmektedir (Duru., 1998).
1.1.1.İnfertilite nedenleri
İnfertilite hem erkek hem de dişiyi etkileyen bir problemdir. Sperm % 30-40
Ovülatör % 15-20 Fallop tüpleri % 25-40 Serviks % 5
1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri
Erkeklerde görülen infertilitede, aşağıdaki parametrelere bakılarak incelenmektedir (Setchell., 1994):
Sperm ile ilgili problemler Düşük sperm sayısı
Sperm üretiminde bozukluk (defektif sperm sayısında artış) Oligospermi (sperm sayısının düşük olması)
Azospermi (sperm bulunmaması) Seminal kanallarda tıkanıklık Seminal sıvı bozuklukları
• Isı sperm potansiyelini azaltabilir: Kronik yüksek ateş, seks öncesi egzersiz, seks öncesi sıcak banyo
Sperm kalitesi ya da sayısında düşmeyi genellikle etkileyen nedenler: Alkol, İlaçlar, Esrar, Nikotin, Bazı tıbbi uygulamalar, Pestisitler, Kurşun, Kronik alkolizm
Belirli hormonal bozukluklar sperm kalitesini etkiler: Hipofiz bozuklukları, Feminizasyon
Testiküler bozukluklar sperm üretimini etkiler Testiküler vein varikozu
Testiküler hasar Testiküler tümör Varikosel
Testikül anomali
İnmemiş testis (çocuklukda başarılı şekilde müdahale edilmemişse) Testiküler burulma
Kabakulak
Radyasyona maruz kalma
Testiküler kanalın bloke olması (sperm salınımını etkiler) Testiküler kanalda kızıl (scarring)
Cinsel yolla bulaşan hastalıklar Gonera
Klamidya
Retrograd ejakülasyonu (mesaneye ters ejakülasyon-çeşitli nedenlerden dolayı oluşabilir)
Prostat cerrahisi, Bazı tıbbi müdahaleler
Ejakülasyonun oluşmaması (çeşitli nedenlere bağlı olabilir) İktidarsızlık (impotens)
Erektil disfonksiyon Diabet
Prostat cerrahisi Üretra cerrahisi
Kan basıncı ile ilgili uygulamalar Bazı kromozom bozuklukları XXY erkekler
Bazı tıbbi uygulamalar
1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler:
1. Spermiyogram 2. Postkoidal test
3. Antisperm antikor ölçümü(serum veya seminal plazmada) 4. Spermatozoanın fertilizasyon kapasite testleri
5. Serumda:
• Serbest ve total testosteron • Luteinleştirici hormon • Follikül uyarıcı hormon
• Prolaktin düzeyleri de önemlidir .
1.3. Endokrinolojik inceleme
Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan erkek seks hormonları Tablo 1.3.1’de gösterilmiştir.
Tablo 1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri (Setchell ve Maddocks., 1994).
Hormon
Etkisi
GnRH FSH ve LH hormonlarının salgılanmasını sağlar. Beyinde hipotalamustan salgılanır.
FSH Testisteki sertoli hücrelerini uyararak sperm üretimini sağlar. Hipofiz bezinden salgılanır.
LH Leydig hücrelerinde testosteron sentezlenmesini ve sperm üretiminin devamlılığını sağlar. Hipofiz bezinden salgılanır.
Prolaktin LH’ın Leydig hücreleri üzerindeki etkisini arttırır. Hipofiz bezinden salgılanır.
Testosteron Sperm üretiminin devamlılığını sağlar. Testisteki Leydig hücrelerinden salgılanır
Estradiol LH sentezini kontrol eder. Karaciğer, kas ve yağ dokusunda testosteronun metabolize edilmesi ile oluşur. %20-25’i Leydig hücrelerinden salgılanır.
İnhibin FSH salınımını engeller. Sertoli hücrelerinden salgılanır.
Aktivin FSH salınımını arttırır. Leydig hücrelerinden salgılanır.
1.4. Semen Analizi (Spermiyogram)
İnfertil çiftlerde yarıya yakın bir oranda erkekte problem olduğu belirlenmiştir. Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon, infertilite nedeni olabilecektir. Bu nedenle erkek faktörünü ortaya koyan en basit test spermiyogramdır (Delilbaşı., 1997).
1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması
Hastalar ile yapılan ilk görüşmede örnek vermek için gelecekleri gün 3-5 günlük bir cinsel perhiz süresine uymaları tavsiye edilir. 2-7 gün arasındaki cinsel perhiz süresi yeterli görülürse de kısa süreli cinsel perhizde semendeki sperm sayısı az, uzun süreli cinsel perhizde de (erkek faktörü mevcut ise) sperm sayısı yeterli olsa bile motilitenin düşük olduğu gözlenmiştir. Yapılan araştırmalarda, uzun süreli cinsel perhizin spermlerin akrozin içeriğinde de azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Önerilen cinsel perhiz süresine uyulduğunda, dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
Hastalara steril şartlarda, steril kutular verilerek bu amaçla düzenlenmiş sperm verme odasını kullanmaları sağlanır. Hastalar, mastürbasyonla örnek vermeleri gerektiği konusunda bilgilendirilir, kullandıkları kutuların üzerine isimleri etiketle yapıştırılır.
Örnek verme esnasında nelere dikkat etmeleri gerektiği önceden hazırlanmış bir bildiri ile kendilerine açıklanmalıdır. Örnek toplanması esnasında krem ya da kayganlaştırıcı bir madde kullanmaması, örnek toplanan kutuya su ya da başka bir madde kaçırmaması söylenir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha önceden yapılan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmadığı ispatlanmış kutular satın alınmalıdır. Hastanın örneğini aldıktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili biyologlara teslim etmeleri gerektiği izah edilmelidir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996., Işık., 1999).
1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi
Erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasında ilk basamak semen analizidir. Bu inceleme esnasında Dünya Sağlık Örgütü tarafından belirtilen kriterler (WHO, 1992) esas alınmaktadır. Semen analizi makroskopik ve mikroskopik incelemeden oluşur (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996., Setchell ve Maddocks., 1994).
1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi
Makroskopik incelemede semen içeriği likefikasyon, görünüm, volüm ve pH özellikleri yönünden değerlendirilmektedir ( Enginsu ve arkd., 1995., Lens., 1996).
1. Likefikasyon (Semenin Çözünülürlüğü): Ejakülasyon sırasında akıcı olan semen koagüle olur. Prostattan salgılanan amilaz ve proteolitik enzimler 10-30 dakika içerisinde semenin likefiye olmasını (çözünürlük kazanmasını) sağlar. Laboratuvara ulaşan semen örneği 37°C’de (etüvde) likefiye olana kadar bekletilir, sonra incelemeye alınır. Bu süreyi aşan örnekler viskoz olarak kabul edilir.
2. Görünüm: Normalde semen sarı-gri renkte, parlak ve homojendir. Prostat bezinden salgılanan spermin’in oksidasyonundan kaynaklanan kendine özgü bir kokusu vardır. Semende eritrositlerin bulunması halinde renk kırmızı-kahverengidir. Uzun süreli cinsel perhizlerde ve pyospermide renk sarıya dönüşür.
3. Volüm: WHO kriterlerine göre semen hacmi 2 ml veya daha fazla olmalıdır. 1 ml’den az olması durumu, hipospermik olarak isimlendirilip toplama sırasında örneğin
dökülmüş olabileceği, kısa cinsel perhiz süresi, retrograd ejakülasyonu veya ejakülatör kanalda darlık gibi nedenler düşünülebilir. Miktarı 6 ml’den fazla olan semen içeriği hiperspermik olarak adlandırılır, bu durumda cinsel perhiz süresi uzun veya seminal sıvı fazladır.
4. pH: Normal pH değeri 7.2 – 8.0 arasındadır. Akut enfeksiyonlar da pH değeri 8’in üzerine çıkabilir. pH’nın düşük olması sperm salınımının yetersizliği ve bu nedenle ejakülatın daha çok asidik prostat sıvısından oluştuğunu gösterebilir.
1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi
Mikroskopik incelemede semen içeriği; sperm konsantrasyonu, hareketliliği (motilite), morfoloji ve yuvarlak hücre sayısı ve bu hücrelerin sınıflandırılması yönünden incelenmektedir (Işık., 1999; Setchell., 1994).
1. Konsantrasyon: Sperm sayımı için günümüzde en fazla kullanılan aletlerden biri “Makler Sperm Sayım Kamerası”dır (Şekil 1.4.4.1). 1978 yılında Prof. Dr. Amnon Makler tarafından sperm sayımı için özel olarak tasarlanmıştır. Semen örneğinin incelendiği kameranın 10 μm derinliğinde olması spermatozoanın tek bir düzlemde serbest hareketine olanak sağlamaktadır. Makler kamerası ile spermlerin hareketlilik yüzdeleri daha kesin olarak saptanabilmektedir.
Makler sperm sayım kamerasının yakın görünümü
Güvenilir bir değerlendirme için ideal olan Makler sperm sayım aletindeki 100 karedeki spermleri saymaktır. Sayım şu şekilde gerçekleştirilir. Bir damla semen (5 μl) kameranın merkezine damlatılıp üzerine kapak camı kapatılır. Dört adet kuvartz bacak sayesinde spermler, 10 μm derinlikte yüzeceklerdir (Şekil 1.4.4.2). Bu derinlikte ancak bir adet sperm başı sığabilir. Bu sebeple bir hat üzerinde yapılacak sayım 20x büyütme altında 10 karede motil ve non-motil sperm sayılır ve 106 ile çarpılarak mililitredeki (x 106/ml) sperm sayısı belirlenir. Normal sperm konsantrasyonu >20x106/ml ve totalde 40x106’dur (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması
2. Motilite: Motilite değerlendirilirken konsantrasyon sayımında olduğu gibi x20 büyütme altında ve 10 karede yapılır (Şekil 1.4.4.3). Motil spermlerin, toplam sperm sayısına oranı yüzde olarak motiliteyi verir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü Dünya Sağlık Örgütü hareketliliği 4 sınıfta değerlendirmektedir:
a- hızlı doğrusal progresif hareket
b- yavaş doğrusal ya da doğrusal olmayan hızlı hareket c- progresif olmayan hareket
d- hareketsiz
Normal sperm konsantrasyonunun >%50’si motil ve bu değerin %25’i progresif olmalıdır (Delilbaşı., 1997).
3. Morfoloji: Morfolojik değerlendirmede WHO veya Kruger’in strict kriterleri kullanılmaktadır. WHO kriterlerine göre normal değer >%30 iken Kruger strict kriterlerine göre %14 olmalıdır. Morfolojik değerlendirmede sperm baş, boyun ve kuyruk anomalileri yönünden dikkatle incelenmelidir. Sperm morfolojisi değerlendirilirken önce lam üzerine yayma yapılarak seçilen boya ile boyama yapılır (WHO için Papanicolaou ve Kruger strict kriterleri için Diff-Quick veya Spermac). Değerlendirme immersiyon yağ altında yapılır tercihen 100 veya 200 sperm incelenerek % normal cinsinden sonuç verilir (Delilbaşı., 1997).
Kruger Strict Kriterleri’ne Göre Morfoloji Değerlendirmesinde Diff-Quick Boyama Tekniği:
- 5 μl likefiye olmuş, taze semen örneği lam üzerine damlatılarak yayma yapılır. - Preparat 3-5 dakika dış ortamda kurutulur.
- 5 dakika şale içerisinde bulunan fiksatif (tesbit) içerisinde bekletilir. - Boyama işlemi için Diff-Quick boya seti şu basamaklarla uygulanır
- I nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (I nolu boya: Eozin G-pH 6.6 fosfat tamponu ile)
- II nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (II nolu boya: Eozin GpH 6.6 fosfat tamponu ile)
- Preparat kurutulur
- Üzerine immersion yağı damlatılarak (x100) faz kontrast mikroskopta incelenir. - Boyama sonrasında akrozom yeşil, nükleus kırmızı, boyun ve kuyruk yeşil boyanır (Enginsu., 1995).
Normal Sperm Morfolojisi
Morfolojik değerlendirme Kruger kriterlerine göre yapılmıştır. Normal sperm morfolojisi > %14 olmalıdır (Şekil 1.4.4.4). Kruger kriterlerine göre:
Baş Düz oval
Akrozom, başın % 40-70’ini oluşturur.
Normal ölçüler; uzunluk 5-6 μm, genişlik 2.5-3.5 μm Borderline baş formları anormal olarak sınıflanır. Boyun Abaksiyel implantasyon olmamalı ve intakt olmalı
Orta kısım Silindir şeklinde 1 μm genişlikte ve baş uzunluğunun 1.5 katı uzunlukta olmalı.
Baş büyüklüğünün ½’den büyük sitoplazmik droplet olmamalı Kuyruk Orta kısımdan hafifçe ince, kıvrım içermeyen 45 μm uzunlukta
olmalı (Enginsu., 1995).
Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri Semen
Ejakülat ya da semen (meni) hipotalamo-pitüiter aks dahilinde testislerin işlevi ve posttestiküler boşaltma kanallarıyla aksesuar bezlerin salgılarından oluşan bir son üründür. Normal insan ejakülatının ortalama hacmi yaklaşık olarak 3 ml olup 2-6 ml aralığında değişir ve iki komponenti vardır:
1. testisler tarafından üretilen spermatozoa,
2. seminal plazma; 1/3’ü prostat sekresyonundan, 2/3’ü seminal kese sekresyonundan oluşur (Isık., 1999; Setchell ve Maddocks.,1995).
Normal semen hacminin % 10’unu spermatozoa, % 90’ını seminal plazma oluşturur. Seminal plazmanın en önemli görevi (pH = 7.2-7.8) spermatozoa transportu ve tampon görevi görerek vajinanın pH’sının yükseltilmesidir. pH 6,2’nin altına düştüğünde spermatozoa yavaşca immobilize olacaktır. Hacmin az olması yeterince tampon kapasitesi oluşturamayacağı için spermatozoa immobilizasyonu gerçekleşecek, hacmin fazla olduğu durumda da spermatozoa konsantrasyonu düşecektir. Bu durum dezavantaj gibi görülmemelidir, çünkü spermatozoa ejakülatın ilk kısmında yer almaktadır. Seminal plazma, ejakülatın sıvı bölümüdür; erkekte çeşitli salgı bezlerinin (epididimis, vas deferens, ampülla, seminal vezikül, prostat bezi) sekresyonundan oluşan bir karışımdır. Aynı kişinin farklı ejakülatlarında, seminal plazma kompozisyonu mevsimsel farklılık gösterebilmektedir. Ayrıca ejakülasyondan sonra seminal plazmadaki enzim ve spermlerin metabolik aktivitesine bağlı olarak da seminal plazmanın kompozisyonu değişmektedir.
İnsan ejakülatının ilk fraksiyonu sperm ve prostatik bir sekresyon olan sitrik asit yönünden zengindir. Fruktoz konsantrasyonu, seminal veziküllerin majör sekretuar ürünüdür ve ejakülatın sonraki sekresyonlarında yükselmektedir (Lens., 1996).
Diğer vücut sıvılarından farklı olarak seminal plazma yüksek konsantrasyonlarda potasyum, çinko, sitrik asit, fruktoz, fosforilkolin, spermin, serbest amino asitler, prostaglandinler ile önemli düzeyde asit fosfataz, betaglukronidaz, laktik dehidrogenaz, alfa amilaz ve prostat spesifik antijenler içermektedir.
1.5. Protein Yıkımı
Protein yıkımı, hücre içerisindeki proteinlerin steady-state diye adlandırılan normal düzeylerinde fonksiyon görmelerini sağlamak amacıyla işleyen düzenli bir mekânizmadır. Ökaryotlarda protein yıkımı, hem sitoplâzmada hem de çekirdek Übikütin Protazom Sistemi (UPS) ve onun düzenleyici proteinleri sayesinde gerçekleşmektedir. Bu düzenleyici proteinler arasında hem COP9 signalozom (CSN) hem de p97/Valosin containing protein (VCP) belirli substratların yıkımını kontrol etmektedirler (Ye ve arkd., 2001; Wei ve Deng, 2003).
1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı
97-kDa’luk Valosin-içeren protein (p97 ve ya VCP), übikütin-protazom sistemine bağlı proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP’nin, übikütin ve kofaktörleri ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS’de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir.
VCP, tip II AAA (ATPases Associated with a variety of Activities: Birçok aktivitesi bulunan ATPazlar) ATPaz ailesine ait bir proteindir ve AAA domaini olarak adlandırılan iki ATPaz domainine sahiptir (Neuwald ve arkd., 1999; Zwickl ve Baumeister, 1999; Vale, 2000; Maurizi ve Li, 2001; Ogura ve Wilkinson, 2001). VCP çeşitli türlerde farklı isimlerle anılmaktadır. Örneğin: arkebakteride VAT, mayada CDC48, Drosophilada TER94, memeli ve bitkilerde ise p97 ve ya VCP olarak bilinmektedir (Frohlich ve arkd., 1991; Pamnani ve arkd., 1997).
VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliübikütin
zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri, VCP’nin şaperon aktivitesinden sorumludur (Figure 1.11.1) (Wang ve arkd., 2003).
Şekil 1.6.1. VCP’nin yapısal domainleri.
A: Walker A, B: Walker B ve SRH: VCP’nin D1 ve D2 domainlerindeki ikinci bölge homoloji motifleri. (Wang ve arkd., 2004).
Elektron mikroskobu çalışmaları, VCP’nin silindirik şekilli homo hekzemerik yapıda olduğunu kanıtlamıştır (Wang ve arkd., 2003).
VCP, hücre içerisinde birçok aktivitede görev yapmaktadır: hücresiklusu gelişimi (Cao ve Zheng, 2004), mitoz sonrası membrane kaynaşması ve iğ ipliklerinin ayrılması (Kondo ve arkd., 1997; Cao ve arkd., 2003; Wojcik ve arkd., 2004), yanlış katlanmış proteinlerin ER’dan geri atılımı (Ye ve arkd., 2001; Braun ve arkd., 2002; Jarosch ve arkd., 2002), proteazomda poliübikütinlenmiş proteinlerin degrade edilmesi (Ghislain ve arkd., 1996; Dai ve Li, 2001) ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu (Hitchcock ve arkd., 2001; Rape ve arkd., 2001).
VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, übikütinlenmiş proteinlere özgün olarak bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak onlara yol gösterir. Substrat übikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini birbirinden ayırmak için ATP’yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar. Örneğin: Herhangi bir şekilde stimüle edilmeyen hücrelerde, NF-κB sitoplâzmada inaktif formda inhibitör IκB proteini ile etkileşim halindedir (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro ve arkd., 2003). Sitimulasyona cevap olarak, NF-κB aktive olur ve IκBα hızlıca fosforile olup, poliübikütinlenir (Karin ve Ben-Neriah, 2000). Bunu takiben, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα’ya bağlanır ve onu NF-κB kompleksinden ayırır (Dai ve arkd., 1998). IκBα’nın NF-κB’dan ayrılmasından sonra, NF-κB hedef genin regülâsyonu nedeniyle nükleusa transfer edilir. Bu arada, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα’ya şaperonluk yaparak, onun 26S proteazomda yıkımı için yol gösterir (Dai ve arkd., 1998).
1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS)
UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS’in übikütinleme ve übikütinlenmiş proteinlerin yıkımı olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk übikütinleme fazında, übikütin (Ub) ATP yardımıyla übikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra übikütin bağlayıcı edici enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, übikütin, protein ligaz (E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub’nin son aminoasidinin (G76) karboksil grubunda gerçekleşir (Şekil 1.2.1) (Pickart, 2001b, a).
Tek bir übikütin molekülünün substrata eklenmesi (monoübikütinleme) ise, lizozomal sınıflandırma, gen ekspresyonu ve endositoz gibi substratın farklı görevlerde iş yapmasına neden olmaktadır (Schnell ve Hicke, 2003)
Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali
A: Übikütin, übikütin aktive edici enzim (E1) ile aktive edilip ve sonra übikütin bağlayıcı
enzime (E2) transfer edilir. Substrat (mavi kutu) ve E2 enzimi özgün olarak übikütin protein ligaza bağlanabilirler ve de aktive olmuş übikütin substrata transfer olur. B: E3, substrata ve E2’ye farklı alanlarda bağlanır. Substrat, übikütinlenme sinyalı ile tanınır. C: Proteolizin gerçekleştiği 26S protazom, 19S kapak kısmı ve esas proteolitik aktiviteye sahip 20S kısmından
oluşur. Proteoliz öncesi 19S kapakla bağlantılı deübikütinleyici enzimler ile substratdan übikütin zincirlerinin uzaklaşması sağlanır (Meusser ve arkd., 2005).
UPS siklusunun ikinci fazında, protazom poliübikütin zincirleri sayesinde, substratı tanır. Substrat, küçük peptidlerine yıkılır ve Ub’nin özgün deübikütinleyici enzimi sayesinde geri eldesi sağlanır. Ub’nin substrata konjugasyonu gibi, proteazomal yıkım da, ATP bağımlıdır. 26S proteazomun, hem übikütinlenmiş proteinlerin übikütinden ayrılması hem de onların yıkımlarının katalizlenmesinde önemli bir görevi vardır (Schwechheimer ve Deng, 2001; Pickart ve Cohen, 2004). Protazom, birbirine bağlı 2 farklı bölümden oluşmuştur. 20S silindirik temel bölüm, proteolitik aktiviteye sahip iken, silindirik bölümün alt ve üst kısımlarına yerleşmiş 19S’lik proteazom kapakları poliübikütinlenmiş substratın tanınması ve proteoliz görevini üstlenmişlerdir. Herbir 19S kompleksi, 6 tanesi ATP az aktivitesine sahip 15-20 subuniteden oluşmuştur.
1.8. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü
Otofaji, uzun süreli hücrede depo edilen proteinleri, makromolekülleri ve ya hasarlı organelleri elimine etmek için ökaryotlarda kullanılan evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir. Otofaji, genelde hücrenin yaşamını sürdürmesi amacıyla açlık, çeşitli stres ve hücrede emekliye ayrılmış dokuları ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. Otofajinin 3 tipi vardır.1-Şaperon aracılı otofaji 2-Makrootofaji 3-Mikrootofaji. Şaperon aracılı otofaji, yüksek ökaryotik canlılarda görülür ve lizozomda sitosolik proteinlerin yıkımına sebep olur. Makrootofaji ise çift membranlı, sitoplazmik materyali yutup bu materyalin yıkımı için lizozom ve ya vakuol ile birleşebilen otofagozomun oluşumu ile karakterizedir. Mikrootofaji ise vakuol ya da lizozom oluşumu ile sitosolik kompartmanların direk yıkımı ile ilişkilidir. Bugüne kadar, mayada 35 tane Autophagy related genes (ATG) (ATG1 den ATG35 e kadar tanımlanmıştır. Bunlardan Atg8 (memelideki karşılığı LC3), otofagozom oluşumu için gereklidir.
p97/VCP’nin otofagozom maturasyonundaki rolü ilk memeli hücrelerinde, p97/VCP’nin N terminal ve D1 domainlerinde mutasyonunun neden olduğu IBMPFD hasta lığında ortaya çıkmıştır. IBMPFD’li VCP mutasyonu gösteren hücrelerde otofagozom markerlerının LC3II ve p62 nin fazlaca ekspre edildiği görülmüştür. p97/VCP, siRNA
yöntemiyle nakdavn edildiğinde, p62 ve LC3II nin hücre sitoplazması içerisinde toplandığı saptanmıştır. Bütün bunlar p97/VCP’nin otofajik protein degradasyonunda gerekli bir protein olduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, p97/VCP’nin otofagozom-lizozom füzyonunda ve otolizozom oluşumunda gerekli olduğu çalışılmıştır. p97/VCP mutant hücrelerin otofagozomlarında ubiquitinin toplandığı görülmüş ve p97/VCP’nin ubikütinlenmiş substratların otofajik degradasyonları için gerekli olabileceğini önermektedir. Fakat p97/VCP aracılı otofagozom-lizozom füzyonunun mekanizması ve ya bazı otofagozom ilişkili proteinlerin ubikütin benzeri domainler ile ilişkisi tam olarak açıklanamamıştır.
1.9. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi
Mitokondri ve peroksizomlar mitofaji ve pekzofaji olarak bilinen yöntem ile yıkılmaktadırlar. Nükleusun bir kısmı, 60S ribozomal ünite ve endoplazmik retikulum yine otofaji yöntemiyle yıkılmaktadır (Dargemont C, 2011, Paris). Maya hücrelerinde yapılan çalışmada, nitrojen yokluğunda olgun ribozomların 60S ünitelerinin degrade olduğu gösterilmiştir. Mitofaji ile ise hasarlı ve ya fonksiyon görmeyen mitokondrinin eliminasyonu sağlanmaktadır. Birçok mitokondriyal proteinin (Atg32, Atg11…) stress ve ya yaşlılık gibi durumlarda otofajik yıkım için devreye girdiği bilinmektedir. Memeli hücrelerinde mitokondrilerin iş görmemesi Parkinson hastalığı gibi önemli nörodejenaratif patolojiler ile ilişkilendirilmiştir. PARK2 gen ürünü olan Parkin’nin mutasyona uğraması, Parkinson hastalığı ortaya çıkmaktadır. Parkin hasarlı mitokondrilerin toplanması ve fonksiyon görmeyenlerin eliminasyonu için gereklidir. p97/VCP’ninde, Parkin aracılı mitokondriyal yıkım için gerekli olduğu belirlenmiştir. p97/VCP’nin aynı zamanda, hasarlı mitokondriyal membranlarındaki ubikütinlenmiş proteinleri membranlardan ayırıp proteasomda degrade olabilmelerini sağlamaktadır. p97/VCP’nin endoplasmik retikulumun ve nükleusun bir parçasının yıkımında da fonksiyon görebileceği gösterilmiştir.
1.10. p97/VCP ve Patalojisi
p97/VCP’nin birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. p97/VCP ile ilişkili, birçok hastalığın farklı sistem ve organlardaki dağılımı Tablo 1.10.1’de gösterilmiştir (Lue ve arkd., 2002). Bu hastalıkların çoğunda VCP geninin ilgili bölgesinde mutasyonlar saptamıştır.
Tablo 1.10.1. p97/VCP ile İlişkili Patolojiler
Sistem ve organlar Patoloji
Kemik ve eklemler Paget hastalığı
Kas Inklüzyon cisimcik miyopati
Beyin Frontotemporal demans
Göz Katarak
Beyin Parkinson, Alzhmeir, ALS
1.11. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları
Birçok proteinle olan ilişkisi nedeniyle, p97/VCP hücrede çok çeşitli aktiviteler göstermektedir (Şekil 1.11.1). Bu şekilde, p97/VCP’nin protein degradasyonu, hücre siklusu kontroli, otofaji gibi birçok önemli fonksiyonu yerine getirdiği özetlenmiştir.
Şekil 1.11.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları. p97/VCP ve kofaktörleri birçok biyolojik fonksiyonun yerine getirilmesinde görev alırlar. Sarı yuvarlak içindekiler: membran oluşumu ile ilgili fonksiyonları. Mavi ve yeşil yuvarlak içindekiler: Protein yıkımı ile ilgili fonksiyonları, Pembe daire içindekiler: Hücre siklusu ve DNA’nın işlenmesi ile ilgili fonksiyonları göstermektedir.
1.12. p97/VCP’nin İnsan Sperm Kapasitasyonu İle İlişkisi
Kapasitasyon memeli sperminin fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gereklidir. Bu olay sırasında birçok proteinin tirozin kuyruları fosforile olur ve spermin hareketinin arttığı gözlenmiştir. Kapasitasyon akrozomal reaksiyon içinde gereklidir. Bu derece fertilizasyon için önemli bir olayda p97/VCP’nin de tirozin kuyruğundan fosforile olduğu gösterilmiştir (Ficarro ve arkd., 2003). İlk defa bu çalışma ile, kapasite olmamış bir sperm ile kapasite olmuş bir sperm hücresinde p97/VCP ekspresyonları karşılaştırılmıştır. Fakat, p97/VCP’nin hangi bölgesinden fosforile olduğu saptanamamıştır.
1.13. p97/VCP’nin Testis ve Epididimis Dokusundaki Ekspresyonları
p97/VCP’nin, ilk olarak bizim çalışmalarımızla (Cayli ve arkd., 2011; Cayli ve arkd., 2012) gelişmekte olan testis ve epididimis dokularındaki ekspresyonları belirlenmiştir. Testiküler dokularda p97/VCP’nin gelişime paralel olarak ekspresyonlarının arttığı ve farklı UPS proteinleri ile ilişkide olduğu belirlenmiştir. Buna ilaveten epididimis dokularındaki ekspresyonları ve epididimisin farklı bölgelerindeki varlığı da değerlendirilmiştir.
1.14. Çalışmanın amacı
p97/VCP’nin, yukarıdaki bölümde detaylı bir şekilde anlatıldığı gibi hücreiçi birçok temel fonksiyonu yerine getirdiği bilinmektedir. Fakat p97/VCP’nin erkek üreme hücresi olan spermlerde bugüne kadar varlığı ve fonksiyonu hakkında çalışma yok denecek kadar azdır. Bu nedenle bu çalışmada öncelikle biz p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerde immunohistokimyasal lokalizasyonunu belirlemeyi amaçladık, ikincil olarak da p97/VCP’nin bu bireylerdeki semen parametreleri ile olan ilişkisini incelemeyi amaçladık.
MATERYAL VE METOD
Projemizin bu bölümünde, deneyler boyunca kullanılan sarf malzemeler ve ait oldukları kaynaklar ayrı başlıklar halinde verildi.
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar
Asetik asit Merck, Darmstadt
Akrilamid 30% Roth, Karlsruhe
Kloroform Merck, Darmstadt
Komasi Mavisi Boyası Sigma-Aldrich, Steinheim
1,4-Ditiotetritol Roche, Mannheim
Etanol Sigma-Aldrich, Steinheim
Igepal CA-630 (NP-40) Sigma-Aldrich, Steinheim
Magnezyum klorid Merck, Darmstadt
Magnezyum sülfat Sigma-Aldrich, Steinheim
Mangan klorid Merck, Darmstadt
β-Merkaptoethanol AppliChem, Darmstadt
Methanol Sigma-Aldrich, Steinheim
Morfolinethan sülfonik asit Serva, Heidelberg
Süttozu Bio-Rad, München
Formaldehit Merck, Darmstadt
Fenilmetilsülfonilflorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Ponseu S Roth, Karlsruhe
Potasyum klorit Merck, Darmstadt
Sodyum klorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Sodyum dodesil sülfat Merck, Darmstadt
Tris Roth, Karlsruhe
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim
Tween-20 Roth, Karlsruhe
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları
Primer antikorlar Firması Dilusyon oranı
α-Biotin-HRP Amersham, Freiburg 1:1,500
Mouse α-VCP ABR, USA 1:1,000
Rabbit α-VCP Santa Cruz, USA 1:200
Sekonder antikorlar
α-rabbit IgG-Rhodamine Chemicon, Hampshire, UK 1:1,000
α-mouse IgG-FITC Dianova, Hamburg 1:1,000
Rabbit α-mouse IgG Cell Signaling , USA 1:100
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları
Hassas terazi Korn ABJ, Turkiye
Microdalga fırını Arcelik, Turkiye
Mini santrifüj Biosan, Turkiye
Floresan mikroskobu Nikon, Almanya
Orbital karıştırıcı Sigma, Almanya
Shaker Velp Scientifica
Mikrotom Leica, Almanya
Etuv Nüve, EN500
2.4. Kromojenler
DAB (Diaminobenzidine) Sigma, Germany
AEC Syctek Lab
Fast red Sigma, Germany
2.5. Örneklerin Temini ve Gruplandırılması
GOP Universitesi Etik Kurulu kararı doğrultusunda planlanan bu çalışmada, GOP Universitesi Tıp Fakultesi Uroloji polikliniğine ve Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı polikliniğine infertilite problemi ile müracaat ederek spermiyogram tetkiki yaptırması tavsiye edilen hastaların semen örnekleri, olguların olurları alındıktan sonra bu çalışmada kullanılmıştır. Semen örnekleri spermiyogram özellikleri yönünden değerlendirilip sonuçları rapor edildikten sonra çalışma için ayrılmıştır.
Hastalar ile yapılan ilk görüşmede örnek vermeğe gelecekleri gün 3-5 günlük bir cinsel perhiz süresine uyarak gelmeleri tavsiye edilmiştir. Önerilen cinsel perhiz süresine uyulduğunda, dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır. Hastaların steril şartlarda, steril kutular kullanarak bu amaçla düzenlenmiş sperm verme odasını kullanmaları sağlanmıştır. Hastalar, mastürbasyonla örnek vermeleri gerektiği konusunda bilgilendirilmiş, kullandıkları kutuların üzerine isimleri etiketle yapıştırılmıştır. Örnek verme esnasında nelere dikkat etmeleri gerektiği önceden hazırlanmış bir bildiri ile kendilerine açıklanmıştır. Örnek toplanması esnasında
krem ya da kayganlaştırıcı bir madde kullanmaması, örnek toplanan kutuya su ya da başka bir madde kaçırmaması söylenmiştir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha önceden yapılan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmadığı ispatlanmış kutular satın alınmıştır. Hastanın örneğini aldıktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili görevliye teslim etmeleri gerektiği izah edilmiştir. Semen örnekleri spermiyogram özellikleri yönünden değerlendirilip sonuçları rapor edildikten sonra çalışma için ayrılmıştır. Örneklerin ayırımı yapılırken lökosit içeren, viskoz olan ve anormal bir görüntüye sahip (örneğin kanlı) örnekler çalışmaya alınmamış, perhiz süresine uygun olarak (ortalama 3-5 gün) toplanmış örnekler seçilmeye dikkat edilmiştir. Örnekler spermiyogram özelliklerine göre; hacim, konsantrasyon, motilite ve morfoloji yönünden değerlendirilmiş ve hastaların ayrıntılı anemnezleri alınmıştır. Kriptorşidizm, geçirilmiş genital infeksiyon hikayesi, genital travma, geçirilmiş operasyonlar, alışkanlıklar (sigara, alkol, uyuşturucu kullanımı), radyasyon tedavisi, kemoterapi gibi maruz kalınan gonodotoksinler sorgulanmış ve bu hastalar fertil gruba dahil edilmemiştir. Hastaların testis sayıları, lokalizasyonu ve volümü kaydedildi. Varikosel varlığı fizik muayene ile belirlendi. Ayrıca epididim ve vas deferensin skrotal kısımlarının palpasyonu yapıldı. Vaz deferens obstrüksiyonu ya da agenezisi şüphesi olan hastalar ile daha önce fertilizasyon amacı ile vazektomi yapılan hastalar çalışmaya alınmadı. Infertil grubun yanında, fertil kontrol grubu daha önce çocuğu olan ve yukarıda belirtilen kriterlere sahip olmayan bireylerden seçildi. Dünya Sağlık Örgütü’nün 1992 verilerine göre konsantrasyon, motilite ve morfoloji için normal olarak kabul edilen değerler: Hacim ≥ 2 ml, Konsantrasyon ≥ 20x106/ml, Motilite > %50, Morfoloji ≥ %14 (Kruger). Fertil (n = 10) ve infertil (n = 10) bireylerden alınan semen örnekleri üzerinde immunohistokimya için hazırlıklar aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandı.
2.6. Deneysel Çalışma Planı
3-5 günlük perhiz süresine uygun olarak steril şartlarda alınan semen örneği 37°C’de likefikasyon için yarım saat bekletildi. Spermiyogram için makler çemberi altında kontrol ve infertil bireylerin semenleri (sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi) değerlendirildi. Semen analizi sonrası, kalan ejakülat immunohistokimyasal işlemler için yıkandı.
2.7. Sperm Yıkama
Ejakülat 37°C’de likefiye olduktan sonra mikroskopik olarak incelenir ve 2500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonrası seminal sıvı içeriği üstten ayrı bir tüpe alınır. Altta kalan sperm pellleti üzerine 500µl-2ml arası (tüpte kalan sperm pelletinin konsantrasyonuna yani pelletin büyüklüğüne göre) yıkama medyumu (Yıkama medyumu olarak hücre kültür işlemlerinde kullanılan bikarbonat, Hepes’li tampon ve İnsan Serum Albümin içeren medyumlar tercih edilmektedir) eklenerek resüspande edilir. Yıkama medyumu 37°C’de %5’lık CO2’e ayarlanmış inkübatörde bir saat bekletilmiş olması gerekir. Resüspansiyon sonrası sperm morfoloji değerlendirmesi için lam üzerine 5-10 µl lik örnek çekilerek yayma yapılır. Polilizinle kaplı lamlara ise yine 5-10 µl aynı örnekten yayma yapılarak, preparatlar kuruduktan sonra 4% lük formaldehit ile fikse edilir. Fikse edilen slaytlar immusitokimyasal işlemlere başlayana kadar 4°C’de saklandı.
2.8. İmmunositokimya
Fertil ve infertil bireylerden hazırlanan fikse edilmiş slaytlar pappen yardımıyla çizildikten sonra, oda ısısında kesitler spesifik olmayan reaksiyonu engellemek için 1 saat 5% lik bovin serum albümin ile inkübe edildi. 1 saatlik inkübasyon sonrası, PBS ile oda sıcaklığında yıkamadan sonra sırayla biotinlenmiş sekonder antikorlar (ScyTek Laboratories, USA) ve peroksidaz-işaretli streptavidin (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile toplam 60 dakika inkübe edildi. Sekonder antikordaki peroksidaz aktivitesi, DAB (Sigma, USA) kromojeni ile inkübasyon sonucu görünür hale getirilip, Mayer’in hematoksileni (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile zıt boyama yapıldı. Sonrasında, slaytlar kapatma solusyonu (Fisher Chemicals, Springfield, NJ, USA) ile kapatıldı. Kontroller için, kesitler primer antikorla benzer konsantrasyonda normal tavşan serumuyla
inkübe edildi. Boyanan kesitler Leica mikroskop (Leica DM2500, Nussloch, Almanya) altında fotoğraflandırıldı. Sekonder antikorun horseradish peroxidase (HRP) ya da alkaline fosfotaz (AP) ile konjuge olma durumuna göre, AEC nin yanında, DAB veya Fast red gibi kromojenler de kullanılarak immunopositif bölgeler görünür hale getirildi.
2.9. İmmunofloresan
Bir önceki bölümde anlatılan immunositokimya yönteminin temel basamakları aynı olmak şartıyla, kullanılan sekonder antikorların rhodamine ve FITC gibi belli dalga boylarında floresan renk vermesi nedeniyle özellikle çiftli boyamalarda immunofloresan işaretleme yöntemi tercih edilir. Kısaca bizim çalışmamızda, primer antikorlarla inkubasyondan sonra, rhodamine ile işaretli anti mouse ve FITC ile işaretli anti rabbit sekonder antikorları ile 1 saat oda ısısında inkübasyon gerçekleştirildi. Floresana uygun kapatma medyumu (Invitrogen) ile slaytlar kapatılarak, Nikon microscope (Nikon E600, Germany) altında fotoğraflar çekildi.
İSTATİKSEL ANALİZ
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi
Herbir kesit için ışık mikroskobu altında 40X büyütmede birbirinden habersiz iki araştırmacı tarafından rastgele beş alan seçildi ve bu alanlar içinde hücrelerin boyanma yoğunluğuna göre [0 (boyanma yok), +1 (zayıf, fakat tespit edilebilir boyanma), +2 ( orta şiddetli boyanma) ve +3 (yoğun boyanma)] hücre sayımı yapıldı. Hesaplama için HSCORE formulü kullanıldı [∑Pi(i+ l): i boyanma yoğunluğu skorunu, Pi boyanan hücrelerin yüzdesini gösterir]. İki gözlemcinin hesapladığı skorların ortalaması alındı ve HSCORE değerleri grafikle gösterildi.
İstatiksel değerlendirmeler SigmaStat versiyon 3.5 (Jandel Scientific Corp., San Rafael, CA) kullanılarak ve anlamlılık p< 0.05 olarak değerlendirilmiştir. Fertil ve infertil hasta gruplarında ortaya çıkabilecek muhtemel farklılıklar karşılaştırmalı testler (ANOVA, t-test) ve korelasyon regresyon analizleri (Pearson, Spearman) ile değerlendirildi.
BULGULAR
4.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP ekspresyonun belirlenmesi
İmmunositokimyasal işlemler sonrası fertil ve infertil bireylerden elde edilen sperm yaymalarında p97/VCP proteininin sperm hücrelerinde lokalizasyonu belirlendi (Şekil 4.1.1). Yapılan immusitokimyasal işaretlemeler sonrası, p97/VCP’nin özellikle baş, boyun ve kuyruk bölgelerinde değişik yüzdelerde lokalize olduğu belirlendi (Şekil 4.1.1).
Şekil 4.1.1: İnfertil bireye ait semen yaymasında p97/VCP immunopozitif işaretli spermler. p97/VCP’nin baş, boyun ve kuyruk bölgelerindeki immunolokalizasyonu izlenmektedir.
4.2. İnfertil ve fertil bireylerdeki p97/VCP pozitivite yüzdelerinin karşılaştırılması Fertil ve infertil bireylerdeki p97/VCP pozitif hücrelerin yüzdeleri karşılaştırıldığında infertil bireylerde anlamlı derecede p97/VCP pozitif hücrelerin yüzdelerinin artmış olduğu saptandı (Şekil 4.2.1).
Şekil 4.2.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP immunpozitivitesinin karşılaştırılması. Fertil bireylerde p97/VCP immuno ekspresyonunun infertil bireylere göre anlamlı derecede az olduğu görüldü. (yıldız: p<0,001).
4.3. p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm konsantrasyonu ile ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.3.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm konsantrasyonu ile ters orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm konsantrasyonu yüksek olan hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu saptanmıştır.
Şekil 4.3.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm konsantrasyonu arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.4. p97/VCP ekspresyonunun sperm motilitesi ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm motilitesi ile ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.4.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm motilitesi ile ters orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm motilitesi yüksek olan hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu saptanmıştır (Şekil 4.4.1).
Şekil 4.4.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm motilitesi arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.5. p97/VCP ekspresyonunun sperm morfolojisi ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm morfolojisi ile ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.5.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm morfolojisi ile ters orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm morfolojisi iyi olan hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu saptanmıştır (Şekil 4.5.1).
Şekil 4.5.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm morfolojisi arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.6. p97/VCP ekspresyonunun ve semen parametreleri
Çalışmamızda kullandığımız fertile ve infertil bireyler için 20’şer hastaya ait semen parametreleri (konsantrasyon, motilite, morfoloji) ve hasta yaşı değerleri tablo 4.6.1’de gösterilmiştir.
Tablo 4.6.1: Fertil ve infertil hastalarda semen parametreleri
FERTİL (n:20)
İNFERTİL (n:20)
Sperm konsantrasyonu
(x106) 132,6 32,6
Motilite (%) 68,7 33,7
İleri motil sperm (%) 62,2 25,5
Normal morfoloji (%) 91 58
Yaş 29,2 28,8
TARTIŞMA
Çalışmamız, fertil ve infertil bireylerde UPS proteinlerinden p97/VCP’nin sperm hücrelerinde lokalizasyonunu ve p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile ilişkisini incelemektedir. p97/VCP’nin insan sperminde ilk defa ekspresyonunun gösterilmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile ilişkisinin olup olmadığının incelenmesi nedeniyle orijinal bulgular içermektedir. Bu projede kullanılan temel metod immunositokimyadır.
Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP’nin sperm baş, boyun ve kuyruk bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/VCP’nin fertil bireylere göre ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/VCP’nin erkek infertilitesi değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir.
Bugüne kadar p97/VCP’nin sperm hücresindeki fonksiyonları ile ilgili yapılan çalışmalar çok azdır (Kondoh ve arkd.,2008; Hozumi ve arkd., 2008; Ficarro ve arkd., 2003). Bu çalışmalarda da direk insan spermindeki fonksiyonu tam olarak belirlenememiştir. Yalnız, Ficarro ve arkd., 2008 kapasite olmuş insan sperminde yaptıkları kütle spektrometrisi çalışmalarında p97/VCP’nin sperm kapasitasyonu sırasında fosforile olduğunu göstermişlerdir. Yine bu çalışmada, kapasite olmuş ve olmamış sperm hücrelerinde p97/VCP’nin lokalizasyonu belirlenmiştir. Örneğin kapasite olmamış spermlerde, p97/VCP spermin boyun bölgesinde lokalize iken, kapasitasyon sonrası bu lokalizasyonun değiştiği ve sperm başında görülmeye başlandığı saptanmıştır (Ficarro ve arkd., 2003). Kapasitasyon memeli sperminin fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gereklidir. Bu olay sırasında birçok proteinin tirozin kuyruları fosforile olur ve spermin hareketinin arttığı gözlenmiştir. Kapasitasyon akrozomal reaksiyon içinde gereklidir. Bu derece fertilizasyon için önemli bir olayda p97/VCP’nin de fosforile olduğunu bilmek, bu proteinin kapasitasyon için ne kadar önemli bir protein olduğunu göstermektedir. Biz de çalışmamızda sperm hücrelerinde p97/VCP’nin özellikle de baş ve kuyruk bölgelerinde var olduğunun gösterilmesiyle Ficarro ve arkadaşlarını destelemiş olduk.
Kondoh ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, p97/VCP’nin bir deniz hayvanı spermlerinde değil de, spermi ovosite çeken kemoatraktan bir madde olan sperm aktive edici faktör (SAAF)’e bağlandığı belirlenmiştir (Kondoh ve arkd.,2008). p97/VCP’nin başlangıçta germinal vesikül aşamasındaki ovositte lokalize olduğu ve oosit olgunlaşması için gerekli olduğu bulunmuştur. Yine aynı çalışmada, p97/VCP’nin yumurtadan salınan SAAF denilen faktörün çalışmasını düzenlediği ortaya çıkarılmıştır.
p97/VCP’nin siliar ve flagellar hareket için gerekli olduğu başka bir çalışmada gösterilmiştir (Hozümi ve arkd., 2008). Yalnız bu çalışma yine insan sperminde değil, deniz hayvanı sperminde siliar hareket için gerekli olan proteinlerin araştırılması sırasında p97/VCP’nin gerekliliğini ortaya koymuştur. Bizim çalışmalarımızla uyumlu olarak bu çalışmada da sperm kuyruğunda p97/VCP’nin görülmesi, p97/VCP’nin sperm hareketliliği ile ilişkisi olabileceğini göstermektedir.
SONUÇLAR
Sonuç olarak, bu çalışma ile;
1- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerde sperm hücrelerindeki lokalizasyonları
2- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerdeki farklı ekspresyonu
3- p97/VCP’nin, sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi ile negatif yönde olan etkileşimi
4- p97/VCP’nin yapılan lokalizasyon çalışmalarına dayanarak fertil bireylerde özellikle sperm kuyruğunda positivitesinin saptanması, p97/VCP’nin sperm hareketliliği ile ilişkili olduğunu ortaya konulmuştur.
Tüm bu sonuçlar ışığında, protein yıkımı ve übikütin protazom sisteminin birçok hücre yolağındaki çalışan p97/VCP’nin önemi düşünüldüğünde, bu çalışmada ortaya konulan sonuçlar ile p97/VCP’nin erkek infertilitesi için önemli bir belirteç olabileceği ortaya konulmuştur.
KAYNAKLAR
Aravind, L., Ponting, C.P., 1998. Homologues of 26S proteasome subunits are regulators of transcription and translation. Protein Sci 7, 1250-1254.
Bounpheng, M.A., Melnikova, I.N., Dodds, S.G., Chen, H., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Christy, B.A., Characterization of the mouse JAB1 cDNA and protein. Gene 2000, 242:41-50.
Braun, S., Matuschewski, K., Rape, M., Thoms, S., Jentsch, S., 2002. Role of the ubiquitin-selective CDC48(UFD1/NPL4) chaperone (segregase) in ERAD of OLE1 and other substrates. Embo J 21, 615-621.
Cao, K., Nakajima, R., Meyer, H.H., Zheng, Y., 2003. The AAA-ATPase Cdc48/p97 regulates spindle disassembly at the end of mitosis. Cell 115, 355-367.
Cao, K., Zheng, Y., 2004. The Cdc48/p97-Ufd1-Npl4 complex: its potential role in coordinating cellular morphogenesis during the M-G1 transition. Cell Cycle 3, 422-424. Cayli,S., Ocakli, S., Erdemir, F, Tas, U., Aslan, H., Yener, T., Karaca, Z., 2011. Developmental expression of p97/VCP (Valosin containing protein) and Jab1/CSN5 in the rat testis and epididymis. Reproductive Biology and Endocrinology 9, 117.
Cayli, S., Erdemir, F., Ocaklı, S., Ungor, B., Kesici, H., Yener, T., Aslan, H., 2012. Interaction between Smad1 and p97/VCP in rat testis and epididymis during the postnatal development. Reproductive Sciences. 19(2), 190-201.
Clermont, Y., Perey, B., 1957. Quantitative study of the cell population of the seminiferous tubules in immature rats. Am J Anat, 100:241-267.
Cronan, J.E., Jr., 1990. Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to label, purify, and study proteins. J Biol Chem 265, 10327-10333.
Dai, R.M., Chen, E., Longo, D.L., Gorbea, C.M., Li, C.C., 1998. Involvement of valosin-containing protein, an ATPase Co-purified with IkappaBalpha and 26 S proteasome, in ubiquitin-proteasome-mediated degradation of IkappaBalpha. J Biol Chem 273, 3562-3573. Dai, R.M., Li, C.C., 2001. Valosin-containing protein is a multi-ubiquitin chain-targeting factor required in ubiquitin-proteasome degradation. Nat Cell Biol 3, 740-744.
Delilbaşı, L., 1997. Tüp Bebek-Yardımcı Üreme Tekniklerinde Laboratuar Yöntemleri.Bayındır Sağlık, Eğitim ve Araştırma Vakfı, Ankara.
Duru, NK., 1998. Subfertil ve İnfertil Sperm Parametreleri. GATA Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Notları Ankara.
Ebisawa T, Fukuchi M, Murakami G, et al. Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation. J Biol Chem. 2001;276(16):12477-12480.
Enginsu, E., Günalp, S., Orhon, E., 1995. Sperm Morfoloji Atlası. Türkiye İnfertilite Vakfı Yayınları No :4, Yılmaz Ofset.
Ficarro,S., Chertihin, A., Westbrook, A., White, F., Jayes, F., Kalab, F., Marto, JA., Shabanowitz, J., Herr,JC., Hunt, D.F and Visconti, PE., 2003; 278 (13): 11579–11589. Frohlich, K.U., Fries, H.W., Rudiger, M., Erdmann, R., Botstein, D., Mecke, D., 1991. Yeast cell cycle protein CDC48p shows full-length homology to the mammalian protein VCP and is a member of a protein family involved in secretion, peroxisome formation, and gene expression. J Cell Biol 114, 443-453.
Ghislain, M., Dohmen, R.J., Levy, F., Varshavsky, A., 1996. Cdc48p interacts with Ufd3p, a WD repeat protein required for ubiquitin-mediated proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J 15, 4884-4899.
Glickman, M.H., Rubin, D.M., Fried, V.A., Finley, D., 1998. The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome. Mol Cell Biol 18, 3149-3162.
Günalp, S., 2004. Kadın Doğum Hekiminin Erkek Faktörünün Araştırılması ve Değerlendirilmesindeki Rolü Ne Olmalıdır? Türk Jinekoloji ve Obstetrik Derneği Uzmanlık Sonrası Eğitim Dergisi, 729:129-140.
Hartmann-Petersen, R., Wallace, M., Hofmann, K., Koch, G., Johnsen, A.H., Hendil, K.B., Gordon, C., 2004. The Ubx2 and Ubx3 cofactors direct Cdc48 activity to proteolytic and nonproteolytic ubiquitin-dependent processes. Curr Biol 14, 824-828.
Henke, W., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Seeger, M., Schade, R., Jungblut, P., Naumann, M., Dubiel, W., 1999. Comparison of human COP9 signalsome and 26S proteasome lid'. Mol Biol Rep 26, 29-34.
Hitchcock, A.L., Krebber, H., Frietze, S., Lin, A., Latterich, M., Silver, P.A., 2001. The conserved npl4 protein complex mediates proteasome-dependent membrane-bound transcription factor activation. Mol Biol Cell 12, 3226-3241.
Hozumi, A., Padma, P., Toda, T.,Ide, H., Inaba, K., 2008. Molecular Characterization of Axonemal Proteins and Signaling Molecules Responsible for Chemoattractant-Induced Sperm Activation in Ciona intestinalis. Cell Motility and the Cytoskeleton 65, 249–267.
Hutchison, G.R., Scott, H.M., Walker, M., McKinnell, C., Ferrara, D., Mahood, I.K., Sharpe, R.M., 2008. Sertoli cell development and function in an animal model of testicular dysgenesis syndrome. Biol Reprod 78, 352-360.
Irvine SD., 1996. Glutathione as a treatment for male infertility. Rev of Reprod.;1:6-12. Işık., AZ, Vicdan, K., 1999. İn Vitro Fertilizasyon Uygulamalarında Laboratuar. Çağdaş Medikal Ankara
Jarosch, E., Taxis, C., Volkwein, C., Bordallo, J., Finley, D., Wolf, D.H., Sommer, T., 2002. Protein dislocation from the ER requires polyubiquitination and the AAA-ATPase Cdc48. Nat Cell Biol 4, 134-139.
Jentsch, S., Rumpf, S., 2007. Cdc48 (p97): a "molecular gearbox" in the ubiquitin pathway? Trends Biochem Sci 32, 6-11.
Jung, H., Kim, T., Chae, H.Z., Kim, K.T., Ha, H., 2001. Regulation of macrophage migration inhibitory factor and thiol-specific antioxidant protein PAG by direct interaction. J Biol Chem 276, 15504-15510.
Karhausen, J., Haase, V.H., Colgan, S.P., 2005. Inflammatory hypoxia: role of hypoxia-inducible factor. Cell Cycle 4, 256-258.
Kim, B.C., Lee, H.J., Park, S.H., Lee, S.R., Karpova, T.S., McNally, J.G., Felici, A., Lee, D.K., Kim, S.J., 2004. Jab1/CSN5, a component of the COP9 signalosome, regulates transforming growth factor beta signaling by binding to Smad7 and promoting its degradation. Mol Cell Biol 24, 2251-2262.
Kondo, H., Rabouille, C., Newman, R., Levine, T.P., Pappin, D., Freemont, P., Warren, G., 1997. p47 is a cofactor for p97-mediated membrane fusion. Nature 388, 75-78.
Kondoh, E., Konno, A., Inaba, K., Oishi,T., Murata, M.,Yoshida, M., 2008. Valosin-containing protein/p97 interacts with sperm-activating and sperm-attracting factor (SAAF) in the ascidian egg and modulates sperm-attracting activity Develop. Growth Differ. 50, 665–673.
Koong, A.C., Denko, N.C., Hudson, K.M., Schindler, C., Swiersz, L., Koch, C., Evans, S., Ibrahim, H., Le, Q.T., Terris, D.J., Giaccia, A.J., 2000. Candidate genes for the hypoxic tumor phenotype. Cancer Res 60, 883-887.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lens, JW., 1996. The Spermatozoon. Bras M, Lens JW, Piederiet MH, IVF lab-Laboratory aspects of in vitro fertilization, Organon pres.
