p97/VCP ekspresyonunun ve semen parametreler

Çalışmamızda kullandığımız fertile ve infertil bireyler için 20’şer hastaya ait semen parametreleri (konsantrasyon, motilite, morfoloji) ve hasta yaşı değerleri tablo 4.6.1’de gösterilmiştir.

Tablo 4.6.1: Fertil ve infertil hastalarda semen parametreleri

FERTİL (n:20)

İNFERTİL (n:20)

Sperm konsantrasyonu

(x106) 132,6 32,6

Motilite (%) 68,7 33,7

İleri motil sperm (%) 62,2 25,5

Normal morfoloji (%) 91 58

Yaş 29,2 28,8

TARTIŞMA

Çalışmamız, fertil ve infertil bireylerde UPS proteinlerinden p97/VCP’nin sperm hücrelerinde lokalizasyonunu ve p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile ilişkisini incelemektedir. p97/VCP’nin insan sperminde ilk defa ekspresyonunun gösterilmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile ilişkisinin olup olmadığının incelenmesi nedeniyle orijinal bulgular içermektedir. Bu projede kullanılan temel metod immunositokimyadır.

Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP’nin sperm baş, boyun ve kuyruk bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/VCP’nin fertil bireylere göre ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/VCP’nin erkek infertilitesi değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir.

Bugüne kadar p97/VCP’nin sperm hücresindeki fonksiyonları ile ilgili yapılan çalışmalar çok azdır (Kondoh ve arkd.,2008; Hozumi ve arkd., 2008; Ficarro ve arkd., 2003). Bu çalışmalarda da direk insan spermindeki fonksiyonu tam olarak belirlenememiştir. Yalnız, Ficarro ve arkd., 2008 kapasite olmuş insan sperminde yaptıkları kütle spektrometrisi çalışmalarında p97/VCP’nin sperm kapasitasyonu sırasında fosforile olduğunu göstermişlerdir. Yine bu çalışmada, kapasite olmuş ve olmamış sperm hücrelerinde p97/VCP’nin lokalizasyonu belirlenmiştir. Örneğin kapasite olmamış spermlerde, p97/VCP spermin boyun bölgesinde lokalize iken, kapasitasyon sonrası bu lokalizasyonun değiştiği ve sperm başında görülmeye başlandığı saptanmıştır (Ficarro ve arkd., 2003). Kapasitasyon memeli sperminin fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gereklidir. Bu olay sırasında birçok proteinin tirozin kuyruları fosforile olur ve spermin hareketinin arttığı gözlenmiştir. Kapasitasyon akrozomal reaksiyon içinde gereklidir. Bu derece fertilizasyon için önemli bir olayda p97/VCP’nin de fosforile olduğunu bilmek, bu proteinin kapasitasyon için ne kadar önemli bir protein olduğunu göstermektedir. Biz de çalışmamızda sperm hücrelerinde p97/VCP’nin özellikle de baş ve kuyruk bölgelerinde var olduğunun gösterilmesiyle Ficarro ve arkadaşlarını destelemiş olduk.

Kondoh ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, p97/VCP’nin bir deniz hayvanı spermlerinde değil de, spermi ovosite çeken kemoatraktan bir madde olan sperm aktive edici faktör (SAAF)’e bağlandığı belirlenmiştir (Kondoh ve arkd.,2008). p97/VCP’nin başlangıçta germinal vesikül aşamasındaki ovositte lokalize olduğu ve oosit olgunlaşması için gerekli olduğu bulunmuştur. Yine aynı çalışmada, p97/VCP’nin yumurtadan salınan SAAF denilen faktörün çalışmasını düzenlediği ortaya çıkarılmıştır.

p97/VCP’nin siliar ve flagellar hareket için gerekli olduğu başka bir çalışmada gösterilmiştir (Hozümi ve arkd., 2008). Yalnız bu çalışma yine insan sperminde değil, deniz hayvanı sperminde siliar hareket için gerekli olan proteinlerin araştırılması sırasında p97/VCP’nin gerekliliğini ortaya koymuştur. Bizim çalışmalarımızla uyumlu olarak bu çalışmada da sperm kuyruğunda p97/VCP’nin görülmesi, p97/VCP’nin sperm hareketliliği ile ilişkisi olabileceğini göstermektedir.

SONUÇLAR

Sonuç olarak, bu çalışma ile;

1- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerde sperm hücrelerindeki lokalizasyonları

2- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerdeki farklı ekspresyonu

3- p97/VCP’nin, sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi ile negatif yönde olan etkileşimi

4- p97/VCP’nin yapılan lokalizasyon çalışmalarına dayanarak fertil bireylerde özellikle sperm kuyruğunda positivitesinin saptanması, p97/VCP’nin sperm hareketliliği ile ilişkili olduğunu ortaya konulmuştur.

Tüm bu sonuçlar ışığında, protein yıkımı ve übikütin protazom sisteminin birçok hücre yolağındaki çalışan p97/VCP’nin önemi düşünüldüğünde, bu çalışmada ortaya konulan sonuçlar ile p97/VCP’nin erkek infertilitesi için önemli bir belirteç olabileceği ortaya konulmuştur.

KAYNAKLAR

Aravind, L., Ponting, C.P., 1998. Homologues of 26S proteasome subunits are regulators of transcription and translation. Protein Sci 7, 1250-1254.

Bounpheng, M.A., Melnikova, I.N., Dodds, S.G., Chen, H., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Christy, B.A., Characterization of the mouse JAB1 cDNA and protein. Gene 2000, 242:41-50.

Braun, S., Matuschewski, K., Rape, M., Thoms, S., Jentsch, S., 2002. Role of the ubiquitin- selective CDC48(UFD1/NPL4) chaperone (segregase) in ERAD of OLE1 and other substrates. Embo J 21, 615-621.

Cao, K., Nakajima, R., Meyer, H.H., Zheng, Y., 2003. The AAA-ATPase Cdc48/p97 regulates spindle disassembly at the end of mitosis. Cell 115, 355-367.

Cao, K., Zheng, Y., 2004. The Cdc48/p97-Ufd1-Npl4 complex: its potential role in coordinating cellular morphogenesis during the M-G1 transition. Cell Cycle 3, 422-424. Cayli,S., Ocakli, S., Erdemir, F, Tas, U., Aslan, H., Yener, T., Karaca, Z., 2011. Developmental expression of p97/VCP (Valosin containing protein) and Jab1/CSN5 in the rat testis and epididymis. Reproductive Biology and Endocrinology 9, 117.

Cayli, S., Erdemir, F., Ocaklı, S., Ungor, B., Kesici, H., Yener, T., Aslan, H., 2012. Interaction between Smad1 and p97/VCP in rat testis and epididymis during the postnatal development. Reproductive Sciences. 19(2), 190-201.

Clermont, Y., Perey, B., 1957. Quantitative study of the cell population of the seminiferous tubules in immature rats. Am J Anat, 100:241-267.

Cronan, J.E., Jr., 1990. Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to label, purify, and study proteins. J Biol Chem 265, 10327-10333.

Dai, R.M., Chen, E., Longo, D.L., Gorbea, C.M., Li, C.C., 1998. Involvement of valosin- containing protein, an ATPase Co-purified with IkappaBalpha and 26 S proteasome, in ubiquitin-proteasome-mediated degradation of IkappaBalpha. J Biol Chem 273, 3562-3573. Dai, R.M., Li, C.C., 2001. Valosin-containing protein is a multi-ubiquitin chain-targeting factor required in ubiquitin-proteasome degradation. Nat Cell Biol 3, 740-744.

Delilbaşı, L., 1997. Tüp Bebek-Yardımcı Üreme Tekniklerinde Laboratuar Yöntemleri.Bayındır Sağlık, Eğitim ve Araştırma Vakfı, Ankara.

Duru, NK., 1998. Subfertil ve İnfertil Sperm Parametreleri. GATA Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Notları Ankara.

Ebisawa T, Fukuchi M, Murakami G, et al. Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation. J Biol Chem. 2001;276(16):12477-12480.

Enginsu, E., Günalp, S., Orhon, E., 1995. Sperm Morfoloji Atlası. Türkiye İnfertilite Vakfı Yayınları No :4, Yılmaz Ofset.

Ficarro,S., Chertihin, A., Westbrook, A., White, F., Jayes, F., Kalab, F., Marto, JA., Shabanowitz, J., Herr,JC., Hunt, D.F and Visconti, PE., 2003; 278 (13): 11579–11589. Frohlich, K.U., Fries, H.W., Rudiger, M., Erdmann, R., Botstein, D., Mecke, D., 1991. Yeast cell cycle protein CDC48p shows full-length homology to the mammalian protein VCP and is a member of a protein family involved in secretion, peroxisome formation, and gene expression. J Cell Biol 114, 443-453.

Ghislain, M., Dohmen, R.J., Levy, F., Varshavsky, A., 1996. Cdc48p interacts with Ufd3p, a WD repeat protein required for ubiquitin-mediated proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J 15, 4884-4899.

Glickman, M.H., Rubin, D.M., Fried, V.A., Finley, D., 1998. The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome. Mol Cell Biol 18, 3149-3162.

Günalp, S., 2004. Kadın Doğum Hekiminin Erkek Faktörünün Araştırılması ve Değerlendirilmesindeki Rolü Ne Olmalıdır? Türk Jinekoloji ve Obstetrik Derneği Uzmanlık Sonrası Eğitim Dergisi, 729:129-140.

Hartmann-Petersen, R., Wallace, M., Hofmann, K., Koch, G., Johnsen, A.H., Hendil, K.B., Gordon, C., 2004. The Ubx2 and Ubx3 cofactors direct Cdc48 activity to proteolytic and nonproteolytic ubiquitin-dependent processes. Curr Biol 14, 824-828.

Henke, W., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Seeger, M., Schade, R., Jungblut, P., Naumann, M., Dubiel, W., 1999. Comparison of human COP9 signalsome and 26S proteasome lid'. Mol Biol Rep 26, 29-34.

Hitchcock, A.L., Krebber, H., Frietze, S., Lin, A., Latterich, M., Silver, P.A., 2001. The conserved npl4 protein complex mediates proteasome-dependent membrane-bound transcription factor activation. Mol Biol Cell 12, 3226-3241.

Hozumi, A., Padma, P., Toda, T.,Ide, H., Inaba, K., 2008. Molecular Characterization of Axonemal Proteins and Signaling Molecules Responsible for Chemoattractant-Induced Sperm Activation in Ciona intestinalis. Cell Motility and the Cytoskeleton 65, 249–267.

Hutchison, G.R., Scott, H.M., Walker, M., McKinnell, C., Ferrara, D., Mahood, I.K., Sharpe, R.M., 2008. Sertoli cell development and function in an animal model of testicular dysgenesis syndrome. Biol Reprod 78, 352-360.

Irvine SD., 1996. Glutathione as a treatment for male infertility. Rev of Reprod.;1:6-12. Işık., AZ, Vicdan, K., 1999. İn Vitro Fertilizasyon Uygulamalarında Laboratuar. Çağdaş Medikal Ankara

Jarosch, E., Taxis, C., Volkwein, C., Bordallo, J., Finley, D., Wolf, D.H., Sommer, T., 2002. Protein dislocation from the ER requires polyubiquitination and the AAA-ATPase Cdc48. Nat Cell Biol 4, 134-139.

Jentsch, S., Rumpf, S., 2007. Cdc48 (p97): a "molecular gearbox" in the ubiquitin pathway? Trends Biochem Sci 32, 6-11.

Jung, H., Kim, T., Chae, H.Z., Kim, K.T., Ha, H., 2001. Regulation of macrophage migration inhibitory factor and thiol-specific antioxidant protein PAG by direct interaction. J Biol Chem 276, 15504-15510.

Karhausen, J., Haase, V.H., Colgan, S.P., 2005. Inflammatory hypoxia: role of hypoxia- inducible factor. Cell Cycle 4, 256-258.

Kim, B.C., Lee, H.J., Park, S.H., Lee, S.R., Karpova, T.S., McNally, J.G., Felici, A., Lee, D.K., Kim, S.J., 2004. Jab1/CSN5, a component of the COP9 signalosome, regulates transforming growth factor beta signaling by binding to Smad7 and promoting its degradation. Mol Cell Biol 24, 2251-2262.

Kondo, H., Rabouille, C., Newman, R., Levine, T.P., Pappin, D., Freemont, P., Warren, G., 1997. p47 is a cofactor for p97-mediated membrane fusion. Nature 388, 75-78.

Kondoh, E., Konno, A., Inaba, K., Oishi,T., Murata, M.,Yoshida, M., 2008. Valosin- containing protein/p97 interacts with sperm-activating and sperm-attracting factor (SAAF) in the ascidian egg and modulates sperm-attracting activity Develop. Growth Differ. 50, 665–673.

Koong, A.C., Denko, N.C., Hudson, K.M., Schindler, C., Swiersz, L., Koch, C., Evans, S., Ibrahim, H., Le, Q.T., Terris, D.J., Giaccia, A.J., 2000. Candidate genes for the hypoxic tumor phenotype. Cancer Res 60, 883-887.

Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Lens, JW., 1996. The Spermatozoon. Bras M, Lens JW, Piederiet MH, IVF lab-Laboratory aspects of in vitro fertilization, Organon pres.

Lin X, Liang M, Feng XH. Smurf2 is a ubiquitin E3 ligase mediating proteasome- dependent degradation of Smad2 in transforming growth factor-beta signaling. J Biol Chem. 2000;275(47): 36818-36822.

Lyapina, S., Cope, G., Shevchenko, A., Serino, G., Tsuge, T., Zhou, C., Wolf, D.A., Wei, N., Deshaies, R.J., 2001. Promotion of NEDD-CUL1 conjugate cleavage by COP9 signalosome. Science 292, 1382-1385.

Maurizi, M.R., Li, C.C., 2001. AAA proteins: in search of a common molecular basis. International Meeting on Cellular Functions of AAA Proteins. EMBO Rep 2, 980-985.

Maytal-Kivity, V., Reis, N., Hofmann, K., Glickman, M.H., 2002. MPN+, a putative catalytic motif found in a subset of MPN domain proteins from eukaryotes and prokaryotes, is critical for Rpn11 function. BMC Biochem 3, 28.

Meusser, B., Hirsch, C., Jarosch, E., Sommer, T., 2005. ERAD: the long road to destruction. Nat Cell Biol 7, 766-772.

Meyer, H.H., Wang, Y., Warren, G., 2002. Direct binding of ubiquitin conjugates by the mammalian p97 adaptor complexes, p47 and Ufd1-Npl4. Embo J 21, 5645-5652.

Neuwald, A.F., Aravind, L., Spouge, J.L., Koonin, E.V., 1999. AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9, 27-43.

Ogura, T., Wilkinson, A.J., 2001. AAA+ superfamily ATPases: common structure--diverse function. Genes Cells 6, 575-597.

Pickart, C.M., 2001a. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70, 503- 533.

Pickart, C.M., 2001b. Ubiquitin enters the new millennium. Mol Cell 8, 499-504.

Pickart, C.M., Cohen, R.E., 2004. Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 177-187.

Richly, H., Rape, M., Braun, S., Rumpf, S., Hoege, C., Jentsch, S., 2005. A series of ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation and proteasomal targeting. Cell 120, 73-84.

Santoro, M.G., Rossi, A., Amici, C., 2003. NF-kappaB and virus infection: who controls whom. Embo J 22, 2552-2560.

Sakai, Y., Nakamoto, T., Yamashina, S., 1988. Dynamic changes in Sertoli cell processes invading spermatid cytoplasm during mouse spermiogenesis. Anat Rec 220, 51-57.

Schnell, J.D., Hicke, L., 2003. Non-traditional functions of ubiquitin and ubiquitin-binding proteins. J Biol Chem 278, 35857-35860.

Schuberth, C., Richly, H., Rumpf, S., Buchberger, A., 2004. Shp1 and Ubx2 are adaptors of Cdc48 involved in ubiquitin-dependent protein degradation. EMBO Rep 5, 818-824.

Seeger, M., Kraft, R., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Dumdey, R., Schade, R., Gordon, C., Naumann, M., Dubiel, W., 1998. A novel protein complex involved in signal transduction possessing similarities to 26S proteasome subunits. Faseb J 12, 469-478.

Setchell, BP., Maddocks, S., 1994. The Male Reproductive System. Knobil E, Neill JD. The Physiology of Reproduction. Raven Pres, Ltd. New York,:1063-1175.

Vale, R.D., 2000. AAA proteins. Lords of the ring. J Cell Biol 150, F13-19.

Vandermoere, F., El Yazidi-Belkoura, I., Slomianny, C., Demont, Y., Bidaux, G., Adriaenssens, E., Lemoine, J., Hondermarck, H., 2006. The valosin-containing protein (VCP) is a target of Akt signaling required for cell survival. J Biol Chem 281, 14307- 14313.

Wang, Q., Song, C., Li, C.C., 2004. Molecular perspectives on p97-VCP: progress in understanding its structure and diverse biological functions. J Struct Biol 146, 44-57. Wojcik, C., Yano, M., DeMartino, G.N., 2004. RNA interference of valosin-containing protein (VCP/p97) reveals multiple cellular roles linked to ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis. J Cell Sci 117, 281-292.

Ye, Y., Meyer, H.H., Rapoport, T.A., 2001. The AAA ATPase Cdc48/p97 and its partners transport proteins from the ER into the cytosol. Nature 414, 652-656.

Zwickl, P., Baumeister, W., 1999. AAA-ATPases at the crossroads of protein life and death. Nat Cell Biol 1, E97-98.