DEN ZL BÖLGES NDE KAN DONÖRLER NDE
BARTONELLA HENSELAE SEROPREVALANSININ
ARA TIRILMASI
UZMANLIK TEZ
Dr. CANSEV YILMAZ
TEZ DANI MANI
Doç. Dr. ÇA RI ERG N
DEN ZL -2008
T.C.PAMUKKALE ÜN VERS TES TIP FAKÜLTES
M KROB YOLOJ VE KL N K M KROB YOLOJ ANAB L M DALI
DEN ZL BÖLGES NDE KAN DONÖRLER NDE
BARTONELLA HENSELAE SEROPREVALANSININ
ARA TIRILMASI
UZMANLIK TEZ
Dr. CANSEV YILMAZ
TEZ DANI MANI
Doç. Dr. ÇA RI ERG N
DEN ZL -2008
T.C.PAMUKKALE ÜN VERS TES TIP FAKÜLTES
M KROB YOLOJ VE KL N K M KROB YOLOJ ANAB L M DALI
TE EKKÜR
Asistanl+,+m süresince bilgi ve deneyimleri ile yol gösteren tez dan+8man+m say+n Doç. Dr. Ça,r+ Ergin’e;
Deneyimlerinden faydaland+,+m Mikrobiyoloji Anabilim Dal+ Ba8kan+ say+n Prof. Dr. lknur Kaleli’ye, deneyimlerini ve bilgisini her f+rsatta bizimle payla8an say+n Yrd. Doç. Dr. Mustafa engül’e, deneyimleriyle destek olmaya çal+8an say+n Yrd. Doç. Dr. Nural Cevahir, Yrd. Doç. Dr. Melek Demir, Yrd. Doç. Dr. Ergun Mete’ye, de,erli bilgileri ile bizi ayd+nlatan Prof. Dr. Hüseyin Turgut’a, tez çal+8mam s+ras+nda deste,ini esirgemeyen say+n Dr. Eva Hjelm, Doç. Dr. Candan Çiçek, Dr. N. Lale Tufan ve Dr. A. Çevik Tufan’a, her an deste,ini hissetti,im y+lmaz dostum say+n Dr. Yüksel Akkaya’ya, de,erli arkada8lar+m say+n Dr. Sevgi Y+lmaz Hanc+, Dr. Rasim ahin, Dr. Umut Y+ld+r+m, Dr. Yusuf Polat, Dr. Özgün Kiri8 Sat+lm+8, Dr. Ay8e Burcu Çam’a, desteklerini içtenlikle hissetti,im say+n Dr. Sefa Gez ve Kan Bankas+ çal+8anlar+na, fakülte sekreterimiz say+n Muammer Güngör Erdo,an’a;
Mesaimizi payla8t+,+m+z say+n Dr. Habibe Övet, Dr. Melahat Gürbüz, Dr. Ebru Tepeli, Dr. Soner Tikve8li, Nilgün Ar+kan, Nesrin Bulu8, Hikmet Da,, Musa Ar+kan, Yasemin anal, Alev Çelik, Tu,ba Kartal, Utku Ta8ç+, Mustafa Uysal, Nergiz Keskin, Kubilay Taylan, brahim Ç+rnaz, Mikrobiyoloji Laboratuvar+’n+n di,er çal+8anlar+na ve ad+n+ yazamad+,+m yüre,inde ‘’insana davranma stratejisi olmayan’’ herkese te8ekkürlerimi sunuyorum.
En de,erli varl+klar+m, hayat+m boyunca deste,ini her durumda esirgemeyen, bana içtenli,i, dürüstlü,ü ve aç+k kalplili,i ö,reten, emeklerine minnettar oldu,um annem enay Y+lmaz, babam Abdullah Y+lmaz ve can+m karde8im Can Y+lmaz’a en içten sevgilerimi ve te8ekkürlerimi sunuyorum.
Ç NDEK LER
G R ……….. 1
GENELB LG LER……….……… 2
BARTONELLA TÜRLER N N TAKSONOM S ………... 2
BARTONELLA TÜRLER N N EP DEM YOLOJ S ………... 4
BARTONELLA HENSELAE’NIN KL N K BEL RT LER ………... 9
KED TIRMI I HASTALI I……… 9
ATE VE BAKTEREM ………... 11
ENDOKARD T……….. 11
PEL YOZ………... 12
BAS LLER ANJ YOMATOZ………... 12
BARTONELLA HENSELAE VE D ER BARTONELLA TÜRLER N N TESP T , ZOLASYONU VE TANIMLANMASI………….. 13
ÖRNEK T PLER ……….. 13
MORFOLOJ VE BOYANMA ÖZELL KLER ………... 14
KÜLTÜR……….. 14
GRAM BOYAMA VE KOLON MORFOLOJ S ………. 16
TANIMLAMA YÖNTEMLER ……… 16
B YOK MYASAL TESTLER………. 17
GAZ-L K D KROMOTOGRAF S ………. 18 MOLEKÜLER YÖNTEMLER……… 18 SEROLOJ K TANI……….. 19 MMÜNOFLUORESANS YÖNTEM………. 21 ENZ M- MMÜN ASSAY……… 23 H STOPATOLOJ K TANI……….. 23
NV TRO ANT M KROB YAL DUYARLILIK………. 23
GEREÇ VE YÖNTEM……….. 25
ÇALI MA GRUBUNUN OLU TURULMASI………... 25
TEST LAMLARININ OLU TURULMASI……… 26
BAKTER KÖKENLER N N CANLANDIRILMASI………... 26
VERO VE HELA HÜCRE KÜLTÜRLER N N KOKÜLTÜVASYONU… 27 ANT JENLER N NAKT VASYONU VE TEFLON LAMLARA KAPLANMASI………... 28
ND REKT FLUORESANS ANT KOR TEKN LE ANT KOR SAPTANMASI……….. 29
FLUORESANS M KROSKOP LE DE ERLEND RME……… 30
BULGULAR……….. 34 TARTI MA……… 47 SONUÇLAR………... 60 ÖZET……….. 62 YABANCI D L ÖZET ……….. 64 KAYNAKLAR………... 66
TABLOLAR Ç ZELGES
Tablo-1 : Baz+ Bartonella türlerinin epidemiyolojisi………... 7
Tablo-2 : Bartonella türlerinin biyokimyasal özellikleri ve tan+mlanmas+…. 20 Tablo-3 : Antikor dilüsyon titresine göre B.henselae antikor pozitifli,i…... 34
Tablo-4 : Cinsiyet özelliklerine göre B.henselae seropozitifli,i………. 35
Tablo-5 : Ya8 gruplar+na göre B.henselae seropozitifli,i……… 35
Tablo-6 : Meslek gruplar+na göre B.henselae seropozitifli,i……….. 36
Tablo-7 : Seropozitif saptanan serum örneklerinin mesleki özellere göre de,erlendirilmesi………. 36
Tablo-8 : Özgeçmi8 ve ya8am özelliklerine göre B.henselae seropozitifli,i.. 37
Tablo-9 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin özgeçmi8 veya8am özelliklere göre seropozitifli,inin de,erlendirilmesi……… 38
Tablo-10 : Evde hayvan besleme öyküsüne göre B.henselae seropozitifli,i... 39
Tablo-11 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin evde hayvan besleme öyküsüne göre de,erlendirilmesi………... 40
Tablo-12 : Evcil hayvan taraf+ndan yaralanma öyküsüne göre B.henselae seropozitifli,i………... 40
Tablo-13 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin evcil hayvan taraf+ndan yaralanma öyküsüne göre de,erlendirilmesi………….. 41
Tablo-14 : Yabani hayvan temas öyküsüne göre B.henselae seropozitifli,i…. 41 Tablo-15 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin yabani hayvan temas öyküsüne göre de,erlendirilmesi……….. 41
Tablo-16 : Yabani hayvan taraf+ndan yaralanma öyküsüne göre B.henselae seropozitifli,i………... 42
Tablo-17 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin yabani hayvan taraf+ndan yaralanma öyküsüne göre de,erlendirilmesi….. 43
Tablo-18 : Artropodlar ile temas öyküsüne göre B.henselae seropozitifli,i…. 43 Tablo-19 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin artropod temas öyküsüne göre de,erlendirilmesi………... 43
Tablo-20 : Sulak alan bulunma özelli,ine göre B.henselae seropozitifli,i…... 44
Tablo-21 : B.henselae seropozitif saptanan serum örneklerinin sulak alan bulunma öyküsüne göre de,erlendirilmesi……….. 44
Tablo-22 : Ya8am özelliklerine göre B.henselae seropozitifli,i………... 45
EK LLER Ç ZELGES
ekil-1 : Akridin Orange boyas+ ile B.henselae’n+n fluoresans mikroskop alt+ndaki görüntüsü………... 27 ekil-2 : Gram boyama yöntemi ile B.henselae’nin hücre kültüründe
+8+k mikroskop alt+ndaki görüntüsü……….. 29 ekil-3 : Fluoresans boyama yöntemi ile B.henselae seropozitifli,inin
KISALTMALAR D Z N
KTH : Kedi T+rm+,+ Hastal+,+ BA : Basiller Anjiyomatoz
IFA : Immunofluorescence Antibody IFAT : Immunofluorescence Antibody Technic EIA : Enzyme Immunoassay KS : Kaposi Sarkomu
ABD : Amerika Birle8ik Devletleri EDTA : Etilendiamin Tetraasetikasit ATCC : American Type Culture Collection BCYE : Buffered Charcoal Yeast Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism HSP : Henoch Schonlein Purpuras+
SPSS : Statistical Package for the Social Science HSM : Hepatosplenomegali
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis LAP : Lenfadenopati
PBS : Phosphate Buffer Saline EMEM : Eagle’s Medium
FCS : Fetal Calf Serum BHI : Brain-Heart Infusion
G R
Bartonella türü bakteriler, Gram-negatif, kokobasil/basil görünümündedirler.
Do,adaki çe8itli rezervuarlardan insanlara vektörler arac+l+,+yla bula8t+,+ kabul edilmektedir. Zoonotik infeksiyonlara neden olabilen f+rsatç+ patojenlerdir. Memelilerin endotel ve eritrosit hücrelerini invaze edebilirler. Kronik-asemptomatik infeksiyonlar+n yan+nda ciddi infeksiyonlara da yol açabilirler. nsanda kedi t+rm+,+ hastal+,+ (KTH), basiller anjiyomatoz (BA), basiller peliyoz, ate8, endokardit, özellikle HIV (Human Immunodeficiency Virus) pozitif olgularda nörolojik sendromlar, Carrion’s hastal+,+ ve siper ate8ine neden olabilirler. B.henselae’n+n do,al rezervuar+ kediler kabul edilse de, do,adaki birçok hayvan türünden izole edilmi8tir. Etken, kedilerde kronik asemptomatik bakteremi olu8turmaktad+r (1, 2).
KTH ilk kez 1889 y+l+nda Dr. Henri Parinaud taraf+ndan t+p literatürüne girmi8tir. Hastal+,+n ad+ 1950 y+l+nda Dr. Robert DebreR taraf+ndan konulmu8, 1991 y+l+nda etkene Afipia felis ad+ verilmi8tir. Ancak sonraki çal+8malarda KTH ile A.felis aras+nda ili8ki saptanmam+8t+r (3-5). Slater ve ark., 1990 y+l+nda HIV pozitif bir hastan+n kan+ndan Rochalimaea benzeri organizma izole etmi8lerdir. Dr. Diane Hensel’in onuruna bu organizmaya Rochalimaea henselae ismi verilmi8tir. Ancak yap+lan yeni s+n+fland+rmada B.henselae olarak isimlendirilmi8tir (5-7).
Sa,l+kl+ insanlar ve farkl+ risk gruplar+nda yap+lan çal+8malar sonucunda
Bartonella türlerinin epidemiyolojisi önem kazanm+8t+r. Çal+8malarda sa,l+kl+ kan
donörlerinde %2-6 oranlar+nda B.henselae seropozitifli,i saptanm+8t+r (5).
Chomell ve ark., Koehler ve ark. yapt+klar+ çal+8malarda evcil kedilerin
Bartonella türleri için rezervuar oldu,unu öne sürmü8lerdir (8, 9).
Sunulan çal+8mada, Denizli bölgesinde bartonelloz risk faktörlerinin belirlenmesi ve B.henselae seroprevalans+n+n saptanmas+ amac+yla, Pamukkale Üniversitesi Kan Merkezi’ne ba8vuran kan donörlerinden IgG/A/M yap+s+ndaki
GENEL B LG LER
Bartonelloz, Bartonella cinsi bakterilerin neden oldu,u, anjiyomatöz deri lezyonlar+yla karakterize, sistemik tutulumun da e8lik edebildi,i s+kl+kla immünitesi bozulan ki8ilerde görülen zoonotik bir hastal+kt+r (1, 10).
Bartonella genusu küçük, zay+f boyanan, Gram-negatif, aerobik, oksidaz
negatif bakterilerdir. Proteobacteria s+n+f+n+n alfa 8ubesinin üyeleri olan Bartonella cinsi bakterilerin 20’den fazla türü vard+r. nsan sa,l+,+n+ ilgilendiren 3 önemli tür;
B.henselae, B.quintana ve B.bacilliformis’tir (1, 11). Evcil kediler (Felis domesticus), B.henselae için rezervuard+rlar. Kedi pireleri (Ctenocephalides felis)
bula8tan yüksek oranda sorumlu vektörlerdir. nsanlar B.quintana için rezervuar kabul edilmektedir. B.bacilliformis için, Lutzomyia verrucarum türü tatarc+klar bula8tan sorumlu tutulan vektörlerdir. Patojen; vücut biti, kum sine,i (tatarc+k, yakarca), kene ve pire gibi vektörler yoluyla geçmektedir (3, 5, 12).
BARTONELLA TÜRLER N N TAKSONOM S
‘’Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology’’nin 1984’teki bas+m+na göre,
Rickettsiales tak+m+ üç familya içermektedir: Rickettsiaceae, Bartonellaceae ve Anaplasmataceae (13). Rickettsiaceae familyas+nda Rickettsia, Coxiella ve Rochalimaea genuslar+ bulunmaktad+r (14). Rickettsia ve Coxiella’lar+n spesifik
konak hücrelerinin d+8+nda kültür edilememelerine ra,men, Rochalimaea genusu üyeleri hücreden ba,+ms+z besiyerlerinde üretilebilmi8tir. Bartonellaceae familyas+nda 1984 y+l+na kadar sadece bir Bartonella türü (B.bacilliformis), iki
Grahamella türü (G.talpae ve G.peromysci) ve iki Rochalimaea türü (R.quintana ve R.vinsonii) tan+mlanm+8t+r. B.elizabethae 1986 y+l+nda yeni bir tür olarak eklenmi8tir
(15). HIV infeksiyonu olan bir hastada, 1990’l+ y+llarda özellikle BA ve hepatik peliyoz gibi birkaç farkl+ klinik durumun varl+,+ bildirilmi8tir (1). Warthin-Starry gümü8 boyas+ ile boyanan organizmalar, deri ve visseral organ lezyonlar+n+n biyopsi kesitlerinde görülebilmi8 fakat organizmalar+n kültürde üremeleri son derece zor olmu8tur. Bu organizmalar, taze olarak haz+rlanm+8 agar besiyerlerinde veya uzun süre inkübasyona b+rak+lan hücre kültürlerinde izole edilmi8, moleküler ve genetik yöntemler ile tan+mlanm+8t+r. Bu zor üreyen bakteriler, Rochalimaea genusunun
üyeleri olarak kabul edilmi8tir (16, 17). Brenner ve ark., yapt+klar+ taksonomik çal+8malar ile Rochalimaea türlerinin B.bacilliformis ile çok yak+n ili8kisi oldu,unu öne sürerek, Bartonella ve Rochalimaea türlerinin birle8mesini desteklemi8lerdir (18). Sonuç olarak, Rochalimaea genusunun tüm üyeleri B.quintana, B.vinsonii,
B.henselae ve B.elizabethae olarak Bartonella genusuna dahil edilmi8tir (19).
1995 y+l+nda 16S rRNA analizleri ile üç yeni Grahamella türü tan+mlanm+8t+r. Birtles ve ark., genetik ve fenotipik ölçütlere dayanarak Londra’daki ‘’Central Public Health Laboratory’’da Grahamella genusunun da Bartonella genusu ile birle8tirilmesini önermi8lerdir. Bu birle8tirme sonras+nda rodentlerde be8 Bartonella türü daha bulunmu8tur: B.talpae, B.peromysci, B.grahamii, B.taylorii, B.doshiae (20). DNA hibridizasyon teknikleri ve 16S rRNA sekans analizi ile Bartonella’n+n
Bartonellaceae familyas+nda tek genus oldu,u saptanm+8t+r. Bu familya Proteobacteria s+n+f+n+n U2 subgrubundaki ‘’Rhizobiales’’ tak+m+na aittir. Afipia,
Brucella ve Agrobacterium tumefaciens ile yak+n akrabad+r (21). B.bacilliformis ve B.quintana insana özgül iken; B.henselae, B.clarridgeiae ve B.koehlerae kedilerden
izole edilmi8 zoonotik türlerdir (22).
Geleneksel kültür ve serolojik yakla8+mlar ile birlikte moleküler ve genetik teknikler kullan+larak birkaç yeni Bartonella türü daha tan+mlanm+8t+r. B.elizabethae 1993 y+l+nda endokarditli bir hastadan izole edilmi8tir (15). Drancourt ve ark., 1996 y+l+nda SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ile B.henselae izolatlar+ndaki hücresel proteinleri kemotaksonomik olarak de,erlendirmi8ler ve 16S rDNA sekans analizi yapm+8lard+r. Bu ara8t+rmac+lar,
B.henselae’y+ B.henselae Houston (16S tip I) kökeni ve B.henselae Marseilles (16S
tip II) kökeni olmak üzere iki geno/serogruba ay+ran teklifi sunmu8lard+r. Bergmans ve ark., Hollanda’da KTH olan ki8ilerde PCR (Polimerase Chain Reaction) yöntemini kullanarak B.henselae Tip I ve Tip II varyantlar+n+ saptanm+8lard+r (23, 24). Clarridge ve ark., 1995’te Houston’da KTH olan iki hastan+n vaka sunumlar+n+ ve kendi laboratuvarlar+n+n yakla8+m+n+ tan+mlayan bir aç+klama yay+nlam+8lard+r (19). Her iki hastadan B.henselae tespit edilmesine ra,men, hastalardan birine ait yavru kedide yeni bir Bartonella türü izole edilmi8tir. Dr. Jill Clarridge’in onuruna 1996 y+l+nda bu yeni izolata B.clarridgeiae ad+ verilmi8tir. Kordick ve ark., 1997
y+l+nda B.clarridgeiae’in neden oldu,u ilk kedi t+rm+,+ vakas+n+ bildirmi8lerdir (25). Droz ve ark. taraf+ndan yap+lan bir sürveyans çal+8mas+nda, iki kedide farkl+
Bartonella türü izole edilmi8, bu yeni tür B.koehlerae olarak adland+r+lm+8t+r. Utah ve
Illinois’teki kedilerden 2000 y+l+nda B.weissii izole edilmi8, Kuzey Carolina’daki s+,+r etlerinde B.bovis saptanm+8t+r (26-28). Son 15 y+l içinde yap+lm+8 çal+8malarda,
Bartonella türlerinin yabani ve evcille8tirilmi8 hayvanlar+n pek ço,unda bulundu,u
saptanm+8t+r. nfekte hayvanlar rezervuar olarak görev yapabilir, hayvan ve insan infeksiyonlar+n+n potansiyel kayna,+ olabilir (5). Kuzey Carolina Devlet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesinde, çe8itli hayvanlar ile temas etmi8 olan bir erkek hastan+n valvüler dokusunda PCR analizi ile 1995 y+l+nda B.vinsonii subsp. berkhoffii tespit edilmi8tir (29-31). B.vinsonii subsp. arupensis, 1999’da belirgin nörolojik semptomlar+ ve ate8i olan s+,+r otlakç+lar+n+n kan kültürlerinden izole edilmi8tir (32). Bu organizma B.vinsonii subsp. berkhoffii ve B.vinsonii subsp. vinsonii ile yak+n ili8kilidir ve infekte farelerden de izole edilmi8tir (33).
BARTONELLA TÜRLER N N EP DEM YOLOJ S
Son y+llarda risk gruplar+n+n saptanmas+ ve epidemiyolojisi önem kazanm+8t+r.
B.henselae’n+n insana bula8mas+nda kediler rezervuar konumundad+r. B.henselae’n+n
insanlara geçi8i genellikle kediler taraf+ndan +s+r+lma ve t+rmalanma ile direkt olurken, kedi pireleri taraf+ndan dolayl+ yol ile de olabilmektedir (9). Kedi pireleri,
B.henselae’y+ ba,+rsaklar+nda bar+nd+rmakta ve d+8k+lar+ ile salg+layarak etkeni
kediler aras+nda ta8+maktad+rlar. Kontamine t+rnaklar ile t+rmalama veya kedilerin kendilerini yalamalar+ s+ras+nda pire d+8k+lar+n+n di8 aralar+na yerle8erek, +s+rma s+ras+nda infeksiyonu insanlara ta8+ma olas+l+,+ artmaktad+r. Nadir de olsa köpeklerden insanlara geçi8 tan+mlanm+8t+r (34).
Bartonelloz ile s+k ili8kilendirilen KTH’n+n Amerika Birle8ik Devletleri’nde (ABD) poliklini,e ba8vuran hastalar içindeki tahmini prevalans+n+n %0.93 olarak hesapland+,+ ve maliyetinin y+lda yakla8+k 12 milyon dolar oldu,u ifade edilmektedir (35-37). KTH her ya8ta ve her iki cinsiyette de görülebilmesiyle birlikte, ya8 da,+l+m+n+ ara8t+ran çal+8malarda olgular+n yar+s+ndan fazlas+n+n 20 ya8 alt+nda (10 ya8+n alt+ndakilerde daha fazla olmak üzere), %33-43’nün 21 ya8 ve üstünde, %17’nin 41 ya8 ve üstünde oldu,u bildirilmektedir (38, 39).
Son y+llarda B.henselae’n+n kenelerden insanlara geçti,i yönünde veriler yay+nlanm+8t+r. Lyme tan+s+ konulan 86 hastan+n %26’nda B.henselae ko-infeksiyonu PCR ile gösterilmi8 ve insanlardan toplanan kenelerin %1.4’nün B.henselae ta8+d+,+ belirlenmi8tir (40).
Yap+lan çal+8malar B.henselae’n+n dünya genelinde kedilerde en yayg+n
Bartonella türü oldu,unu ortaya koymaktad+r. Kedilerdeki B.henselae pozitifli,inin
+l+man ve nemli bölgelerde yüksek, so,uk ve kurak bölgelerde dü8ük oldu,u görülmektedir. Bu farkl+l+,+n nedeni, B.henselae’n+n kediler aras+ geçi8inde vektör konumundaki pirelerin iklimsel etkiler sonucu ço,alma yeteneklerin etkilenmesi olarak aç+klanmaktad+r. Genç kedilerdeki Bartonella pozitifli,i daha fazlad+r (5, 41-45). Kedilerin bar+nma ve ya8am 8eklindeki farkl+l+klar pire enfestasyonuna yakalanma olas+l+,+n+ etkiledi,inden, ayn+ bölgedeki sokak kedilerinin ev kedilerine göre daha yüksek oranda bakteremik ve seropozitif oldu,u bildirilmi8tir (41).
Çe8itli ülkelerdeki sa,l+kl+ bireylerde ve farkl+ risk gruplar+nda Bartonella spp. seropozitifli,i %0.2-40.0 aras+nda bildirilmi8tir (1, 2, 11, 46-51). Risk grubu olan veterinerler ve ilgili mesleklerde B.henselae seroprevalans+ ABD’de %7.1, Avrupa’da %5 saptanm+8t+r (5, 39). Kediler ile temas+ olan sa,l+kl+ kan donörlerinde
B.henselae seroprevalans+ ABD’de %2-6, sveç’te %4, Avusturalya’da %5 iken; bu
oran immün yetmezli,i olan hastalarda Japonya’da %9.6, Güney Afrika’da %10, Bahreyn’de %16 olarak saptanm+8t+r. Türkiye’de raporlanan sporadik KTH ve BA olgular+ mevcut olmakla birlikte, B.henselae’n+n sa,l+kl+ insanlardaki seroprevalans+na ili8kin bir yay+na ula8+lamam+8t+r (52-54). ili’de 181 çocuk, yeti8kin, teknik ve profesyonel olarak kedi bak+m+nda görevli 107 ki8ide
B.henselae’a kar8+ IgG antikoru immünofluoresans yöntem (IFAT) ile ara8t+r+lm+8,
24 (%13.3) çocuk ve mesleki olarak risk alt+nda olan 11 (%10.3) ki8ide seropozitif olarak tespit edilmi8tir (55). Polonya’da 1998-2001 y+llar+ aras+nda 265 hastada
B.henselae ve B.quintana için IgM ve IgG antikorlar+ indirekt
mikro-immünofluoresans yöntem ile ara8t+r+lm+8t+r. Lenfadenopatisi (LAP) olan 146 hastada (%57.0) spesifik B.henselae antikoru, dört tanesinde de B.quintana antikoru pozitif saptanm+8t+r (56). Almanya’da 116 KTH olmayan çocuk ve 19 KTH olan çocukta 2 ayr+ IFAT ile B.henselae antikorlar+ ara8t+r+lm+8t+r. Bu ara8t+rmada, KTH
olmayan çocuklardaki antikor titresi V1/64’te %3.5 ve %13 oranlar+nda, KTH olan çocuklarda ise %26 ve %37 oranlar+nda pozitif saptanm+8t+r (57). Polonya’da IFAT ile yap+lm+8 çal+8mada, B.henselae’ya kar8+ olu8mu8 spesifik IgG; evsiz alkoliklerde %48.3, veterinerlerde %45.0 ve kedi sahiplerinde %53.3 olarak saptanm+8t+r (58). Ürdün’de, randomize seçilen 482 çocukta IFAT ile yap+lan çal+8mada; %11
B.henselae ve %4.1 B.quintana seropozitifli,i saptanm+8t+r (59). Yunanistan’da
sa,l+kl+ 500 ki8ide IFAT ile yap+lan çal+8mada, B.henselae’ya kar8+ %19.8 ve
B.quintana’ya kar8+ %15 oranlar+nda IgG antikorlar+ pozitif olarak tespit edilmi8tir
(49). sveç’te 1999 y+l+nda 498 kan donörünün serum örnekleriyle yap+lm+8 bir çal+8mada, B.henselae (Houston-1 kökeni), B.henselae (Marseille kökeni),
B.elizabethae, B.grahamii, B.quintana ve B.vinsonii subsp. vinsonii’ye kar8+ geli8mi8
antikorlar IFAT ile test edilmi8tir. Bu çal+8mada serum örneklerinin %16.1’nin en az bir Bartonella türüne kar8+ antikor içerdi,i saptanm+8t+r. B.henselae (Houston-1 kökeni) %1.2; B.henselae (Marseille kökeni) %1.8; B.quintana %0.2; B.elizabethae %14.1; B.grahamii %2.6 oranlar+nda seropozitiflik saptan+rken, B.vinsonii subsp.
vinsonii seropozitifli,i saptanmam+8t+r (11). sveç’te 1992-1993 y+llar+nda 322 kan
donöründe IFAT ile yap+lan di,er çal+8mada Bartonella spp. seroprevalans+ %6.8 oran+nda saptanm+8t+r (60). Baltimore’da intravenöz ilaç kullanan 630 ki8ide IFAT ile yap+lan bir çal+8mada, B.henselae’ya kar8+ %11, B.elizabethae’ya kar8+ %33 ve
B.quintana’ya kar8+ %10 oran+nda seropozitiflik saptanm+8t+r (61). Pekin’de 357
sa,l+kl+ ki8ide yap+lm+8 bir çal+8mada, enzyme-linked immun assay ile %34.5 ve IFAT ile %35.6 oran+nda seropozitiflik saptanm+8t+r (62). Japonya’da profesyonel olarak hayvanc+l+k yapan 233 ki8inin serum örne,inde immünoperoksidaz yöntem ile yap+lan çal+8mada, B.henselae %15.0 seropozitif olarak saptanm+8t+r (63). B.henselae antikorlar+ için Tayland’da 163 sa,l+kl+ ki8ide yap+lan çal+8mada, IgG %5.5, IgM %1.2; Japonya’da KTH 8üpheli 48 ki8ide IgG %39.6, IgM %8.3; kardiyovasküler hastal+,+ olan 159 hastada IgG %3.1; 129 sa,l+kl+ veteriner ö,rencide IgG %10.9 ve IgM %0.8 oranlar+nda seropozitif olarak bildirilmi8tir (64, 65). sveç’te eroin ba,+ml+l+,+ nedeniyle ölen, 24’nün HIV pozitif oldu,u 59 ki8inin otopsisi s+ras+nda al+nan serum örneklerinde IFAT ile yap+lan bir çal+8mada, B.henselae (Houston-1 kökeni) %14, B.quintana %3, B.elizabethae %39, B.grahamii %3 oranlar+nda seropozitif saptanm+8t+r (50).
Tablo 1- Baz+ Bartonella türlerinin epidemiyolojisi
a: Pediculus humanis corporis; b: Peromyscus spp.; c: Ctenocephalides felis; d: Microtus pennsylvanicus; e: Clethrionomys
glareolu; f: Apodemus spp.; g: Microtus agrestis
Not: Tabloda bo8 b+rak+lan yerler ara8t+r+lmas+ tamamlanmam+8 verileri göstermektedir.
B ar to ne lla tü rü Ke8 if y+ l+ lk kü ltü r ya p+ la n y+ l R ez er vu ar V ek tö r im di ki co ,r af ik ya y+ l+ m + K ay na kl ar
B.bacilliformis 1909 1919 nsanlar Phlebotomines (L. verrucarum) Peru, Ekvador, Kolombiya, Bolivya, ili, Oand, Guatemala 67, 68
B.quintana 1914 1961 nsanlar nsan vücut bitia Dünyada yayg+n 69, 70
B.talpae 1905 Köstebekler Büyük Britanya 20
B. peromysci 1942 Farelerb Birle8ik Devletler 20
B.henselae 1950 1990 Kediler Pirelerc Dünyada yayg+n 16
B.clarridgeiae 1995 1995 Kediler Pirelerc Kozmopolit 5, 25, 71
B.koehlerae 1999 1999 Kediler Pireler Kaliforniya 26
B.vinsonii subsp.
vinsonii 1946 1996 Tarla fareleri
d Kanada 72
B.vinsonii subsp.
berkhoffii 1995 1995 Köpekler Pireler ve keneler Kozmopolit 29, 30 B. vinsonii subsp.
arupensis 1999 1999 S+,+rlar 32
B.elizabethae 1986 1993 S+çanlar Pireler 15
B.grahamii 1995 1995 S+çanlare Büyük Britanya 20
B.taylori 1995 1995 S+çanlarf Büyük Britanya 20
B.doshiae 1995 1995 S+çanlarg Büyük Britanya 20
B.tribocorum 1998 1998 S+çanlar (Rattus
rattus) 73 B.weissii 1999 1999 Karaca, geyik, s+,+r, büyük ba8 hayvanlar, kedi Birle8ik Devletler, Fransa 5, 74
B.birtlesii 2000 2000 S+çanlarf Fransa 75
B.alsatica Yabani tav8anlar 76
B.schoenbuchii 77 B.bovis 27 B.capreoli 27 B.tribocorum 1998 S+çanlar 73 B.tamiae sp. Keneler 78 B.washoensis Kemirgenler 5 B.australis sp. Kanguru 79
talya’n+n Toscana bölgesinde sa,l+kl+ 508 bebek, çocuk ve adolesan+n serum örneklerinde yap+lan bir çal+8mada, B.henselae IgG seropozitifli,i V1/64’te %61.6 oran+nda saptanm+8t+r (66).
Küçük memeliler, gevi8 getiren hayvanlar ve di,er yabani hayvanlar aras+ndaki serolojik sürveyans ve kan kültürü çal+8malar+ ile Bartonella türleri tan+mlanm+8t+r. Fransa’da yabani tav8anlardan (Oryctolagus cuniculus) B.alsatica, yabani s+çanlardan (Rattus norvegicus) B.tribocorum türleri izole edilmi8tir (76).
B.schoenbuchii, B.bovis, B.capreoli ve B.birtlesii yeni türlerdir ve s+ras+yla karaca,
süt ine,i, rengeyi,i ve küçük memelilerin kan+ndan izole edilmi8lerdir (27, 75, 77). Amerika’da yap+lan bir çal+8mada koyun kan+nda Bartonella spp. izole edilmi8tir (80). Hollanda’daki karacalardan toplanm+8 olan 121 Ixodes ricinus kenesinden ve California’da toplanan Ixodes ve Dermacentor kenelerinden haz+rlanan ekstraktlarda
Bartonella gen dizileri tespit edilmi8tir (81, 82). Güneydo,u Amerika’da rodentlerde
yap+lm+8 saha çal+8mas+nda %42’nde Bartonella türleri saptanm+8t+r (83). Portekiz ve Amerika’da yakalanan rat türlerinde %11.8-19.0 oranlar+nda Bartonella türleri izole edilmi8tir (84). Peru, Louisiana ve Maryland’de yakalanan R.norvegicus’lardan elde edilmi8 izolatlar+n B.elizabethae ile özde8 genetik sekanslar+ oldu,u ortaya ç+kar+lm+8t+r (15). Ellis ve ark. Rattus türleri ve muhtemel di,er kemiricilerin
B.elizabethae için rezervuar olduklar+n+ belirtmi8lerdir (84). Los Angeles 8ehir
merkezinde ücretsiz klini,i kullanan ve kemiriciler ile temas etti,i dü8ünülen evsiz 200 ki8inin serumunda B.henselae, B.quintana ve B.elizabethae’ye kar8+ s+ras+yla %3.5, %9.5, %12.5 oranlar+nda seropozitiflik bildirilmi8tir (85). California’da yap+lan çal+8malarda çe8itli hayvanlardan %15-49 aras+nda Bartonella türlerini izole edilmi8tir (74). California’n+n farkl+ co,rafik bölgelerinde ya8ayan çakallarda %7-76 oranlar+nda B.vinsonii subsp. berkhoffii seropozitifli,i bulunmu8tur. Bu çal+8malar,
B.vinsonii subsp. berkhoffii’nin vah8i hayattaki en önemli rezervuar+n+n çakallar
oldu,unu dü8ündürmü8tür (86, 87).
Seroprevalans çal+8malar+ dünyan+n çe8itli bölgelerinde ya8ayan kediler aras+ndaki Bartonella infeksiyonu oran+n+n yüksek oldu,unu göstermi8tir. Kedilerde
Danimarka’da %45.5 saptan+rken, sveç’te B.elizabethae’ya kar8+ %25 oran+nda tespit edilmi8tir (88-91).
Bartonella türleri, özellikle de B.henselae kedi pirelerinden (Ctenocephalides felis) ara8t+r+lm+8t+r. Chomel ve ark. %89’u B.henselae ile bakteremik olan 47
kediden al+nan 132 pirenin %34’nde B.henselae DNA’s+n+ tespit etmi8lerdir (92, 93). Bu ki8iler ayn+ zamanda bakteremik kedilerden al+nan kedi pirelerinin sa,l+kl+ kedilere B.henselae geçi8ini sa,layabildi,ini göstermi8lerdir. Bununla birlikte, pire olmadan bakteremik kediler ile birlikte ayn+ eve konulan yavru kediler, B.henselae ile infekte olmam+8lard+r (94).
B.henselae veya B.clarridgeiae ile bakteremisi olan kediler genellikle
asemptomatiktir. Kordick ve ark. 18 adet spesifik patojenden yoksun kediye
B.henselae ve B.clarridgeiae’i inoküle etmi8 ve persistan bakteremiye ra,men klinik
belirti ve semptomlar+n minimal oldu,unu saptam+8lard+r (95).
BARTONELLA TÜRLER N N KL N K BEL RT LER
Bartonella bakterileri; LAP, santral sinir sistemi bozukluklar+ (ensefelopati,
hemipleji, epilepsi ve subkortikal frontopariyetal lezyonlar), basiller anjiyomatoz, basiller peliyoz, ate8, adenit, endokardit, hepatosplenik tutulum, kutanöz vaskülit, 8iddetli görme kayb+ ve osteomiyelit olu8turabilir. Hastal+k, tedavi edilmedi,i durumda komplikasyonlar+ nedeniyle fatal olmaktad+r (1, 6, 96, 97).
Bartonella türleri, özellikle HIV-1 ile infekte ki8ileri içeren immündü8kün
konaktaki infeksiyonlar ile ili8kilidir. Deri ve/veya sistemik tutulum ile birlikte BA, klasik ve kentsel siper ate8i, bakteremi ile birlikte nüks eden ate8, KTH, endokardit, hepatik peliyozu içeren iyi tan+mlanm+8 çe8itli klinik durumlar+ içermektedir.
B.henselae öncelikli olarak KTH, ate8 ve bakteremi, endokardit, peliyoz, BA
kliniklerinde etkindir (19, 98).
1-KED TIRMI I HASTALI I
KTH, B.henselae’y+ içeren kedi piresi (Ctenocephalides felis) feçesinin deriye inokülasyonu sonucu geli8mektedir. B.henselae’n+n insana kesin geçi8 yolu
bilinmemekle birlikte, kedi piresi feçesiyle kontamine olmu8 kedi t+rnaklar+ ya da di8leri ile yaralanma sonras+ geçi8in olabilece,i öne sürülmektedir (5). KTH, Özellikle çocuk ve adolesanlardaki LAP’+n yayg+n nedenidir. Dünyan+n heryerinde görülmektedir; en çok vakalar eylül-mart aylar+ aras+nda olup +l+man iklimlerde temmuz ve a,ustos aylar+nda s+k rastlan+r. Hastalar+n %90’+ kediyle temas ve yakla8+k olarak %75-80’nde kedi t+rmalamas+ veya +s+rmas+ öyküsü vard+r. KTH tipik ve atipik olmak üzere iki formda geli8ir. Tipik formda t+rmalama ve +s+rma yerinde eritematöz papül veya püstül 8eklinde primer lezyon ortaya ç+kar ve genellikle iz b+rakmadan 2-4 hafta içinde iyile8ir. Takiben geli8en bölgesel LAP en önemli klinik belirtidir (34, 99). Malignensi ile kar+8abilen LAP ve HSM (Hepato-splenomegali) olabilir (100, 101). Warthin-Starry gümü8leme bask+ boyas+ ile boyanm+8 lenf nodu biyopsi kesitlerinde organizma s+kl+kla küme halinde görülür (19). Yayg+n olmamas+na ra,men, KTH atipik seyir ve komplikasyonlar olu8turabilir. Bu belirtiler hepatik ve splenik mikroabseler, rabdomiyosarkomu taklit eden epitroklear kitle, osteomiyelit, preaurikular LAP ile birlikte konjonktivit veya oküler granülom olarak kendini gösteren Parinaud’un oküloglandüler sendromunu içerir (102-105). Ensefelopati, aseptik menenjit, retinit KTH’n+n nadir komplikasyonlar+d+r. (106-109). Sistemik KTH ayn+ zamanda t+rmalama veya +s+rma yerinden uzakta multifokal osteomiyelite neden olabilir (110, 111). KTH’n+n pulmoner göstergeleri çok nadirdir (112). KTH genellikle kendi kendini s+n+rlayan bir hastal+kt+r. B.henselae’n+n invitro olarak birçok antimikrobik ajana duyarl+ olmas+na ra,men, antimikrobiklerin KTH tedavisinde kullan+m+ yararl+ olmam+8t+r. KTH’n+n süpüratif komplikasyonlar+n+n tedavisinde sadece aminoglikozitler, özellikle de gentamisin etkili olarak gösterilmi8tir (99).
Regnery ve ark. 1992’de, IFAT kullanarak asemptomatik kedilerin kan+ndan
B.henselae’y+ izole etmi8lerdir. Ayn+ grup, KTH olan hastalar+n %88’nin A.felis
antijenlerine kar8+ de,il, B.henselae antijenlerine kar8+ yüksek oranda antikorlara sahip oldu,unu saptam+8lard+r (113). KTH olan hastalar+n süpüratif lenf nodlar+ndan al+nan pürülan materyalde B.henselae DNA’s+n+n varl+,+n+ göstermek için PCR ve benzeri teknikler kullan+lm+8t+r (114-116). Zangwill ve ark. 112 kontrol hastas+n+n %3’nde ve KTH olan 45 hastan+n %84’nde IFAT ile B.henselae’ya kar8+ antikor saptam+8lard+r (117). Dolan ve ark. 1993’te, KTH olan immünitesi sa,lam iki
hastan+n lenf nodlar+ndan B.henselae’y+ tespit etmi8lerdir (118). Min ve ark. yapt+klar+ çal+8mada süpüratif lenf nodlar+nda hastal+k etkenini B.henselae olarak tan+mlam+8lard+r (119). Di,er çal+8malarda A.felis’in KTH’daki rolü tamamen karakterize edilmemesi ile birlikte, B.henselae’n+n KTH’da predominant etken oldu,u savunulmu8tur (120, 121). Di,er Bartonella türü olan B.clarridgeiae de 1997’de KTH vakas+ ile ili8kili olarak tan+mlanm+8t+r (25).
2-ATE VE BAKTEREM
B.henselae bakteremisi HIV’li, AIDS’li, farmakolojik olarak immün süprese
allojenik organ al+c+lar+ ve immünitesi sa,lam ki8ilerde tespit edilmi8tir (7, 16).
B.henselae bakteremisi, BA veya fokal peliyoz ile birlikte olan veya olmayan
AIDS’li hastalarda tespit edilmi8tir. Organizma lenf nodlar+, kemik ili,i, kalp, karaci,er, dalaktaki nekrotik inflamatuar lezyonlardan histopatolojik olarak veya moleküler teknikler ile saptanabilir (122). mmünitesi sa,lam HIV negatif bireylerde kemik ve kas a,r+s+na e8lik eden ani ba8lang+çl+ ate8 ile kendini gösterir. B.henselae, çocuk ve yeti8kinlerde serolojik olarak Xnedeni bilinmeyen ate8Xin nedeni olarak gösterilmi8tir (123, 124). Spach ve ark. Seattle’da kronik alkolizmi olan HIV negatif 10 ki8ide, Brouqui ve ark. çe8itli çal+8malarda evsiz insanlarda B.quintana bakteremisi saptam+8lard+r (46, 47, 125, 126). nfeksiyon immünitesi sa,lam hastalarda genellikle tedaviye h+zl+ yan+t verir ve genellikle tekrarlamaz. Baz+ durumlarda antimikrobiyal kemoterapiye gerek kalmadan infeksiyon düzelebilir (127). Bununla birlikte Lucey ve ark. B.henselae için pozitif kan kültürü olup hastal+,+n relaps etti,i immünitesi sa,lam iki hastay+ bildirmi8lerdir (128). Bu hastalar+n ikisinin de hastalanmadan önce kene taraf+ndan sokuldu,u tespit edilmi8tir. Drancourt, Raoult ve di,er ara8t+r+c+lar kan ve kemik ili,i kültürlerinden
B.quintana izole edilen hastalardan ikisinde kronik granülomatöz mediastinal LAP
ve bakteremi oldu,unu bildirmi8lerdir (19). 3-ENDOKARD T
Hadfield ve ark. 1993’te alkolizm öyküsü olan 57 ya8+ndaki HIV negatif bir in8aat i8çisinde B.henselae’n+n neden oldu,u ilk endokardit vakas+n+ tan+mlam+8lard+r. Di,er B.henselae endokarditi vakas+ 1995’te önceden sa,l+kl+ olan 41 ya8+ndaki bir erkekte bildirilmi8tir (129, 130). Bu hastalar+n ikisinin de kapak
replasman cerrahisi gerektirdi,i bildirilmi8tir. Sonraki y+llarda B.henselae çe8itli immünitesi sa,lam hastalardaki do,al ve prostetik kapak endokarditinin nedeni olarak tan+mlanm+8t+r (131-133). Bartonella türleri, özellikle B.quintana birkaç kültür negatif endokardit vakas+nda izole edilmi8tir (125). B.vinsonii subsp.
berkhoffii zamanlarda insanlardaki asemptomatik endokarditin nedeni olarak da
bildirilmi8tir (31, 134). 4-PEL YOZ
Hepatik peliyoz, karaci,er parankimine da,+lan kistik, kan ile dolu lezyonlar ile karakterizedir (135). Karaci,er ve dala,+ tutan peliyoz vakalar+n+n say+lar+n+n artmas+, HIV infeksiyonu ile ili8kili olarak bildirilmi8tir (136). Di,er iç organlar+n parankimal basiller peliyozu (dalak, kalp, larinks, akci,erler, adrenal bezler, serviks, overler, pineal bez ve koroid pleksus gibi) de bildirilmi8tir. Hepatik peliyoz yaln+zca
B.henselae infeksiyonu ile ili8kilendirilmektedir ve BA’un di,er bir göstergesi
oldu,una inan+lmaktad+r (1, 17, 19). 5-BAS LLER ANJ YOMATOZ
Basiller anjiyomatoz ilk olarak 1983’te tan+mlanm+8t+r (137). Genellikle immündü8kün ki8ilerde görülmesine kar8+n immünitesi sa,lam ki8ilerde de olabilmektedir. HIV infeksiyonu, kronik alkolizm, intravenöz ilaç kullan+m+, eroin ba,+ml+l+,+, dü8ük sosyo-ekonomik durum, vücut ve saç bitine maruz kalma, evsiz-sokakta ya8am, kedi sahibi olma, kedi +s+r+,+ ve kedi t+rmalamas+na maruz kalma, kronik lenfositik lösemi, sitotoksik kemoterapi ve transplantasyon öyküsünün de
B.henselae’n+n olu8turdu,u basiller anjiyomatoz yönünden risk grubunu olu8turdu,u
bildirilmi8tir (65, 138, 136, 140, 141). BA, B.henselae ve B.quintana’n+n neden oldu,u ola,an d+8+ yayg+n vasküler proliferasyon ile sonuçlanan bakteriyel infeksiyondur. Ço,unlukla ilerlemi8 HIV infeksiyonu olan hastalarda görülmektedir (138, 142-146). Ayn+ zamanda kanser kemoterapisi alan, uzun süre kortikosteroid tedavisi alan ya da transplantasyon geçirmi8 immün süprese hastalarda da bildirilmi8tir (140, 146, 147). BA, ayn+ zamanda immünitesi sa,lam bireyler ve çocuklarda da görülmü8tür (148). Kutanöz BA en s+k görülen formdur. BA ve Kaposi sarkomu ayn+ hastada birlikte bulunabilir (149, 150). Geni8 osteolitik lezyonlar olu8turarak kemik ve kemik ili,ini tutabilir (151). Visseral tutulumda
basiller hepatik peliyoz veya dissemine vasküler lezyon olu8abilir. BA’un lezyonlar+ konjonktiva, orbita, kalp, diyafram, biliyer sistem, kaslar, karaci,er, dalak, lenf nodlar+, genital yol, santral sinir sistemi, üst ve alt solunum yolu, gastrointestinal yolun mukozal yüzeylerinde de gösterilmi8tir (152-157). BA’un histopatolojik tan+s+ kutanöz ve subkutanöz lezyonlar için parça biyopsisi veya eksizyonel biyopsilerin al+nmas+n+ gerektirir (19).
B.henselae, baz+ vakalarda da B.quintana kan, deri lezyonlar+, kemik, visseral
organlar ve BA’lu hastalar+n beyninden izole edilmi8tir (6, 17, 151, 158). San Francisco’da 1997’de, 49 BA’lu hastan+n bir vaka kontrol çal+8mas+nda, hastalar+n %53’ü B.henselae ile ve %47’si de B.quintana ile infekte olarak saptanm+8t+r (136). Baz+ ara8t+r+c+lar ve klinisyenler, BA’un kedi t+rm+,+ hastal+,+n+n immündü8kün konakta görülen bir göstergesi oldu,una inanmaktad+rlar (159). Bartonella’n+n invitro çal+8malar+, bu organizman+n anjiyogenezisi uyarabilece,ini göstermi8tir. Fizyolojik süreç, yeni kan damarlar+n+n olu8umu ile sonuçlan+r ve endoteliyal hücrelerin ço,almas+n+ ve göçünü etkilemektedir (160). Kutanöz BA, oral ya da parenteral tedavi ile sa,alt+labilir. Eritromisin, rifampin, tetrasiklinler, makrolidler, kloramfenikol, trimetoprim-sulfametoksazol, vankomisin, norfloksasin, siprofloksasin, gentamisin tedavide kullan+lmaktad+r. Ancak tedavinin kesilmesini takiben relapslar s+k olu8maktad+r (1, 135). Lezyonlar+n deri ile s+n+rl+ oldu,u durumda, cerrahi olarak eksizyon ile ç+kar+labilir (19).
BARTONELLA HENSELAE VE D ER BARTONELLA TÜRLER N N
TESP T , ZOLASYONU VE TANIMLANMASI ÖRNEK T PLER
Örnekler, lenf nodu biyopsileri ve aspiratlar+, 8üpheli kutanöz veya sistemik BA lezyonlar+n+n biyopsi örnekleri ve kan+ içerir. Bu örnekler Bartonella türlerinin izolasyon ve tan+mlanmas+ için kullan+labilir. üpheli KTH olan hastalardan al+nan örneklerin, klinik seyirin erken döneminde özellikle lenf nodu biyopsi örneklerinin toplanmas+ tercih edilmektedir (19). Doku örnekleri homojenize edilerek petride kültüre edilmelidir. Bu zor üreyen bakterilerin kan örneklerinden elde edilmesini geli8tirmek için lizis santrifüj yöntemleri bildirilmi8tir. Heparinize edilmi8 kan
örneklerinin dondurulmas+ ve daha sonra oda +s+s+nda eritilmesi, kan+n direkt olarak besiyerine ekiminden daha önce organizman+n saptanmas+n+ sa,layabilmektedir. Organizmalar+n büyümesi s+ras+nda az miktarda CO2 üretmesi veya hiç üretmemesi nedeniyle, otomotize kan kültürü sistemlerindeki Bartonella türlerinin tespiti zor olabilir. Üremeyi kolayla8t+rmak için ticari olarak sa,lanan BACTEC PLUS 26 8i8eleri kullan+labilir. Bu 8i8eler içine inoküle edilmi8 örneklerin sekiz gün inkübasyonundan sonra haz+rlanan yaymalar+n akridin oranj fluoresans boyama ile incelenmesi önerilmektedir (161, 162).
MORFOLOJ VE BOYANMA ÖZELL KLER
B.henselae, 1-2x0.5-0.6 µm boyutlar+nda, Gram-negatif, hafif k+vr+k,
pleomorfik, genellikle kokobasil morfolojide, flagellas+z, mikroaerofilik, fakültatif hücre içi bir bakteridir. Otoaglütinasyon özelli,inden dolay+ Gram boyamada bir araya toplanarak kümeler halinde görülmektedir (6, 7, 163). B.bacilliformis ve
B.clarridgeiae’de hareket flagella ile sa,lan+rken, B.henselae’da titreme hareketi
görülmektedir (34). KÜLTÜR
B.henselae, eritrosit içi yerle8im gösterdi,inden kan kültürü yap+labilir. Ancak
insanda nadiren bakteremi yapt+,+ için kandan izolasyonu zordur. Kan kültürü, nedeni belli olmayan ate8, nörüretinit, ensefalit, endokardit, peliyoz ve basiller anjiyomatozlu hastalarda yararl+ olabilir ancak LAP’l+ olgularda önerilmemektedir (37, 164). nsanlarda kültür için karaci,er, dalak, lenf nodu ve deri biyopsi örnekleri kullan+labilir (22). Di,er örneklerle birlikte endoteliyal hücre kültürünün hem izolasyon oran+n+ artt+rd+,+ hem de izolasyon süresini k+saltt+,+ için oldukça yararl+d+r ancak s+k kullan+lan bir yöntem de,ildir (34).
B.henselae’n+n kedilerde hücre içi yerle8imi nedeniyle eritrosit ve lökositlerin
lizisini takiben kandan izolasyon oran+ daha yüksektir. Lizis solüsyonu içeren izolatör santrifüj tüpleri veya EDTA (etilendiamin tetraasetikasit)’l+ kan örneklerinin -70[C’de 24 saat dondurup çözdürüldükten sonra kanl+ agara inoküle edilmesi ile kandan B.henselae izolasyon oran+ yükselmi8tir (41, 42, 45).
Besiyerleri ekimler yap+ld+ktan sonra 35-37[C’de %5’lik CO2’li ortamda inkübe edilir. Yakla8+k 5-15 gün aras+nda koloniler görülmeye ba8lar ve 45 günlük inkübasyondan sonra üreme yoksa negatif olarak kabul edilir. Yava8 üreme özelli,i ve biyokimyasal testler ile di,er Gram-negatif mikroorganizmalardan ayr+l+r (6, 7, 16). Kültür yöntemi ve biyokimyasal testlerin zaman al+c+ ve tür düzeyinde tan+mlaman+n zor olmas+ gibi nedenlerle h+zl+ tan+ amac+yla direkt fluoresans antikor yöntemleri geli8tirilmi8tir. Ancak bu yöntem sadece referans merkezlerde uygulanmaktad+r (34). Bartonella türleri, uygun bir petri kültürü veya hücre kültüründe ko-kültüvasyon ile izole edilebilir. Hücre kültüründe insan endoteliyal hücre tabakas+ (ECV 304 hücre dizisi vb) veya di,er hücre tiplerini (örn: Vero hücreleri, HELA hücreleri, L292 hücreleri) içeren ‘’shell vial’’ veya ‘’flask’’ içinde uygulan+r (11, 139, 151, 165).
Koehler ve ark. BA lezyonlar+n+n do,ranm+8 doku biyopsilerinden B.henselae ve B.quintana’y+ izole etmek için, s+,+r endoteliyal hücre dizisini (CPA hücreleri, ATCC hücre dizisi #207) kullanm+8lard+r (151). Bu ara8t+r+c+lar, 9-30 günlük inkübasyon sonras+ bulan+k kültür süpernatantlar+n+ geli8me ve tan+mlama için agar besiyerine subkültüre etmi8lerdir. Drancourt ve ark. B.quintana’y+ üretmek için ECV 304 (devaml+ insan endotel hücre dizisi) hücrelerini kullanm+8lard+r (139). Bu teknik ile organizmalar, shell vial içinde immünofluoresans yöntem ile tespit edilebilir. Ayr+ca PCR ve di,er moleküler teknikler ile tan+mlanabilir. Bartonella türlerinin et suyu ile zenginle8tirme sonras+ ke8fi, piruvat, aminoasitler ve hemin eklenmi8 RPMI 1640 (doku kültürü tipi likid besiyeri) içeren besiyeri ile yap+lmaktad+r (166).
Agar temelli kültür yöntemleri, %5’lik at kan+ ya da tav8an kan+ içeren kalp infüzyon agar kültürünü içerir. Kan eklenmi8 beyin-kalp infüzyon (BHI) agar, triptik soy agar, Columbia agar ve zenginle8tirilmi8 çukulata agar, Brusella agar, BCYE agar (buffered charcoal yeast extract agar), MacConcey agar, aerobik BACTEC 8i8esi de büyümeyi destekleyebilir. Antibiyotik duyarl+l+k testi için Columbia agar , kanl+ Muller Hinton agar tercih edilmektedir. Taze olarak haz+rlanm+8 besiyeri, optimal ke8if için esansiyeldir. Selektif besiyeri yoktur. Antimikrobiyal ajanlar+ içeren besiyeri kullanmaya gerek yoktur. Baz+ Bartonella türlerinin büyümesi için 45 güne kadar inkübasyonu gerekmesine ra,men, inoküle edilmi8 petri besiyerleri 35-37
[C’de nemli atmosferde en az 21 gün inkübe edilir (98). Yava8 büyüyen primer kültürlerden iyi bir geli8me elde edilene kadar 15-20 gün subkültürler gerekebilir. Ço,u Bartonella türleri anaerobik 8artlar alt+nda, 25[C veya 42[C’de veya hemin ve CO2yoklu,unda üremez. Ancak B.bacilliformis üremek için CO2’e ihtiyaç duymaz ve dü8ük +s+y+ (25-28[C) tercih eder (19).
GRAM BOYAMA VE KOLON MORFOLOJ S
Primer izolasyonda, Bartonella türleri ba8lang+çta beyaz, büyüklük ve 8eklinde çe8itlilik gösteren küçük yap+8kan koloniler olarak görünmektedir. B.henselae,
B.quintana ve B.elizabethae’nin baz+ kökenleri büyümeleri s+ras+nda agar yüzeyini
çukur yapabilir. Karakteristik olarak, B.henselae kolonileri beyaz, kuru, yap+8kan, karnabahar benzeri, agar içine gömülmü8 ve morfolojik olarak heterojendir. Çok say+da pasaj ile koloniler daha az kuru, daha az yap+8kan, daha geni8 ve daha h+zl+ üremeye e,ilimli olmaktad+rlar. B.elizabethae kolonileri, %5’lik tav8an kan+ eklenmi8 kalp infüzyon agarda büyüyen kolonilerin etraf+nda hafif veya parsiyel hemolizler görülebilmesinin d+8+nda B.henselae’ya benzemektedir (15). B.bacilliformis kolonileri ba8lang+çta düzgün, küçük, saydamd+r ve subkültürlerde de
ayn+ 8ekilde kal+rlar. Bu nedenle kolonileri di,er türlerden farkl+d+r (19).
Bartonella organizmalar+ salin ile haz+rlanm+8 süspansiyonlarda seyirme
8eklinde motilite gösterirler (19). B.bacilliformis ve B.clarridgeiae’in flagellas2 vard+r. B.bacilliformis’te flagellan+n olmas+, eritrosit invazyonunu kolayla8t+r+r.
B.tribocorum’da fimbria benzeri polar yap+lar vard+r. B.henselae’n+n flagellas+
yoktur. Pitassi ve ark. yapt+,+ bir çal+8mada B.henselae’n+n eritrositi invazyonu gösterilmi8tir (167).
TANIMLAMA YÖNTEMLER
KTH için özgül tan+mlama yöntemlerinin geli8tirilememi8 olmas+ nedeniyle son y+llara kadar tan+ klinik bulgular ile konulmu8tur. LAP ile ba8vuran olgular+n anamnezinde kedi sahibi olmak veya kedilerle temas halinde olup t+rmalama ve +s+r+lmay+ takiben geli8en semptomlar+n varl+,+ B.henselae’n+n neden oldu,u hastal+klar+ dü8ündürmektedir (3). KTH 8üpheli olgularda rutin laboratuvar testleri tan+ya yard+mc+ de,ildir. Olgular+n tam kan analizinde s+kl+kla lökositoz ve
sedimentasyon h+z+nda art+8 gözlenir. BOS incelemesi genellikle normaldir, ancak hafif pleositoz veya protein düzeylerinde yükselme saptanabilir. Laboratuvar sonuçlar+ tan+y+ do,rulamak veya d+8lamak için yeterli de,ildir (34). Eskiden beri KTH tan+s+nda B.henselae antijeni içeren deri testi kullan+lmaktad+r. Antijen inokülasyonundan 48-96 saat sonra olu8an hipersensisivite reaksiyonuna göre de,erlendirme yap+lmaktad+r (3).
B.henselae’n+n laboratuvar tan+s+, klinik örneklerden bakterinin izolasyonu,
genetik materyalin gösterilmesi ve histopatolojik inceleme yöntemleriyle direkt olarak ve/veya serumda B.henselae’ya kar8+ özgül antikorlar+n gösterilmesiyle indirekt olarak konulmaktad+r (37). nsan infeksiyonlar+n+n tan+s+nda s+kl+kla IFAT ve PCR tercih edilmektedir. Do,al enfekte kediler genelde asemptomatik seyir sergilediklerinden kedilerde hastal+,+n tan+s+nda seroloji, kan kültürü ve moleküler yöntemler uygulanabilir (168).
Biyokimyasal testler
Genelde Bartonella türleri biyokimyasal olarak inerttir ve oksidaz, katalaz, indol, üreaz, dekarboksilaz ve nitrat redüksiyon testlerini içeren rutin biyokimyasal tan+mlama testleri ile nonreaktiftir. Bartonella türlerini tan+mlamak için fenotipik yöntemler, ya, asiti analizleri için kullan+lan kemotaksonomik yöntemler ve moleküler tetkikleri (PCR, nükleik asit sekanslama vb.) içeren çe8itli varsay+ma dayal+ ve tan+mlay+c+ yöntemler vard+r. Türe spesifik monoklonal antikorlar,
B.quintana’n+n h+zl+ tan+mlanmas+ için kullan+l+r (169-174). B.henselae, B.quintana
ve B.vinsonii’yi içeren Bartonella türlerinin varsay+ma dayal+ tan+mlanmas+, yap+lan bakteriyel enzimleri tespit etmek için kromojenik enzim substratlar+ kullan+larak ticari tan+mlama sistemleri ile birlikte tespit edilebilir (örn: Microscan Rapid Anaerob Panel, Vitek Neisseriae-Haemophilus tan+mlama kart+, IDS Rapid ANA II Panel, API AnIDENT panel, Microscan HNID Panel) (175). Sadece Microscan Rapid Anaerobe Panel B.henselae ve B.quintana’y+ tür düzeyinde birbirinden ay+rabilmektedir (Tablo 2).
Gaz-likid kromotografisi
Bartonella türleri hücresel ya, asitlerinin gaz-likid kromatografik analizi ile
tan+mlanabilir (Tablo 2) (6). Tüm Bartonella türleri, küçük bir miktarda C13:1 ve C17:0 ya, asitleri ile birlikte, %50’den daha büyük miktarda C18:1 izoasitleri, %16-25 C18:0 ve %16-22 C16:0 içermektedir (15). Çe8itli Bartonella türlerinin ya, asiti içeri,indeki farkl+l+klar tabloda gösterilmi8tir (Tablo 2).
Moleküler yöntemler
Moleküler yöntemler, direkt klinik örneklerden h+zl+ tan+, kültürden etkenin tan+mlanmas+ ve izolatlar+n tür tayininin yap+lmas+ amac+yla kullan+lmaktad+r. nsan ve kedilerden izole edilen Bartonella 8üpheli izolatlarda PCR ile tür tayini uygulanmaktad+r (7, 96). Doku örneklerinde veya kanda PCR yöntemi daha yüksek duyarl+l+k ve özgüllü,e sahip olmas+na ra,men rutin olarak kullan+lmamaktad+r. Dondurulmu8 ve taze biyopsi örnekleri PCR için uygun örnekler iken, parafinlenmi8 doku örnekleri tercih edilmemektedir (164). Bartonella türlerinin ay+r+m+nda nükleik asit amplifikasyonu ve de,i8ik genlerin sekans analizi kullan+lmaktad+r. Bartonella türlerinin tiplendirilmesinde, filogenik özelliklerin s+n+fland+r+lmas+nda ve tan+mlanmas+nda 16S/23S rRNA intergenik ara bölgesinin sitrat sentaz geni (gltA), riboflavin sentez geni (RibC), +s+ 8ok protein geni (groEL) ve pap31 geni dizileri kullan+lm+8t+r (164, 166). Çe8itli genlerin (+s+ 8ok proteinleri, sitrat sentaz, riboflavin sentez genleri, hücre bölünme genleri) PCR ile amplifikasyonu veya amplikonlar+n 16S-23S rRNA intergenik spacer bölgeleri ve restriksiyon endonükleaz analizi tür tan+m+nda uygulan+r (171-174). Matar ve ark. AluI ve HaeIII restriksiyon enzim k+rmas+n+n sonras+nda PCR ile B.henselae’n+n izolatlar+n+n subtiplemesinde bu yöntemi önermi8lerdir (176). Sitrat sentaz geni parças+ (gltA) da Bartonella türlerinin tan+mlanmas+ için kullan+lmaktad+r (7, 172, 177). Sitrat sentaz kodlayan genin (gltA) 940 bp’lik fragman dizileri ve 60 k-DA olan +s+ 8ok proteininin gen dizi analizi (groEL) ile Bartonella türlerinin filogenetik analizi yap+lm+8t+r (173, 178). Primer oligonükleotidler, ribC DNA bölgesi (riboflavin sentez geni) tür spesifik PCR yöntemleri geli8tirmek için kullan+lm+8t+r (179). Handley ve Regnery; restriksiyon endonükleaz ile ayr+lm+8 segmentlerin amplifikasyonuna dayal+ PCR ba,+ml+ tan+mlama yöntemini bildirmi8lerdir (180). Çe8itli PCR temelli tan+mlama yöntemleri ile 16SrRNA operonu içinde tür spesifik temel sekans varyasyonlar+
tan+mlanm+8t+r (21, 23, 181-184). Matar ve ark. klinik örneklerdeki Bartonella’n+n direkt olarak tan+mlanmas+ için PCR-RFLP yöntemini kullanm+8lard+r (185). Sander ve Penno, 16SrRNA geni bölgesinin biyotinlenmi8 amplikonlar+n+ üretmek için PCR kullanm+8lard+r. Sonradan modifiye edilmi8 enzyme immunoassay (EIA) format+ndaki antidigoksigenin peroksidaz+n eklenmesi, B.henselae ve B.quintana’n+n h+zl+ tan+mlanmas+n+ sa,lam+8t+r (184). Avidor ve ark. klinik örneklerdeki
B.henselae’n+n direkt tespiti için amplikonlar+n RFLP analizi taraf+ndan takip edilen
ya gltA (sitrat sentaz) geni ya da htrA’n+n (+s+ 8ok protein genleri) PCR temelli amplifikasyonu ile, PCR arac+l+ 16SrRNA gen amplifikasyonunu de,erlendirmi8lerdir. Bu ara8t+r+c+lar, gltA/RFLP ile direkt test yap+lmas+n+n kolay ve tercih edilir oldu,unu öne sürmü8lerdir (171).
SEROLOJ K TANI
Bartonella infeksiyonunda klinik tan+n+n do,rulanmas+nda kültür ve moleküler
yöntemlerin zaman al+c+, pahal+ ve belli merkezlerde uygulanabilir olmas+ nedeniyle seroloji en çok tercih edilen tan+ yöntemidir. B.henselae’ya kar8+ olu8an antikorlar+n saptanmas+ için s+kl+kla IFAT ve EIA yöntemleri kullan+lmaktad+r. Özellikle IFA yöntemi CDC taraf+ndan BA tan+s+ için geli8tirilmi8tir (3, 113, 117, 190). Regnery ve ark. KTH serolojisinde B.henselae ile infekte Vero hücrelerini antijen olarak kullanm+8lard+r. Vero hücrelerinin kullan+lmas+ ile etkenin otoaglütinasyonunun engellendi,ini ve test alan+na yay+ld+,+n+ gözlemi8lerdir. Bu yöntemi kullanarak haz+rlanan antijen ile yap+lan IFAT ile V1/64 de,erlerini pozitif olarak de,erlendirmi8lerdir. Bu çal+8ma temel al+narak bir çok ara8t+rmac+ IFAT antijen olarak B.henseale ile enfekte Vero hücrelerini kullanm+8lard+r (186). Ayr+ca Maurin ve ark. da laboratuvarda haz+rlad+klar+ antijen kapl+ lamlar ile ticari olarak ald+klar+ antijen kapl+ lamlar+ IFAT kullanarak kar8+la8t+rm+8lard+r (187).
Akut KTH’da IgM titrelerinin V1/16 olmas+ infeksiyonun erken döneminin göstergesidir. IgG için V1/256 titreler geçirilmekte olan infeksiyonu ifade ederken 1/64 ve 1/128 titreler 8üpheli kabul edilmektedir. Genel olarak uygun anamnez ve klinik bulgu ve belirtilerin varl+,+nda IFAT ile V1/64 titreler tan+ koydurucudur (164). Akut infeksiyon tan+s+, akut ve konvelesan serum örneklerindeki IgG titre art+8+n+n gösterilmesi ile konulmaktad+r. Ancak hastalar+n ilk ba8vurusunda
Tablo 2- Bartonella türlerinin biyokimyasal özellikleri ve tan+mlanmas+ (19) Özellik B .b ac ill if or m is B .q ui nt an a B .h en se la e B .e liz ab et ha e B .c la rr id ge ia e B .g ra ha m i B .v in so ni i su bs p. vi ns on ii B .v in so ni i su bs p. be rk ho ffi i B .v in so ni i su bs p. ar up en si s O.B.S. 25-30°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C 35-37°C Hemoliz - - - +h - - - - -Oksidaz - D - - - - D - - Katalaz + D - - - - D D - Nitrat redüksiyonu - - - -Üreaz - - - ndol - - - Aseton - - - + - VY VY O/F Glukoz -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Flagella + - - - + - - - Hareket - + + - - - Major hücre ya, asitleri C18:1_7c C16:0 C16:1_7C C12:0 C18:1_7c C16:0 C18:0 C18:1_7c C18:0 C16:0 C18:1_7c C17:0 C16:0 C18:1_7c C16:0 C18:0 VY C18:_7c C18:0,C17:0 C16:0,C15:0 C18:1_7c C18:0 C16:0,C15:0 C18:1_7c C16:0,C17:0 C18:0 Bis-p nitrofenilfosfat + D + + VY VY + + + L-Arginin-`-naftilamidaz + + + + + VY + + + Glisin-`-naftilamidaz + + + + + VY + + + Glisil-glisin-`-naftilamidaz + + + + VY VY + + + L-lösin-`-naftilamidaz + + + + VY + + + + L-lizin-`-naftilamidaza + - + + h VY VY - + - L-lizin-`-naftilamidaze + + + + VY VY + + + DL-metyonin-`-naftilamidaz + + + + VY VY + + + h L-prolin-`-naftilamidaz - + + - + D D + - L-prolidonil-`-naftilamidaz - - - - VY - - - - L-triptofan-`- naftilamid-asetilamidaz + + + + VY VY + + +
O.B.S: Optimal büyüme s+cakl+,+; O/F: Oksidasyon/Fermantasyon; +: pozitif reaksiyon; -: negatif reaksiyon; D: de,i8ken reaksiyon; +h: hafif pozitif reaksiyon; VY: veri yok; e: esas; a: asidik
yüksek düzeyde IgG antikorlar+n+n varl+,+, IgG antikorlar+n+n uzun süre yüksek düzeylerde kalabilmesi ve baz+ hastalarda antikor yan+t+n+n geli8memesi infeksiyonun tan+s+n+ güçle8tirebilir. Bartonella sp. için IFAT’+n duyarl+l+,+ %84-88, özgüllü,ü %94-96 olarak bildirilmi8 olmakla birlikte, EIA yönteminin ise IgM için V1/250 titrelerinde duyarl+l+,+n+n %83-95, özgüllü,ününün %95’e ula8t+,+ belirtilmi8tir (37, 188). Atipik KTH formlar+nda serolojik testler tan+da oldukça faydal+d+r. B.henselae antikorlar+ ile B.quintana, Chlamydia spp. ve Coxiella burnetii antikorlar+ aras+ndaki çapraz reaksiyonlar nedeniyle yalanc+ pozitiflikler söz konusudur (3). KTH 8üpheli olgularda B.henselae antikorlar+n+n negatif bulunmas+ durumunda, etkenin B.clarridgeiae veya A.felis olabilece,i dü8ünülmelidir (164).
mmünofluoresans Yöntem
B.henselae doku örneklerinde immünofluoresans (IF) yöntemle
saptanabilmektedir. IF yöntemin duyarl+l+,+ de,i8ken olmakla birlikte özgüllü,ün yüksek olmas+ tan+ problemi olan olgularda önem kazanmas+n+ sa,lamaktad+r (189). Monoklonal antikorlar+n kullan+ld+,+ immünohistokimyasal yöntemler gelecek için ümit göstermektedir (19).
Bartonella türlerinin kültürde güç üremeleri nedeniyle, infeksiyonun
saptanmas+nda serolojik yöntemler kullan+lmaktad+r. Regnery ve ark. B.henselae için IFAT geli8tirmi8ler ve KTH olan hastalar+n %88’nde B.henselae antikor titrelerinin V1/64 oldu,unu tespit etmi8lerdir (113). Rolain ve ark. PCR’+n referans laboratuvarlar+nda uygulanabilinece,ini öne sürerek, B.henselae infeksiyonlar+n+n tan+s+nda, indirekt ve direkt immünofluoresans yöntemlerinin kullan+lmas+ ile tan+n+n daha kolay, duyarl+l+k ve özgüllü,ünün yüksek oldu,unu belirtmi8lerdir (189). Dalton ve ark. 1995’te, B.henselae, B.quintana ve B.elizabethae’yi Vero hücre kültüründe üretmi8ler ve IFA ile test etmek için bu organizmalar+ kullanarak laboratuvarda antijen haz+rlam+8lard+r (190). KTH olan 91 hastada yap+lan bir çal+8mada B.henselae ya da B.quintana için IFA ile V1/64’te %95 oran+nda seropozitiflik saptanm+8t+r. B.quintana KTH ile ili8kili bulunmad+,+ndan dolay+,
B.quintana’ya kar8+ geli8mi8 olan antikor titrelerinin her iki tür aras+nda serolojik
olarak çapraz reaksiyon gösterdi,i dü8ünülmü8tür. B.elizabethae ve di,er iki
B.quintana’ya kar8+ yüksek antikor titrelerine sahip olan örneklerde gösterilmi8tir.
Vero hücreleri ile ko-kültüve olmu8 B.bacilliformis organizmalar+, Güney Amerika’n+n endemik bölgelerindeki bartonellozun tan+s+ için de IFA prosedürü geli8tirmek için kullan+lm+8t+r. Bartonellozun akut döneminde, PCR pozitif veya kültür ile do,rulanm+8 lam pozitifli,i (Giemza ince yaymas+nda eritrositlerde gösterilen organizmalar vb.) olan 106 hastan+n serumundaki antikorlar+n saptanmas+nda IFA yöntemi %82 oran+nda duyarl+ bulunmu8tur (191). Çal+8mada IFA testinin pozitif prediktif de,eri %89 olarak hesaplanm+8t+r. Bergmans ve ark. Hollanda’da KTH’n+n tan+s+ için EIA ve IFA yöntemlerinin her ikisini de kullanarak Vero hücreleriyle ko-kültüve edilmi8 ve edilmemi8 B.henselae antijenlerine kar8+ IgM ve IgG antikorlar+n+n tespitini de,erlendirmi8lerdir. Sonuç olarak, IFA lamlar+n+n haz+rlanmas+ için bakteriyel antijenlerin kayna,+na dayanan belirgin farkl+l+klar bulmu8lard+r (188). Sa,l+kl+ kan donorlerinin serum örnekleri kullan+lmas+yla, IgG ve IgM testlerinin her ikisinin de özgüllü,ü %95-100 olarak saptanm+8t+r. Bu ara8t+r+c+lar, KTH’n+n serolojik tan+s+ için kullan+lan IFA’n+n güvenilir bir yöntem olmas+ için, yöntemin kullan+m+ndan önce bir çok i8lem gerekti,inin sonucuna varm+8lard+r. Ticari olarak sat+lan IFA lamlar+, ya kanl+ agardan ya da hücrelerden elde edilmi8 B.henselae’n+n antijen olarak kullan+lmas+ ile haz+rlanm+8t+r. Zbinden ve ark. iki ticari IFA kitini kulland+klar+ bir çal+8mada, Vero hücrelerinde ko-kültive edilmi8 B.henselae’y+ antijen olarak kullanarak laboratuvarda haz+rlad+klar+ IFA lamlar+ ile ticari kitleri kar8+la8t+rm+8lard+r (192). Fransa’da yap+lan bir çal+8mada, laboratuvarda ECV 304 endotel hücre dizileri kullan+larak haz+rlanan Bartonella antijenleri ile IgG için Bartonella antijen eldesinde Vero hücre dizisini ve IgM tespiti için agar temelli besiyerleri kullanan ticari firmadan haz+r olarak sat+n al+nan kitler IFAT ile duyarl+l+k ve özgüllük yönünden kar8+la8t+r+lm+8t+r. Her iki kit için de IgM V1/20’de, IgG ise V 1/64’de pozitif olarak de,erlendirilmi8tir. KTH olanlarda B.henselae’ya kar8+ antikor saptanmas+nda Vero IFA kitinin laboratuvarda haz+rlanan kitten daha duyarl+ oldu,u belirtilmi8tir. Ayr+ca bu çal+8mada KTH tan+s+nda EIA ve Western Blot yöntemlerinin IFAT’tan üstün olmad+,+ belirtilmi8tir (187).
Enzim i8aretli immün yöntem
EIA testi de KTH’n+n serolojik tan+s+nda serolojik yöntem olarak de,erlendirilmektedir. Barka ve ark. özelle8mi8 laboratuvarlarda (Santa Monica, CA) solid faz antijeni olarak agarda üretilmi8 B.henselae bakterilerini kullanarak, spesifik IgG, IgM ve IgA’n+n tespiti için EIA’y+ geli8tirmi8lerdir (19).
Histopatolojik Tan+
KTH’da LAP histopatolojik incelemesinde, epiteloid, eozinofil ve dev hücrelerin çevreledi,i merkezi nekrozlu çok say+da uydu abselerin görülmesi karakteristiktir. Brown-Hopp doku boyama ve Warthin-Starry gümü8 boyama yöntemleriyle küçük, k+vr+k, çomak 8eklinde bakteriler görülebilir (34). BA’da mikroskobik olarak yeni vasküler proliferasyonlar+n görülmesi tan+da önemlidir.
mmündü8kün bireylerde anjiyogenez olmaks+z+n çe8itli iç organlarda lenfositik infiltrasyonlar ve merkezi nekroz odaklar+ gözlenir (22). Peliyozda içi kanla dolu milimetrik çaptaki lezyonlar+n karaci,erde veya dalakta bulunmas+ karakteristiktir. Elektron mikroskobik inceleme ile doku örneklerinde de bakteri saptanabilir (3).
NV TRO ANT M KROB YAL DUYARLILIK
Maurin ve Raoult, agar dilüsyon yöntemi ile B.henselae, B.quintana ve
B.vinsonii’nin çe8itli antimikrobiyal ajanlara kar8+ invitro duyarl+l+,+n+ test
etmi8lerdir (193). Bu organizmalar ampisilin, 3. ku8ak sefalosporin, tetrasiklinler, makrolidler, rifampisin, trimetoprim-sülfametoksazol ve aminoglikozit grubundaki antibiyotiklere kar8+ duyarl+ olarak saptanm+8t+r. Çe8itli Bartonella türlerinin invitro duyarl+l+,+n+ saptamak için kanl+-Columbia agar ile agar dilüsyon yöntemi uygulanm+8t+r (194). Fluorokinolonlara kar8+ duyarl+l+k de,i8kenlik göstermi8tir (195). Bartonella türlerinin di,er duyarl+l+k çal+8malar+nda hücre kültüründe büyüme inhibisyonu öne ç+km+8t+r. Ives ve ark. Vero hücrelerinin ko-kültüvasyon yöntemini kullanarak, eritromisin ve doksisiklinin fagositik hücrelerde serum konsantrasyonundan daha yo,un konsantrasyona ula8t+klar+na dikkati çekmi8lerdir (196, 197). Kordick ve ark. bakteremik kedilerden elde edilen B.henselae ve
B.clarridgeiae’in tüm kökenlerinin doksisiklin, enrofloksasin ve siprofloksasine
duyarl+ olduklar+n+ saptam+8lard+r (198). Ba8ka bir çal+8mada Bartonella türleri için amoksisilin, sefotaksim, seftriakson, doksisiklin, eritromisin, rifampin ve
siprofloksasinin bakteriyostatik oldu,u, sadece aminoglikozitlerin bakterisidal oldu,u gösterilmi8tir (199). Pendle ve ark. yapt+klar+ bir çal+8mada Bartonella spp.’nin E test yöntemi ile antibiyotik duyarl+l+,+n+n çal+8+lmas+n+n tekrarlanabilir ve güvenilir oldu,unu öne sürmü8lerdir (200).
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal+8ma grubunun olu8turulmas+
Pamukkale Üniversitesi E,itim Uygulama ve Ara8t+rma Merkezi T+bbi Mikrobiyoloji Anabilimdal+’nda, Denizli ili çevresinde ya8ayan sa,l+kl+ kan donörlerinden B.henselae seroprevalans+n+n saptanmas+n+ amaçlayan çal+8ma için Pamukkale Üniversitesi T+bbi Etik Kurul Ba8kanl+,+’ndan onay al+nd+ (Ek-1). A,ustos 2006-May+s 2007 döneminde Pamukkale Üniversitesi E,itim Uygulama ve Ara8t+rma Merkezi’ndeki Kan Merkezi‘ne kan vermek için ba8vuran 800 sa,l+kl+ ki8i çal+8ma grubunu olu8turdu. Bartonelloz için risk grubunu olu8turan hayvan sa,l+,+ çal+8anlar+ ve hayvanlar ile ili8kili mesleklere sahip olan ki8iler, evde hayvan besleyenler, evcil ve yabani hayvanlar taraf+ndan +s+r+lm+8 veya t+rmalanm+8 olanlar, evcil ve yabani hayvanlar ile temas edenler, rezervuarlar ve vektörler ile temas+n yo,un olarak bulundu,u sulak yerle8im bölgelerinde ya8ayan veya çal+8an ki8iler, artropod vektörler ile temas öyküsü olanlar, yurt d+8+na seyahat öyküsü olanlar, ev d+8+nda aç+k alanlarda spor yapanlar ve yaralanmas+ olanlar, hayvanc+l+k yapanlar, avc+l+k yapanlar alt gruplar olarak de,erlendirildi.
Gönüllü kan donörleri kendilerine yap+lacak i8lem ve sonuçlar+ hakk+nda bilgilendirildi ve serum örneklerinin al+nmas+ için bilgilendirilmi8 gönüllü onay formu okutularak, kendi istekleri ile çal+8maya kat+ld+klar+ için imzalar+ al+nd+ (Ek-2). Çal+8maya dahil edilen donörlerin protokol numaras+, ad+, soyad+, ya8+, cinsiyeti, mesle,i, ev ve i8 adresleri, telefon numaras+ kaydedildi. Bartonelloz yönünden risk grubunu belirlemek için kendi istekleriyle ara8t+rmaya kat+lan bireylere bilgi verilerek etik kurulca onaylanm+8 anket formlar+n+ doldurmalar+ istendi (Ek-3). Ankette bartonelloz yönünden risk gruplar+na yönelik haz+rlanan sorular yöneltildi.
Gönüllü kan donörlerinin sa, ön kol yüzeyel venlerinden 10 ml’lik steril enjektörler ile intravenöz yolla 6 ml kan örnekleri al+nd+. Steril al+nan kanlar enjektör yard+m+yla 10 ml’lik tüplere konuldu. Al+nan tüm kan örnekleri oda s+cakl+,+nda 1-2 saat içinde Pamukkale Üniversitesi E,itim Uygulama ve Ara8t+rma Merkezi Mikrobiyoloji Laboratuvar+’na ula8t+r+ld+. Laboratuvara getirilen tüm kan örnekleri
3000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilerek serumlar+ ayr+ld+. Ayr+lan serumlar 2 ml’lik steril eppendorf tüpler içinde çal+8ma zaman+na kadar -20°C’de sakland+.
Test lamlar+n+n olu8turulmas+
Liyofilize B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) kökeni, Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Ara8t+rma Projeleri kapsam+nda LGC Promochem firmas+ndan sat+n al+narak ngiltere’den temin edildi. Çal+8ma süresine kadar +4°C’de sakland+.
Bakteri kökenlerinin canland+r+lmas+
Liyofilize B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) kökeni Pamukkale Üniversitesi Ara8t+rma ve Uygulama Merkezi Mikrobiyoloji Laboratuvar+’nda Tip II güvenlik kabini içinde steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile süspanse edildi. Bakteri süspansiyonu taze olarak haz+rlanm+8 %5 defibrine at kanl+ Columbia agar ve %5 defibrine at kanl+ BHI agar besiyerlerine ekim yap+ld+. Ekim yap+lan besiyerleri nem ve %5-10’luk CO2 sa,layan etüvde 30 gün süresince inkübe edildi. Ekimin ba8lang+c+ndan itibaren bir hafta aral+klar ile B.henselae’ya ait koloni olu8umunun varl+,+ ara8t+r+ld+. nkübasyonun 30. gününe do,ru koloni olu8umu gözlendi. Olu8an kolonilerin XAcridine-OrangeX fluoresans boyas+ ve Gram boyas+ ile B.henselae yönünden üreme kontrolü yap+ld+. XAcridine-OrangeX fluoresans boyas+ ile sar+-turuncu refle veren basiller ve Gram boyas+ ile Gram-negatif basillerin görülmesi ile üremenin oldu,u saptand+ ( ekil 1).
ekil 1: Akridin Orange boyas+ ile B.henselae’nin fluoresans mikroskop alt+ndaki görüntüsü
Vero ve HeLa hücre kültürü serilerinin ko-kültüvasyonu
Vero ve HeLa hücreleri Ege Üniversitesi Viroloji Laboratuvar+’ndan temin edildi. Güvenlik kabini içinde, önceden 25 cm2’lik flasklar içinde üremi8 Vero ve HeLa hücrelerinin içinde bulundu,u besiyeri ortam+ steril bir enjektör yard+m+yla bo8alt+ld+. Flasklar içindeki hücreler steril PBS ile çalkalanarak y+kand+. Ölü olan hücreler y+kanarak ortamdan uzakla8t+r+ld+. Flask yüzeyine tutunmu8 olan sa,l+kl+ hücreler, flask içine 2 ml tripsin ilave edilerek 3 dakika boyunca tripsin etkisine maruz b+rak+ld+. Flask yüzeyine tutunmu8 olan sa,l+kl+ hücrelerin besiyeri ortam+ içine dökülmesi sa,land+. Besiyeri ortam+ndaki sa,l+kl+ hücreler üzerindeki tripsin maruziyetinin giderilmesi için, EMEM (Eagle’s Medium), FCS (Fetal Calf Serum), L-glutamin, kullan+ma haz+r HEPES solüsyonu ve amforetisin-B kullan+larak haz+rlanan hücre büyüme solüsyonundan 4 ml al+narak 25 cm2’lik flask içine konuldu. Hücrelerin içinde bulundu,u süspansiyon s+v+s+ steril kapakl+ bir tüpe aktar+ld+ ve 25 °C’de 1000 g’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonras+ üstte kalan süpernatant s+v+, güvenlik kabini içinde steril pasteur pipeti yard+m+yla d+8ar+ at+ld+. Geri kalan hücre pelleti üzerine önceden haz+rlanan 2 ml büyüme solüsyonu konuldu. Vortekslenerek hücre pelleti resüspanse edildi. Resüspanse edilmi8 olan hücreler
steril pasteur pipeti yard+m+yla 2 adet 25 cm2’lik ve 2 adet 75 cm2’lik steril flasklar içerisine aktar+ld+. Hücre süspansiyonu konulan 75 cm2’lik flasklara 25’er ml, 25 cm2’lik flasklara 5’er ml önceden haz+rlanan büyüme solüsyonu konuldu. Hücrelerin bir k+sm+ EMEM, FCS ve dimethyl sulfoxide kullan+larak haz+rlanan koruyucu solüsyon içine konularak -80 °C’de sakland+. Flasklar içine al+nan hücreler 37 °C’de %5-10 CO2içeren, nemli ortam sa,layan etüvde 24. ve 48. saate kadar inkübe edildi. Hücreler invert mikroskop alt+nda X400 büyütmede incelenerek tek tabakal+ hücre dizisi olu8una kadar inkübasyona devam edildi.
Hücrelerin tek tabaka olu8umu sa,land+ktan sonra, %5 at kanl+ BHI agar besiyerinde canland+r+lm+8 olan B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) kökeni, BHI buyyonu ile süspanse edildi. Haz+rlanm+8 bakteri süspansiyonundan 100 µl al+narak tek tabaka halinde hücre içeren 25 cm2’lik flasklar içinde (Ege Üniversitesi- zmir) ko-kültüvasyona al+nd+. Hücreler 37 °C’de %5-10’luk CO2 ve nem sa,layan etüvde bir hafta inkübe edildi.
Antijenlerin inaktivasyonu ve teflon lamlara kaplanmas+
Ticari olarak sat+n al+nm+8 olan teflon kapl+ lamlar deterjan ve musluk suyu ile uygun 8ekilde y+kand+ktan sonra %96’l+k etanol içeren 8ale içinde 10 dakika bekletildi. Hava ak+m+ alt+nda uygun 8ekilde kurutulan lamlar kullan+ma haz+r hale getirildi.
nkübasyonda b+rak+lm+8 hücreler, B.henselae’n+n üreme kontrolü ve olas+ bakteri ve küf kontaminasyonunu de,erlendirmek için güvenlik kabininde (Tip II) steril pasteur pipeti yard+m+yla lam üzerine al+nd+. Gram boyama ile de,erlendirildi. Bakteri ya da küf kontaminasyonunun olmad+,+ görüldü ( ekil 2).
ekil 2: Gram boyama yöntemi ile B.henselae’nin hücre kültüründe +8+k mikroskop alt+ndaki görüntüsü
Hücreler güvenlik kabini (Tip II) içinde steril pasteur pipeti yard+m+yla steril cam tüplere al+nd+. Benmaride 56 °C’de 30 dakika su banyosunda bekletilerek
B.henselae antijenlerinin inaktivasyonu sa,land+. Güvenlik kabininde 100 µl’lik
pipet yard+m+yla inaktive edilmi8 antijen süspansiyonundan 10’ar µl al+narak, her birinde on kuyucuk bulunan 2.5x7.5 cm boyutlar+ndaki teflon kapl+ lamlar üzerine antijenler konuldu. Lamlar hava ak+m+ yard+m+yla oda +s+s+nda kurumaya b+rak+ld+. Kurutulmu8 olan lamlar, so,utulmu8 aseton kullan+larak -20 [C’de 15 dakika tespit edildi. Antijen kapl+ lamlar+n aseton ile tespitinden sonra lamlar saklama kab+ içinde -70 °C’de çal+8ma süresine kadar sakland+.
IFAT ile antikor saptanmas+
Çal+8ma kapsam+na al+nan serum örneklerine Regnery ve ark.’n+n olu8turdu,u protokol uyguland+ (113). B.henselae’ya kar8+ antikor varl+,+ indirekt fluoresans antikor tekni,i ile ara8t+r+ld+. Çal+8mada, patolojik ve klinik olarak BA tan+s+ alm+8 hasta serumu seropozitif serum örne,i kullan+ld+. Bu testte total IgG/A/M antikorlar+ kalitatif olarak de,erlendirildi. mmünofluoresans yöntem ile +2 pozitiflik seropozitiflik olarak de,erlendirildi.
