PROBİYOTİK OLARAK KULLANILABİLECEK BİFİDOBAKTERİLERİN İZOLASYONU VE
TANIMLANMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ
Ayşe Gülden KÜTÜK Anabilim Dalı: Biyoloji Program: Moleküler Biyoloji Tez Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Seher GÜR
T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
PROBİYOTİK OLARAK KULLANILABİLECEK BİFİDOBAKTERİLERİN İZOLASYONU VE TANIMLANMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ Ayşe Gülden KÜTÜK
112110101
Anabilim Dalı: Biyoloji Program: Moleküler Biyoloji
Tez Danışmnı: Yrd. Doç. Dr. Seher GÜR
Tezin Enstitüye Verildiği Tarih: 26 Ekim 2015
I ÖNSÖZ
Günümüzde tüketicilerin beslenmenin sağlık üzerindeki etkileri konusunda artan ilgisine bağlı olarak probiyotik gıdalara olan talep giderek artmaktadır. Probiyotik gıdalar arasında en çok ilgi gören grup olarak yoğurt gibi fermente süt ürünlerinde kullanılan mikroorganizmaların sağlığa olumlu etkileri bazı klinik çalışmalarla kanıtlandıktan sonra dünya çapındaki tüm gıda firmaları, probiyotikleri daha fazla gıda ve içeceğe eklemenin yollarını aramaya başlamıştır.
Probiyotik bakteriler insan ve hayvanların doğal mikroflorasına ait, özellikleri geliştiren, tüketimleri sonucunda ağızda, sindirim sisteminde, üst solunum yollarında ya da ürogenital kanallarda yararlı etkileri ile konakçının sağlığını koruyan, buralarda oluşan enfeksiyonların iyileşmesine katkıda bulunan, immün sistemi uyaran tek veya karışık mikroorganizma kültürleridir. Probiyotik olarak kullanılacak bir ürünün güvenilir olması, kullanıldığı insan ve hayvanda yan etkisi olmaması, stabil olması, düşük pH ve safra tuzları gibi olumsuz çevre koşullarından etkilenmeden midede canlı kalabilmesi ve bağırsakta metabolize olması, antimikrobiyal maddeler üreterek patojenik bakterilere antimikrobiyal etki göstermesi, antibiyotiklere dirençli olması istenmektedir.
Probiyotik bakteri olarak kullanılan Bifidobacterium’ların anne sütü ve anne sütüyle beslenen bebeklerin dışkısından izole edilip asit dirençliliği ve antimikrobiyal aktivitesini belirlemek amacıyla planlanan bu çalışma süresince beni yönlendiren, yakın ilgisini esirgemeyen, bilgi ve görüşlerinden faydalandığım danışmanım Sayın Yrd. Doç. Dr. Seher GÜR’e ve Yrd. Doç. Dr. Nazmi GÜR’e, laboratuar çalışmalarım süresince bana yardımcı olan hocam Sayın Prof. Dr. Kadri ÇETİN’e tüm eğitim-öğretim hayatımda olduğu gibi yüksek lisansım sırasında da hep destekçim olan annem Serpil KÜTÜK ve babam M. Cengiz KÜTÜK’e ve uzun ve yorucu çalışmalarımda her zaman yanımda olan kardeşlerime tüm içtenliğimle teşekkür ederim.
Ayşe Gülden KÜTÜK ELAZIĞ-2015
II İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖNSÖZ ... I İÇİNDEKİLER ... II ÖZET ... IV SUMMARY ... V ŞEKİLLER LİSTESİ ... VI TABLOLAR LİSTESİ ... VII SEMBOLLER LİSTESİ ... VIII
1. GİRİŞ ... 1
1.1. Gastrointestinal Sistemin Mikroflorası ... 4
1.2. Probiyotikler ... 8
1.2.1. Probiyotiklerin özellikleri... 11
1.2.1.1. Asit ve safra tuzu toleransı ... 12
1.2.1.2. Antibakteriyal etki mekanizması ... 13
1.2.1.3. Tutunma bölgeleri üzerindeki etki mekanizması ... 16
1.2.1.4. İmmün sistem üzerindeki etki mekanizması ... 18
1.2.1.5. Toksin reseptörleri yıkımı ... 20
1.2.1.6. Proteolitik aktivite ... 20
1.2.1.7. β- D- galaktosidaz aktivitesi ... 20
1.2.1.8. Probiyotik bakterilerin güvenilir olması ... 21
1.2.2. Probiyotiklerin klinik etkileri ... 21
1.2.2.1. Ağız ve diş sağlığı ... 21
1.2.2.2. Helikobakter enfeksiyonu... 22
1.2.2.3. Laktoz intoleransı... 24
1.2.2.4. Diyare ... 25
1.2.2.5. Kabızlık ... 26
1.2.2.6. “İrritable” bağırsak sendromu ... 27
1.2.2.7. Enflamatuar bağırsak hastalıkları ... 27
1.2.2.8. Kolon kanseri ... 28
1.2.3. Probiyotiklerin diğer klinik etkileri ... 29
1.2.3.1. Ürogenital sistem enfeksiyonları ... 29
1.2.3.2. Serum kolesterol düzeyinin düşürülmesi ... 31
1.2.3.3. Hipertansiyon ... 33
1.2.3.4. Atopik dermatit ... 33
1.2.4. Probiyotiklerin tümleyeni prebiyotikler ... 33
1.2.5. Probiyotik ve prebiyotiklerin ürünlerde bulunması gereken miktarı ... 37
1.2.6. Probiyotik-prebiyotik pazarı ... 37
1.2.7. Başlıca probiyotikler ... 40
1.2.7.1. Bifidobacterium ... 42
1.2.7.1.1. Bifidobacterium sınıflandırılması ... 43
III
1.2.7.1.3. Bifidobacterium ekolojisi ... 45
1.2.7.1.4. Bifidobacterium fizyolojisi ... 47
1.2.7.1.5. Bifidobacterium biyokimyasal özellikleri ... 48
1.2.7.1.6. Bifidobacterium hücre duvarının bileşimi ve fosfolipid kompozisyonu ... 50
2. MATERYAL VE METOT ... 62
2.1. Materyal... 62
2.1.1. Materyal örnekleri ... 62
2.1.2. Araştırmada kullanılan besiyerleri ... 62
2.1.3. Kullanılan çözeltiler ... 64
2.1.4. Kullanılan boyalar ... 64
2.1.5. Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları ... 65
2.1.6. Araştırmada kullanılan test bakterileri ... 66
2.2. Metot ... 66
2.2.1. Bakterilerin izalasyonu ... 66
2.2.2. Bakterilerin muhafaza edilmesi ... 67
2.2.3. Dışkı ve anne sütü örneklerinden izole edilen bakterilerin tanımlanması ... 67
2.2.3.1. Gram boyama ... 67
2.2.3.2. Fizyolojik ve biyokimyasal testler ... 68
2.2.3.3. Fruktoz 6-fosfat fosfoketolaz testi ... 70
2.2.4. Bifidobacterium’ların asit dirençliliğinin belirlenmesi ... 70
2.2.5. Bakterilerin antimikrobiyol etkisi ... 71
3. BULGULAR ... 72
3.1. İzolasyon ... 72
3.2. İzolatların Kültürel ve Biyokimyasal Testleri ... 74
3.3. Asit Dirençliliği ... 80
3.4. Antimikrobiyal Aktivite ... 80
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA ... 82
KAYNAKLAR ... 92
IV ÖZET
Probiyotikler, konakçı organizmanın sağlığı üzerinde olumlu etkileri kanıtlanmış ve bağırsak florasını düzenleyen canlı organizmalardır. Bunun yanı sıra birçok hastalıkta tedavi edici veya koruyucu etki yaptığı bildirilmektedir. Konu üzerinde ilgi giderek artmakta ve probiyotik ürünlerin kullanımı da yaygınlaşmaktadır. Fermantasyondan biyolojik işlemlere, zirai uygulamalardan gıdaya ve özellikle son zamanlarda tıp alanına kadar geniş bir sahada probiyotik olarak kullanılan Laktik Asit Bakterileri (LAB) önemli araştırmaların konusu haline gelmiş ve üzerinde yapılan çalışmalar yoğunlaşmıştır.
Bu çalışmada, anne sütü ve anne sütüyle beslenen bebeklerin dışkısı kullanılarak, probiyotik özellikte olan LAB’nden Bifidobacterium suşlarının 50 mg/l mupirosin ilave edilerek değiştirilen TPY katı besiyeri kullanılarak izolasyonu ve klasik biyokimyasal testlerin yanı sıra fruktoz 6-fosfat fosfoketolaz testi ile tanımlaması yapılmıştır. İzolatların asit direnci (pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ve 8.0) ve antimikrobiyal aktiviteleri gibi probiyotik kullanım açısından önemli olan bazı özellikleri araştırılmıştır. Asit toleransı ile ilgili çalışmalarda sonuçlara bakıldığında daha asidik ortamlarda (pH 3.0-4.0) çalışıldığında bakteri yoğunluğunda önemli düşüşler olmuştur. Ancak bakterilerin bir kısmının pH 3.0 değerinde canlılıklarını koruyabildiği gözlenmiştir. pH 5.0 ve pH 6.0’da bakteri sayısında artış gözlenirken maksimum gelişme pH 7.0-8.0 olmuştur. Antimikrobiyal aktivitesi çalışmalarında izole edilen bakterilerin E. coli ATCC 25922 ve S. aureus ATCC 6538 P. suşlarına karşı yüksek inhibisyon etki gösterdikleri tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Probiyotikler, Laktik Asit Bakterileri, Bifidobacterium, Asit toleransı, Antimikrobiyal Aktivite
V SUMMARY
Isolation and Identification of Bifidobacteria can be Used as Probiotic Bacteria Probiotics can be defined as living microorganisms of which has proved beneficial effects on health of the host and that modulate the intestinal flora. Besides, it has been stated that they threats or protects against many illness. İnterests on the subject and consumption of these products are presumeably increasing. From fermantation to biological processes, from agricultural processes to foods and especially recently in medicine area, Lactic Acid Bacteria (LAB) have became a significant issue of researches and researches on LAB have been zoomed in.
On this work breast milk and breastfed infants feces were decided to use as source and Bifidobacterium strains, which are LABs and have probiotic speciality, are isolated using TPY agar modified by the addition of mupirocin (50mg/L) and charecterized be using fructose-6-phosphate phosphoketolase enzyme activity becide testing with classical bio chemical methods. Some important properties in terms of probiotic use such as resistance to acid (pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ve 8.0) and antimicrobial activities of these isolates has been examined. Looking at the results of studies on acid tolerance has been a significant decrease in bacterial concentration when working in more acidic conditions (pH 3.0-4.0). However, it is seen that some of the bacteria retain their viability pH 3.0 value. pH 5.0 and pH 6.0 has also been an increase in the number of bacteria observed pH 7.0-8.0 maximum development. Antimicrobial activity of the isolated bacteria of the study have showed high antimicrobial activities on tested bacteria E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538 P.
Key Words: Probiotics, Lactic Acid Bacteria, Bifidobacterium, Resistance to Acid, Antimicrobial Activities.
VI
ŞEKİLLER LİSTESİ
Sayfa No
Şekil 1.1. Bebeğin bağırsak mikroflorasına dış faktörlerin etkisi. Yeşil oklar yararlı değişiklik gösterir; Kırmızı oklar sağlıklı gelişimi için negatif değişiklik
göstermektedir ... 6 Şekil 1.2. Bağırsak mikroflorasını etkileyen faktörler ... 8 Şekil 1.3. İnsan bağırsak hücrelerine L. acidophilus BG2FO4’ün yapışması için
önerilen model. Yapışan Lactobacillus' lar tarafından üretilen ekstraselüler bağlayıcı protein bakterinin bağırsak hücrelerine bağlanmasında köprü görevi görür ... 18 Şekil 1.4. Oligosakkaritlerin bağırsak bakterileri tarafından fermentasyonu sonucu
ortaya çıkan kısa zinzirli yağ asitleri ... 36 Şekil 1.5. 16S-rRNA geninin 1500 nükleotidlik bir karşılaştırmalı dizi analizi bağlı
olarak Bifidobacterium cinsinin üyeleri filogenetik ağacı. Farklı filogenetik kümeler vurgulanır... 44 Şekil 1.6. Hücre içine alınan oksijenin enzimler aracılığıyla kullanımı ... 48 Şekil 1.7. Bifidobacterium tarafından glikoz ile ilgili asetat ve laktat oluşumu yolu.
Homofermantatif yolu olarak 1- heksokinaz ve fruktoz 6-fosfat izomeraz, 2-fruc-tose-6-fosfat fosfoketolaz, 3-transaldolaz, 4-transketolaz, 5-riboz-5-fosfat izomeraz, 6-ribuloz-5-5-riboz-5-fosfat-3-epimeraz, 7-ksiluloz-5-fosfoketolaz, 8-asetat kinaz, 9-enzimler ... 49
VII
TABLOLAR LİSTESİ
Sayfa No
Tablo 1.1. Probiyotik üretiminde kullanılan mikroorganizmalar ... 42
Tablo 1.2. Bifidobacrerium cinsi bakterilerin habitatları ... 46
Tablo 1.3. Bazı Bifidobacterim türlerinin hücre duvarı kompozisyonu ... 50
Tablo 2.1. Trypticase-Phytone-Yeast Extract (TPY) sıvı besiyeri ... 62
Tablo 2.2. Man Rogosa ve Sharpe (MRS) sıvı besiyeri... 63
Tablo 2.3. Nutrient sıvı besiyeri ... 64
Tablo 3.1. Bebeklerden alınan dışkı örneklerinin kodları ve izolat sayıları ... 73
Tablo 3.2. Annelerden alınan süt örneklerinin kodları ve izolat sayıları ... 73
Tablo 3.3. İzole edilen bakterilerin fizyolojik ve biyokimyasal test sonuçları ... 76
Tablo 3.4. Bakterilerin asit dirençliliği sonuçları ... 80
VIII
SEMBOLLER LİSTESİ KISALTMALAR
ATCC : American Type Culture Collection Cfu : Colony forming unit
Dk : Dakika
LAB : Laktik Asit Bakterileri MRS : Man-Rogosa Sharpe rpm : Devir sayısı
F6PPK : Fruktoz 6-fosfat fosfoketolaz
HMOs : İnsan sütü oligosakaritlerinin metabolizması ADP : Adenozin Difosfat
ATP : Adenozin Trifosfat
Caco-2 : Kolon adeno karsinoma hücresi TPY : Trypticase-Phytone-Yeast Extract
Dk : Dakika
TCA : Taurokolik asit SEMBOLLER LİSTESİ
gr : Gram
ml : Mililitre
mg : Miligram
ºC : Santigrat derece pH : Asitlik Bazlık Birimi spp : Species (Türleri)
nm : Nanometre
μm : Mikrometre
cm : Santimetre
1 1.GİRİŞ
Sağlıklı olmanın göstergesi, beden, akıl ve sosyal yönden iyi gelişmiş bir vücut yapısı ve bu yapının bozulmadan uzun süre işlemesidir. İnsan sağlığı, beslenme, kalıtım ve çevre koşulları gibi birçok etmenin etkisi altındadır. Bununla birlikte yanlış beslenme vücut direncini azalttığından hastalıklara yakalanma olasılığı artmakta ve hastalıklar daha ağır seyretmektedir (Canbulat ve Özcan, 2007). Kimyasal ve biyolojik bilimler geliştiği ve kronik hastalıkların tedavi masrafları arttığı için tıbbın ilgi odağı, hastalığın tedavi edilmesinden çok, hastalığın önlenmesine doğru kaymıştır (Turgut, 2006). Sağlıklı yaşam için gastrointestinal sistemin yapısal ve fonksiyonel olarak normal olması önemlidir (Özden, 2005). İnsan ve hayvanların sağlığı üzerinde sindirim sisteminde bulunan mikrofloranın çok önemli bir rolü bulunmaktadır (Sağdıç vd., 2004).
Mikroorganizmalar çeşitli ekolojik nişlerde yaşarlar (Ventura vd., 2012). Doğal olarak toprak, su, bitki, gübre, atık su ve omurgalı hayvanların gastrointestinal sisteminde v.b. yer alırlar (Ağyar, 2010). İntestinal sistemde, deride, ürogenital sistemde, ağız ve burun boşluklarında, kısacası insan vücudunun dış ortamın etkisi altındaki ve bakterilerin hayatta kalması için uygun şartlara sahip olan her kısmında farklı grup ve türlere ait çok sayıda mikroorganizmadan meydana gelen bir mikroflora vardır. Bu mikroflora üyelerinin sayısının 1013-1014 gibi rakamlara ulaştığı tahmin edilmektedir ki bu rakam toplam insan vücut hücrelerinin yaklaşık on katıdır ve toplu olarak onların genom içeriğinden yüz mislinden daha fazla gen içermektedir. Sağlıklı bir insanın sindirim kanalı da bir çok metabolik fonksiyonları etkileyen çok fazla sayıda ve çeşitteki mikroorganizmadan meydana gelen kompleks bir ekosisteme sahiptir (Tok, 2007; Bevilacqua vd., 2003; Ventura vd., 2012). Normal mikroflora özellikle çok yoğun ve farklı bakterinin bulunduğu gastrointestinal sistem florası, konağın birçok biyokimyasal, fizyolojik ve immunolojik özelliklerini etkilemektedir (Doğan, 2012). Genel olarak sindirim sisteminde yer alan mikrobiyal popülasyondaki optimum denge iyi beslenme ve sağlıkla ilgilidir (Ortakcı, 2010). Ancak bu denge belirli nedenlerle bozulduğunda tedavi gerektirecek sağlık problemleri ortaya çıkabilmektedir (İkinci, 2011). Son yıllarda bazı besinlerin “doğal” yollardan hastalıkların önlenmesi ve tedavisindeki etkinliğinin bilimsel olarak ortaya konulması, sağlığımızın korunmasında beslenme desteğinin önemine dikkat çekmiştir (Coşkun, 2005).
2
Son yıllardaki çalışmalar probiyotik mikroorganizmaların bağırsak mikroflora dengesini yeniden sağlayarak sağlığı olumlu yönde etkilediğini ve birçok hastalıkta tedavi edici veya koruyucu etki yaptığı bildirilmektedir (Coşkun, 2005; Gülmez ve Güven, 2002). Probiyotikler; sindirim sistemi mikroflorasını geliştirerek konakçının sağlığı üzerine yararlı etkiler sunan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmıştır (Turgut, 2006).
Probiyotikler insan bağırsağındaki bakterilerin, özellikle de patojen bakterilerin kolonizasyonunu önleyerek bağırsak rahatsızlıklarını gidermede etkili olan birçok mekanizmayı harekete geçirmektedirler (Gülmez ve Güven, 2002). Ayrıca, patojen bakterilerin üremesini engelleyen inhibitör antimikrobiyal maddeler (laktik asit, asetik asit, formik asit, sitrik asit, hippurik asit gibi organik asitleri, hidrojen peroksit, diasetil, asetaldehit ve bakteriyozin gibi) üreterek patojen mikroorganizmalar üzerine direkt antagonistik etki yapmaktadırlar (Alp, 2008). Probiyotikler patojenler için gerekli olan besin maddelerini tüketerek onların sistemde uzun süre kalmasını önlemekte ve tutunma bölgeleri için patojenlerle rekabete girerek intestinal sistemde yerleşmelerini engellemektedirler (Demirkan vd., 2012). Ayrıca toksin reseptörünü yıkma ve immün sistemi güçlendirme gibi fonksiyonları da bulunmaktadır (Gülmez ve Güven, 2002).
Probiyotikler bakterilerin birçok gastrointestinal sistem hastalığının tedavisinde veya korunmada etkili olduğu gösterilmiştir (İnanç vd., 2005). Bu hastalıklar ağız ve diş sağlığı,
Helicobacter pylori enfeksiyonu, gastrit ve peptik ülser, gıda alerjiler, laktoz intoleransı,
diyare, insülin direnci, kabızlık, obezite, ‘’irritable” bağırsak sendromu, crohn ve ülseratif kolit gibi enflamatuar bağırsak hastalıkları ve kolon kanseri olarak sayılabilir (Cronin vd., 2011; Gürsoy ve Kınık, 2006). Son zamanlarda yapılan klinik çalışmalarla sadece gastrointestinal sistem rahatsızlıklarında değil başka hastalıkların tedavisinde bazı hastalıklardan ise korunmada etkili olduğu gösterilmiştir (Canbulat ve Özcan, 2007). Ürogenital sistem enfeksiyonları, atopik dermatit, serum kolesterol düzeyinin düşürülmesi ve hipertansiyon bunlara örnek verilebilir.
Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Lactobacillus, Bifidobacterium,
Pediococcus, Lactococcus, Bacillus, Bacteriodes, Streptococcus gibi bakteriler ve Aspergillus ve Candida gibi mayalardır (Önal vd., 2005). İnsanlarda Bifidobacterium
doğumdan sonra 2. ve 5. günlerde görünmeye başlamakta ve 1. haftadan sonra bağırsak mikroflorasında baskın bir duruma geçmektedir (Ceyhan ve Alıç, 2012). Anne sütünün önemli kısmını oluşturan; oligosakkaritler (nacetylglucosamine dahil), glukoz, galaktoz,
3
fukoz oligomerleri, glikoproteinler Bifidobacterium için spesifik üreme faktörüdürler (Özden, 2005). Bifidobacterium, özellikle kalın bağırsakta fazla bulunmaktadır. Bebek ve yetişkinlerin bağırsak mikroflorasında Bifidobacterium’ların baskın duruma geçmesi onların sağlıklı olduğunu göstermektedir (Alp, 2008). Bifidobacterium konağın immünoloji ve fizyoloji yanı sıra bağırsak mikrobiyal dengesini korumasıyla bağırsak sağlığının sürdürülmesinde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bifidobacterium suşlarının klinik etkileri bağırsak mikroflorasının karsinojenik aktivitesinden korunma, iltihaplı bağırsak hastalıklarını iyileştirilmesi ve ishallerin önlenmesi veya hafifletilmesi, serum kolesterol düzeyinin azaltılması, laktoz sindirim bozukluğu hafifletilmesi olarak sayılabilir (Sanz, 2007; Russell vd., 2011). Ayrıca, asetik asit ve laktik asit gibi asitlerin üretimleri ile bağırsak pH’sını da kontrol altında tutarak patojenlerin kolonizasyonunu engellemektedir (Alp, 2008). Bu yüzden probiyotik bakteri olan Bifidobacterium’lar üzerinde özellikle durulmaktadır. Bu bakteriler normal flora içerisinde korbonhidratları konakçının doğrudan kullanacağı şekilde indirgerler. Süt dönemi bebeklerinin bağırsak florasının % 95’ini oluşturan bu etkenler bebeği hastalıklardan korumada rol oynamaktadır. Bu etkenler aynı zamanda kalsiyum emilimi kolaylaştırmaktadırlar ve suda eriyen vitaminleri de sentezlemektedirler (Gülmez ve Güven, 2002; Prasanna vd., 2014). İn vitro koşullarda,
Bifidobacterium’lar E. coli, S. aureus, S. typhi, S. dysenteriae, C. albicans gibi belirli
organizmalara karşı antibakteriyel etkinlik göstermiştir (Ceyhun ve Alıç, 2012).
Probiyotik olarak kullanılacak Bifidobacterium’ların detaylı olarak yararlarının ve vücut ile etkileşimlerinin net olarak ortaya konması ve onların daha doğru kullanılması için; bu bakterilerin izolasyonu yapılmalı, fizyolojik, biyokimasal ve moleküler olarak tanımlanmalı ve sonuç olarak hangi şartlarda yaşadıkları ve hangi metabolik yollarla etki ettikleri belirleme yoluna gidilmelidir (İkinci, 2011; Ağyar, 2010).
Bu çalışmanın amacı; anne sütü ve anne sütü ile beslenen bebeklerin dışkı örneklerinden Bifidobacterium’ların izole edilmesi, izole edilen bakterilerin fizyolojik ve biyokimyasal testler (katalaz testi, arjinin hidrolizi, jelatin hidrolizi, indol reaksiyonu, glikozdan gaz çıkısı) kullanılarak tanımlanmasıdır. Daha sonra fizyolojik ve biyokimyasal testlerden geçen bakterilerin Bifidobacterium cinsine ait olduğunu belirlemek için fruktoz 6-fosfat fosfoketolaz enzim testi kullanılarak F6PPK aktivitesine pozitif olan bakterilerinin seçilmesi ve seçilen bakterilerin bazı probiyotik olabilme özelliklerinin belirlenmesidir. Bakterilerin probiyotik özelliklerinin en önemlileri arasında midenin asidik ortamına ve
4
bazı patojen bakterilere karşı olan dirençlilikleridir. Bu anlamda, izole edilen
Bifidobacterium bakterilerin asitlik dirençlilikleri belirlenmesi gerekmektedir. Son olarak
bazı patojen bakteriler üzerine Bifidobacterum’ların antimikrobiyal etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.
1.1. Gastrointestinal Sistemin Mikroflorası
Gastrointestinal sistemin (GİS) son kısımlarında, kolon ve ince bağırsak, bağırsak mikroflorası olarak adlandırılan kompleks bir bakteri ekosistemi yasamaktadır (Yeşillik, 2008). Gastrointestinal sistem doğuma kadar sterildir ve mikrobiyal kolonizasyon doğumdan sonra hemen başlar (Mitsou vd., 2008). Yeni doğan bebek önce annesinin vajinal, fekal florası ile tanışırken sonra diğer aile bireylerinin florası ve çevresel orijinli mikroplar ile temasa gelir (Özden, 2005; Favier vd., 2003). Böylece bebeğin doğumundan sonra yaklaşık 3-10 saat içerisinde bakterilerle kontamine olmakta ve ilk dönemde dominant olan E. coli, Streptococcus ve fakültatif anaerob bakteriler anne sütü ile beslenmeye başlayınca yerlerini Bifidobacterium ile Bacteroides gibi zorunlu anaerob bakterilere bırakmakta ve oral beslenmeye geçildiğinde de yetişkin kişilerin mikroflorasına benzer hale gelmekte yaşam sürecinde ufak tefek değişiklikler olsa da önemli değişiklik göstermeden varlığını devam ettirmektedir (Yeşilova, 2010; Özden, 2005). Bebeğin bağırsak florasını oluşturan bakterilerin türü ve miktarına etki eden çok sayıda faktör vardır. Annenin aldığı besinler ve probiyotik bakteri içeren gıdaları tüketip tüketmediği, doğum şekli (vajinal veya cerrahi), gebelik yaşı ve bebeğin başlangıç beslenme şekli (anne sütü ya da mama), düşük doğum ağırlıklı bebekler, antibiyotik tedavisi, erken doğum, coğrafi bölge gibi dış faktörlerin yanı sıra yeni doğan bebeğin sağlık durumu, immünolojik durumu, gastrointestinal sistem geçiş zamanı, pH’sı ve stres gibi iç faktörler bakteri gelişimini etkilemektedir (Canbulat ve Özcan, 2007; Vlková vd., 2005; Mitsou vd., 2008). Doğum kanalından geçmediklerinden sezaryenle doğan bebeklerde flora gelişimi geç olur ve daha çok çevreden alınan mikroorganizmaları içerir ve Klebsiella, Enterobacter ve
Clostridium cinsi bakteriler dominanttır ve Bifidobacterium sayısı azdır. Bu nedenle de
normal flora bakterilerinin kazanılması güçtür, gastrointestinal ve immünolojik bozukluklara daha yatkındırlar (Coşkun, 2006; Mitsou vd., 2008; Ventura vd., 2012). Yaşamın ilk haftalarında anne sütü ile beslenen bebeklerin bağırsak florasında,
Bifidobacterium’lar ve Lactobacillus’lar baskın iken mama ile beslenen bebeklerin
5
bebeklerin florasında Bifidobacterium’lar yer almakta ise de anne sütü alanlarınkinden daha azdır ve flora dağılımı oldukça karmaşıktır. Bir yaşında anne sütü ve mama ile beslenen çocukların bağırsak floraları biribirine benzer ve erişkin florasına yakındır (Mehrnıa vd., 2014). Anne sütünün önemli kısmını oluşturan; oligosakkaritler (Nacetylglucosamine dahil), glukoz, galaktoz, fukoz oligomerleri, glikoproteinler
Bifidobacterium’lar için spesifik üreme faktörüdürler (Prebiyotik). İnsan sütünün proteinin
farklı bileşimi ve protein içeriğinin az olması ve tamponlama kapasitesinin düşük olması, düşük fosfor içeriği, çok çeşitli oligosakaritler, çok sayıda humoral ve hücresel medyatör
Bifidobacterium ve Laktobacillus’ların dominant olduğu bir bebek bağırsak mikroflorası
gelişimini artırabilir (Özden, 2005; Mitsou vd., 2008). Anne sütüyle beslenen bebeklerde gözlenen Bifidobacterium’un yüksek seviyede olması anne sütü içindeki bifidogenik oligosakkaritlerin varlığındandır (Arboleya vd., 2011). Bifidobacterial türlerin (örneğin,
Bifidobacterium longum subsp. infantis) tipik bebek bağırsak mikrobiyota ile ilişkili
genomik analizi insan sütü oligosakaritlerinin metabolizması (HMOs) özel enzimleri kodlayan bir gen takımının varlığı ortaya koymuştur (Ventura vd., 2012).
Genel olarak anne sütüyle beslenen bebeklerin feçeslerinde 1010-1011 kob/g
Bifidobacterium bulunmaktadır ki bu sayı tüm bağırsak mikroflorasının tek başına % 25’
ini kapsamaktadır. Anne sütüyle beslenen bebeklerde Bifidobacterium sayısı belirgin bir şekilde artarken E. coli ve Streptococcus sayısı azalmaktadır. Clostridium yok veya çok az
sayıda bulunmaktadır. Anne sütü almayan bebeklerin sindirim sisteminde ise bu değişim gözlenememekte, Bacteroides, Clostridium ve Streptococcus yüksek sayıda kalmakta,
6
Şekil 1.1. Bebeğin bağırsak mikroflorasına dış faktörlerin etkisi. Yeşil oklar yararlı değişiklik gösterir; Kırmızı oklar sağlıklı gelişimi için negatif değişiklik göstermektedir
(Matamoros vd., 2013).
Bifidobacterum’ların çoğalmaları anne kolostrum sütü ve daha sonra anne sütündeki
k-kazeinin glikoprotein bileşeni tarafından uyarılmaktadır. Sütten kesme ve yaşın ilerlemesiyle bağırsak florasında kademeli bir değişim meydana gelmektedir. Sindirim sistemindeki türler arasında % 86’lık pay ile baskın hale geçen Bacteroides ve
Eubacterium’ların ardından Bifidobacterium üçüncü sıraya gerilemektedirler. Ek olarak B. bifidum ileri yaşlarda B. adolescentis ve B. longum ile yer değiştirmektedir. Yaşlanmanın
başlaması, genellikle ileri yaşlarda mide salgılarının azalmasının sonucu olarak kontaminant Clostridium ve koliform grubu bakterilerin sayısında artma ve
Bifidobacterium’ların sayısındaki önemli azalmalarla karakterize edilmektedir. Bundan
başka sindirim sistemindeki asıl bakterilerin profilleri değişmektedir. Bebeklerdeki B.
infantis ve B. breve ileri yaşlarda B. adolescenstis ile yer değiştirmektedir. B. longum ise
bütün yaşam boyunca bu bölgede kalmaktadır. Bu yaş profili diyetle alınan bifidojenik İntrauterin Bulaştırma Annenin bağırsak mikroflorasından translokasyon Bifidobakterium, Lactobacillus, Enterococcus Doğum şekli Sezeryanla doğum Staphylococcus, Corynebacterium, Propionibacterium Vajinal Lactobacillus, Prevotella, Sneathia Ailesel çevre Clostridium Beslenme tipi Anne sütü Bifidobacterium Mama Enterobacteriaceae Tedavi Probiotik-prebiotik Bifidobacterium, Lactobacillus Antibiyotik mikrobiyal çeşitlilik azalması
Doğum öncesi Doğum İlk hafta İlk ay Yetişkine
benzer mikroflora
7
faktörlere ve konakçının fizyolojisine bağlı olarak değişebilmektedir. B. adolescentis ve B. longum ise daha stabildir. Yaşın ilerlemesiyle bağırsak florası yeniden değişmektedir. Bifidobacterium’ların sayısı daha da azalırken zararlı bakterilerin cins ve sayısı artmaktadır
(Gomes ve Malcata, 1999; Turgut, 2006). Bağışıklık sisteminin gelişmesinde ilk mikrobiyal kolonizasyon aşaması çok önemlidir. İnsanın sağlıklı bir yaşam sürdürebilmesi için sağlıklı ve dengeli bir gastrointestinal sisteme sahip olması gerekmektedir aksi halde immün sistemin normal fonksiyon gösteremeyeceği belirtilmektedir. İnsanın normal bağırsak florası bu içeriğin gramı başına yaklaşık 1012 adet mikroorganizmadan oluşmaktadır ve bu flora 400'ün üzerinde bakteri türünü içermektedir (Canbulat ve Özcan, 2007). İnsanlarda bağırsak bakteriyel popülasyonunun yaklaşık olarak % 95’ni
Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium, Fusobacterium, Peptococcus, Bacteroides, Peptostreptococcus ve türlerinin içinde bulunduğu zorunlu anaeroplar oluşturmaktadır.
Geriye kalan kısmı ise Lactobacillus, E. coli, Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus ve
Bacillus türlerinin dahil olduğu fakültatif anaeroplardır (Doğan, 2012). İnsan
gastointestinal sistem mikrobiyel florası beslenme ve sağlıkta anahtar rol oynamaktadır. Bağırsak florası genellikle çok çeşitli ve dirençlidir (Demirkan vd., 2012). Mikroorganizmaların oluşturduğu bu mikroflora vücudumuzda bir denge halindedir (İkinçi, 2011).
Gastrointestinal sistemin bu mikroflora dengesi günümüzde tüketilen beslenme tarzındaki değişiklikler nedeniyle atalarımızdan farklılıklar göstermektedir. Atalarımız 500’den fazla farklı bitkisel yiyecek tüketirken bugün 50’den az bitkisel orijinli yiyecek tüketmekteyiz. Onlar bu yiyecekleri çiğ veya mayalanmış olarak alırken günümüzde konserve edilmiş, kurutulmuş ya da pişirerek almaktayız. Geçmişte besinler doğal olarak tüketilirken günümüzde gıda teknolojisinin ilerlemesi ile yiyeceklere birçok koruyucu madde konmakta ve artık daha rafine, daha steril gıdalar tüketmekteyiz (Özden, 2005). Beslenme tarzındaki bu değişiklikler nedeniyle geçmişte insanlar daha az tuz, yağ ve şeker tüketmekteydi. Yılda kişi başına tüketilen şeker 1850 yılında 0.5 kg iken, 2000 yılında 50 kg’a yükselmiş durumdadır. Ayrıca iki kat daha fazla mineral, 10 kat daha fazla lif, 20 kattan daha fazla antioksidan, 50 kattan daha fazla omega-3 yağ asitleri ve milyarlarca kat daha fazla canlı bakteri almaktaydılar (Coşkun, 2006). Bu nedenle gastrointestinal mikrofloramızın da atalarımızdan farklılıklar göstermesi doğaldır (Özden, 2005). Gastrointestinal sistemin mikroflora dengesi beslenme tarzındaki bu değişikliklere ilave
8
olarak çevresel etkilerden dolayı da farklılıklar göstermektedir. Yaşlılık, stres, diyet alışkanlıklarının değiştirilmesi, iklim koşullarında meydana gelen değişmeler, enfeksiyonlar, antibiyotik kullanımı ve radyasyon tedavisi gibi faktörler de gastrointestinal mikroflora dengesinde farklılıklar meydana getirmektedir (Bozkurt ve Aslım, 2004; Doğan, 2012). İntestinal sistemin dengesinde meydana gelen bu dengesizlikler “disbiosis” olarak adlandırılmaktadır. Disbiosisin tersi bir durum olarak, intestinal sistemde bulunan faydalı mikroorganizmaların sistemin fizyolojik dengesine olumlu yönde katkıda bulunmasına “probiosis”, bu mikroorganizmalara da “probiyotik mikroorganizmalar” denilmektedir (Tok, 2007).
Şekil 1.2. Bağırsak mikroflorasını etkileyen faktörler (Doğan, 2012).
Son yıllardaki çalışmalar probiyotik mikroorganizmaların ve oligosakkaroz olan prebiyotiklerin bu dengeyi yeniden sağlayarak sağlığı olumlu yönde etkilediğini ve birçok hastalıkta tedavi edici veya koruyucu etki yaptığı bildirilmektedir (Coşkun, 2005; Gülmez ve Güven, 2002).
1.2. Probiyotikler
Fermente ürünler üzerinde yapılan çalışmaların başlangıcı çok eskilere dayanmakla birlikte, probiyotikler konusunda yapılan çalışmalar ancak son 10–15 yılda hız kazanmıştır. Probiyotik terimi yeni olsa bile insanlar ve hayvanlarda sindirim üzerinde belirli
9
mikroorganizmalar uygun etkilerine ilişkin incelemeler, yüzyılın başına kadar uzanır (Gümüştekin, 2010). Gerçekten de laktik asit üreten bakterilerin konakçı insanla faydalı işbirliği 100 yıldan daha uzun bir zaman önce 1892 yılında Döderlein tarafından vajinal bakteriler için, 1900 yılında Moro ve 1901 yılında Beijerinck ve Cahn isimli araştırıcıların önderliğini yaptığı çalışmalarda, özellikle sindirim sistemindeki laktik asit bakterileri için ileri sürülmüştür. Laktik asit bakterilerinin fermente süt ürünlerinde kullanılmasıyla sağlığa yararlı etkiler yaptığı 1908 yılında Elie Metchnikoff isimli Rus araştırmacı tarafından savunulmuştur. (Turgut, 2006). Böylece Metchnikoff’ un teorisi ile “probiyotik” kavramı doğmuştur. Bu gelişmeyi takiben, 1930’larda probiyotiklerin beslenme üzerine etkileri konusunda ilk klinik denemeler gerçekleştirilmiş; 1950’lerin sonlarında ise domuzlarda görülen bir Escherichia coli enfeksiyonunun tedavisinde ilaç olarak kullanılmak üzere Amerika Birleşik Devletleri Tarım Departmanı tarafından probiyotik bir ürüne lisans verilmiş ve böylece probiyotik kavramı 20. yüzyılın başlarında hipotez olmaktan çıkmaya başlamıştır (Tok, 2007).
Fagosit teorisi ile 1903 yılında nobel ödülü alan Rus biyolog Elie Metchnikoff, Bulgar köylülerinin uzun yaşamasını fazlaca fermente süt ürünü tüketmelerine bağlayarak bu konudaki çalışmaların temelini atmıştır (Yeşilova vd., 2010; Yeşillik, 2008). Bu görüşe yönelten gözlem ile Metchnikoff bağırsaklardaki zararlı mikroorganizmaların yaşamı kısaltan ve hastalıkları davet eden toksinler salgıladığını, yoğurt tüketimi ile
Lactobacillus’ların egemen duruma geçip zararlı mikroorganizmaların yerini aldığını ileri
sürmüştür (Coşkun, 2005). 1907’de “The Prolongation of Life: Optimistic Studies” adlı kitabında yoğurttaki laktik asitin bağırsaklardaki patojen bakterileri öldürerek ya da midedeki çürüme süreçlerini engelleyerek zehirleri etkisizleştirdiğini, dolayısıyla insan vücudundaki yaşlanmayı geciktirdiğini; Kafkaslar, Anadolu ve Balkanlar’da ortalama insan ömrünün uzamasına yardımcı olduğunu öne sürerek, düzenli yoğurt yenmesinin yararlarından söz etti. 1928’de Sir Alexander Fleming’in (1881-1955) penisilini bulmasından önce bağırsak hastalıklarında bağırsak florasını düzeltmek için patojen olmayan canlı bakteriler ağız yoluyla veriliyordu. Metchnikoff’un laktik asit bakterilerinin yararlarından söz ettiği yıllarda, 1900 yılında bir Fransız çocuk hekimi olan ve Pasteur Enstitüsü’nde çalışmakta olan Henry Tissier, anne sütüyle beslenen sağlıklı bebeklerin dışkılarında çok sayıda bulunan “Y” şeklindeki “bifid” bakterilerin (Bifidobacterium) sayısının ishalli bebeklerde çok azalmış olduğunu görerek, ishal tedavisinde Bacillus
10
bifidus communis adını verdiği bu bakterilerin kullanılabileceğini ileri sürdü. Bugün
Slovenya’nın başkenti olan, ancak o yıllarda Avusturya-Macaristan İmparatorluğu’na bağlı olan Ljubljana’da doğan ve bütün çocuk hekimlerinin çok iyi bildiği “Moro Refleksi” ni tanımlayan Avusturyalı Ernst Moro (1874-1951) Viyana’da Escherichia coli’yi bulan Theodor Escherich (1857–1911) ile çalışırken, 1900’de bebeklerin dışkılarında sütü fermente eden bakterilerden ve daha sonra Lactobacillus acidophilus adı verilecek olan “Blaubacillus” (Bacillus acidophilus) olduğunu gösterdi. Bu bakteri annenin sütünde, bebeğin ağzında, midesinde ve bağırsaklarında bulunduğundan, değişik pH’larda yaşayan benzer bakteriler olabileceğini düşündü. 1901’de Arnold Cahn (d. 1858) mama ile beslenen bebeklerin dışkılarında da Lactobacillus acidophilus saptadı; 1904’de Hiram Bertram Weiss (1893-1982) bu bakterierin bol süt içenlerin dışkısında daha fazla bulunduğunu gösterdi. Anne sütüyle beslenen bebeklerin dışkılarında hangi bakterilerin daha fazla olduğu konusu Moro ile Tissier arasında tartışma konusu oldu. Moro
Lactobacillus’ların, Tissier Bifidobacterium’ların çoğunlukta olduğunu söylüyordu.
Sonunda yaşamın ilk günlerinde Bifidobacterium’ların daha fazla bulunduğu belirlendi. Ancak her ikisinin de ortak görüşü inek sütü ile beslenen bebeklerde Lactobacillus
acidophilus’un daha fazla bulunması idi. Leo F. Rettger (1877-?) ve arkadaşları 1912-1921
yıllarında yaptıkları çalışmalarda süt ve laktozdan zengin besinlerle beslenenlerin bağırsak bakteri floralarında Bifidobacterium’ların daha çok artarak Lactobacillus’lara üstünlük sağladıklarını gösterdi. Metchnikoff fermente süt ürünlerindeki laktik asit yapan bakterilerin pH düzeyini azaltarak bağırsaklarda “çürüme” (pütrefaktif, proteolitik) yapan bakterilerin sayısını azaltarak etkili olduklarını düşünüyor ve bu nedenle Bacillus
bulgaricus içeren yoğurt yenilmesini öneriyordu (Yurdakök, 2013).
Probiyotik bakteriler yeterli miktarlarda uygulandığında tüketiciye sağlık faydaları sağlayan "canlı mikroorganizmalar’’ olarak tanımlanmıştır (World Health Organization) (Ceapa vd., 2013). Probiyotik terimi ilk olarak, 1954 yılında Vergio’nun “Anti und probiotika” adlı eserinde, antibiyotikler ve diğer antimikrobiyal maddelerin sindirim sistemi mikroflorası üzerindeki zararlı etkilerini, konakçının sindirim sistemi mikroflorası üzerine olumlu etki yapan “probiotika” faktörlerle karşılaştırdığı zaman kullanılmıştır (Turgut, 2006). 1965 yılında Lilly ve Stillwell “bir mikroorganizma tarafından salgılanarak diğer bir mikroorganizmanın çoğalmasını uyaran maddeler” anlamında ve “antibiyotik” teriminin karşıtı olarak kullanılmıştır. Parker tarafından 1974 yılında intestinal mikroflora
11
üzerinde yararlı etkileri olan ilave tamamlayıcı yiyecekler olarak tanımlanmıştır. Fuller 1989’da probiyotikleri “konak hayvanın yararına olacak şekilde intestinal mikrobiyal dengesini iyileştiren canlı mikrobiyal besin katkısı” olarak ifade etmiştir (Yeşilova vd., 2010). 1992 yılında Havenaar ve Huis in’t Velt tarafından ‘’insan ve hayvanda yararlı mikrofloranın yararını artıran tek ve karışık canlı mikroorganizma kültürü’’ olarak genişletilmiştir (Gülmez ve Güven, 2002). 1995 yılında Avrupa birliğinin girişimi ile Brüksel’de probiyotik konulu uzmanlar toplantısı yapılmış, bu çerçevede probiyotikler; sağlığı artırıcı etki gösteren beslenme fizyolojisinin ana sistemleri üzerinde etkili, canlı, belirli mikroorganizmalar olarak tanımlanmıştır (Önal vd., 2005). Amsterdam’da 2004 yılında yapılan Uluslararası Probiyotik Çalıştayı’nda (International Probiotic Workshop= IPW) sağlık yönünden belirli hastalıkları tedavi edici etkileri klinik deneylerle kanıtlanmış ürünler (bakteriyel tedavi edici, mikrobiyal tedavi edici veya bakteriyel immün sistem düzenleyici) probiyotikler olarak tanımlanmıştır (Yeşilova vd., 2010).
1.2.1. Probiyotiklerin özellikleri
Bir mikroorganizmanın probiyotik olarak kabul edilebilmesi için çeşitli özelliklere sahip olması gerekir. Bunlar:
Patojen ve toksik olmamalı, Doğal floraya adapte olabilmeli, Sindirimi kolaylaştırmalı,
Probiyotik insan kökenli olmalı, Stabil olmalı,
Bağırsak hücrelerine tutunabilmeli, kolonize ve metabolize olabilmeli, Patojen bakterilere karşı antagonistik etkileri olabilmeli,
Antimikrobiyal madde üretebilmeli,
Gastrointestinal enfeksiyonlara karşı doğal direnci arttırmalı, Gıda alerjilerine ve patojenlere karşı savunmayı güçlendirebilmeli,
Bağırsakta kanamaya neden olmamalı ve bağırsak doğal geçirgenliğini bozmamalı, Oral tüketileceğinden tüketimi hoş olmalı,
Agregasyon ve koagregasyon yeteneğine sahip olmalı,
Kan basıncı ve serumda kolesterol konsantrasyonunu düşürebilmeli,
İnsan ve hayvan sağlığında çeşitli nedenlerden dolayı kullanılan antibiyotiklere karşı dirençli olmalı,
12
Gastrointestinal immün sistemi sitimüle etmeli, Kolon kanseri gelişimini önleyebilmeli,
Gıdalara eklendiğinde kaliteyi düşürmemeli ve yüksek oranda canlı mikroorganizma içermeli (Özden, 2005; Gümüştekin, 2010: Gülmez ve Güven, 2002).
Stoklama ve kullanım süresince canlı kalabilmelidir (Özden, 2005). Probiyotiklerin raf ömrü 3-6 haftadır. Kurutulmuş suplementlerin 12 ay içinde probiyotik miktarı azalmakta, bu da kullanılan bakteri düzeyine bağlı olarak değişmektedir (Yeşillik, 2008). Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerinin Genel Etiketleme ve Beslenme Yönünden Etiketleme Kuralları Tebliği (2002)’de de bir gıda ürününün probiyotik beyanına sahip olabilmesi için raf ömrü boyunca en az 106 kob/g probiyotik bakteri içermesi gereği belirtilmiştir (Akman, 2009).
1.2.1.1. Asit ve safra tuzu toleransı
Lan-szu ve Bart probiyotik bakteriler olarak seçilmiş suşların herhangi bir sağlık yararları vermeden önce ve bağırsak içinde büyümek ve epitele yapışmak için en az 90 dakika süreyle asit ve safra tuzlarına tahammüllü olduğunu kanıtlamışlardır (Liu vd., 2007). Bir mikroorganizmanın probiyotik özelliklerini gösterebilmesi için bağırsak sisteminde ve endüstriyel işlemler sırasında canlı kalabilmelidir. Ağız yolu ile alınan probiyotiklerin bağırsak sisteminde fayda sağlayabilmeleri için, bağırsağa ulaşmadan önce midenin asit ortamından (pH 1.5-3.0) canlı olarak geçebilmeleri gerekmektedir (Başyiğit, 2004). Burada kalma süresi kişiye, diyete ve ortamdaki genel duruma göre bir saatten birkaç saate kadar değişebilmektedir. Midenin pH değeri, midede gıda yokken düşük (pH 1.5), mide dolu iken yüksektir (pH 5.5). Bu şartlarda midede canlı kalabilen bakteriler için diğer bir tehdit, ince bağırsağın üst kısmındaki (duodenum) safra salgısı ve safra tuzlarına ek olarak pankreas salgıları, proteazlar ve hidrolazlar da probiyotikler için bir çevresel tehdit faktörü oluşturmaktadır. İnsanlarda uygun fizyolojik safra tuz konsantrasyonu % 0.3-0.5 arasında değişmektedir. Ancak salgılanan safra tuzlarının oranı ve konsantrasyonu tüketilen gıdaya bağlı olarak değişmektedir. Sindirimin başladığı ilk saatlerde safra tuzu konsantrasyonu % 0.5-2.0 arasında olup ikinci saat içerisinde bu oran daha düşük değerlere inebilmektedir. Bu bakımdan probiyotik bakterilerin bu konsantrasyondaki safra asitlerine dirençli olmaları gereklidir (Turgut, 2006). Safra organik (safra tuzları, kolesterol, fosfolipitler) ve inorganik (su, elektrolitler) bileşiklerin sulu bir karışımından oluşur. Safra,
13
ya doğrudan safra kanalı yoluyla karaciğerden onikiparmak bağırsağına geçer ya da sindirim için hemen gereksinim yoksa safra kesesinde depolanabilir. Karaciğerde sentezlenen safra asitleri karaciğerden ayrılmadan önce bir molekül glisin ya da taurin amino asitleri ile konjuge edilir. Konjugasyon, safra asidinin karboksil grubu ile eklenen bileşiğin amino grubu arasında oluşan amid bağı tarafından sağlanır. Oluşan bu yeni bileşik safra tuzları olarak adlandırılırlar (Hajikhani, 2011). Bunlar, glikokolik asit, glikokenodeoksikolik asit, taurokolik asit ve taurokenodeoksikolik asit’tir (Tok, 2007). Safra asitlerinin konjuge olan ve olmayan formları özellikle mikroorganizmalar üzerinde antimikrobiyal etkiye sahiptir. Ancak bu etki gram pozitiflerde daha belirgin olarak görülmektedir. Yapılan in vitro çalışmalarla Lactobacillus ve Bifidobacterium türlerinden bazılarının düşük pH’a karşı dirençli oldukları, ancak Bifidobacterum’ların Lactobacillus’lara kıyasla daha az dirençli oldukları bilinmektedir. Ayrıca
Bifidobacterium’lar ile Lactobacillus’ların safra tuzlarına dirençleri karşılaştırıldıklarında Bifidobacterium’ların daha dirençli oldukları belirtilmektedir (Başyiğit, 2004). Probiyotik
bakterilerin mideden geçerken canlı kalabilmelerinin farklılık gösterebildiği ve bu özelliğin suşa bağlı olduğu belirtilmektedir (Turgut, 2006). Lankaputhra ve Shah (1995)’ın yaptığı araştırmada L. acidophilus ve Bifidobacterium ssp.’ın sadece birkaç suşu asidik fermente gıdalarda ve sindirim sistemindeki safra tuzu konsantrasyonlarında canlı kalabilmiştir. Bu yüzden, bütün probiyotik organizmaların asit ve safra tuzunu tolere edebileceği genellenemez. Yoğurt gibi çeşitli fermente süt ürünlerinin üretiminde kullanılan laktik asit bakterileri sindirim sisteminde canlı kalamadıkları için bu ürünlere Lactobacillus
acidophilus ve Bifidobacterium gibi probiyotik bakteriler ilave edilmeye başlanmıştır
(Sağdıç vd., 2004). Probiyotik bakterilerin asitliğe karşı dayanıklı olmaları, sadece sindirim sisteminden geçerken canlı kalmalarını değil aynı zamanda bağırsaklarda kolonize olmaları için de gerekli olmaktadır (Turgut, 2006). Sonuç olarak gastrointestinal sağkalım kapasitesi potansiyel probiyotik suşlar için ilk seçim için kriter önemli bir adım olarak kabul edilmektedir (Liu vd., 2013). L. acidophilus ve L. casei pH 4.0’ün altında gelişebilirken,
Bifidobacterium spp. türleri pH 5.0’in altında gelişimleri yavaşlamaktadır (Eren, 2009).
1.2.1.2. Antibakteriyal etki mekanizması
Zamanla bazı bakterilerin antibiyotiğe karşı direnç kazanmasıyla, patojenlerin probiyotik içeren gıdalarla doğal yolla tedavi edilmesi fikri ortaya çıkmıştır. Probiyotik bakteriler sindirim sistemindeki patojenlere karşı; (1) sindirim sistemindeki bağışıklıkla
14
ilgili ve ilgili olmayan savunma bariyerlerinin artırılması, (2) patojenlerin tutunmalarının engellemesi, (3) laktik asit, asetik asit, formik asit, sitrik asit, hippurik asit gibi organik asitleri, hidrojen peroksit, CO2, diasetil, asetaldehit, bakteriosinler, diasetil ve safra tuzları
gibi metabolik ürünler vasıtasıyla patojenlerin antimikrobiyal inhibisyonu ve kompetitif baskılama şeklinde sıralanan mekanizmalarla mukavemet etmektedir (Sağdıç vd., 2004; Turgut, 2006). Probiyotiklerin bakteriyosinler, farklı düşük-moleküler ağırlıklı peptitler, antifungal peptitler veya proteinler ve yağ asitleri gibi çok sayıda antimikrobiyal bileşikler gibi farklı madde üretme kabiliyetleri, onların bağırsak içerisinde canlı kalıp konakçı canlıya faydalı etki göstermeleri ve patojenlerle rekabet edip onların bağırsaklara tutunmalarını inhibe etmeleri için en önemli özelliklerinden biri olmaktadır (Turgut, 2006). Antimikrobiyal maddeler, mikroorganizma gelişimini engelleyen, biyolojik kökenli, ikincil metabolitlerdir. Bunlar, mikroorganizmanın çoğalmasını engelleyici “bakteriostatik” veya “fungustatik” olabildikleri gibi; mikroorganizmanın ölümüne sebep olan “bakterisit” ve “fungisit” gibi maddeler de olabilirler. Mikroorganizmalar tarafından üretilen, düşük moleküler ağırlıklı, organik doğal ürünlerdir (Gümüştekin, 2010). Probiyotik bakteriler gastrointestinal sistemde enerji kazanımı için fermantasyon işlemi gerçekleştirirler. Biyokimyasal reaksiyon sonucu önemli oranda laktat ve kısmen de asetat oluştururlar (Doğan, 2012).
Glikoz 5ADP + 5Pi 3 Asetat + 2 Laktat + 5ATP
Fermantasyon sonucu oluşan laktik asit ve asetik asit ortam pH’ sını düşürür ve patojen bakterilerin üzerinde bakterisidal ve bakteriostatik etki yapar (Hajikhani, 2011). pH kontrolü aynı zamanda bakteri toksinlerinin, fenol ve aminlerin üretimini de kısıtlamaktadır. Yapılan araştırmalar sonucunda pH’nın düşmesine bağlı antimikrobiyal özelliğe sahip laktik asidin, Gram negatif bakterilerinin yaşamını kaybetmesine yol açan lipopolisakkaritlerin serbest bırakılmasına ve bunun sonucunda dış membranın geçirgen olmasına neden olan bir madde olduğunu bildirmişlerdir. Mikroorganizmaların membran yapısını bozarak, hücrenin substrat taşıma özelliğini yok etmektedir (Yiğit, 2009). Organik asitlerin antimikrobiyal etkileri pH düşürücü kabiliyetlerinin yanı sıra moleküllerin ayrışmamış formlarından dolayı ortaya çıkmıştır. Organik asitlerin varlığında hücre dışı pH’nın düşük olduğundan ve ayrışmamış asitlerin lipofilik özelliklerinden dolayı kolaylıkla ve pasif transport yoluyla hücrelerin içine girip, sitoplazmanın asidifikasyonuna neden olabildikleri belirlenmiştir. Ayrışmamış asit molekülleri patojen bakterilerin hücre
15
zarındaki elektro-kimyasal proton akışını çöktürerek ve hücre zarı geçirgenliğini değiştirerek, substrat transport sisteminin bozulmasına yol açıp ve bu yoldan patojen bakterileri üzerinde bakteriyostatik veya bakteriyosidal etki göstermektedirler. Bununla birlikte, LAB’lerinin fermente ettiği gıdalarda laktik asidin yanı sıra çok az miktarda asetik asit ve formik asitte oluşmaktadır ki buda pH’nin düşmesine ve dolaysıyla gıdalardaki kontaminant ve patojen bakterilerin inhibisyonuna neden olmuştur (Hajikhani, 2011). Bunun yanında asetik asidin Gram negatif bakterilere karşı laktik asitten daha inhibe edici olduğu belirlenmiştir (Yiğit, 2009). Üretilen organik asitler bağırsakların peristaltik hareketini hızlandırarak dolaylı olarak patojenlerin hızlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamaktadır. Probiyotikler tarafından üretilen H2O2, laktoperoksidaz-tiyosiyanat yoluyla
oluşan hidrosiyanik asit vasıtasıyla gıda kaynaklı patojenlere etki etmektedir. H2O2’nin
antimikrobiyal etkisi birçok enzimin denaturasyonuna sebep olan sülfidril gruplarının oksidasyonundan ve membran geçirgenliğinin artmasına sebep olan membran lipitlerinin peroksidasyonundan kaynaklanmaktadır (Turgut, 2006). Rahim ağzı kanserinin nedenlerinden biri olan HPV (Human Papilloma Virus) ile ilgili yapılan bir çalışma sonucunda hidrojen peroksit konsantrasyonu yüksek olan ortamdaki hücrelerin kanser hücrelerine dönüşümünün engellendiği, hatta laktik asit bakterilerinin oluşturduğu hidrojen peroksidin kanserli hücreleri tekrar eski haline dönüştürdüğü düşünülmektedir (Yiğit, 2009). Heterofermantatif LAB tarafından sentezlenen CO2 enzimatik dekarboksilasyon
reaksiyonlarını inhibe eden anaerobik ortam oluşturarak veya ikili membran lipit tabakasında birikip geçirgenliği bozarak patojenleri inhibe edebilmektedir (Turgut, 2006). Bakteriyosinin etki mekanizmasına ilişkin geliştirilen en çok kabul gören hipotezin, iki aşamalı olduğunu, birinci aşamada bakteriyosinin hücre duvarında bulunan spesifik reseptörlere hızla tutunduğunu, ikinci aşamanın ise hücrenin ölümüyle sonuçlandığını, bakteriyosinlerin letal etkilerini farklı yollarla ortaya koyduklarını; enerji üretimini ve protein veya nükleik asit sentezini engelleyen reaksiyonları başlatabildikleri gibi hücre geçirgenliğini değiştirmek suretiyle de etkilerini gösterebildiklerini bildirmektedir. İrlanda kefir tanesinde bulunan bir laktokok türünden izole edilen geniş spektrumlu bir bakteriyosin olan laktisin 3147’in bütün Gram pozitif bakterileri inhibe edebildiği gözlemlenmiştir. Bu inhibitör hedef bakteri türüne karşı dar veya geniş spektrumlu etkisi olan bakterisidal proteinler olarak bilinmekterdir (Yıldırım, 2005). Bakteriyosinlerin etki mekanizması genellikle membran seviyesinde olup, K+ iyonunun ve ATP’nin bozulmasına yol açan membran potansiyelini değiştirerek hücrenin intraselüler pH’sını koruyamamasını
16
sağlar (Yeşillik, 2008). Probiyotik bakteriler tarafından üretilen bakteriyosinler,
Staphylococcus aureus ve Clostridium perfringens gibi Gram-pozitif bakterilere karşı, Salmonella typhimurium, L. monocytogenes, B. cereus ve Escherichia coli gibi
Gram-negatif bakterilerden daha etkilidir; onların bakteriyostatik etkileri bakterisidal etkilerinden daha fazla gibi görünmektedir (Sağdıç, 2004: Bevilacqua vd., 2003). Nisin, laktobrevin, acidophilin, acidolin, laktosidin, laktolin gibi çok sayıda bakteriyosinlerin
Lactobacillus’lar tarafından üretildiği rapor edilmiştir ve bu bakteriyosinlerin geniş bir
aralıktaki gıda kaynaklı patojenlere karşı etkili olduğu bilinmektedir (Kaılasapathy ve Chın, 2000). Bifidobacterium’lar tarafından üretilen bakteriyosinler antimikrobiyal
maddeler arasındadır. Bifidin ve bifidosin olarak adlandırılan bakteriyosinlerin sırasıyla B.
bifidum 1452 NCDO ve B. bifidum 1454 NCFB suşları tarafından üretildiği ve bunların Micrococcus, Listeria, Staphylacoccus, Bacillus, Leuconostoc, Lactobacillus, Enterecoccus gibi bazı bakterilere karşı antimikrobiyal etki gösterdikleri belirlenmiştir
(Alp, 2008).
Probiyotikler bağırsaklarda patojen mikroorganizmaları inhibe etmekten başka K vitamini, biotin, pridoksin, pantotenik asit, folik asit gibi B grup vitaminlerin sentezinde etkili olduğu bilinmektedir (Demirkan vd., 2012). Bifidobacterium türleri tiamin (B1),
piridoksin (B6), folik asit (B11) ve nikotinik asit (ya da niyasin, B3) gibi B vitaminlarinin sentezinde görev alırlar, aynı zamanda, bazı suşlar da riboflavin (B2) biyosentezinde görev alan genler içerir (Cronin vd., 2011). B. animalis’in ratlarda çinko yetmezliğinden kaynaklanan bağırsak hasarını önlediği belirtilmiştir (Gülmez ve Güven, 2002). Probiyotik
Lactobacillus’lar kullanılması ile Ca, Mg, Fe gibi minerallerin emiliminin arttığına dair
bulgular elde edilmiştir (Yeşillik, 2008).
1.2.1.3. Tutunma bölgeleri üzerindeki etki mekanizması
Probiyotikler intestinal mikrobiyal dengeyi geliştirerek floraya katkıda bulunmakta, yarışma yolu ile reseptörlere bağlanarak patojenlere yer bırakmamakta, dışkı ile atılmalarını sağlamaktadır (İnanç vd., 2005). Bağırsak mukozasına probiyotik mikroorganizmaların tutunması, kolonizasyon ve enteropatojenlere karşı antogonistik etki göstermesi için gereklidir (Doğan, 2012). Probiyotiklerin bağırsak mukozasına yapışması, patojenlerin kolonizasyonunu azalttığı, immün sistemi modüle ettiği için ve zarar gören mukozanın iyileşmesini artırdığı için önemli olabilir. Lactobacillus kolonizasyonu aynı zamanda gastrointestinal hastalıkların önlenmesi için önemli olabilir. Örneğin, mukozal
17
Lactobacillus'ların miktarının azalması, ülseratif kolitle ve rotavirüs diyareye neden
olabileceği düşünülmektedir. Probiyotik kültürlerin bağırsağa ulaşması halinde, peristaltik hareketler ile bağırsaktan kayıp gitmemesi için bağırsak lümenini örten mukus tabakasına ve epitel hücrelerine tutunması gerekmektedir (Önal vd., 2005). Flora bakterileri ile bağırsak epitel hücreleri ve intestinal lenfoid doku arasında devamlı bir etkileşim söz konusudur. Bağırsak bakterileri “toll-like reseptörler” (TLR) ve “nucleotide-binding oligomerisation domain” (NOD) proteinleri tarafından tanınır. Bu reseptörler bakteri hücre duvarı lipopolisakkaritleri, peptidoglikanlar, bakteriyal flajellin ve metillenmemiş bakteri DNA’ları aracılığı ile tanınır. Patojen bakteriler bu reseptörler aracılığı ile enflamasyon başlatırken, patojen olmayanlar başlatmamaktadır (Coşkun, 2006). Bakteri hücre yüzeyindeki bileşimler, bakterilerin bağırsak epitel hücrelerine tutunmasına aracılık edebilir (Önal vd., 2005). Hücre duvarı yüzeyinde yer alan asidik mukopolisakkaritler, karbonhidrat kapsül polimerleri, glikoproteinler ve karbonhidratlar, karbonhidrat kombinasyonları ve protein benzeri (proteinaceous) bir faktördür (Doğan, 2012). Bağırsak epitel tabakalarını kaplayan mukus, sindirim sistemi mikroorganizmaları için bağırsaktaki ilk yüzeysel temas yeri olup, bakteriyel yapışma ve kolonizasyon için önemli bir yer olarak göz önüne alınır. Bakteri hücre yüzeyindeki bileşimler, bakterilerin bağırsak epitel hücrelerine yapışmasına aracılık edebilmektedirler. Probiyotik bakterilerin intestinal epitel hücrelerle adezyonunu sağlayan çeşitli yüzey etkenleri vardır. Bu etkenler, pasif kuvvetler, elektrostatik ilişkiler, hidrofobik, sterik kuvvetlerle ve lipoteikoik asit, lektinlerle kaplı özgün yapılarla ilişkili etkenler olarak sayılabilir (Ağyar, 2010). Lactobacillus’ların insan bağırsak hücrelerine tutunmasının, bakteri yüzeyinde bulunan protein ve karbonhidratların farklı kombinasyonlarından oluşan mekanizmadan kaynaklandığı ayrıca divalent katyonların (Ca+2) da tutunmada etkili olduğu görülmüştür (Önal vd., 2005).
Bifidobacterium’ların epitel yüzeylere tutunmasında proteinaceous olarak adlandırılan
protein yapıda bir bileşiğin aracılık ettiği bulunmuştur (Ceyhan ve Alıç, 2012).
Bifidobacterium’ların yapışkan-benzeri proteinlerinin türe özgü olduğu gösterilmiştir.
Bağırsaktaki tutunma yerleri en çok; enterositlere benzeyen Caco-2 (kolon adeno karsinoma hücresi) ve HT-29 hücreleri doku kültür hücreleri, bağırsak mukusu ve ekstraselüler matriks glikoproteinleridir. Bu hücre tabakaları, polarizasyon, işlevsel fırça kenar ve bağırsak hidrolazlarını içeren olgun enterosit karakterine sahiptir (Doğan, 2012). Özellikle insanda, in vivo olarak bakteriyel yapışma çalışmaları sırasında karşılaşılabilecek zorluklar nedeniyle, insan bağırsak hücrelerine bakteriyel yapışma için in vitro model
18
sistemi geliştirilmiştir. Araştırıcılar, insan bağırsak epitelinde bulunan çeşitli tipteki hücrelerin özelliklerine sahip, insan adenocarcinoma hücrelerini izole ettiler. Bakteriyel çalışmalarda çoğunlukla kullanılan hücrelerden biri Caco-2 (Colon Adeno Carcinoma Cell) hücresidir. Caco-2 hücreleri normal ince bağırsak villus hücrelerinin özelliklerine sahip olduğu için, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, enterotoksijenik
Escherichia coli ve Vibrio cholerae ile yapılan yapışmaya yönelik çalışmalarda yaygın
olarak kullanılmaktadır. Caco-2 hücreleri yalnızca normal mikroorganizmaların yapışma mekanizmasıyla ilgili çalışmada değil, aynı zamanda bu bakterilerin patojenler ile aynı ekosistem için nasıl rekabete girebildiklerini gösteren çalışmalarda da kullanılmıştır (Önal vd., 2005). İnsan intestinal mukoz dokularından yapılan çalışmalarda patojenik E. coli ve
Salmonella türlerinin intestinal doku hücrelerine tutunma yeteneğinin probiyotik
bakterilerle yaptığı rekabet sonucu azaldığı görülmüştür. Lactobacillus GG ve L.
rhamnosus türleri patojenlerin intestinal dokulara tutunmasını azalttığı saptanmıştır
(Doğan, 2012). Bifidobacterium ssp. genellikle, L. acidophilus, B. infantis ve B. longum’dan daha iyi tutunma özelliğine sahip olmuştur (Sağdıç vd., 2004).
Şekil 1.3. İnsan bağırsak hücrelerine L. acidophilus BG2FO4’ ün yapışması için önerilen model. Yapışan Lactobacillus' lar tarafından üretilen ekstraselüler bağlayıcı protein bakterinin bağırsak hücrelerine bağlanmasında köprü görevi görür (Önal vd., 2005).
1.2.1.4. İmmün sistem üzerindeki etki mekanizması
Probiyotik bakteriler bağırsaklardaki immün sistem hücreleri ile devamlı etkileşim halindedir. Bu etkileşim immün sistemin gelişimi için önemlidir. Bağırsaklar, lenf dokuları ile ilişkilisinden dolayı canlı vücudundaki en büyük immun organ sayılırlar (Ağyar, 2010). İmmün sistemin yaklaşık % 70’i GİS’de bulunmaktadır. Bakterisiz ortamda yetiştirilen
19
hayvanların bağırsak lenfoid dokusunun gelişememesi bakterilerin immun sistemde ne kadar önemli ve gerekli olduğunu göstermektedir (Yeşillik, 2008). In vitro sistemlerde, hayvan ve insanlar üzerine yapılan araştırmalarda probiyotik bakterilerin hem spesifik (doğal immunite) hem de spesifik olmayan (adaptif immunite) immun yanıtları arttırarak konukçunun immun sistemi üzerine pozitif etkilere sahip oldukları saptanmıştır (Eren, 2009). Probiyotiklerin bağırsaklarda özgül olmayan savunma bariyerini uyarıcı etkisi, artan intestinal permeabiliteyi normale dönüştürmesi ve bağırsak mikroflorasını değiştirmesi ile açıklanmaktadır. Ayrıca bu etkinin intestinal immünoglobulin A (IgA) yanıtını arttırması ve intestinal inflamatuar yanıtı hafifletmesi ile ilgili olabileceği belirtilmektedir (Bozkurt ve Aslım, 2004). Probiyotiklerin bu etkinliklerini fagositik aktivite, sitokin salınımı, doğal öldürücü hücre aktivitesi, immünoglobulin aktivitesi (IgA, IgG, IgM), T ve B hücre fonksiyonunu arttırarak gösterdiği ileri sürülmektedir (Tok, 2007). Bifidobacterium’lar in
vivo koşullarda, yüksek oranlarda IgA oluşumunu teşvik etmektedir. Bir araştırmada, B.
animalis, B. longum, B. breve türlerinden B. breve’nin tüm suşları ile bir B. longum
izolatlarının IgA sentezini önemli oranlarda yükselttiği tespit edilmiştir (Başyiğit, 2004). Ig A gibi antikorların artması virüs, Clostridium, E. coli gibi patojenlere karşı vücudun dirençliliğini artırmıştır (Yiğit, 2009). Gönüllü deneklerle yapılan başka bir araştırmada L.
acidophilus ve B. bifidum bakterilerinin tüketilmesinden sonra, bu kişilerin kanlarında
spesifik olmayan fagosit aktivitesinin arttığı saptanmıştır. Yine placebo kontrollü 12 kişi üzerinde yapılan bir çalışmada B. lactis verilen kişilerde verilmeyen kişilere göre genel bağışıklığın arttığı bildirilmiştir. İmmunoglobülin üreten hücrelerin yaklaşık % 80’i (1010) tek başına ince bağırsaklarda bulunmaktadır. Probiyotik etkilerin birçoğu bağışıklığın düzenlenmesinde ve özellikle de T lenfositlerden salgılanan sitokinlerin dengede tutulmasında yardımcı olmakta ve bu suretle bağırsak rahatsızlıklarının hafifletilmesinde, mukozal yapının düzeltilmesinde ve alerjilerin iyileştirilmesinde probiyotiklerin kullanılmaları önerilmektedir (Turgut, 2006). Probiyotiklerin bu aktivitesinin alerjik duyarlılığı olan bireyler içinde önemli olduğu vurgulanmıştır. Yapılan çalışmalarda probiyotik bakterilerin sağlıklı ve alerjik bireylerde farklı fagositik aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Sağlıklı bireylerde immün sistemi uyarıcı etki, alerjik bireylerde inflamatuar yanıtı azaltıcı etki yapmaktadır. Bu veriler gastroenterit, besin alerjisi ve inflamatuar barsak hastalıkları gibi barsak mukoza bariyerindeki bozukluklarda probiyotiklerin kullanılabileceğini göstermektedir (Bozkur ve Aslım, 2004). Probiyotikler GİS’teki immun sistemi güçlendirdiği gibi sistemik immun yanıt üzerine de etkilidir. Tifo aşısı ile birlikte
20
Lactobacillus GG verilen grupta aşıya yanıt daha iyi olmuştur. Finlandiya’da yapılan bir
çalışmada ise rotavirus aşısına yanıtta benzer sonuçlar alınmıştır (Yeşillik, 2008). Probiyotikler immünite üzerinde yukarıda sıralanan değişiklikleri yaparken vücuda zarar verebilecek immün mekanizmaları harekete geçirmemektedir (Coşkun, 2006).
1.2.1.5. Toksin reseptörleri yıkımı
Bu mekanizma hayvanlarda Saccharomyces boulardii intestinal mukozada bulunan
Clostridium difficile toksin reseptörlerini parçalayarak konakçıyı koruması nedeniyle
ortaya atılmıştır (Demirkan vd., 2012). Probiyotikler antitoksin etki göstererek GİS enfeksiyonlarına karşı direnç oluşturmaktadırlar. Ayrıca safra tuzları ve yağ asitlerini enteropatojen mikroorganizmaların sindiriminden koruyarak, bunların toksik veya zararlı ürünlere dönüşümünü önlerler (İnanç vd., 2005).
1.2.1.6. Proteolitik aktivite
Probiyotik bakterilerin ayrıca proteolitik enzimler (pH 2.5–9.0 aralığı) ürettiği gözlemlenmiştir. Böylece normal bağırsak mikroflorasında bu bakterilerin proteinleri metabolize ettiği sonucuna varılmıştır (Doğan, 2012). Yoğurt geleneksel olarak
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve L. delbrueckii ssp. bulgaricus kullanılarak
üretilir ve bu bakteriler, proteolitik tabiatı ile simbiyotik ilişkilerinden dolayı esansiyel amino asitleri üretirler. Bu iki bakteri sütte çok hızlı gelişir. Bununla beraber, L.
acidophilus ve Bifidobacterium’lar, proteolitik aktivitelerinin eksikliğinden dolayı sütteki
gelişmeleri yavaştır. Yoğurt bakterileri probiyotik bakterilerden (L. acidophilus ve
Bifidobacterium’lar) daha yüksek proteolitik aktiviteye sahiptirler. Bundan dolayı yoğurt
bakterilerinin, fermantasyon süresinin azaltılması için probiyotik ürünlere katılması pratiktir. Sonuç olarak yoğurt bakterileri, probiyotik bakterilerle beraber kültür olarak kullanılmaktadır. Bu bakımdan probiyotik bakterilerin seçiminde proteolitik aktivite önemlidir.
1.2.1.7. β- D- galaktosidaz aktivitesi
Yoğurt bakterileri, probiyotik bakterilerden daha fazla β-galaktosidaz aktivitesine sahiptir. Yoğurt bakterileri, probiyotik bakterilerle beraber kullanıldığında, probiyotik bakterilerden daha hızlı geliştikleri için, proteolitik ve β-D- galaktosidaz aktiviteleri daha yüksektir (Sağdıç vd., 2004).
