4. DENEY SONUÇLARI VE YORUMLAR
4.4 Yoğunluk Ölçümü
5.1) Obtenção dos peptídeos
Todos os peptídeos empregados nesse estudo foram sintetizados manualmente através de síntese em fase sólida. Esta metodologia foi escolhida pelo fato de ser mais rápida e prática que a síntese em solução. Dentre as diversas estratégias de síntese em fase sólida, optamos por adotar a estratégia t-Boc, devido à estabilidade do grupo t- butiloxicarbonila (t-Boc) empregado como protetor do α-aminogrupo dos aminoácidos doadores de acila ao tratamento com ácido trifluoroácetico que é utilizado na remoção do grupo t-Boc (Machado e cols., 2004). Alem disso, as cadeias laterais reativas dos aminoácidos por serem protegidas por grupos do tipo benzila também apresentam estabilidade durante todo o processo sintético.
A resina de partida apresentava um grau de substituição de 0,7 mmol/g-1 e a escala
de síntese adotada foi de 1,0 mmol para todas as sequências peptídicas sintetizadas. Escolheu-se a resina comercial metilbenzidrilamino-resina (MBAR) pelo fato de a mesma apresentar partículas poliméricas cujo tamanho e formato permitem um inchamento rápido e eficiente. Os grãos desta resina são totalmente inertes aos reagentes e solventes utilizados durante a síntese. Outra vantagem de se empregar a resina MBA é que na etapa de desproteção do grupamento t-Boc por TFA, praticamente não ocorre a indesejável clivagem parcial do peptídeo da resina. Além disso, durante a etapa de clivagem final do peptídeo com TFMSA não apresenta problemas de desligamento dos peptídeos como tem sido observado com resinas benzidrilamino (BAR), principalmente quando o primeiro resíduo de aminoácido é hidrofóbico (Jubilut e cols., 1999).
Nos acoplamentos utilizou-se um excesso de 2,5 vezes dos componentes carboxílicos (Boc-AA) e dos agentes acopladores (TBTU/DIPEA) com o objetivo de deslocar o equilíbrio da reação no sentido da formação do produto. Nesta etapa, uma mistura de 20% DMSO em NMP foi usada como solvente, e em média, gastou-se cerca de duas horas para o acoplamento de cada resíduo de aminoácido. Os acoplamentos e as desproteções em cada etapa foram monitorados pelo teste de Kaiser (Kaiser e cols., 1970).
Durante o processo de síntese, com o avanço no enlongamento da cadeia peptídica, enfrentamos dificuldades nos acoplamentos, sobretudo a partir do terceiro resíduo de serina na posição 93. A partir desse ponto tornou-se cada vez mais difícil acoplar os resíduos de aminoácidos subseqüentes, sendo necessárias várias etapas de reacoplamento, o que talvez tenha contribuído para o surgimento de contaminantes, e consequentemente acarretando um baixo rendimento observado em todas as sínteses.
Todos os fragmentos obtidos apresentaram boa solubilidade em água, sendo desnecessária a adição de soluções acidificadas com AcOH ou ácido fórmico por exemplo, para tentar melhorar a solubilidade.
O uso de colunas de fase reversa nas purificações por cromatografia liquida mostrou-se satisfatório na obtenção adequada dos peptídeos de interesse. A maior parte das purificações foi realizada em uma única etapa na presença de TFA como par iônico, exceto para os fragmentos [D-Leu4]-OB3 e Ac-[Ser96, D-Leu90]-hLEP
89-98-NH2, cujas
purificações foram realizadas em 2 etapas (TEAP seguida de TFA – Vide Tabela VI – pg.
41). Os rendimentos das purificações variaram entre 4 e12% (Tabela VI). Esse baixo rendimento estava dentro do previsto, pois o objetivo principal de nossas sínteses foi o de obter peptídeos com pureza acima de 95% (vide Tabela VII – pg. 42).
Todos os peptídeos utilizados neste trabalho foram caracterizados por HPLC acoplada a espectrometria de massas (Vide Tabela VII – pg. 42 e Figuras 17 e 18 –
pgs. 39 e 40, tomadas como exemplo). Os cromatogramas de LC/ESI-MS mostraram
perfis semelhantes e compatíveis entre si, e os resultados obtidos por espectrometria de massas apresentaram-se coerentes com os valores teóricos esperados, confirmando assim, a identidade química dos peptídeos estudados.
5.2) Análise estrutural dos peptídeos - Dicroísmo circular (CD)
5.2.1) Estudos em água e em diferentes concentrações de SDS e TFE
Em água (Vide Figura 19 – pg. 44), todos os espectros dos fragmentos, com exceção do Ac-[Ser96, D-Leu98]-hLEP
89-98-NH2, possuem um mínimo negativo em torno
de 205 nm e um máximo positivo em torno de 190 nm, que caracterizam estruturas do tipo beta. No caso de peptídeos, essas estruturas incluem principalmente dobras, fitas e mesmo grampos em último caso. Em geral, folhas paralelas e/ou antiparalelas não são formadas em sequências peptídicas curtas como as aqui apresentadas. Além disso, não se pode descartar a possibilidade de algum conteúdo desordenado. O fragmento Ac-
[Ser96, D-Leu98]-hLEP89-98-NH2 possui o mínimo negativo em torno de 197 nm, além da
ausência do máximo positivo, apontando para um estrutura mais desordenada do que os demais compostos. Ainda em água (Vide Figura 20 – pg. 45), os espectros dos fragmentos, Ac-[Ser96, D-Leu90]-hLEP89-98-NH2; Ac-[Ser96, D-Ala91]-hLEP89-98-NH2 e Ac-
[Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2 possuem um mínimo negativo em torno de 205 nm, mas
sem um máximo positivo em torno de 190 nm, caracterizando estruturas majoritariamente desordenadas. Já os espectros dos fragmentos, Ac-[Ser96, D-Val89]-hLEP89-98-NH2; Ac-
bem definidos caracterizando estruturas ordenadas. Os dois primeiros espectros, Ac- [Ser96, D-Val89]-hLEP
89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Ser93]-hLEP89-98-NH2 possuem um máximo
positivo em torno de 200 e um mínimo negativo em torno de 220, característicos de estruturas tipo beta, que incluem principalmente dobras, fitas e chegando a grampos, em último caso. Neste caso, dificilmente haverá algum conteúdo desordenado, como os encontrados com os compostos ilustrados na Figura 19 (pg. 44). O espectro do fragmento Ac-[Ser96]-hLEP89-98-NH2, embora possua mínimo em torno de 205 e um
máximo positivo, indicando estrutura ordenada, pode também indicar a presença de estrutura desordenada.
Na presença de 1 mM de SDS (Vide Figura 21 – pg. 46), todos os fragmentos possuem um espectro com forma característica de alto conteúdo de estrutura desordenada: mínimo negativo abaixo de 200 nm e a ausência de um máximo positivo em torno de 190 nm. A variabilidade destes espectros (posição exata do mínimo e intensidade dos mínimos) é também característica do estado desordenado. Com exceção do espectro (Vide Figura 22 – pg. 47) do fragmento Ac-[Ser96]-hLEP89-98-NH2, todos os
demais adquiriram característica de estruturas ordenadas na presença do 1 mM de SDS. Embora apresentem picos que caracterizem estruturas regulares, os fragmentos adquiriram estruturas diferentes entre si.
Em 15 mM de SDS (Vide Figura 23 – pg. 48), apenas os espectros dos fragmentos, Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP89-98-NH2; Ac-[Ser96, D-His97]-hLEP89-98-NH2 e Ac-
[Ser96, D-Leu98]-hLEP
89-98-NH2 apresentaram algum conteúdo de estrutura organizada
(podendo ser helicoidal), como sugerido pelo aparecimento do mínimo em torno de 220 nm. Apenas o espectro (Vide Figura 24 – pg. 49) do fragmento Ac-[Ser96, D-Ser93]-
hLEP89-98-NH2 parece conter a maior porcentagem de estrutura regular neste grupo. Os
demais apresentam espectros característicos de estruturas tipo beta, porém com conteúdo considerável de estruturas randômicas, como no caso dos espectros da Figura
19 (pg. 44).
Na presença de 10% de TFE (Vide Figura 24 – pg. 49), os espectros dos
fragmentos, Ac-[Ser96, D-His97]-hLEP
89-98-NH2; Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP89-98-NH2; Ac-
[Ser96, D-Lys94]-hLEP89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Leu98]-hLEP89-98-NH2 parecem ter
adquirido uma banda em torno de 220 nm sugerindo uma estrutura um pouco mais regular. Os demais apresentam espectros característicos de estruturas tipo beta, porém com algum conteúdo de estruturas randômicas. Apenas o espectro (Vide Figura 26 – pg. xx) do fragmento Ac-[Ser96, D-Ser93]-hLEP89-98-NH2 parece conter a maior porcentagem
estruturas tipo beta, porém com conteúdo considerável de estruturas randômicas, como no caso da Figura 19 (pg. 44).
Em 50% de TFE (Vide Figura 27 – pg. 52), com exceção do espectro do fragmento
Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP
89-98-NH2, os demais adquiriram uma forma espectral condizente
com o aumento na estrutura regular. Alguns mostram o aparecimento de uma leve banda em torno de 220 nm sugerindo conteúdos helicoidais, como esperado quando da adição de TFE. Todos os espectros (Vide Figura 28 – pg. 53) dos fragmentos possuem uma forma condizente com alta porcentagem de estruturas regulares. Além disso, há o aparecimento de uma leve banda próxima a 220 nm, sugerindo o aparecimento de estruturas helicoidais, provavelmente induzidas pelo TFE.
5.3) Ensaios biológicos
5.3.1) Variações no consumo alimentar e de peso corporal
Durante a elaboração desse estudo havíamos planejado a utilização de camundongos ob/ob, já que com este modelo de experimentação animal não haveria a necessidade de cirurgias e a via de administração das soluçoes contendo os peptídeos seria subcutanea. Este modelo tem sido empregado com sucesso por outros grupos de pesquisa (Rozhavskaya-Arena e cols., 2000b; Grasso e cols., 2001; Della-Fera e cols., 2005; Duan e cols., 2007; Vareniuk e cols., 2007; Novakovic e cols., 2010). Infelizmente, devido a problemas com as ninhadas no biotério da UNIFESP (CEDEME) não houve a disponibilidade dos animais em numero suficiente para os ensaios biológicos planejados. Por esta razão, decidiu-se pela utilização de ratos Wistar machos, com idade de 12 semanas e pesos entre 260 e 280g. Nessa escolha levamos em consideração a disponibilidade dos animais nos biotérios do CEDEME e do INFAR. No entanto, o uso deste tipo de animal obriga a realização de manipulção cirurgica para o implante de uma cânula guia para a administração das soluções dos peptídeos via intracerebroventricular. O emprego de ratos Wistar em lugar de camundongos ob/ob, também tem sido empregado com bastante sucesso em pesquisas sobre obesidade, como modelos experimentais não-genéticos (Telles e cols., 2003; Telles, 2006; Martins e cols., 2009).
Inicialmente, encontramos alguns problemas no protocolo e também no período de recuperação pós-cirúrgico, que muitas vezes levava a perda de animais, principalmente, em razão de infecção e/ou outras complicações. Para contornar esses problemas e para promover o melhor conforto possível aos animais, após o procedimento cirúrgico os mesmos foram acondicionados individualmente em gaiolas providas de um microisolador. Após seis horas do procedimento cirúrgico e durante os quatro dias subseqüentes os
animais receberam doses ip de Ceftriaxona Sódica que é antibiótico de largo espectro. Alem disso, foram administradas doses, via oral, de Ibuprofeno, que é uma droga antitérmica e antiinflamatória. Os animais tiveram seus pesos corporais registrados durante todo o período de recuperação e aqueles que apresentaram perdas maiores que 20%, indicativo de que os animais estão passando por algum grau de sofrimento, ao final do sétimo dia de recuperação foram descartados.
Inicialmente, optou-se em apresentar as variações no consumo alimentar (Figuras
29 e 31 – pgs 54 e 56), assim como os de peso corporal (Figuras 30 e 32 – pgs. 55 e 57) em duas figuras para facilitar a visualização destes resultados. Os efeitos causados
pelos peptídeos foram sempre comparados com os obtidos com os seguintes controles: 1) CSF, meio liquido em que os peptídeos são diluídos e administrados; 2) fragmento [D-
Leu4]-OB3 descrito e testados por Grasso e colaboradores (Grasso e cols., 2001; Lee e
cols., 2010; Novakovic e cols., 2010) que foi por nos escolhido por ser um composto muito citado na literatura e 3) o Ac-[Ser96]-hLEP89-98-NH2 que também já foi testado e descrito
anteriormente pelo nosso grupo (Martins e cols., 2009). Este último composto foi o ponto de partida na elaboração das sequências peptídicas empregadas neste trabalho. A sua escolha foi devida a sua importante atividade biológica e também ao seu pequeno tamanho (em comparação com a leptina integra) o que representa uma tremenda economia financeira em sua obtenção. Como esta molécula não apresenta uma boa estabilidade quando diluída em plasma, nesta nova serie de fragmentos os resíduos de aminoácidos foram puntualmente substituídos pelos seus respectivos D-isômeros. Este tipo de estratégia tem sido muito empregada com este objetivo (Hong e cols., 1999; Tugyi e cols., 2005; Fazio e cols., 2006).
Nas Figura 29 e 30 (pgs. 54 e 55) observa-se que dentre os peptídeos testados somente [D-Leu4]-OB3 e Ac-[Ser96]-hLEP
89-98-NH2 foram capazes de promover reduções
no consumo alimentar (da ordem de 60%) e do peso corporal (4 e 6%, respectivamente) de modo significativo quando comparados ao grupo controle (CSF). Já os fragmentos Ac-
[D-Ser96]-hLEP89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Lys94]-hLEP89-98-NH2 foram capazes de reduzir o
consumo (cerca de 30 e 20%, respctivamente), mas não causaram variações significativas no peso corporal do animais tratados. Diferentemente do comportamento global, o fragmento Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP
89-98-NH2 promoveu um aumento de 20% na
ingestão alimentar e de 4% no peso corporal.
Nas Figuras 31 e 32 (pgs. 55 e 57) observa-se que dentre os peptídeos testados
[D-Leu4]-OB3, Ac-[Ser96]-hLEP89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2 foram
primeiros de 50% para o ultimo) e do peso corporal (entre 4 e 6) de modo significativo quando comparados ao grupo controle (CSF). Já os fragmentos Ac-[Ser96, D-Leu90]-
hLEP89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Val89]-hLEP89-98-NH2 promoveram um aumento de 30% na
ingestão alimentar e de 2% no peso corporal.
Na Figura 33 (pg. 58) estão sumarizados os efeitos globais, ao longo dos 4 dias de tratamento, nas variações de consumo alimentar e de peso corporal de todos os fragmentos testados. Como pode novamente observado os melhores resultados foram os obtidos com os fragmentos, [D-Leu4]-OB3, Ac-[Ser96]-hLEP
89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-
Phe92]-hLEP89-98-NH2. Já os compostos, Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP89-98-NH2; Ac-[Ser96, D-
Val89]-hLEP89-98-NH2 e Ac-[Ser96, D-Leu90]-hLEP89-98-NH2, apresentaram os piores
resultados, pois causaram aumentos tanto na ingestão alimentar como no peso corporal.
5.3.2) Variações das taxas glicêmicas em ratos Wistar
Para as medidas da glicemia os animais foram submetidos a um jejum prévio de seis horas, quando então, sofreram leve punção caudal com o auxílio de uma lanceta estéril para obtenção de amostras de sangue. Os resultados estão representados na
Figuras 34 e 35 (pgs. 59 e 60), onde observa-se que somente os peptídeos [D-Leu4]-
OB3 e Ac-[D-Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2 foram capazes de reduzir a glicemia após o
quarto dia de tratamento. O resultado obtido com o fragmento [D-Leu4]-OB3 já era
esperado uma vez que Grasso e colaboradores, já assim o haviam descrito (Novakovic e cols., 2010). Com o fragmento Ac-[D-Ser96, D-Phe92]-hLEP
89-98-NH2 a redução
significativa da taxa glicêmica foi concordante com o resultado observado na variação de consumo e de peso corporal.
5.3.3) Estabilidade dos fragmentos em plasma.
Em relação aos estudos de estabilidade dos peptídeos, utilizamos um pool de plasmas frescos de 10 ratos Wistar machos, com idade de 12 semanas. A cinética de degradação (Vide Figura 36, pg. 61) nos mostra que os peptídeos que adquiriram uma maior resistência à degradação quando comparados com o controle, Ac-[Ser96]-hLEP
89- 98-NH2 (praticamente 100% de degradação em apenas 10 minutos), foram aqueles com
substituições nos resíduos nas posições de 91 a 94 (Ac-[D-Ser96, D-Ala91]-hLEP
89-98-NH2,
Ac-[D-Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2, Ac-[D-Ser96, D-Ser93]-hLEP89-98-NH2 e Ac-[D-
Ser96, D-Lys94]-hLEP89-98-NH2). Destas observações podemos inferir que a inserção de
um D-aminoácido nas posições entre os resíduos 91 e 94 do fragmento promoveram um aumento na proteção das moléculas.
Destes resultados destacamos os obtidos com fragmento Ac-[D-Ser96, D-Phe92]-
hLEP89-98-NH2 cujas atividades na variação de ingestão alimentar e de peso corporal
foram das melhores por nos obtidas.
5.3.4) Relação estrutura-atividade dos fragmentos.
Quando fazemos uma analise global dos resultados das atividades biológicas com os estudos conformacionais por Dicroísmo Circular observamos que não há uma clara correlação entre eles, ou seja os peptídeos mais ativos não assumem uma conformação única e estável. A falta de uma estrutura preferencial e preponderante já era esperada devido a principalmente o tamanho dos peptídeos aqui estudados.
Dentre os três peptídeos mais ativos, [D-Leu4]-OB3, Ac-[Ser96]-hLEP
89-98-NH2 e
Ac-[Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2 cabem as seguintes considerações. O [D-Leu4]-OB3
que já foi e continua sendo muito estudado na literatura (Rozhavskaya-Arena e cols., 2000b; Grasso e cols., 2001; De Oliveira e cols., 2008; Lee e cols., 2008; Novakovic e cols., 2009; Lee e cols., 2010; Novakovic e cols., 2010) por apresentar um único resíduo de cisteína sofre o processo de oxidação, e consequentemente de dimerização (via formação da ponte de dissulfeto intramolecular) como pode ser observado nas Figuras 37 e 38 (pgs. 62 e 63). O mesmo fenômeno também foi observado [Vide Figuras 39 e 40 (pgs. 64 e 65)] com o peptideo Ac-hLEP89-98-NH2 (Ac-F-S-K-S-C-H-L-P-W-A-NH2) daí a
necessidade de se substituir o resíduo de cisteína por um de serina, originando o composto Ac-[Ser96]-hLEP
89-98-NH2 usado neste trabalho como controle e ponto de
partida no desenho desta nova serie de fragmentos derivados da leptina. Quanto ao fragmento Ac-[Ser96]-hLEP
89-98-NH2 embora muito ativo, mostrou-se
estremamente instável quando diluido no plasma, uma vez que foi rapidamente degradado.
Assim sendo, deste trabalho concluímos que o melhor fragmento foi o Ac-[Ser96, D-
Phe92]-hLEP
89-98-NH2 que está entre os mais ativos e é também mais estável no que se