Yapılan Diğer Çalışmalar

4.5.4.1. Desenho do estudo e população estudada

Foi realizado um estudo longitudinal para avaliar a expressão gênica na fase sintomática da LV e após a fase de recuperação (>2 meses após o tratamento). Os critérios de inclusão para confirmação da LV compreendiam positividade em pelo menos dois métodos diagnósticos, incluindo demonstração parasitológica, positividade para formas amastigotas no aspirado de medula óssea, e sorologia positiva pelo método ELISA utilizando fração solúvel (SLA) e antígeno K39 de Leishmania infantum. Nenhum dos pacientes tinha sido transfundido e todos apresentavam sorologia negativa para HIV.

4.5.4.2. Isolamento do RNA

Foram coletados 10mL de sangue para obtenção de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). PBMC foram obtidas utilizando um gradiente de Ficol hypaque. As células foram estimuladas com 10µg/mL de antígeno solúvel de leishmania (SLA) durante 4 horas em incubadora com 5% CO2 e temperatura de 37ºC. A cada poço com células são adicionados 200µL

trizol seguindo uma incubação de 15 minutos. Após ser incubado por 15 minutos foram adicionados 0,2mL de clorofórmio para 1mL de trizol inicial, incubado a temperatura ambiente por 2 minutos. A amostra foi centrifugada a 11400rpm por 15 minutos a 4ºC. Após a centrifugação foi retirado a fase aquosa (superior) e transferidos para um microtubo, o RNA total precipitado com isopropanol: (0,5ml de propanol para cada 1mL de trizol). O RNA precipitado foi incubado durante 10 minutos em temperatura ambiente e centrifugado 11400rpm por 10 minutos a 4ºC. O precipitado foi então lavado

com 1mL de etanol 75% e seco a 37ºC por 10 minutos. O RNA total foi ressuspenso em 30L de água livre de RNAse. Os estoques de RNA foram mantidos a –80ºC.

4.5.4.3. Avaliação da expressão gênica em células mononucleares.

A concentração do RNA foi determinada utilizando o espectrofotômetro

NanoDrop ND-1000, seguida da avaliação usando o RNA 6000 Nano Assay do Agilent 2100 Bioanalyzer. As amostras que apresentaram bons picos na posição 18S e 28S, sem picos de degradação e contaminação com DNA genômico com RIN (número de integridade de RNA) acima de 7.0 foram utilizadas para gerar o cDNA.

A amplificação do RNA foi realizada utilizando-se o WT-OvationTM Pico RNA Amplification System (Nugen Technologies, Inc). Este sistema utiliza a tecnologia Ribo-SPIATM para preparar cDNA a partir do RNA total. Inicialmente foi preparado a primeira fita de cDNA a partir do RNA utilizando um primer mix, uma fita única de DNA/RNA quimérico e a transcriptase reversa (RT). Os primers possuem uma porção do DNA que hibridiza tanto na porção 5’ da sequência poly (A) quanto aleatoriamente através do transcrito. O resultado desta etapa é a molécula híbrida cDNA/mRNA contendo a sequência única de RNA na porção 5’ final da fita de cDNA. A fragmentação do mRNA do complexo cDNA/mRNA cria sítios para a DNA polimerase sintetizar a segunda fita gerando a fita dupla de cDNA. Após a amplificação o sistema utilizado foi o WT-OvationTM _{Exon Module (catalog#2000-12,2000-60) para gerar o ST-cDNA}

que foi fragmentado e marcado funcionando como alvo para o Affymetrix GeneChip Exon. Após a preparação do ST-cDNA foi utilizado o último sistema, FL-OvationTM _{cDNA Biotin Module V2 (catalog#4200-12, 4200-60, 4200-A01) o}

que resultou em um fragmento marcado (fluorescente) capaz de hibridizar ao Affymetrix GeneChip γ’ expression arrays.

4.5.4.4. Análise da expressão gênica.

Os dados brutos da amplificação do cDNA foram analisados em script escrito em R e no software do Projeto Bioconduct. O controle de qualidade foi realizado utilizando affyQCReport. Os dados de fluorescência foram ajustados, normalizados e convertidos para dados de expressão usando gcrRMA. Para

cada par (antes e depois do tratamento para LV), os resultados de expressão das amostras pós tratamento foram transformados (log2 gcRMA) e subtraídos

do nível de expressão das amostras pré-tratamento e estes dados pareados foram analisados usando um modelo de classe RankProd. O RankProd ordena cada conjunto de sondas em cada réplica de acordo com o nível de amplificação e calcula o valor RP para cada sonda. Tendo como base a quantidade que uma sonda particular aparece no topo ou no nível menor de lista. O Valor RP aumenta de acordo com a presença da sonda no topo (maior expressão) ou no nível inferior (supressão). O software então reordena as sondas de acordo com o valor RP, levando em considerações as comparações dos pares e ajustando para múltiplas hipóteses via permutação das replicatas. Para cada sonda, um percentual falso positivo (PFP) é calculado como estimativa de taxa falsa. O valor de corte foi selecionado para um PFP de 5% ou menos. Após os genes terem sido identificados, anotação e agregação foram realizadas no programa DAVID. A lista de genes oriundo de AffyIDs para cada condição (pré e pós-tratamento) foram submetidas a lista de Genes e analisadas como clusters funcionais. Vias foram identificadas usando Gene Set Enrichment Analysisv.2.

4.5.4.5. Validação dos dados da expressão gênica por qPCR.

As amostras de cDNA foram obtidas a partir do RNA total purificado pelo uso do kit cDNA Superscript III First Strand Synthesis System kit (Invitrogen) utilizando primers hexameros aleatórios seguido de tratamento RNaseH de acordo com as instruções do fabricante. De um total de 362 genes observados diferencialmente expressos foram selecionados 28, cujo, os valores de expressão entre as fases sintomáticas e recuperadas foram consideradas (acima de 1.5 vezes). A validação foi realizada pelo método de PCR em tempo real no sistema TaqMan. Ensaios TaqMan® foram adquiridos por encomenda, com inclusão dos genes selecionados e genes constitutivos (18S, GADPH, Actina B). O TaqMan® custom arrays é uma placa de 384 poços, 8 amostras podem ser colocadas em cada placa, cada uma conectada a 48 poços. O cDNA obtido é misturado ao master mix, aplicado, centrifugado e submetido então a amplificação. A análise das amostras antes e pós tratamento foram realizadas aos pares (teste bicaudal) para determinar significância pela fórmula

de quantificação relativa, usando o método comparativo de Ct (threshold cycle). Todas as quantificações foram normalizadas pela expressão dos genes constitutivos, de forma a tornar as amostras comparáveis pela elaboração de um valor delta Ct. O valor de expressão da citocina foi obtido pela fórmula 2- ΔΔCt_{. Amostras com CT maior que 40 foram ajustadas para 40 de forma que}

mesmo assim pudessem contribuir com a mudança da expressão gênica. 4.6. Considerações Éticas.

Os participantes da pesquisa foram recrutados dentro do protocolo de pesquisa avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), sob o número CAAE 0139.0.051.069-06. Todos os participantes da pesquisa ou guardião legal, no caso de menores, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

V. RESULTADOS.

5.1. A dinâmica da leishmaniose visceral no Rio Grande do Norte e o risco