Hsp/şaperon sistemi hem normal büyüme koşullarında hem de stresin bulunduğu hücrelerde önemli bir rol oynamaktadır (Thomashow,1999; Diamant, Eliahu, Rosenthal ve Goloubinoff, 2001; Wang, Vinocur, Shoseyov ve Altman, 2004). AtDREB2A, cis-etkili dehidrate-cevaplayıcı element (DRE) dizisi ile etkileşen iyi bilinen transkripsiyon faktörüdür. Sadece kuraklık ve tuz-stres yanıtında değil, aynı zamanda sıcaklık stresiyle ilişkili birçok geninin gen ifadesiunu aktive eder (Sakuma vd., 2006). Arabidopsis’de Hsf=Isı şoku faktör ailesinin 21 üyesinden HsfA3, DREB2A tarafından ısı şoku sırasında transkripsiyonel olarak uyarılan ve Hsps kodlayan genlerin gen ifadesiunu düzenleyen tek transkripsiyon faktörüdür (Schramm, 2008).
Swindell, Huebner ve Weber (2007) yılında yaptıkları çalışmalarında; Arabidopsis Hsfs ve Hsps'nin transkripsiyonel yanıt profilleri ile bir dizi abiyotik ve biyotik stres örneklerinde (ısı, soğuk, ozmotik stres, tuz, kuraklık, ultraviyole ışığı, oksidatif stres, yaralanma ve patojen enfeksiyon) Hsp70 ve Hsp100 ailelerine ait genlerin, stres anında yüksek regüle olduğunu saptamışlardır. ClpB/Hsp100 olarak adlandırılan yaklaşık 100 kDa'lık bir proteini kodlar. Arabidopsis (Schirmer, Lindquist ve Vierling, 1994) ve soya fasulyesi (Lee, Nagao ve Key, 1994) için ClpB proteinlerinin termotoleransı yeniden kazandırdığı ve işlevsel olarak termik koruma sağladığı tespit edilmiştir. Hsp101 aşırı sentezleyen bitkilerin, yüksek sıcaklık stresine karşı daha güçlü bir
51
koruma yapısına sahip olduğunu belirlenmiştir (Queitsch, Hong, Vierling ve Lindquist, 2000).
Bitkilerde domates (Koning, Rose ve Comai, 1992), menekşe (Schroder, Langer, Hartl ve Bukau, 1993), mısır (Marrs vd., 1993), pirinç (Liu, Zhang, Cheng, Takano ve Liu, 2006) ve bitki tohum yağında (Krishna, Reddy, Sacco, Frappier ve Felsheim, 1997) Hsp90 genleri belirlenmiştir ve bunlar çeşitli abiyotik streslerden kuvvetle indüklenmiştir.
Arabidopsis'de Hsp90 aile üyelerinin sıcaklık, soğuk, yüksek tuzluluk, ağır metal (bakır, kadmiyum, kurşun ve arsenit) streslerinde ve bazı fitohormonların gelişimsel olarak düzenlenmelerinde ve indüklendikleri gözlemlenmiştir (Krishna ve Gloor, 2001; Milioni ve Hatzopoulos, 1997). Sitozolde ve organellerde AtHsp90 genlerinin aşırı gen ifadesiu, tuz ve kuraklık streslerine karşı tolerans kazandırmıştır (Song vd., 2009).
Ispanak’da 10 adet Hsp70 geninin soğuk stresinde gen ifadesiu incelendiğinde, bazı genlerin geçici olarak yüksek ifade olduğu, diğerlerinin ise devamlı şekilde gen ifadesiun arttığı belirlenmiştir. Domateste, test edilen 15 molekül şaperondan 11'i için stres anında gen ifadesiun arttığı gözlenmiştir (Li, Haskell ve Guy, 1999). At-Hsc70- 1/Hsp70-1'in, normal sıcaklıkta yapraklarda eksprese edildiği belirlenmiştir ayrıca, ısı şoku stresinde de uyarıldığı rapor edilmiştir (Sung, Vierling ve Guy, 2001).
Hsp70'in koruyucu şaperon aktivitelerinin, Arabidopsis'te sıcaklık ve kuraklık stresine toleransda katkıda bulunduğu belirlenmiştir (Sung ve Guy, 2003). Domates hücrelerinde (Banzet vd., 1998) Hsp22’in mitokondriyal bölgede, pirinçte (Lee vd., 2008) ise Hsp26’nin kloroplastda lokalize olduğu belirlenmiştir. Oksidatif stres koşullarında bu genlerin uyarıldığı ve stres yanıtında önemli bir rol oynadığı saptanmıştır. Stres faktörlerinin yokluğunda Hsf’ler (Isı şoku transkripsiyon faktörü) DNA’da herhangi bir bağlayıcı faaliyet söz konusu olmadığı için sitoplazmada münferit ve serbest olarak bulunurlar, fakat stres başladığında faktörler üçlü olarak kümelenir ve çekirdekte toplanır (Sorger ve Nelson, 1989).
52
Hse (ısı şok elemanı) DNA’daki gen aktivatör bölgesinde konumlu olan spesifik bir tanıma dizisidir. Hse 50-nGAAn-30 değişimli üniteler olarak tanımlanmıştır ve etkili bir bağlama için en az üç ünite gereklidir (Morimoto, Tissieres ve Georgopoulos, 1998; Schöffl vd., 1998). Isı şok proteinlerinin sentezlenmesine yönelik gen ifadelerine neden olan moleküler izyolu; gen ifadesinin aktivasyonunun ısı şok elemanının (Hse) DNA’da bağlanması ile gerçekleştiği Hsf’ye sinyal transfer mekanizmasına bağlı olan sıcaklık algılama mekanizması gibi birden fazla mekanizmadan oluşur (Schöffl vd., 1998; Larkindale Hall, Knight ve Vierling, 2005).
Domates (Solanum lycopersicum) fidelerinde Hsf’lerin DNA’ya bağlanması salisilik asit (SA) tarafından desteklenmiş olup, Hsp70 mRNA transkripsiyonunu veya HSFA2 ve HSFB1 gibi Hsf’lerin ifadesini desteklememiştir. Bu SA’nın bağlamak için Hsf’nin modülasyonunda bir rol oynadığına işaret edilebilir (Snyman ve Cronje, 2008).
Morimoto ve Santoro (1998) Hsp’lerin hücreleri yaralanmaya karşı koruduklarını ve normal büyüme koşullarına döndükten sonra iyileşmelerini ve hayatta kalmalarını kolaylaştırdıklarını belirtmiştir. Diğer tarafta Timperio, Egidi ve Zolla (2008) ısı stresi sonrasında Hsp’nin moleküler şaperon olarak rolünün şüphesiz olduğunu, termal olmayan streste işlevlerinin farklı olabileceğini ifade etmiştir. Gerçekleştirilen bir çalışmada (Nakamoto ve Vigh, 2007) küçük ısı şok proteinlerinin (sHsp) zar kalite kotrolünde ve potansiyel olarak özellikle stres koşulları altında zar bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynadıklarına dair bazı ibarelerin bulunduğu sonucuna varılmıştır.
P. sativum ile gerçekleştirilen bir araştırmada; bu sınıfın faaliyetleri (proteinlerin katlanması) ve sHsp18.1 gibi küçük ısı şok proteinlerinin faaliyetleri (proteinlerin kümeleşmesinin engellenmesi) arasında bir işbirliği bulunduğu rapor edilmiştir (Lee ve Vierling, 2000). A. thaliana üzerinde gerçekleştirilen bir çalışma; kloroplastda bulunan Hsp70’nin çimlenen fidelerin ayrıştırılması ve bunların ısı toleransı için gerekli olduğunu göstermiştir (Su and Li, 2008). Oryza sativa’da Hsp90’ın gen ifadesinin incelenmediği çalışmada; Hsp87 ısı şoku proteninin; 2 saat süreyle ısı şoku
53
(28°C ila 45°C) uygulandığında ortaya çıktığını ve bunun miktarının uzun süreli (4 saat) ısı stresi sonrasında ve normal koşullara (stressiz) dönüş sırasında dahi yüksek ve sabit kaldığını tespit etmişlerdir. Aynı zamanda Hsp90’ın (Hsp85 ve Hsp87) tuzluluk, kuraklık ve soğuk gibi başka türlü stres ile de uyarılabileceği saptamışlardır. Bu araştırmada onbeş yabani pirinç türünde bu proteinlerin farklı birikme düzeyleri rapor edilmiştir (Pareek, Singla ve Grover, 1998).
Wyoming’de bulunan Yellowstone Milli Parkındaki doğal bir habitatta toprak sıcaklığının 40°C üzerinde olduğu yerde bazı bitkilerde (monokotlar ve dikotlar) Hsp’lerin böylesi zorlu çevrelere adaptasyondaki rolünü değerlendirmek için; bu bitkilerin filiz ve kök sistemlerindeki Hsp içeriğini tespit etmişlerdir. Sınıf I sitoplazmik sHsp varlığı rapor edilmiştir. Diğer tarafta, gerek yapraklarda gerekse kök sisteminde Hsp100 (Hsp101) tespit edilmiştir (Stout ve Al-Niemi, 2002).
Doğal saha koşullarını taklit eden iki veya daha fazla stres faktörüne maruz bırakılan bitkilerde Hsp varlığı konusunda araştırmalar mevcuttur. Sahada ısı stresine genellikle kuraklık, yüksek ışınlama, tuzluluk gibi bir veya daha fazla stres faktörü eşlik etmiştir. Bu araştırmalardan bir tanesi sulanan ve sulanmayan pamuk bitkileri (Gossypium hirsutum L.) üzerinde gerçekleştirilmiş olup sulanmayan bitkilerde çoğu büyüme parametreleri gerilemiştir (%80 ila %85) (Burke, Hatfield, Klein ve Mullet, 1985). Araştırma aynı zamanda sulanan bitkilere kıyasla gün ortasında azalan bir fotosentez (iki katlama) ortaya koymuştur ki sulanan bitkilerde üst bitki tabakası altındaki sıcaklık 30°C dereceye ulaşırken; sulanmayan bitkilerde üst bitki tabakası altında 40°C derecededir. İki işlem arasındaki bu farklara protein içeriğindeki farklar da eşlik etmektedir. Sulanmayan bitki yapraklarının birkaç hafta sonra istikrarlı bir şekilde moleküler ağırlığı 100, 94, 89, 75, 60, 58, 37, ve 21 kDa (kilodalton) protein düzeyleri biriktirilmiştir ve bu proteinler sulanan bitkilerin yapraklarında tespit edilmiştir. Bu araştırmanın nihai çıkarımında ise, pamuk bitkilerinin doğal kuraklık stresi koşullarında ve 40°C sıcaklıkta ısı şok proteinlerini biriktirdiği şeklinde rapor edilmiştir. Gündüz/gece sıcaklık döngüsü bitki büyümesini etkilemektedir ve etli çöl bitkilerinde 20/30°C sıcaklıktan 40/50°C sıcaklığa değişikliğin etkisini test etmek için bir deney gerçekleştirilmiştir (Kee ve Nobel, 1986). 10 gün sonra termal toleransta bir
54
artışın (6-8°C) olduğu ve her üç türün de yalnızca (40/50°C) döngüsünde moleküler ağırlığı 25-27 kDa olan protein biriktirdiği ve diğer Hsp tiplerini türe göre biriktirdiği rapor edilmiştir.
Doğal çevrede ışık yoğunluğu, en azından bazı bölgelerde, çok yüksektir. Işık Hsp’lerin sentezini uyarır ve bu nedenle; yüksek yoğunluktaki ışığın neden olduğu hasarı iyileştirebilir. Bu olasılık Asteraceae ailesinden Solidago altissima bitkisinin doğrudan güneş ışığına maruz kalmış olan yaprakları ile gölgede kalan yapraklarının sahada soğuk günlerde ve sıcak günlerde Hsp içeriğinin karşılaştırılması ile incelenmiştir (Barua ve Heckathorn, 2006). Sonuçlar doğrudan güneş ışığına ve doğal ısı stresine maruz bırakılan yapraklardaki Hsp içeriğinin belirgin bir şekilde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Gerek ışık gerekse sıcaklık laboratuvar ortamında Hsp’lerin toplanmasını bariz bir şekilde etkilemiştir.
Çöl baklagili olan Retama raetam ile yapılan kurak bölgelerde stres faktörlerinin etkileşimi hakkında bir araştırma sonucunda, fotosentezin günlük seyrini ortaya koymuştur. Periyotlardan bir tanesi saat 07:00 ile 10:00 arasında; diğeri ise saat 15:00 ile 17:00 arasında belirlenmiştir (Merquiol vd., 2002). Benzer bir periyodiklik, Şili çölünde yetişen başka bir baklagil olan Prosopis chilensis için rapor edilmiştir (Ortiz and Cardemil, 2001). Fotosentez oranındaki azalma sırasında (saat 11.00 ile 15.00 arasında) savunmaya katılan enzim transkriptlerinde (reaktif oksijen aracılarının giderilmesi-süpürülmesi) ve Hsp sentezinde bir artış söz konusu olmuştur. Nihai olarak çıkarılan sonuç; R. raetam’ın çöl arazisinde hakim olan stresli koşullara dayanmak için kaçınma ve aktif savunma mekanizmalarının bir kombinasyonunu kullanıdığı seklinde olmuştur.
Abiyotik stres faktörlerine bitki tepkisi, karmaşık bir gen ağı tarafından kontrol edilmektedir. AtGenExpress başlıklı A. thaliana gen ifadesi veri tabanı projesinde çeşitli abiyotik streslerin (sıcaklık, soğukluk, tuzluluk, osmotik, UV-B, ışık ve yaralanma) etkisi A. thaliana fideleri üzerinde benzer koşullar altında araştırılmıştır (Kilian vd., 2007) ve sonuçlar DNA Microarray Teknolojisi ile analiz edilmiştir. Bu araştırma; UV-B, kuraklık ve soğuk streslerine tepkide gen ifadeleri bilgileri dahil
55
olmak üzere abiyotik stresler ile uyarılan gen ifade türlerini sunmaktadır. Sonuçlar bu bitkide transkripsiyon düzeyinde strese ilk tepkinin bir stres tepki gen grubunu içerdiğini göstermiştir. Bu genler farklı streslere tepkide hayati bir role ve de strese maruz kalan doku tarafından üretilen sistemik sinyallerin ana rolüne sahip olabilir. Analizin sonuçları tüm streslerin ısı şok proteinlerinin ve faktörlerinin tepki izyollarında etkileşimde bulunduğunu, fakat etkileşim düzeyinin farklı olduğunu göstermiştir ki bu da düzenleyici ağda bir çapraz iletişim olduğunu düşündürmektedir. Hu vd. (2009) ısı stresine maruz kalmış pirinç fideleri ile stres koşullarındaki ifade profillerini incelemiştir. Sonuçları soğuk, kuraklık ve tuz stresleri altındaki pirinç verileri ile karşılaştırmışlardır. Hsp’lerin ve Hsf’lerin farklı stres sinyali dönüştürme ağlarında önemli unsurlar olabileceği sonucuna varmışlardır.
Genel olarak Hsp’lerin ve bunun Hsf faktörlerinin ifadesi büyük ölçüde sıcaklık, soğukluk, tuzluluk ve osmotik stres tarafından uyarılmıştır. Başka stres faktörlerine tepki protein sınıfına ve dokuya bağlı olabilmektedir. Örnek olarak, tüm stres türleri altında sınıf Hsp20 için yüksek ifade tepkisi bilgilerinin yüksek benzerliği kaydedilmiştir. Bitkinin köklerinin yaralanması (12 saat sonra) sınıf Hsp20, Hsp70 ve Hsp100 için çeşitli genlerin ifade edilmesini uyarmıştır. UV-B stresi altında yüzeysel dokularda (filizlerde) Hsp’ler ve bunun Hsf faktörleri için yüksek gen ifade tepkisi gözlemlenmiş olup yüzeysel olmayan dokularda (kökler) gen ifadesi gerçekleşmemiştir (Swindell, Huebner ve Weber, 2007). Her iki stresin de Hsp’lerin ifade edilmesine/toplanmasına yol açan nedenleri uyardıkları için ısı stresine tepki ve oksidatif strese tepki arasındaki ilişkinin varlığına dikkat çekilmiştir (Dat, Foyer ve Scott, 1998; Lee vd., 2000).
Genom dizileri tamamlanan çoğu tür için fonksiyonel genom çalışmaları yapılmaktadır. Genlerin karakterizasyonlarına ait çalışmalar son yıllarda önem kazanmıştır. J. Zhang vd. (2013) ve (2015) yaptıkları çalışmalarda Populus trichocarpa genomunda sHsp (37), Hsp60 (28), Hsp70 (20), Hsp90 (10) ve Hsp100 (5) gen ailelerine toplam 100 adet gen tanımlamışlardır.
56