Canlı organizmalarda fizyolojik ve biyokimyasal denge bozulmasına neden olan iç ve dış etkenler “stres faktörleri” olarak ifade edilmektedir. Bu olumsuz koşullara karşı hücre tarafından “hücre stres yanıtı” oluşturulmaktadır (Parsel ve Linquist, 1993; Kregel, 2002).
Sesil organizmalar olarak bitkiler sürekli değişen stres faktörlerine maruz kalmaktadırlar. Kuraklık, tuzluluk, düşük ve yüksek sıcaklıklar ve kimyasallar gibi birincil stres faktörleri bitkiler üzerindeki etkilerinde birbiri ile bağlantılıdır. Bu faktörler bitki hücrelerinde hasara neden olurlar, ozmotik ve oksidatif stresler gibi ikincil streslere yol açabilirler. Bitkiler bu faktörlere maruz kalmaktan kaçınamazlar, fakat bazı başka mekanizmalarla morfolojik ve fizyolojik olarak adapte olabilirler (Young ve Elliott, 2002; Soransen, Kristensen ve Loeschcke, 2003)
Bitkiler hayatta kalabilmek için abiyotik ve biyotik kaynaklı stresin üstesinden gelmek zorundadır ve bu nedenle hücre zarı stabilitesinin korunması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) yakalanması, antioksidanların sentezi, osmotik maddelerin toplanması ve osmoregülasyonu, strese tepki gösteren bazı kinazların, kalsiyuma bağlı kinaz proteinlerinin tetiklenmesi ve şaperonların sinyal transferinin iyileştirilmesi dahil bazı mekanizmalar geliştirmiştir (Ray, 1999; Wahid, Gelani, Ashraf ve Foolad, 2007). Sürekli artan bir stres etkeni, hücrede korunma mekanizmalarının çalışmasını gerekli kılmaktadır. Neredeyse tüm stresler ısı şoku proteinleri (Hsp) veya strese dayalı proteinler olarak adlandırılan bir grup proteinin üretilmesine neden olmaktadır. Bu şekilde strese moleküler düzeyde bir tepki oluşturulmaktadır. Genotipik ifadede ani değişiklikler sonucunda stresin algılanması ve sinyal oluşumuna tepki olarak da “stres proteinleri” sentezlenmektedir. Sentezlenen polipettitlerin (proteinlerin) istenilen işlevi istenilen sürede yapabilmesi için üç boyutlu yapıya sahip olması gerekmektedir. Oluşan protein hasarının engellenmesine yardımcı olmak için stres proteinleri-ısı şoku proteinleri (Hsp) koruyucu rol üstlenmektedirler (Lindquist ve Craig, 1988; Feder ve
42
Hofmann, 1999; Swindell, Huebner ve Weber, 2007; Panaretou ve Zhai, 2008; Hu, Hu ve Han, 2009; Gupta, Sharma, Mishra, Mishra ve Chowdhuri, 2010).
Şekil 2.20. Stres cevabında ısı şoku proteinleri ve şarepon ağı (Wang vd., 2004; Grigorova, 2010).
Hsp genleri hücrede fizyolojik olarak taşıdıkları sorumlulukları ve hücre içerisinde yardımcı fonksiyonları sebebiyle, “moleküler şaperon” olarak adlandırılan refekatçi proteinlerdir (Şekil 2.20). Strese maruz kalan ve denatüre olan proteinleri onararak, stabil hale getirirler. Polipeptidleri yanlış bağlanmasını önleyerek, agregasyonu engellemekte görev alırlar (Hendrick ve Hartl, 1993). İtalyan bilim adamı Ferruccio Ritossa’nın Drosophila melanogaster’in (meyve sineği) tükürük salgısında ısı artışına bağlı spesifik gen ifadelerine dair değişiklikler gözlemlemiştir. Hücrenin strese karşı bir cevap oluşturduğu keşfedilmiştir. Modern stres cevabı ilk kez Isı Şok Proteinlerinin keşfi ile başlamıştır. (Ritossa, 1962). Bu rapordan sonra bu proteinler tanımlanmış ve ısı şok proteinleri olarak adlandırılmıştır (Tissieres vd., 1974).
43
Çevresel adaptasyonda ısı şoku proteinlerinin düzeyleri önemli olup, moleküler ağırlıklarına göre beş grup içinde sınıflandırılırlar. Sırasıyla Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 ve küçük ısı şoku proteinleri 17-30 kDA (sHsp) olarak adlandırılmaktadır (Tablo 2.4; Tablo 2.5; Şekil 2.21).
Bu proteinler (şaperonlar); kuvvetli hidrojen bağları, güçlü hidrofobik etkileşimleri ve çift kutuplu heliks stabilitesinden dolayı denatüre olmazlar. Ökaryotik hücrelere göre bakterilerde farklı adlandırmaların kısaltmaları yapılmıştır. Proteinlerin stabilitesinde ve denatüre olmuş proteinlerin katlanmalarında rol alırlar (Trent, 1996; Schöffl, Prandl ve Reindl, 1998; Wang, Vinocur, Shoseyov ve Altman, 2004; Gupta vd., 2010).
Tablo 2.4. Isı şoku proteinlerine ait Escherichia coli bakterisinde farklı kısaltmalar
Escherichia coli Ökaryotik hücre
ClpB HSP100
HtpG HSP90
Dnak HSP70
GroEL HSP60
Isı şoku proteninin gen transkripsiyonu; ısı şok faktör transkripsiyon faktörleri ile ısı şok protein gen promotor bölgelerindeki ısı şok elementlerinin etkileşimi aracılığı ile sağlanır. Normal koşullar altında ısı şok faktör1 (HSF1) sitoplazma içinde DNA’ya bağlı olmayan bir monomer molekül gibi bulunur. Stres koşulları altında HSF1, DNA’ya bağlanma kapasitesine sahip olmak için üç fosfatlı forma dönüştürülür ve sitoplazmadan çekirdeğe geçer. Çekirdekte HSF DNA’nın promotör bölgelerine bağlanır. Böylece Hsp geninin transkripsiyonunu sağlayarak, Hsp sentezini arttırır (Pockley, 2001).
Stres proteinleri (Hsp), çeşitli çevre etkenlerinin canlılar üzerindeki biyolojik etkilerinin moleküler seviyede belirlenmesinde biyobelirteç olarak kullanılmaktadırlar. Son yıllarda ısı şoku proteinleri ıslah çalışmalarında da indikatör olarak kullanılmaktadır (Schöffl vd., 1998; Farcy, Serpentini, Fievet ve Lebel 2007).
44
Tablo 2.5. Isı şoku protein gen ailesi (Hsps) özellikleri (Wang vd., 2004)
Hsp (Isı şoku protein) gen ailesi Hsp Moleküler ağırlık (kDa) Fizyolojik yerleşim Streste yerleşim Fonksiyon Hsp100 ailesi Hsp100 100 Endoplazmik Retikulum (ER) Endoplazmik Retikulum (ER) Glukoz metabolizması
Hsp104 104 Sitoplazma Sitoplazma Proteinlerin
agregatlardan serbestleşmesi Hsp110 110 Nükleus/ Sitoplazma Nükleus/ Sitoplazma Nükleusun stresten korunması Hsp90 ailesi
Hsp90α 86 Sitoplazma Sitoplazma Hormon
aktivitesinin düzenlenmesi
Hsp90β 84 Sitoplazma Sitoplazma Aktin
grp 94 94 ER ER Protein kalite kontrolü Hsp70 ailesi Hsp80 80 ER ER Protein taşınımı grp78 78 ER ER Protein katlanması
Hsp75 75 Mitokondri Mitokondri Glukoz
metabolizması
Hsp73 73 Sitoplazma Nükleus Protein
katlanması
Hsp70 70,72 Sitoplazma/
Nükleus
Nükleus Çeşitli ajanlara karşı hücrenin korunması Hsp60 ailesi Hsp60 58,60 Sitoplazma/ Mitokondri Mitokondri Moleküler şaperon, hücre korunması
45
Tablo 2.5’in devamı
HSP40 ailesi HSP47 47 Sitoplazma/ Mitokondri Mitokondri/ Sitoplazma Kollajen şaperon Küçük sHsp ailesi HSP32 (Hem oksijenaz) 32 Sitoplazma Sitoplazma/ Nükleus Moleküler şaperon, yıkıma taşınma HSP27 27 Sitoplazma/ Nükleus Sitoplazma/ Nükleus Moleküler şaperon, hücre korunması
HSP25 25 Sitoplazma Sitoplazma α-kristallin
HSP8 (Ubikitin) 8 Sitoplazma/ Membran Sitoplazma/ Membran Lizozomal olmayan yıkım
Hsp’lerin moleküler şaperon olarak rolleri hakkında üç ana işlev düşünülebilir. Bunlar: (1) denatüre proteinlerin uyarılması (yeniden katlanması), (2) yeniden sentezlenen proteinlerin doğru yapı ile sonuçlanması ve (3) protein kümeleşmesinin azaltılması (Trent, 1996).
46
Basit olarak Hsp’ler protein komplekslerinin olgunlaşmasında ve hasarlı veya yanlış katlanmış peptitlerin degradasyonunda rolleri ve pek çok sinyal proteinlerinin faaliyetlerinin düzenlemeleri ile bilinirler (Pratt ve Toft, 2003; Rutherford, 2003). Genel olarak stres sırasında geniş ölçüde ifade edilen HSP’ler uygunsuz katlama ve kümelenme sorunlarını düzeltici doğrudan ve dolaylı işlevlere sahiptirler (Queitsch, Hong, Vierling ve Lindquest, 2000).
Stres koşulları altında olmayan hücrelerde Hsp varlığı düşük düzeyde iken; stres koşullarına maruz hücrelerde yüksek seviyelerde saptanmıştır. Normal hücre fonksiyonlarının devamlılığında ise düşük konsantrasyonlar gözlenmiştir (Romano, Horton ve Gray, 2004). Hsps proteinlerinin moleküler ağırlıkları 7 ile 110 kDa arasındadır ve intraselüler, ekstraselüler yerleşimli olanlar, hemen her hücrenin sitoplazma, mitokondri, çekirdek gibi kompartmanlarında bulunmaktadır (Kiang ve Tsokos, 1998). Isı şoku proteinleri hücre metabolizması kontrolünde anahtar rol oynarlar (Pratt ve Toft, 2003) (Şekil 2.26).
2.4.1. sHsp Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
sHsp monomer molekülü 8-40 kDa`luk kütleler halinde bulunur. Bu sınıfın karakteristik işlevlerinden bir tanesi uygunsuz katlanmış olan proteinlerin ayrıştırılmasıdır. Temsili protein sınırlandırılmış enzimleri ile sHsp ubikuitin’dir (moleküler ağırlığı 8.5 KD’dir) (Ferguson, Guikema ve Paulsen, 1990). Bu sHsp’leri başka şaperon sınıflarından ayıran diğer bir özellik bunların faaliyetlerinin ATP’den bağımsız oluşudur (Miernyk, 1999).
Hsp60 ve Hsp70’ den farklı olarak, sHsp’ler proteinleri yeniden katlayamazlar, fakat kısmen katlanmış veya denatüre substrat proteinleri bağlayabilirler ve böylece geri alınamaz protein açılmasını veya yanlış protein kümelenmesini önleyebilirler (Sun, Motangu ve Verbruggen, 2002). sHSP’ler sadece strese karşı korunmada değil, aynı zamanda diğer hücresel fonksiyonların (apoptozis ve farklılaşma gibi) modülasyonunda görev aldığı bilinmektedir (Wang vd., 2004).
47
Organizmalardaki dağılımı çok değişkendir. Sitoplazma ve çekirdekte bulunur. Stres algısında hücrelerde belirgin olarak artış gösterir. Ayrıca, antioksidan özelliği vardır (Pockley, 2001). Kristal yapıdaki küçük ısı şoku protein (sHsp) ailesi üyelerinin hücre dengesi, hasar cevapları ve hastalıklarda önemli rolleri bulunmaktadır. Hücresel stres yanıtı esnasında kısmi katlanmış proteinler ile etkileşime girerek bu proteinleri stabilize ettikleri ve yapışarak çökelmelerini engelledikleri belirlenmiştir (Pantzartzi, Kourtidis, Drosopoulou, Yiangou ve Scouras, 2009).
2.4.2. Hsp40 Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
Hsp40 ökaryot organizmalarda Hsp70’in fonksiyonlarına yardımcı olur. Büyük moleküllü şaperon grubuna ait olup, Hsp70 ile aynı görevi yerine getirmektedir. Hsp47 özellikle fotofosforilizasyon sırasında hücredeki miktarı önemli düzeyde artar ve serin proteaz enziminin aktivitesinde rol oynar (Wang vd., 2004).
En az 50 üyeyi içeren ve üç alt gruba (DNAJA, DNAJB ve DNAJC) göre sınıflandırılan en büyük insan Hsp ailesidir (Kampinga vd., 2009). ATPaz aktivitesinin uyarılmasından sorumlu oldukları için protein katlama, yeniden katlama ve translokasyonda önemlidir (Qiu, Shao, Miao ve Wang, 2006; Kampinga vd., 2009). DNAJ ailesinin bazı üyeleri aynı zamanda diğer Hsp'lerin aktivitesini düzenler. Sitozol, çekirdek, ER, mitokondri, endozomlar ve ribozomlar gibi farklı hücre bölmelerinde bulunabilirler. Bazıları doku spesifik gen ifadesiunu göstermektedir (Qiu vd., 2006).
2.4.3. Hsp60 Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
Hsp60, proteinlerin sitoplazmadan mitokondrial matrikse taşınmasında ve aminoasit zincirlerinin işlevsel formlarına düzgün bir şekilde katlanmasında görev yapar. Aynı zamanda Hsp60 apoptozisi (programlı hücre ölümü) önlemede anahtar rol oynamaktadır. Hücrede sıcaklık şoku esnasında Hsp60 proteinini kodlayan genlerin transkripsiyonunda artış gözlemlenmiştir. Çünkü Hsp60 sadece moleküler şaperon olarak değil, aynı zamanda stres tepkisinde de görev yapmaktadır (Gonzalez,
48
Hernando ve Manso, 2007). Hsp60, ökaryot hücrelerin mitokondri ve kloroplastlarında yer alır (Matz, Treble ve Krone, 2007; Ellis, 1997). Hsp60 sınıfı şaperoninler olarak adlandırılırlar. Genel olarak, Rubisco gibi plastit proteinlere yardımcı olma konusunda önemli oldukları kabul edilmektedir (Wang vd., 2004). Bazı çalışmalar bu sınıfın kloroplastlar ve mitokondri gibi organellere taşınmış olan pek çok proteinin katlanmasına ve kümelenmesine katılımcı olabileceklerine işaret etmektedir (Lubben, Donaldson, Viitanen ve Gatenby, 1989).
Normal çevre koşulları değiştiği zaman, Hsp60’ın sentezi artar ve biyolojik aktivitenin devam edebilmesi için hasar gören proteinlerin agregasyonlarını önlemek suretiyle hasarı onarırlar. Ayrıca Hsp’ler, artan stres durumlarında immün yanıt oluşturmada da görev yaparlar (Choi, Jo ve Choi, 2008). Mitokondri ve sitoplazmada bulunur. Hsp70 ile birlikte proteinin doğal katlanmasına aracılık yapar. Stresten korunma ve protein katlanması için gereklidir. Hatalı katlanan polipeptidlere bağlanarak doğru katlanmalarına yardım ederler (Nollen, Brunsting, Roelofsen, Weber ve Kampinga, 1999).
2.4.4. Hsp70 Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
Hsp70 evrim süresince korunmuş olan en önemli stres uyarımlı proteindir (Ojima, 2005). Evrimsel süreçte büyük ölçüde korunmuşlardır. Yüksek sıcaklık ve diğer stres koşullarında uyarılmaktadırlar. Katlanmamış veya kısmen denature olmuş polipeptidlere bağlanırlar. Omurgalı, mantar, bakteri ve bitkilerdeki bazı Hsp70 grubu proteinleri fosforile edildiği ya da metillendiği bulunmuştur (Su ve Li, 2008).
Hsp70 neredeyse tüm organizmalarda kümeler halinde birikmelerini engellemek ve nihai konumlarına transferleri sırasında düzgün bir şekilde katlanmalarını sağlamak için yeni sentezlenmiş proteinler için şaperon işlevine sahiptirler (Sung, Kaplan ve Guy, 2001; Su and Li, 2008). Hsp70 ve sHsp’ler öncelikli olarak moleküler bir şaperon olarak faaliyet gösterirler ve bitki hücresini ısı stresinin zararlı etkilerine karşı korumada hayati bir rol oynarlar. Hücredeki sentezi en fazla yüksek ısı ve ağır metal etkisinde artmaktadır (Rouch, Bingham ve Sommerfeld, 2004).
49
Stres altında proteinleri korurlar. Katlanmamış proteinlerin kümeleşmesini önlerler. Katlanmamış ve yanlış katlanmış proteinler arasındaki dengeyi sağlamaktadırlar. Polipeptitleri birbirine bağlayarak HSF’nin aktivitelerini düzenlerler ve ısı şok proteinlerin transkripsiyonunun kontrolünü sağlar. ATP’ye bağlanır ve ATPaz aktivitesi gösterirler (Pockley, 2001). Yüksek sıcaklık ve diğer stres koşullarında uyarılmaktadırlar. Katlanmamış veya kısmen denature olmuş polipeptidlere bağlanırlar (Schroda, Vallon, Wollman ve Beck, 1999).
2.4.5. Hsp90 Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
Hücredeki en çok fonksiyonlu stres proteinidir (Zhang vd., 2009). Hsp90 proteinlere bağlanarak onların aktivasyonunu ve katlanmasını düzenler. Geri katlanan peptidlerin kümeleşmesini önler. Sitoplazma ve endoplazmik retikulumda bulunur. Endoplamik retikulumda en fazla bulunan ısı şok proteinidir (endoplazmik versiyon) Hsp90, Hsf1 (Isı şok faktör-1)’in fizyolojik koşullarda durumunun dengelenmesinde görev alır (Wiech, Buchner, Zimmermann ve Jakob, 1992). Hsp90 proteinleri yüksek düzeyde korunmuş yapılar olup, başlıca görevi protein katlanmasını gerçekleştirmektir (Lindquist ve Craig, 1988). Ayrıca sinyal iletme ağında, hücre döngüsünün kontrolünde, protein yıkımında ve protein taşınımında rol oynar. Toplam hücresel proteinin % 1-2’ sini oluşturur. Birçok organizmada strese bağlı olarak artar (Wang vd., 2004).
Hsp90 sınıfı; Hsp70’i pek çok şaperon kompleksinde bağlayabilmesinden ve protein işlevini sinyalleme ve alışverişinde önemli bir role sahip olmasından dolayı diğer sınıflarla moleküler bir şaperon olma rolünü paylaşmaktadır (Pratt ve Toft, 2003).
2.4.6. Hsp100 Gen Ailesi ve Hücresel Fonksiyonları
100 ila 104 kDa moleküler ağırlık aralığındadırlar. Bu gruptaki proteinlerin hücrenin gelişmişliğiyle yakın ilişkili olduğu belirtilmiştir. Bununla birlikte stres koşullarına bağlı olarak hücredeki sentezi artış göstermektedir. Hsp100 grubunda bulunan proteinler daha çok proteinlerin yığılmasını ve/veya protein degradasyonunu
50
önlemekte görev yaparlar (Wang vd., 2004). Bu proteinler düzenleyiciler olarak işlev görürler ve moleküler koruyucu olarak çalışırlar (Burton ve Baker, 2005). Bu sınıfın özgün işlevlerinden bir tanesi işlevsel olmayan protein kümelerinin yeniden çözülmesi yoluyla ve aynı zamanda degrade, geri dönüştürülmez şekilde hasarlı polipeptitlere yardımcı olarak (Bösl, Grimminger ve Walter, 2006; Kim, Hwang ve Lee, 2007) kümelenmiş proteinlerin reaktivasyonunu sağlamaktır (Parsell ve Lindquist, 1993). Bu sınıf aynı zamanda stres sonrasında organizmanın normal durumunu da kolaylaştırmaktadır (Gurley, 2000).