Öğrenci 37: Düştükten sonra etki eden hiçbir kuvvet yoktur.
6. Yandaki kaykay sürtünmesiz ortamda bulunmaktadır ve hareket etmemektedir.
da biomassa e produção de etanol
Os microrganismos catalisam transformações indispensáveis dos ciclos biogeoquímicos da biosfera e produzem componentes importantes para a
atmosfera, além de representarem a maior diversidade genética e metabó- lica dentre as formas de vida existentes. O solo é o habitat que contém a maior quantidade e diversidade de microrganismos, um grama de solo con- tém mais de 10 mil diferentes espécies (Torsvik; Ovreas; Thingstad,2002). A utilização de técnicas de cultivo puro permite o estudo de microrga- nismos individualmente e sua caracterização, principalmente por critérios metabólicos (provas bioquímicas). Entretanto, a abordagem do cultivo li- mita seriamente a avaliação taxonômica e filogenética como estimativa da diversidade microbiana, devido à falha do cultivo da maioria dos microrga- nismos pelos métodos convencionais (Pace, 1997).
Microbiologistas sempre investiram grandes esforços na descoberta de microrganismos capazes de sintetizar compostos e de catalisar reações im- portantes, dentro da perspectiva humana. A busca por eles levou os pesqui- sadores a isolarem dezenas de milhares de linhagens produtoras de diversas substâncias de interesse biotecnológico e, ainda hoje, aqueles cultiváveis de solo representam, por exemplo, a principal fonte de antibióticos e outros compostos bioativos.
Atualmente, o uso de técnicas de biologia molecular permite uma aná- lise populacional independente do cultivo, baseada no estudo do conjunto de genomas do ambiente. Análise da comunidade total de DNA de uma amostra constitui uma medida de sua heterogeneidade, inferindo-se para a diversidade microbiana nela presente. Coletivamente, o genoma da mi- crobiota total encontrada na natureza é denominado metagenoma – termo usado pela primeira por Handelsman e colaboradores em 1998 –, sendo que tal estratégia permite o acesso de muito mais informação genética que os procedimentos baseados em cultivo. Metagenoma é o conjunto de genes de um determinado ambiente, e pode ser analisado de modo similar ao que se faz com um genoma único (Figura 4.1).
Essa abordagem envolve o uso de vetores para clonar, estavelmente, segmentos de DNA de amostras ambientais (Shizua et al., 1992). Vários vetores têm sido utilizados como sistema de expressão para estudar geno- mas microbianos de organismos pré-cultivados ou do DNA microbiano total extraído diretamente do solo (Figura 4.2) (Rondon et al., 2000) . Essa clonagem constitui, portanto, uma ferramenta útil para o estudo do con- teúdo genômico total da microbiota de uma amostra, como solo. Através
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de clonagem e análise de grandes segmentos de DNA microbiano do solo ou de qualquer ambiente, pode-se avaliar com mais detalhes a diversidade, a fisiologia e a função dos microrganismos na natureza. Além disso, essas metodologias possibilitam o isolamento e expressão de genes de interesse em diversos setores da indústria biotecnológica, sem a necessidade de isola- mento dos microrganismos do ambiente.
O solo constitui, indubitavelmente, um dos principais reservatórios de carbono orgânico da Terra e um dos mais importantes habitats para mi- crorganismos, principalmente procariotos. A abundância do carbono e ou- tros elementos produzidos por procarióticos sugerem que cerca de metade do protoplasma vivo da terra seja de origem microbiana (Whitman et al., 1998). Devido à vasta diversidade, às grandes populações e à longa história evolutiva, os microrganismos vêm contribuindo fortemente para a rique-
Figura 4.1 – Esquema mostrando a sequência de procedimentos para estudo do DNA meta- genômico extraído da amostra de um solo
Figura 4.2 – Comparação esquemática de duas diferentes abordagens para obtenção de no- vas enzimas. Usando a tecnologia de cultivo a partir de isolamento de organismos (esquer- da); e a partir da técnica metagenômica (direita). Pela técnica tradicional de cultura, enzimas de interesse podem ser obtidas por cultivo e extração ou clonagem de um gene específico. Pela técnica metagenômica pode-se isolar e clonar vários genes de um ambiente, para poste- rior prospecção e expressão de uma enzima desejada. (Lorenz et al., 2002)
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za e a complexidade das interações entre os organismos do solo, incluindo desde simbioses altamente específicas a mutualismos difusos (Beare et al., 1995). Tais organismos são componentes essenciais no processo de decom- posição do solo, no qual resíduos de plantas e animais são degradados em matéria orgânica, liberando nutrientes na cadeia alimentar.
O número dos microrganismos e sua biomassa coletivas varia dentro e entre os diferentes tipos e condições dos solos, sendo o grupo das bactérias mais numeroso (Whitman et al., 1998), mas o grupo dos fungos tem igual ou maior importância em muitos solos, como mostrado pela íntima asso- ciação com raízes de plantas e pela competência saprofítica com detritos fisicamente maiores e compostos estruturalmente complexos (Meeting Jr., 1993; Carrol; Wicklow, 1992). Um grau muito maior de plasticidade feno- típica e genotípica existe dentro de comunidades microbianas do que foi previamente avaliado.
Evidências demonstram que os microrganismos presentes em ambientes naturais são filogeneticamente mais diversos do que era sabido pelas análises de sequências de linhagens cultivadas (Hugenholtz; Pace, 1996). A ampla ocorrência de partículas virais infecciosas, mutações, plasmídeos e outros elementos genéticos móveis e seus papéis nos processos de transdução, trans- formação e conjugação permitem concluir que ecossistemas microbianos são comunidades geneticamente abertas (Terzaghi; O’Hara, 1990) e com enor- me potencial de aquisição de diversidade genética (Whitman et al., 1998). Até recentemente, com o desenvolvimento de técnicas de cultivo puro, os microrganismos puderam ser estudados isoladamente e caracterizados, em algum grau, por critérios nutricionais, principalmente. Entretanto, a abordagem do cultivo limitou seriamente a avaliação taxonômica e filoge- nética, como estimativa da diversidade microbiana, devido à falha de cul- tivo da maioria dos microrganismos pelos métodos convencionais (Pace, 1997). Nesse contexto, numerosos meios de cultura, seletivos e não-seleti- vos, foram utilizados para enumerar e isolar microrganismos do solo e da rizosfera com influência destes nos graus de diversidade genética obtida (Sorheim, 1989; Buyer, 1995; Tabacchioni et al., 2000). Entretanto, ferra- mentas moleculares e tecnologias baseadas em sequências gênicas vêm re- duzindo essas limitações e revelando nova perspectiva sobre a diversidade microbiana.
A caracterização dos microrganismos não-cultiváveis, utilizando-se de métodos moleculares e análises filogenéticas a partir de sequências de DNA, é, portanto, um esforço para identificar e conhecer suas distribui- ções e funções no meio ambiente. Os novos métodos de detecção de micror- ganismos, sem necessariamente cultivá-los, certamente contribuirão para inferências inéditas sobre sua significância nos solos.
Ambas as abordagens, baseada em cultivo (Hattori et al., 1997) ou cul- tivo independente, apoiam, uma vez mais, o estabelecido de que os solos representam um dos mais diversos habitats para microrganismos. Estudos moleculares, tais como os resultantes das análises de sequências de 16S rRNA, confirmam a rica diversidade entre divisões bacterianas divergentes (Hugenholtz et al., 1998), por exemplo. Assim, as divisões Proteobacteria , , e são usualmente bem representadas, como são Cytophagales, Ac- tinobacteria e Gram-positivas de baixo conteúdo de GC. Esses resultados são particularmente relevantes para a descoberta de produtos naturais, pois membros cultiváveis dessas últimas duas divisões são prolíferos produtores de antibióticos (Rheims et al., 1996).
Em relação aos fungos, estimativas sugerem que há 1,5 milhão de espécies na Terra, sendo que aproximadamente 70 mil delas foram descritas, donde se conclui que 95% encontram-se ainda sem descrição (Hawksworth et al., 1997). Estratégias utilizadas para tal identificação incluem análises compa- rativas de sequências de 18S rRNA (Pace, 1997; Kowalchuk, 1998). Outros exemplos poderiam ser citados sobre o impacto dos estudos cultivo inde- pendentes no conhecimento da filogenia e diversidade microbiana no solo; e, quão pobremente estão representados pelos seus membros cultivados.
A partir da década de 1980, um grande número de metodologias mo- leculares DNÁsicas vêm sendo desenvolvidas para análise da diversidade microbiana dos solos (Amann; Ludwig; Schleifer, 1995; Borneman; Tri- plett, 1997; Cullen; Hirsch, 1998; Duarte et al., 1998; Muyzer et al., 1993; Torsvik et al., 1998). Com quantidades pequenas de solo, tais procedimen- tos permitem análise de múltiplas amostras com eficiências próximas de 80% e purificação de DNA com o emprego de kits, tornando as análises mais rápidas (Zhou et al., 1996; Kuske et al., 1998; Ogram et al., 2000).
Empregando-se de reassociação cinética do DNA extraído de comuni- dades bacterianas, Torsvik e colaboradores (Torsvik et al., 1990a; 1990b)
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encontraram números acima de 10 mil espécies em apenas um grama de solo sob floresta, muitas das quais nunca haviam sido cultivadas em labo- ratório. Ritz e Griffths (1994), empregando hibridização do DNA total ex- traído de diferentes solos, e sob diversas condições, verificaram diferentes padrões de diversidade genética entre os mesmos. Com relação aos fungos, avaliação por métodos moleculares sugere que a grande maioria das espé- cies do planeta ainda está por ser revelada e analisada (Hawksworth et al., 1997; Amann; Ludwig; Schleifer, 1995).
O acesso molecular individual aos tipos de bactérias existentes no solo tem sido baseado na determinação das sequências dos genes 16S rRNA (Fi- gura 4.3) amplificados e clonados (Borneman; Triplett, 1997; Kuske et al., 1998; Borneman et al. 1996; Lee et al., 1996; Gesolmino et al., 1999). Por outro lado, a distinção entre espécies de fungos, embora menos frequente- mente utilizada, tem sido feita com base nas sequências 18S rRNA (Borne- man; Triplett, 1997; Amann; Ludwig; Schleifer, 1995; Elsas et al., 2000). Outras tecnologias têm sido avaliadas e aperfeiçoadas para análise da biodi- versidade do solo, tais como a técnica do T-RFLP p (Liu et al., 1997) e a de
shotgun para sequenciamento do DNA de clones genômicos, fragmentos de restrição e produtos de PCR (Birren et al., 1997).
Figura 4.3 – Estrutura do genes 16SrRNA – O gene do rRNA 16S das bactérias (1542pb) consiste de nove sequências conservadas (C1-C9), espaçadas por regiões hipervariáveis (V1-V9, com 10 a 50 bases). A amplificação do gene 16SrRNA com o uso de primers especí- ficos para regiões conservadas e que consigam amplificar também regiões variáveis facilitam a identificação das bactérias. (Petrosino et al., 2009)
Atualmente, as novas metodologias de sequenciamento de DNA em grande escala têm colaborado e tornado mais ágeis os estudos metagenômi- cos, quer seja nas análises de diversidade, quer seja na prospecção de genes. Essas novas tecnologias, além de estarem se tornando pouco onerosas, têm a capacidade de geração de uma grande quantidade de dados em um curto espaço de tempo. Dessa forma, diversas amostras ambientais estão sendo
avaliadas através do sequenciamento em grande escala: oceanos (Sogin et al., 2006; Huber et al.; 2007), solos (Leininger et al., 2006; Fierer et al., 2007), recifes (Wegley et al., 2007), assim como amostras fecais e de biofil- mes (Mardis, 2008; Claesson et al., 2010).
A diversidade biológica de muitos ecossistemas pode ser ameaçada por processos degradativos diversos. Relativamente pouco tem sido feito para quantificar as relações benéficas entre diversidade microbiana, funciona- mento do solo-qualidade vegetal e sustentabilidade do ecossistema (Ken- nedy; Smith, 1995). Em agroecossistemas, as funções mais importantes são aquelas envolvidas na ciclagem de nitrogênio e carbono, na manutenção da estrutura do solo, na antibiose etc.
Relata-se que a desertificação do ecossistema terrestre atinge milhões de hectares anualmente, como resultado dos impactos das atividades degrada- tivas antropogênicas, caracterizadas pelo aumento da atividade dos agentes naturais, ameaçando a sustentabilidade dos solos. Distúrbios nas comuni- dades naturais vegetais são os primeiros sintomas visíveis desse desequilí- brio; porém, frequentemente são acompanhados ou precedidos por perda das propriedades físico-químicas e biológicas, principalmente, microbioló- gicas dos solos (Mäder et al., 1996; Requena et al., 2001). Tais propriedades determinam, decisivamente, a fertilidade e a qualidade dos solos, alterando diretamente o estabelecimento e a produtividade das plantas.
Desde que apenas uns poucos microrganismos no solo são produtores primários, sendo em sua maioria saprófitas ou entidades mutualísticas, estes, por sua vez, dependem da produção primária das plantas; e, assim, esses dois sistemas biológicos estão fundamentalmente interligados (Ohto- nen et al., 1997). O funcionamento do ecossistema do solo é, portanto, go- vernado, em grande parte, pela dinâmica de sua população microbiana que é fortemente influenciada pelos distúrbios aplicados ao solo.
Sistemas convencionais de produção agrícola, baseados em agroquími- cos, constituem fontes de poluição que, direta ou indiretamente, contri- buem para a degradação do ambiente biológico do solo, com destruição dos recursos naturais (Filser et al., 1995). Da mesma forma, o cultivo intensivo baseado em práticas culturais agressivas altera a biota do solo, causando, inclusive, erosão excessiva com poluição das águas superficiais e lençóis freáticos (Filser et al., 1995; Hassink et al., 1991; Valarini et al., 1998). Des-
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matamento (Cullen; Hirsch, 1998) e desertificação, em particular, apre- sentam impacto negativo, reduzindo o potencial de inóculo de simbiontes microbianos mutualísticos os quais constituem fatores essenciais na cicla- gem dos principais nutrientes de plantas e, portanto, na sustentabilidade da cobertura vegetal em habitats naturais (Requena et al., 2001).
O crescimento e desenvolvimento das culturas estão estreitamente rela- cionados à natureza da microbiota do solo. A baixa eficiência de produção agrícola é influenciada por fatores fisiológicos culturais, pelo ambiente e por outros fatores biológicos representados, principalmente, pelos micror- ganismos do solo. A microbiota do solo e, particularmente, da rizosfera po- dem acelerar o crescimento das plantas, podendo apresentar efeito primário em ambos, qualidade do solo e qualidade do cultivo.
Manejo de associações simbióticas entre plantas e microrganismos, por exemplo, pode restaurar ecossistemas desertificados (ibidem). Do ponto de vista fitossanitário, as interações microbianas em alguns solos podem natu- ralmente prevenir o estabelecimento de patógenos ou inibir suas atividades patogênicas. Tal fenômeno é denominado supressividade do solo (Baker; Cook, 1974), sendo esta relacionada diretamente à atividade microbiana do solo (Rodríguez-Kábana; Calvet, 1994).
A metagenômica é uma abordagem promissora que, além de permitir estudos da diversidade microbiológica de um ambiente sem o isolamento desses, ainda permite acessar o genoma desses organismos incultiváveis, e oferece a oportunidade de recuperação de genes desconhecidos que estão diretamente envolvidos na biossíntese de inúmeros compostos de impor- tância tecnológica. Essa tecnologia consiste na extração de DNA direta- mente do ambiente e construção de uma biblioteca de grandes fragmentos desse genoma misto.