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Após desenvolvimento do biocatalisador para uso em biorreator iniciou-se uma nova etapa de desafios para se realizar a hidrólise de penicilina G durante o cultivo de

Penicillium chrysogenum. Primeiramente, foi necessário implantar metodologias simples e

rápidas para quantificação de penicilina G e 6-APA em caldo fermentativo durante o cultivo. A utilização de HPLC, técnica reconhecidamente precisa e reprodutível, era inviável para este estudo, pois a grande quantidade de interferentes presentes no caldo de cultivo e o elevado número de amostras torna essa técnica demasiadamente cara. Uma vez superada essa etapa, vários cultivos em biorreator foram realizados para determinar as condições (aeração, agitação, alimentação de sacarose) em que o bolor cresceria na forma de pellet. Isso foi necessário para simular o processo industrial da produção de penicilina, no qual o fungo é mantido na forma de pellet para obter a máxima produção de penicilina. Após definição das condições adequadas de cultivo, foi definido protocolo para controle de contaminação para a reutilização do biocatalisador.

5.3.1 Quantificação de PG e 6-APA em meio de cultivo

A produção industrial de penicilina G por P. chrysogenum é realizada em meio complexo, utilizando, entre outros nutrientes, água de maceração de milho, sacarose ou glicose, e diferentes sais como, por exemplo, sulfato de amônio, carbonato de cálcio, fosfatos

de sódio e outros. Além destas espécies químicas, ao longo do cultivo, vários compostos orgânicos são liberados, incluindo ácidos orgânicos e proteínas.

A complexidade desse meio dificulta a quantificação de penicilina durante o processo de produção desta. A análise de PG tem sido realizada por métodos como: ensaio microbiológico, titulação mecuriométrica, métodos espectrofotométrico utilizando agentes de derivatização como, hidroxilamina, imidazole, ácido cloroplatínico e cromatografia. Análise cromatográfica é de longe a técnica mais popular para a separação de impurezas e produtos de degradação da PG. O pH é um fator crítico para o desenvolvimento de um método cromatográfico, pois pequenas diferenças no valor de pK pode promover a separação de substância parecidas. É importante verificar a estabilidade de PG frente a pH, sendo o melhor 6,5 (ALICINO et al., 1946; GRIME et al., 1979; RAYCHOWDHURY et al., 1979; YONGXIN et al., 1997). Devido a pouca capacidade de absorção de energia da penicilina muitos autores utilizam etapas de derivatização para detectar baixas concentrações deste antibiótico (FOULSTONE et al., 1982). Entretanto, a toxicidade dos reagentes de derivatização e o tempo gasto na análise tornam o método cromatográfico pouco atraente, principalmente num estudo em que muitas amostras serão analisadas.

A quantificação de 6-APA em caldo fermentativo foi investigada utilizando diferentes métodos, como iodométrico e cromatográfico (ALICINO et al, 1961; IVASHKIV et al., 1964). O bioensaio (baseado no diâmetro do halo que se forma no cultivo em placa de uma bactéria sensível à penicilina, na presença de amostra contendo antibiótico) poderia ser utilizado na quantificação de penicilina, apesar de demorado e ser menos preciso que o cromatográfico. Contudo, para 6-APA, a baixa bioatividade dessa molécula torna a aplicação desse método limitada. Outra estratégia a ser utilizada consiste em determinar indiretamente a concentração de 6-APA através da formação de penicilina sintética e sua quantificação por hidroxilamina.

Com base nos obstáculos descritos acima, foi implementada uma metodologia de análise de penicilina G e 6-APA utilizando espectrofotômetro. A precisão e exatidão do método desenvolvido dependem das condições de análise estabelecidas como: volume e concentração do reagente, volume e composição da matriz contendo o analito, concentração do analito e outros (SHEWALE et al., 1987). O caldo fermentativo é uma matriz complexa com altas quantidades de proteínas, a presença de fase líquida secundária (anti-espumante) e partículas sólidas, por exemplo, provenientes da água de maceração de milho (Schugerl e Seidel, 1998). Assim, muitas moléculas podem interferir na quantificação do analito de interesse. O aldeído utilizado reage com qualquer composto que apresente aminas primárias,

com distintas velocidades de reação. Além disso, dependendo da estrutura química do composto aminado, diferentes cores podem surgir desta reação.

Portanto, a aplicação deste método para quantificar 6-APA em caldo fermentativo exige uma investigação detalhada do efeito de interferentes sobre a análise. Neste trabalho, a metodologia implementada utiliza 25 μL de amostra e 2,5 mL da solução de PDAB. Esta relação entre os volumes foi necessária para que a interferência da cor do caldo fermentativo sobre os valores de absorbância fosse mínima, visto que a amostra foi muito diluída.

Amostras de caldo fermentativo livre de 6-APA foram utilizadas como controle, para estimar o valor de absorbância devido aos interferentes. Observou-se que somente 0,010 u.a. correspondiam à absorção por interferentes. Esses valores são relativamente pequenos, mesmo comparados a valores obtidos para soluções com baixas concentrações de 6-APA. Portanto, a metodologia mostrou-se viável para quantificar 6-APA em caldo fermentativo. Visando aumentar a exatidão do método, a curva de calibração foi construída utilizando como solvente para o preparo de soluções de concentração conhecida do analito, caldo fermentativo livre de 6-APA, e o branco também foi preparado misturando-se 25 μL deste caldo a 2,5 mL da solução de PDAB. O tempo de reação foi de 2,5 minutos e a leitura foi realizada a 415 nm. A curva de calibração e equação obtidas são mostradas na Figura 5.38.

Curva de calibração

(quantificação 6-APA em caldo fermentativo)

Abs = 0,0497(Capa) + 0,0161 R2 _{= 0,9994} 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 5 10 15 C6-APA (g/L) Ab so rb â n ci a

pontos experimentais Linear (pontos experimentais)

Figura 5.38: Curva de calibração para quantificação de 6-APA em caldo fermentativo. Faixa de concentração: 0,85-13,57 g/L; Volume amostra: 25 µL; Volume PDAB: 2,5 mL; Tempo de reação: 2,5 min a temperatura ambiente; Comprimento de onda: 415 nm.

A concentração de penicilina G pode ser determinada indiretamente utilizando este método. A cada amostra retirada do fermentador, 25 μL eram separados para a quantificação direta de 6-APA e 1 mL era submetida a hidrólise por penicilina G acilase. Assim, a concentração molar de 6-APA na amostra hidrolisada menos a concentração de 6- APA medida diretamente resulta na concentração de penicilina. Os resultados obtidos utilizando essa metodologia simples e rápida mostraram-se satisfatórios quando comparados aos resultados obtidos por HPLC (Tabela 5.10).

Tabela 5.10: Comparação entre os métodos HPLC e Hidrólise enzimática. Dados da dissertação de mestrado de Barros, 2008

HPLC Hidrólise enzimática

Conc. Teórica de PG (g/L) Conc. de PG (g/L) Conc. de PG (g/L)

50,00 49,65 48,85 25,00 23,56 26,11 12,50 13,21 12,27 6,25 6,21 6,34

Contudo, para algumas amostras ainda foi necessário uso do método cromatográfico para quantificação do consumo de ácido fenil acético - AFA e degradação de 6-APA durante o cultivo de P. chrysogenum. Foi utilizado gradiente de concentração de acetonitrila para separação de analitos de grande similaridade química, conforme protocolo adaptado por Silva, 2003). Os resultados obtidos na resolução dos picos foram satisfatórios, como mostra a Figura 5.39.

Figura 5.39: Cromatograma separação APA, AFA e PG.

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