No processo industrial convencional de produção de PG, o antibiótico acumula-se no biorreator até o final do cultivo; neste caso a temperatura é de 25 ºC. Em outros processos, parte do caldo fermentativo, contendo penicilina G, é transferido para um tanque de armazenagem (T< 12 ºC) e meio fresco é adicionado à dorna de fermentação. Este procedimento é importante devido à instabilidade química e térmica deste antibiótico (MENEZES, 2000).
A hidrólise de PG pode ser realizada em ambos os sistemas de produção. As vantagens de realizar a hidrólise a 12 ºC no tanque de armazenagem são: maior facilidade na separação do biocatalisador (menor quantidade de massa celular), menor perda de atividade catalítica e menor degradação do produto por efeito da temperatura. Apesar da velocidade de reação nessa condição de temperatura ser muito baixa, isto não seria um obstáculo, pois estes bioprocessos são realizados em até dez dias.
Por outro lado, se a hidrólise de PG é realizada dentro da dorna de fermentação (25ºC), tem-se a vantagem da remoção de AFA pelo fungo, reduzindo efeitos inibitórios. Considerando que o biocatalisador utilizado neste trabalho apresenta excelente estabilidade térmica, conclui-se que a hidrólise de PG no tanque de armazenagem ou na dorna de cultivo apresenta vantagens sobre o processo industrial utilizado atualmente para a produção de 6- APA. Portanto, nesta etapa do trabalho, o estudo cinético foi realizado em duas temperaturas de interesse industrial (12 e 25 ºC).
A análise dos parâmetros cinéticos foi realizada, inicialmente, utilizando o método de velocidades iniciais. O tempo de reação foi estabelecido de maneira que a conversão não ultrapassasse 10% para evitar efeitos de inibição e a reação inversa.
O efeito da temperatura sobre a atividade catalítica foi investigado para PGA na forma livre e imobilizada com o objetivo de compreender também o efeito da imobilização nas propriedades finais da enzima.
O objetivo nesta etapa do trabalho foi estimar os parâmetros cinéticos para a hidrólise da PG em biorreator durante o cultivo de P. chrysogenum pelo método das velocidades iniciais. Entretanto, 28 cultivos (sete níveis de concentração de PG, duas temperaturas diferentes, duas formas da enzima: livre e imobilizada) seriam necessários para ter os valores de velocidades iniciais determinados no meio reacional real. Considerando, a dificuldade de reproduzir as características de cada caldo cultivo, o tempo e reagentes gastos nestes experimentos, optou-se por estimar estes parâmetros fora do biorreator. Portanto, a hidrólise em biorreator foi simulada em microrreator (100 mL de capacidade).
Para tentar reproduzir as condições do biorreator foi realizado um cultivo de P.
chrysogenum e 6 L de caldo fermentativo livre de 6-APA, AFA e PG foi gerado,
considerando que a cepa utilizada não é capaz de produzir penicilina. A massa de fungo foi separada por filtração e o filtrado foi utilizado como solvente para preparar as soluções de PG em diferentes concentrações.
Para a estimativa dos parâmetros KM e Vmax foi empregado o programa
Microsoft ORINGIN 7.0. A equação utilizada para a estimativa dos parâmetros cinéticos pelo método das velocidades iniciais é apresentada (Equação 4.1).
]
[
]
[
.
maxS
K
S
V
v
m+
=
(4.1)Esta equação relaciona a velocidade (v), a velocidade máxima (Vmax) e a
concentração inicial de substrato [S] com a constante de Michaelis-Menten (KM).
A Figura 5.57 apresenta as curvas de velocidade versus concentração de PG obtidas para a enzima livre a 12 e 25 ºC. A unidade utilizada para a velocidade da enzima livre neste experimento (µmol/min*g) foi utilizada para comparar este parâmetro com o da enzima imobilizada. Este cálculo foi feito substituindo o volume da solução da enzima livre pela massa do biocatalisador (agarose + proteínas) contendo as unidades deste volume. O modelo de Michaelis-Menten foi ajustado aos pontos experimentais, visto que a cinética da maioria das reações enzimáticas é bem representada por esse modelo.
0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Livre 25 ºC Livre 12 ºC K M : 3,98 ± 1,7; Vmáx : 17,72 ± 1.5; R 2 : 0.7883 KM : 5,30 ± 1,8; Vmáx : 47,84 ± 3,5; R2 : 0.8755 V (µ mol/min* g) C penicilina (mM)
Figura 5.57: Velocidade de hidrólise de PG em função da concentração de substrato a 12 e 25 ºC com PGA livre.
A concentração de PG variou de 2,68 a 107,38 mM. Devido a limitações do sistema de detecção. Concentrações menores que 2,68 mM não puderam ser utilizadas. Em todos os níveis de concentração da PG a velocidade foi estimada respeitando a conversão máxima de 10%. Nestas mesmas condições foram levantadas as curvas de cinética para PGA imobilizada, cujo resultado é apresentado na Figura 5.58.
0 20 40 60 80 100 120 0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 Imob. 25 ºC Imob. 12 ºC K M : 9.73 ± 2.9; Vmáx : 1.29 ± 0.1; R 2 : 0.92773 KM : 14.76 ± 2.6; Vmáx : 4.21 ± 0.2; R2 : 0.97759 V (µ mol/min*g) C penicilina (mM)
Figura 5.58: Velocidade de hidrólise de PG em função da concentração de substrato a 12 e 25 ºC com PGA imobilizada.
O baixo valor de KM para hidrólise de PG associado a pouca sensibilidade do
método colorimétrico utilizado ocasionaram grandes desvios nos valores obtidos para os parâmetros cinéticos, portanto os resultados apresentados aqui são apenas uma estimativa destes valores. A dificuldade na determinação destes parâmetros é refletida na acentuada variação nas ordens de grandeza de valores publicados na literatura (ALKEMA et al., 1999).
Os valores obtidos para os parâmetros cinéticos pelo método das velocidades iniciais são apresentados na Tabela 5.11.
Tabela 5.11: Parâmetros cinéticos para a hidrólise de PG em reator (100 mL) pelo método das velocidades iniciais. PGA Parâmetro 12 ºC 25 ºC Km (mM) 3,98 ± 1,7 5,30 ± 1,8 Livre Vmáx (μmol/min.g) 17,72 ± 1,3 47,84 ± 3,5 Km (mM) 9,73 ± 2,9 14,76 ± 2,6 Imobilizada
Ao comparar os parâmetros cinéticos estimados nos sistemas empregando enzima livre e imobilizada, verifica-se que há uma drástica redução na velocidade de hidrólise ao empregar PGA imobilizada. A existência de efeitos cruzados pode justificar este resultado. Entre os principais efeitos sobre a velocidade de hidrólise estão os efeitos difusivos e formação de gradiente de pH intra-partícula (SPIEβ et al., 1999; GONÇALVES et al., 2008).
Comparando-se os valores de Vmáx para enzima livre e imobilizada em uma temperatura em particular, por exemplo, a 12 ºC nota-se uma efetividade experimental de aproximadamente 0,077, este valor a 25 ºC é 0,084 (Estes valores foram obtidos dividindo-se o valor da atividade medida para PGA imobilizada pela atividade medida para a enzima livre, considerando-se a mesma quantidade de proteína em ambos os sistemas). Esta pequena variação da efetividade, com o aumento da temperatura, não é suficiente para afirmar que o efeito difusivo controla a cinética de hidrólise.
Acredita-se que uma maior variação da temperatura poderia demonstrar a presença de efeitos difusivos, entretanto, para as condições de cultivo e hidrólise exigidas neste trabalho torna esta investigação desnecessária.
O fato de que o método de envolvimento das partículas de agarose (400 μm) contendo a PGA imobilizada não causa inativação da enzima, e de que a esfera formada tem diâmetro muito grande (4 mm) fortalecem a hipótese de efeitos difusivos. Além disso, estes efeitos difusivos associados à liberação de AFA durante a hidrólise e ao baixo valor de pH do caldo de cultivo (atividade aparente ~10 vezes menor comparada à da enzima livre) favorecem a formação do gradiente de pH.
5.6.2 Efeito de Inibição de PGA Imobilizada por 6-APA na Hidrólise de