Yönetim Muhasebesinin Tarihi

Dentro do menor prazo possível após a coleta, as amostras foram centrifugadas a 3.500RPM durante 15 minutos, 4oC, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha) do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde – UFRN. O plasma obtido foi aliquotado e armazenados a -80ºC até a realização dos ensaios, adicionando-se anteriormente uma mistura contendo os seguintes inibidores de proteases: aprotinina (Sigma- ALDRICH® Steinheim, Germany), benzamidina (Sigma-Aldrich® Steinheim, Germany), fenil-metil sulfonil fluoreto (PMSF) (Sigma-Aldrich® Steinheim, Germany) e hidroxitolueno butilato (BHT) (Sigma-Aldrich® Steinheim, Germany) (5µL para cada 100µL de amostra). As concentrações finais de antioxidantes nas amostras foram de: aprotinina = 2mg/mL, benzamidina = 2 mM, PMSF = 1 mM e BHT = 20 mM.

4.8.4.1 ELISA para a determinação da LDL(-)

Microplacas de poliestireno com 96 poços foram sensibilizadas com 10µg/mL/poço de anticorpo monoclonal anti LDL- 1A3H2 diluído em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M pH 9,6 e aplicado 50µL/poço, para em seguida ser incubado por 16-18 horas 4oC. O sobrenadante foi descartado e as placas foram lavadas três vezes com 200µL de tampão PBS-Tween 0,05% e batida posteriormente para retirada do excesso de líquido. A partir daí as placas foram bloqueadas com 150 µL/poço de uma solução de PBS-Tween 0,01% e leite desnatado a 2% (Molico®, Nestlé), previamente inativado pelo aquecimento a 100oC e filtrado em gaze. Após 1 e ½ hora de incubação a 37ºC, o sobrenadante foi desprezado e repetido o procedimento de

lavagem descrito anteriormente. Foi aplicado 50 mL/poço da amostra diluída 1:2000 em PBS- Tween 0,01% leite desnatado 1%, em triplicata. Para a curva padrão foi utilizado LDL(-) (concentração de 283mg/mL) obtida a partir de plasma humano e realizados todos os procedimentos de purificação. O material foi incubado por 1 e ½ hora a 37ºC. Após novo procedimento de lavagem, as placas foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-LDL(- )2C7D5F10 conjugado com biotina 10mg/mL/poço, diluído em PBS-Tween 0,01% leite desnatado 1% e aplicado 50µL/poço, por 1 hora a 37oC. As placas foram lavadas 4 vezes e permaneceu de molho por 30 segundos. Adicionou-se 50mL/poço de streptavidina conjugada com peroxidase por 1 hora 37oC. A reatividade da peroxidase foi medida nas placas lavadas e incubadas com orto-fenilenediamina (OPD) diluído em tampão citrato-fosfato pH5,3 adicionado de 5mL de peróxido de hidrogênio (50mL/poço) por 15 minutos a 37oC. A reação foi parada após a adição de ácido sulfúrico 2M (50mL/poço) e a absorbância a 492nm foi medida usando leitora de microplacas (Spectra Count Microplate Photometer, Packard

Instruments Company, EUA). As análises foram realizadas no Laboratório de Bioquímica

Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo e os valores foram expressos em U/L.

4.8.4.2 ELISA para a determinação de Ac anti LDL(-)

Microplacas de poliestireno com 96 poços foram sensibilizadas com 1µg/mL/poço de LDL(-) purificada e diluída em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M, pH 9,6 (50µL/poço), para em seguida ser incubado por 16-18 horas 4oC. O sobrenadante foi descartado e as placas foram lavadas três vezes com 200µL de tampão PBS-Tween 0,05% e batida posteriormente para retirada do excesso de líquido. A partir daí as placas foram bloqueadas com 150 µL/poço de uma solução de PBS-Tween 0,01% e leite desnatado a 2% (Molico®, Nestlé), previamente inativado pelo aquecimento a 100oC e filtrado em gaze. Após 1 e ½ hora de incubação a 37ºC, o conteúdo foi desprezado e repetido o procedimento de lavagem descrito anteriormente. Foi aplicado 50 mL/poço da amostra diluída 1:300 em PBS-Tween 0,01% leite desnatado 1%, em triplicata. Para a curva padrão foi utilizado o anticorpo monoclonal anti LDL(-) MAb2C7D5F10. O material foi incubado por 1 e ½ hora a 37ºC. Após novo procedimento de lavagem as placas foram incubadas com anti-IgG humana conjugado com peroxidase, diluída 1:3500 em PBS-Tween 0,01% leite desnatado 1%, aplicada no lado das amostras (50µL/poço); e com anti-IgG de camundongo, diluída 1:3500 em PBS-Tween 0,01% leite

desnatado 1% conjugado com peroxidase, aplicado na curva padrão (50µL/poço). A placa permaneceu em estufa 1 hora a 37oC. As placas foram lavadas 4 vezes e incubadas por 30 segundos e batidas. A reatividade da peroxidase foi medida nas placas lavadas e reveladas após aplicação de tetrametilbenzidina (TMB) (50mL/poço) por 15 minutos a 37oC. A reação foi parada com a adição de ácido sulfúrico 0,5M (50mL/poço) e a absorbância a 450nm foi medida usando leitora de microplacas (SLT SPECTRA A-5082®- SLT Labinstruments,

Austria). As análises foram realizadas no Laboratório de Bioquímica Clínica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo e os valores foram expressos em mg/L.

4.8.4.3 ELISA para a determinação de imunocomplexos Ac - LDL(-)

Microplacas de poliestireno com 96 poços foram sensibilizadas com 5µg/mL/poço com a porção Fab do anticorpo anti LDL(-) MAb2C7D5F10, diluído em tampão carbonato- bicarbonato 0,1M, pH 9,6 (50µL/poço), para em seguida ser incubado por 14-16 horas 4oC. O sobrenadante foi descartado e as placas foram lavadas cinco vezes com 200µL de tampão PBS-Tween 0,05%, incubando-se 30 segundos a cada lavagem e batida posteriormente, para retirada do excesso de líquido. A partir daí as placas foram bloqueadas com 150 µL/poço de uma solução de PBS-Tween 0,01% e leite desnatado a 5% (Molico®, Nestlé), previamente inativado pelo aquecimento a 100oC e filtrado em gaze. Após 1 e ½ hora de incubação a 37ºC, o sobrenadante foi desprezado e repetido o procedimento de lavagem descrito anteriormente. Foi aplicado 50 mL/poço da amostra diluída 1:50 em PBS-Tween 0,01% leite desnatado 1%, em triplicata. Para a curva padrão foi utilizado um pool de IgG humano, após aplicação de procedimentos de purificação. O material foi incubado por 1 e ½ hora a 37ºC. Após novo procedimento de lavagem as placas foram incubadas com anti-IgG humana (Fc) conjugado com peroxidase, diluída 1:4000 em PBS-Tween 0,01% leite desnatado 1%, aplicada 50µL/poço. A placa permaneceu em estufa 1 hora a 37oC. As placas foram lavadas conforme descrito anteriormente. A reatividade da peroxidase foi medida nas placas lavadas e reveladas após aplicação de TMB (50mL/poço) por 12 minutos a 37oC. A reação foi parada após a adição de ácido sulfúrico 0,5M (50mL/poço) e a absorbância a 450nm foi medida usando leitora de microplacas (SLT SPECTRA A-5082®- SLT Labinstruments, Austria). As análises foram realizadas no Laboratório de Bioquímica Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo e os valores foram expressos em g/L.