Timokinonun Bcl-2, Bcl-xl ve Kaspaz-3 üzerinde yaptığı değişiklikleri incelemek
amacıyla bu proteinlerin 6 ve 12. saatteki düzeylerine bakıldı. Bcl-2 ve Bcl-xl’de timokinon ve 6- OHDA’nın etkileri bakılırken, Kaspaz-3’de antiapoptotik Z-DEVD-FMK’nın etkisine ve
timokinon ve 6-OHDA ile etkileşimine de bakıldı.
Bcl-2’nin 6. saatteki düzeyleri timokinon ve 6-OHDA etkisi açısından anlamlı bulunmadı (p>0.05). 12. saatteki düzeylerinde ise timokinon tek başına anlamlı bir değişim oluşturmazken (p>0.05) 6-OHDA anlamlı bir azalmaya neden oldu(p<0.05). Timokinon ön uygulaması yapılıp 6-OHDA uygulanmış grupta ise sadece 6-OHDA uygulanmış gruba göre anlamlı bir artış gözlendi (p<0.0005) (Şekil 10).
28
Şekil 10 Timokinon, 6-OHDA ve Timokinon+6-OHDA’nın 6 ve 12 saat uygulanmasıyla Bcl-2 düzeylerinde oluşan değişim. (* : 12 saat 6-OHDA uygulaması bcl-2 düzeyini kontrole göre anlamlı şekilde düşürdü (p<0.05), ***: 12 saat Timokinon ön uygulaması bcl-2 düzeyini 6- OHDA’inin düşürdüğü düzeye göre anlamlı şekilde arttırdı (p<0.0005).)
Bcl-xl’nin 6. saatteki düzeylerinde kontrole göre timokinon tek başına anlamlı bir artış (p<0.05), 6-OHDA de anlamlı bir azalma (p<0.005) oluşturdu. Timokinon ön uygulaması yapılıp 6-OHDA uygulanmış grupta sadece 6-OHDA uygulanmış gruba göre anlamlı bir farklılık
gözlenmedi (p>0.05). Bcl-xl’nin 12. saatteki düzeylerinde timokinon ve 6-OHDA’nın anlamlı bir etkisi görülmedi (p>0.05) (Şekil 11).
29
Şekil 11 Timokinon, 6-OHDA ve Timokinon+6-OHDA’nın 6 ve 12 saat uygulanmasıyla Bcl-xl düzeylerindeki değişim. (*: 6 saat Timokinon uygulaması kontrole göre Bcl-xl düzeyinde anlamlı bir artış oluşturdu (p<0.05).
Kaspaz-3’ün 6. saatteki düzeyleri timokinon ile arttı, 6-OHDA ile düştü. Timokinon ön uygulamasının Kaspaz-3 düzeyine etkisi, sadece 6-OHDA uygulamasına göre anlamlı bir etki oluşturmadı (p>0.05). Z-DEVD-FMK ile Kaspaz-3 düzeyleri anlamlı azaldı (p<0.0005). Z- DEVD-FMK ile 6-OHDA’nın beraber uygulanması Kaspaz-3 düzeyini kontrole ve Z-DEVD- FMK’nın tek başına uygulamasına göre anlamlı arttırdı (p<0.0005). Timokinon ön uygulamasıyla beraber 6-OHDA verilmesi kaspaz-3 düzeyini, sadece Z-DEVD-FMK uygulaması ve 6-OHDA ile Z-DEVD-FMK’nın beraber uygulamasına göre anlamlı arttırdı (p<0.0005). 12. saatte timokinon ve 6-OHDA’nın oluşturduğu kaspaz-3 düzeyleri 6. saatteki gibi timokinon ile artmış ve 6-OHDA ile azalmış olarak bulunurken, timokinon ön uygulamasıyla 6-OHDA’nın beraber verilmesi anlamlı bir değişiklik oluşturmadı (p>0.05). 6. saatte olduğu gibi, Z-DEVD-FMK Kaspaz-3 düzeyini azalttı ve Z-DEVD-FMK uygulamasına göre 6-OHDA ile Z-DEVD-FMK, kaspaz-3 düzeyini arttırdı (p<0.0005). Z-DEVD-FMK, 6-OHDA ve timokinon ön uygulaması ise Z-DEVD-FMK’ya göre 6. saatin aksine Kaspaz-3 düzeyini azalttı (p<0.0005) (Şekil 12).
30
Şekil 12 A: Timokinon, 6-OHDA ve Z-DEVD-FMK’nın tek başlarına ve kombine olarak birbirlerine göre Kaspaz-3 düzeylerinde yaptığı etkilerin karşılaştırılması. (***:Kontrole göre timokinon Kaspaz-3 düzeyini anlamlı arttırdı(p<0.0005), Z-DEVD-FMK’nın Kaspaz-3’de oluşturduğu azalmayı 6-OHDA ve timokinon anlamlı şekilde arttırdı(p<0.0005).) B: Aynı 3 molekülün 12 saat uygulamayla Kaspaz-3 düzeylerindeki etkilerinin karşılaştırılması. (***: Timokinon’un 6 saatteki Kaspaz-3 düzeyi arttırıcı etkisi devam etti (p<0.0005), 6-OHDA Kaspaz- 3’ü kontrole göre anlamlı azalttı (p<0.0005), Z-DEVD-FMK uygulamasına göre 6-OHDA Kaspaz-3 düzeylerini anlamlı arttırdı (p<0.0005).
31 5.TARTIŞMA
Çalışmamızda SH-SY5Y hücrelerine PH modeli oluşturmak amacıyla en uygun doz 100 µM konsantrasyonda 6-OHDA olarak belirlenmiştir (111–115). Dozun belirlenmesinde
literatürde daha önce benzer amaçla uygulanan 6-OHDA dozları, MTT hücre canlılığı testi kullanılmış; hem istenmeyen etkileri azaltıp daha hassas bir deney oluşturabilmek için, hem de malzeme ekonomisi göz önüne alınarak bu doza karar verilmiştir. Timokinonun SH-SY5Y hücrelerine ön uygulamasında kullanılacak en uygun doz 2.5 µM bulunmuştur . Literatürde SH- SY5Y hücreleriyle timokinonun kullanıldığı çalışmalar kaynak oluşturmak için yetersiz
olduğundan dozun belirlenmesinde MTT hücre canlılığı testi verileri kullanılmıştır.
6-OHDA’nın proapoptotik bir protein olan Bax’ı arttırdığı çalışmamızda gösterilmiştir ve literatürde benzer doz ve sürelerde 6-OHDA uygulanmış çalışmalar ile sonuçlar uyumludur (116– 119). Bu sonuçtan yola çıkarak 6-OHDA’nın apoptotik parametreler üzerinden nöron hasarı oluşturduğu düşünülmüş, dolayısıyla timokinonun antiapoptotik etkisini ortaya çıkarmak için yapılacak deneylerde kullanılacak hücre kültürü modelinde 6-OHDA tercih edilmiştir.
Bu çalışmada 6-OHDA ile SH-SY5Y hücrelerinde oluşturulmuş PH modelinde timokinonun nöron koruyucu etkisi ve apoptotik parametrelerde yaptığı değişiklikler
incelenmiştir. MTT testinde timokinonun hücre canlılığını arttırabildiği görülmüştür. Literatürde 6-OHDA ve SH-SY5Y hücreleriyle oluşturulmuş PH modelinde timokinon denenmiş herhangi bir çalışma bulunmamaktadır ancak arsenik ve H2O2 ile oluşturulmuş SH-SY5Y modellerinde hücre canlılığını koruyucu etkisi gösterilmiştir (120,121). Bunların dışında farklı teknik ve hücre modelleriyle oluşturulmuş çalışmalar (81,122,123) ve PH hayvan modelleri de (83,124)
timokinonun nöron koruyucu etkisini desteklemektedir. Kendi bulgularımız ve literatür değerlendirildiğinde timokinonun dopaminerjik nöronlar üzerinde koruyucu bir etkisi olduğu, PH’a karşı koruyucu bir ilaç olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Bu koruyucu etkinin apoptoz mekanizmaları üzerinden oluştuğunu göstermek amacıyla apoptozda önemli rolleri olan Bcl-2, Bcl-xl ve Kaspaz-3 protein düzeylerinde timokinonun etkisi araştırılmıştır. Timokinonun 6-OHDA’ya karşı antiapoptotik Bcl-2 proteinini arttırdığı
gözlenmiştir. Literatürde timokinonun Bcl-2 üzerine etkisini gösteren, SH-SY5Y hücreleri veya 6-OHDA kullanılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Sıçan kortikal nöronlarına alkol toksisitesi uygulanmış bir çalışmada timokinonun hem nöron koruyucu etkisi, hem de Bcl-2’yi arttırdığı gösterilmiştir (125). Timokinonun beyin dışı diğer dokulardaki koruyucu etkisini ve
32 bcl-2’yi arttırıcı etkisi olduğunu gösteren bir çok hayvan çalışması da bulunmaktadır (126–129). Çalışmamızdaki sonuçlar literatürle uyumludur ve timokinonun nöron koruyucu etkisini Bcl-2 artışı üzerinden antiapoptotik bir etki aracılığıyla oluşturduğunu düşündürmektedir.
Timokinon, bulgularımızda Bcl-xl üzerinde de arttırıcı bir etki gösterse de, bu etki Bcl-2 düzeyindeki artış kadar belirgin değildir ve 6-OHDA’nın oluşturduğu azalmayı normal düzeylere getirmeye yetmemektedir. Literatürde timokinonun Bcl-xl üzerinden koruyucu etkisini araştıran herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Elimizdeki bulgular timokinonun nöron koruyucu etkisini Bcl-xl artışı üzerinden gerçekleştirmediğini düşündürmektedir, ancak timokinon için seçilen doz aralığı değiştirilerek Bcl-xl üzerine bir etki oluşma ihtimali ileri deneylerle değerlendirilmelidir.
Total Kaspaz-3 düzeyi çalışmalarımızda, kontrole göre 6-OHDA’nın total Kaspaz-3’ü azalttığı, timokinonun ise total Kaspaz-3’ü arttırdığı görülmüş; total Kaspaz-3 artışının aktif kaspaz-3’ün azalmasından kaynaklanabileceği, dolayısıyla bu sonuçların apoptozun azalması anlamına gelebileceği düşünülmüştür. Literatür de aktif Kaspaz-3’ün 6-OHDA uygulaması ile arttığını göstermektedir (130–132). 6-OHDA ve timokinonun beraber kullanıldığı bir çalışma bulunmasa da farklı hasarlayıcı ajanlar ile yapılan çalışmalarda timokinonun aktif kaspaz-3’ü düşürerek antiapoptotik bir etki yaptığı gösterilmiştir (129,133–135). Çalışmamızda aktif Kaspaz- 3 düzeyi ölçülmediğinden bu ayrımı yapmak mümkün olmamıştır, fakat ilerleyen çalışmalarda kaspaz-3 enzim aktivitesinin ölçülmesi planlanmaktadır. Timokinonun 6-OHDA’ya oluşturduğu zıt etki 12 saat uygulamada çok belirgin iken, 6 saat uygulamada 6-OHDA’nın etkisinde anlamlı bir fark oluşturamamıştır. Bcl-2 ve bcl-xl uygulamalarında da 6 saatlik uygulamada değişiklik gözlenmezken, 12 saatlik uygulamalarda görülmüştür. Dolayısı ile timokinonun 6-OHDA etkisini geç etki eden bir mekanizma ile azalttığı, veya 6-OHDA timokinondan daha hızlı metabolize oluyor ise yıkımından sonra etkisi zayıflayınca baskılayabildiği düşünülmüştür. Z-DEVD-FMK ile kaspaz inhibe edilerek uygulanan timokinon ve 6-OHDA de doğrudan uygulamayla benzer sonuçlar oluşturmuştur.
33 6.SONUÇ VE ÖNERİLER
Elimizdeki bulgular timokinonun PH modelinde hücre canlılığını koruduğu ve mitokondriyal intrensek yolak üzerinden apoptozu azalttığı yönündedir. Dolayısıyla PH’ye karşı koruyuculuğu olan bir ilaç olarak potansiyeli olduğu, ancak daha ileri çalışmalarla bu bulgunun doğrulanması gerektiği düşünülmüştür.
Bu çalışmada bcl-2 ve bcl-xl proteinleri incelenmiştir, bu proteinler de sadece intrensek yolak üzerinden apoptoz oluşumunu göstermektedir. Ekstrensek ve perforin/granzim yolaklarında etkili protein düzeyleri de incelenerek apoptoz mekanizmasıyla ilgili tüm mekanizma açıklığa kavuşturulmalıdır.
Aktif kaspaz-3 düzeyi veya kaspaz-3 enzim aktivitesi çalışmamızda ölçülememiştir, ilerleyen süreçlerde bu parametrelerin de katılması ile apoptoz üzerinde timokinonun etki mekanizması netleştirilmelidir.
Elimizdeki bulgular, bu önerilerin eklenmesi ve hayvan deneyleri ile güçlendirildiği takdirde, önümüzdeki aşamalarda timokinon ile ilgili veriler, PH için umut vadeden bir ilaç üretilebilecek netliğe ulaşacaktır.
34 7.KAYNAKLAR
1. de Lau LM, Breteler MM. Epidemiology of Parkinson’s disease. Lancet Neurol [Internet]. 2006 Jun 1 [cited 2019 Feb 7];5(6):525–35. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1474442206704719?via%3Dihub 2. Findley LJ. The economic impact of Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat Disord
[Internet]. 2007 Sep [cited 2019 Feb 18];13:S8–12. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17702630
3. Samarghandian S, Farkhondeh T, Samini F. A Review on Possible Therapeutic Effect of Nigella sativa and Thymoquinone in Neurodegenerative Diseases. CNS Neurol Disord - Drug Targets [Internet]. 2018 Aug 28 [cited 2018 Oct 30];17(6):412–20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29962349
4. Fouad IA, Sharaf NM, Abdelghany RM, El Sayed NSED. Neuromodulatory Effect of Thymoquinone in Attenuating Glutamate-Mediated Neurotoxicity Targeting the
Amyloidogenic and Apoptotic Pathways. Front Neurol [Internet]. 2018 [cited 2018 Nov 9];9:236. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29706929
5. Pazhouhi M, Sariri R, Khazaei M, Moradi M, Khazaei M. Synergistic effect of
temozolomide and thymoquinone on human glioblastoma multiforme cell line (U87MG). J Cancer Res Ther [Internet]. 2018 [cited 2018 Nov 9];14(5):1023. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30197342
6. Pazhouhi M, Sariri R, Rabzia A, Khazaei M. Thymoquinone synergistically potentiates temozolomide cytotoxicity through the inhibition of autophagy in U87MG cell line. Iran J Basic Med Sci [Internet]. 2016 Aug [cited 2018 Mar 30];19(8):890–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27746872
7. Zhang Y, Fan Y, Huang S, Wang G, Han R, Lei F, et al. Thymoquinone inhibits the metastasis of renal cell cancer cells by inducing autophagy via AMPK/mTOR signaling pathway. Cancer Sci [Internet]. 2018 Oct 28 [cited 2018 Nov 9]; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30259603
8. Alobaedi OH, Talib WH, Basheti IA. Antitumor effect of thymoquinone combined with resveratrol on mice transplanted with breast cancer. Asian Pac J Trop Med [Internet]. 2017
35 Apr [cited 2018 Nov 9];10(4):400–8. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28552110
9. Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol [Internet]. 2007 Jun 25 [cited 2018 Oct 23];35(4):495–516. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17562483
10. Xicoy H, Wieringa B, Martens GJM. The SH-SY5Y cell line in Parkinson’s disease research: a systematic review. Mol Neurodegener [Internet]. 2017 Dec 24 [cited 2019 Feb 17];12(1):10. Available from:
http://molecularneurodegeneration.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13024-017-0149- 0
11. Kuan N-K, Edward Passaro J. Apoptosis: Programmed Cell Death. Arch Surg [Internet]. 1998 Jul 1 [cited 2019 Feb 19];133(7):773. Available from:
http://archsurg.jamanetwork.com/article.aspx?doi=10.1001/archsurg.133.7.773
12. Parkinson J. An Essay on the Shaking Palsy. J Neuropsychiatry Clin Neurosci [Internet]. 2002 May [cited 2019 Jan 29];14(2):223–36. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983801
13. Björklund A, Dunnett SB. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci [Internet]. 2007 May [cited 2019 Jan 29];30(5):194–202. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17408759
14. BIRKMAYER W, HORNYKIEWICZ O. [The L-3,4-dioxyphenylalanine (DOPA)-effect in Parkinson-akinesia]. Wien Klin Wochenschr [Internet]. 1961 Nov 10 [cited 2019 Jan 29];73:787–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13869404
15. Anglade P, Vyas S, Javoy-Agid F, Herrero MT, Michel PP, Marquez J, et al. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients with Parkinson’s disease. Histol Histopathol [Internet]. 1997 Jan [cited 2018 Oct 29];12(1):25–31. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9046040
16. Pan T, Kondo S, Le W, Jankovic J. The role of autophagy-lysosome pathway in neurodegeneration associated with Parkinson’s disease. Brain [Internet]. 2008 Jan 10 [cited 2019 Jan 29];131(8):1969–78. Available from:
36 https://academic.oup.com/brain/article-lookup/doi/10.1093/brain/awm318
17. Tysnes O-B, Storstein A. Epidemiology of Parkinson’s disease. J Neural Transm [Internet]. 2017 Aug 1 [cited 2018 Oct 16];124(8):901–5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28150045
18. Reeve A, Simcox E, Turnbull D. Ageing and Parkinson’s disease: Why is advancing age the biggest risk factor? Ageing Res Rev [Internet]. 2014 Mar [cited 2018 Oct 16];14:19– 30. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24503004
19. Emamzadeh FN, Surguchov A. Parkinson’s Disease: Biomarkers, Treatment, and Risk Factors. Front Neurosci [Internet]. 2018 [cited 2018 Oct 16];12:612. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30214392
20. Shahed J, Jankovic J. Exploring the relationship between essential tremor and Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat Disord [Internet]. 2007 Mar [cited 2019 Jan 29];13(2):67–76. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16887374
21. Zeng X-S, Geng W-S, Jia J-J, Chen L, Zhang P-P. Cellular and Molecular Basis of Neurodegeneration in Parkinson Disease. Front Aging Neurosci [Internet]. 2018 Apr 17 [cited 2018 Oct 16];10:109. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29719505
22. Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M. alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with lewy bodies. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 1998 May 26 [cited 2019 Jan
31];95(11):6469–73. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9600990 23. Dickson DW, Ruan D, Crystal H, Mark MH, Davies P, Kress Y, et al. Hippocampal
degeneration differentiates diffuse Lewy body disease (DLBD) from Alzheimer’s disease: light and electron microscopic immunocytochemistry of CA2-3 neurites specific to DLBD. Neurology [Internet]. 1991 Sep [cited 2019 Jan 31];41(9):1402–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1653914
24. Kuzuhara S, Mori H, Izumiyama N, Yoshimura M, Ihara Y. Lewy bodies are ubiquitinated. A light and electron microscopic immunocytochemical study. Acta Neuropathol [Internet]. 1988 [cited 2019 Jan 31];75(4):345–53. Available from:
37 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3364159
25. Goldman JE, Yen SH, Chiu FC, Peress NS. Lewy bodies of Parkinson’s disease contain neurofilament antigens. Science [Internet]. 1983 Sep 9 [cited 2019 Jan
31];221(4615):1082–4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6308771 26. Kouli A, Torsney KM, Kuan W-L. Parkinson’s Disease: Etiology, Neuropathology, and Pathogenesis [Internet]. Parkinson’s Disease: Pathogenesis and Clinical Aspects. Codon Publications; 2018 [cited 2019 Feb 7]. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30702842
27. Lai BC., Marion S., Teschke K, Tsui JK. Occupational and environmental risk factors for Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat Disord [Internet]. 2002 Jun 1 [cited 2019 Feb 7];8(5):297–309. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1353802001000542
28. Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science
[Internet]. 1997 Jun 27 [cited 2019 Jan 31];276(5321):2045–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9197268
29. Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J, et al. -Synuclein Locus Triplication Causes Parkinson’s Disease. Science (80- ) [Internet]. 2003 Oct 31 [cited 2019 Jan 31];302(5646):841–841. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14593171
30. Creed RB, Goldberg MS. Analysis of α-Synuclein Pathology in PINK1 Knockout Rat Brains. Front Neurosci [Internet]. 2018 [cited 2019 Jan 31];12:1034. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30686993
31. Zimprich A, Biskup S, Leitner P, Lichtner P, Farrer M, Lincoln S, et al. Mutations in LRRK2 Cause Autosomal-Dominant Parkinsonism with Pleomorphic Pathology. Neuron [Internet]. 2004 Nov 18 [cited 2019 Jan 31];44(4):601–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541309
32. Jiang H, Ren Y, Yuen EY, Zhong P, Ghaedi M, Hu Z, et al. Parkin controls dopamine utilization in human midbrain dopaminergic neurons derived from induced pluripotent
38 stem cells. Nat Commun [Internet]. 2012 Feb 7 [cited 2019 Jan 31];3:668. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22314364
33. Agnihotri SK, Shen R, Li J, Gao X, Büeler H. Loss of PINK1 leads to metabolic deficits in adult neural stem cells and impedes differentiation of newborn neurons in the mouse hippocampus. FASEB J [Internet]. 2017 Jul [cited 2019 Feb 7];31(7):2839–53. Available from: http://www.fasebj.org/doi/10.1096/fj.201600960RR
34. Jankovic J. Parkinson’s disease: clinical features and diagnosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry [Internet]. 2008 Apr 1 [cited 2019 Jan 29];79(4):368–76. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18344392
35. Thomas RJ. Blinking and the release reflexes: are they clinically useful? J Am Geriatr Soc [Internet]. 1994 Jun [cited 2019 Jan 29];42(6):609–13. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8201145
36. Vreeling FW, Jolles J, Verhey FR, Houx PJ. Primitive reflexes in healthy, adult volunteers and neurological patients: methodological issues. J Neurol [Internet]. 1993 Sep [cited 2019 Jan 29];240(8):495–504. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8263556 37. Hunker CJ, Abbs JH, Barlow SM. The relationship between parkinsonian rigidity and
hypokinesia in the orofacial system: a quantitative analysis. Neurology [Internet]. 1982 Jul 1 [cited 2019 Jan 29];32(7):749–54. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7201112
38. Ramaker C, Marinus J, Stiggelbout AM, van Hilten BJ. Systematic evaluation of rating scales for impairment and disability in Parkinson’s disease. Mov Disord [Internet]. 2002 Sep [cited 2019 Jan 29];17(5):867–76. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12360535
39. Senard JM, Raï S, Lapeyre-Mestre M, Brefel C, Rascol O, Rascol A, et al. Prevalence of orthostatic hypotension in Parkinson’s disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry [Internet]. 1997 Nov 1 [cited 2019 Jan 30];63(5):584–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9408097
40. Pursiainen V, Haapaniemi TH, Korpelainen JT, Sotaniemi KA, Myllylä V V. Sweating in Parkinsonian patients with wearing-off. Mov Disord [Internet]. 2007 Apr 30 [cited 2019
39 Jan 30];22(6):828–32. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17357129 41. Aarsland D, Andersen K, Larsen JP, Lolk A, Nielsen H, Kragh-Sørensen P. Risk of
dementia in Parkinson’s disease: a community-based, prospective study. Neurology [Internet]. 2001 Mar 27 [cited 2019 Jan 30];56(6):730–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11274306
42. Aarsland D, Brønnick K, Ehrt U, De Deyn PP, Tekin S, Emre M, et al. Neuropsychiatric symptoms in patients with Parkinson’s disease and dementia: frequency, profile and associated care giver stress. J Neurol Neurosurg Psychiatry [Internet]. 2007 Jan 1 [cited 2019 Jan 30];78(1):36–42. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16820421
43. Lai EC, Jankovic J, Krauss JK, Ondo WG, Grossman RG, Jankovic J. Long-term efficacy of posteroventral pallidotomy in the treatment of Parkinson’s disease. Neurology
[Internet]. 2000 Oct 24 [cited 2019 Jan 30];55(8):1218–22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071505
44. Schenck CH, Bundlie SR, Mahowald MW. 44th annual meeting of the American Academy of Neurology. San Diego, Ca., May 3-9, 1992. Abstracts. Neurology [Internet]. 1992 Mar 1 [cited 2019 Jan 30];42(3 Pt 2):1–35. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1542424
45. Borek LL, Kohn R, Friedman JH. Phenomenology of dreams in Parkinson’s disease. Mov Disord [Internet]. 2007 Jan 15 [cited 2019 Jan 30];22(2):198–202. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17133561
46. Stern MB, Doty RL, Dotti M, Corcoran P, Crawford D, McKeown DA, et al. Olfactory function in Parkinson’s disease subtypes. Neurology [Internet]. 1994 Feb 1 [cited 2019 Jan 30];44(2):266–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8309571
47. Vingerhoets FJG, Schulzer M, Calne DB, Snow BJ. Which clinical sign of Parkinson’s disease best reflects the nigrostriatal lesion? Ann Neurol [Internet]. 1997 Jan [cited 2019 Jan 29];41(1):58–64. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9005866 48. Broussolle E, Krack P, Thobois S, Xie-Brustolin J, Pollak P, Goetz CG. Contribution of
40 [cited 2019 Jan 29];22(7):909–14. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1002/mds.21484
49. Ashour R, Jankovic J. Joint and skeletal deformities in Parkinson’s disease, multiple system atrophy, and progressive supranuclear palsy. Mov Disord [Internet]. 2006 Nov [cited 2019 Jan 29];21(11):1856–63. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16941460
50. Riley D, Lang AE, Blair RD, Birnbaum A, Reid B. Frozen shoulder and other shoulder disturbances in Parkinson’s disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry [Internet]. 1989 Jan 1 [cited 2019 Jan 29];52(1):63–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2709037
51. Williams DR, Watt HC, Lees AJ. Predictors of falls and fractures in bradykinetic rigid syndromes: a retrospective study. J Neurol Neurosurg Psychiatry [Internet]. 2006 Apr 1 [cited 2019 Jan 29];77(4):468–73. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16543524
52. Koller WC, Glatt S, Vetere-Overfield B, Hassanein R. Falls and Parkinson’s disease. Clin Neuropharmacol [Internet]. 1989 Apr [cited 2019 Jan 29];12(2):98–105. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2720700
53. BIRKMAYER W, HORNYKIEWICZ O. [The L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) effect in Parkinson’s syndrome in man: On the pathogenesis and treatment of Parkinson akinesis]. Arch Psychiatr Nervenkr Z Gesamte Neurol Psychiatr [Internet]. 1962 [cited 2019 Feb 2];203:560–74. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13971142 54. Bastide MF, Meissner WG, Picconi B, Fasano S, Fernagut P-O, Feyder M, et al.
Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson’s disease. Prog Neurobiol [Internet]. 2015 Sep [cited 2019 Feb 2];132:96–168. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26209473
55. Napolitano A, Del Dotto P, Petrozzi L, Dell’Agnello G, Bellini G, Gambaccini G, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of L-Dopa after acute and 6-week tolcapone administration in patients with Parkinson’s disease. Clin Neuropharmacol [Internet]. [cited 2019 Feb 2];22(1):24–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10047930
41 56. Grall-Bronnec M, Victorri-Vigneau C, Donnio Y, Leboucher J, Rousselet M, Thiabaud E,
et al. Dopamine Agonists and Impulse Control Disorders: A Complex Association. Drug Saf [Internet]. 2018 Jan 31 [cited 2019 Feb 2];41(1):19–75. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28861870
57. Moore JJ, Saadabadi A. Selegiline [Internet]. StatPearls. StatPearls Publishing; 2018 [cited 2019 Feb 2]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30252350
58. Muthuraman M, Koirala N, Ciolac D, Pintea B, Glaser M, Groppa S, et al. Deep Brain Stimulation and L-DOPA Therapy: Concepts of Action and Clinical Applications in Parkinson’s Disease. Front Neurol [Internet]. 2018 [cited 2019 Feb 2];9:711. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30210436
59. Lee DJ, Dallapiazza RF, De Vloo P, Lozano AM. Current surgical treatments for Parkinson’s disease and potential therapeutic targets. Neural Regen Res [Internet]. 2018 Aug [cited 2019 Feb 2];13(8):1342–5. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30106037
60. Allert N, Cheeran B, Deuschl G, Barbe MT, Csoti I, Ebke M, et al. Postoperative rehabilitation after deep brain stimulation surgery for movement disorders. Clin
Neurophysiol [Internet]. 2018 Mar 1 [cited 2019 Feb 2];129(3):592–601. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1388245718300038?via%3Dihub 61. Kabra A, Sharma R, Kabra R, Baghel US. Emerging and alternative therapies for
Parkinson disease: an updated review. Curr Pharm Des [Internet]. 2018 Aug 20 [cited 2018 Oct 18];24. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30124146
62. Fang X, Han D, Cheng Q, Zhang P, Zhao C, Min J, et al. Association of Levels of Physical Activity With Risk of Parkinson Disease. JAMA Netw Open [Internet]. 2018 Sep 21 [cited 2019 Feb 2];1(5):e182421. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30646166