3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.4. Verilerin İstatiksel Analizleri
Çalışmanın verilerinin istatiksel analizi için Pearson ki- kare, Fisher kesin ki-kare kullanılmış, p < 0.05 değerleri istatiksel açıdan anlamlı kabul edilmiştir. Tüm istatiksel testler SPSS for Windows, Version 15.0 paket programı ile gerçekleştirilmiştir.
Duyarlılık; gerçekten hasta olan bireylerin test tarafından hangi oranda saptanabildiğini belirten bir olasılıktır. Testin gerçek hastaları ortaya çıkarmakta ne kadar duyarlı olduğunu belirtir. Özgüllük; bir testin gerçekten hasta olmayanları ayırabilme yeteneğini belirten orandır. Pozitif prediktif oranı; bir testin gerçekten hasta diye nitelendirdiği kişilerin gerçekten ne kadarının hasta olduklarını gösteren orandır.
Negatif prediktif değer; testin gerçekten hasta olmadığını belirttiği kişilerin, gerçekte hangi oranda hasta olduklarını gösteren orandır (83). Tanıda kullandığımız yöntemlerin duyarlılık ve özgüllük, pozitif prediktif değerleri belirlemek için Medcal 11.03 paket programı kullanılmıştır.
3.5. ELISA
ESOGÜ Tıp Fakültesi Eğitim Hastanesi Ruh Sağlığı ve Hastalıkları polikliniğinden gelen kan örnekleri ve çalışmaya gönüllü olarak katılan kontrol grubundan alınan örneklerin tamamı (150 hasta ve 50 kontrol, toplam 200 serum örneği) ELISA testi ile çalışılmıştır. Örnekler çalışma öncesi -20oC’lik derin dondurucudan çıkartılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda çalışılmıştır.
ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay testinin İngilizce kısaltmasıdır.
ELISA, Antijen-antikor reaksiyonları göstermek için enzimlerin kullanıldığı bir serolojik tanı yöntemidir. Kolay uygulama, yüksek duyarlılık, kullanılan reaktiflerin uzun süre saklanabilmes, otomatize edilerek çok sayıda örneğin kısa sürede çalıştırılabilmesi sonuçların spektrometrede objektif olarak değerlendirilebilmesi ve saklanabilmesi gibi avantajlara sahip olan bu yöntem, parazit hastalıklarının tanısında da yaygın olarak kullanılmaktadır. (21, 115).
Enzim bağlı immuno sorbent testinin prensibi;
Bir enzimin bilinen bir antijen ya da antikora bağlanması,
Enzim bağlı materyalin hasta örneği ile tepkimeye sokulması
Enzime ait substrat eklenerek enzin etkinliğinin ölçülmesidir.
Şekil 3.1. ELISA testinin çalışmasının şematik anlatımı
Tanıda ARCHITECT tarafından üretilen Toxo IgM ve Toxo IgG ELISA kiti kullanıldı.
ARCHITECT Toxo IgG tetkiki, insan serumu ve plazmasında bulunan Toksoplasma gondii IgG antikorlarının kantitatif belirlenmesi için CMIA teknolojisi kullanılarak adlandırılan Chemiflex® gibi esnek tetkik protokoller kullanılan iki adımlı bir immünolojik tetkikidir.
İlk adımda ön seyreltilmiş örnek, tetkik düluenti ve rekombinant T.gondii antijeni P30 (SAG1) ve P35(GRA8) rekombinant antijenleri içeren) kaplı paramanyetik mikropartiküller birleşir. Örnekte mevcut T. gondii spesifik antikorları, rekombinant T.
gondii antijen kaplı mikropartiküllere tutunur. Yıkamadan sonra, ikinci adımda sıçan akridinium etiketli anti-insan IgG konjugatı reaksiyon karışımına ilave edilir.
Elde edilen kemilüminesan reaksiyon, bağıl ışık üniteleri (RLU’lar) olarak ölçülür. Örnekteki anti-Tokso IgG miktarı ve ARCHITECT ιSystem optik sistemleri ile tespit edilen RLU’lar arasında doğrudan ilişki bulunmaktadır.
ARCHITECT Toxo IgM; İnsan serumu ve plazmasında bulunan T. gondii’ye karşı IgM antikorlarının kantitatif belirlenmesi için CMIA teknolojisi ile Chemiflex® olarak adlandırılan esnek tektik protokoller kullanan iki adımlı bir immünolojik tetkiktir.
İlk adımda, ön seyreltilmiş örnek ve anti-insan IgM fare monoklonal antikoru kaplı paramanyetik mikropartiküller birleştirilir. Diğer spesifiklerde olan IgM antikorları ile birlikte örnekte mevcut anti-tokso spesifik IgM, anti-insan IgM fare monoklonal antikor kaplı mikropartiküller tarafından bağlanır ve bir antikor- antikor
bileşeni oluşturur. Yıkamadan sonra ikinci adımda bir reaksiyon karışımı oluşturmak için, akridinium etiketli anti- tokso 30 antijen fare monoklonal F(ab’)2 fragman ve p30 antijen içeren doğal T. gondii lizat oluşan konjugat bileşeni eklenir. Bu konjugat bileşeni ilk adımda anti-insan fare monoklonal antikor kaplı mikropartiküllerden tutulan anti- tokso spesifik IgM tarafından bağlanır ve bir antikor- antikor- konjugat bileşeni oluşturur. Diğer bir yıkama dönüşümünden sonra pre-trigger ve triggersolüsyonları reaksiyon karışımına ilave edilir.
Elde edilen kemilüminesan reaksiyon, bağıl ışık üniteleri (RLU’lar)olarak ölçülür.
Örnekteki anti-Tokso IgM miktarı ve ARCHITECT i System optik sistemleri ile tespit edilen RLU’lar arasında doğrudan bir ilişki bulunmaktadır. Örnekte anti- Tokso IgM’nin varlığı ya da yokluğu reaksiyondaki kemilüminesan sinyalinin aktif bir kalibrasyon eğrisinden elde edilen cutt off sinyali ile karşılaştırılmasıyla tespit edilir.
Örnekteki kemilüminesan sinyal, cutoff sinyalinden büyük ya da eşit ise, örnek anti-tokso IgM için reaktif olarak değerlendirilir.
Kit prosedürüne göre ELISA testinin uygulanması;
1. ARCHITECT Toxo IgM/IgG Reaktif kitininsisteme yüklenmeden önce mikropartikül şişesi karıştırıldı, dibe çökme olup olmadığı kontrol edildi.
2. Mikropartiküller karıştırıldıktan sonra şişeye bir septum yerleştirildi.
3. ARCHITECT Toxo IgM/IgG Reaktifi ARCHITECT i Systemi’ne yüklendi.
4. Bütün reaktiflerin bulunduğu kontrol edilip ve reaktiflerin septumlarının takıldı.
5. Örnekler ARCHITECT i Systemi’ne yüklendi.
Sonuçların Değerlendirilmesi:
Kit prosedürüne göre hasta sonuçlarının yorumlanması;
Tokso IgG değerlendirmesi;
Konsantrasyon değerleri < 1.6 IU/ml olan örnekler Toksoplasma gondii IgG antikorları için negatif değerlendirildi.
Konsantrasyon değerleri ≥ 3.0 IU/mL olan örnekler Toksoplasma gondii IgG antikorları için pozitif olarak değerlendirildi .
Konsantrasyon değerleri 1.6 ila < 3.0 IU/mL olan numuneler şüpheli olarak değerlendirildi. Test tekrarı yapıldı.
Tokso IgM değerlendirmesi;
< 0.50 indeks sonuçlarına sahip örnekler Toksoplasma gondii IgM antikorları için negatif olarak değerlendirildi.
≥ 0.60 indeks sonuçlarına sahip örnekler Toksoplasma gondii IgM antikorları için pozitif olarak değerlendirildi.
0.50 ≤ x < 0.60 indeks aralığında sonuçlara sahip örnekler şüpheli olarak değerlendirildi.
3.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Örnekler -20oC’den oda ısısına çıkarıldı. Oda ısısına gelen örneklerden önce QIAGEN DNA Mini-Kit ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda DNA ekstraksiyonu yapıldı, ekstrakte edilen örnekler The PrimerDesign™ Toksoplasma gondii Kit ile kit prosedürlerine göre değerlendirildi.
3.6.1. Ekstraksiyon
150 hasta ve 50 kontrol olmak üzere, örneklerin tamamının ekstraksiyonu yapıldı.
Ekstraksiyon işlemleri üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıdaki şekilde uygulandı.
Başlamadan önce:
1. Isı Bloğu dördüncü adımda kullanılmak üzere 56oC’ye ayarlandı.
2. Örnek sayısı kadar ependorf tüpleri, ikişerli gruplar halinde numaralandırıldı.
3. Buffer AW1’e 25 ml, Buffer AW2’e ise 30 ml ethanol eklenerek hazır hale getirildi.
4. Internal Extraction Control DNA’a 600 μl PZR suyu ile sulandırıldı.
Protokol: