3. YÖNTEM
3.4 VARYANT DOĞRULAMA
Hastalıkla ilişkili olduğu düşünülen tüm varyantlar, Sanger dizi analizi ile doğrulanmıştı. Ayrıca aile üyelerinin segregasyon analizleri değerlendirildi. Segregasyon analizlerinde hastalıkla ilişkili olduğu düşünülen tüm varyantlar için UCSC veritabanı ve Primer3 yazılımı kullanılarak amplikon boyutu 18-30 baz çifti, GC oranı yaklaşık %40-60 ve
37 primer bağlanma sıcaklığı 59-61oC aralığında olacak şekilde primer dizaynları
gerçekleştirilmişti. Her bir varyant için tasarlanan primerler PCR yöntemi ile çoğaltılmıştı. PCR koşulları Tablo 28’de verilmiştir.
Tablo 28. PCR koşulları
Sıcaklık Süre Döngü Sayısı Denatürasyon 94 0C 5 dakika 1 Denatürasyon Bağlanma Uzama 94 0C 55 0C 72 0C 30 saniye 30saniye 35 45 saniye
Son Uzama 72 0C 7 dakika 1 Bekleme 4 0C ∞
Sanger dizi analizi işlemi için “ABI Prism 3.1 Big-Dye Terminatör Kit” kullanılmıştı. Aşağıdaki protokol uygulanmıştı:
• 8 µl Big Dye enzim ve buffer karışımı PCR tüplerine dağıtılır. • Her tüp için 7,5 µl didistile su eklenir.
• Tüplere 0.5 µl Forward veya Reverse primerlerden (10 µM) biri eklenir. • Son olarak 4 µl purifiye PCR ürünü de eklenerek, her bir örnek için toplam
20µl’lik volüm elde edilir.
• Bu PCR miksi standart bir PCR cihazının Big Dye Terminator Kit programı (Tablo 29) ile reaksiyona bırakılır.
Tablo 29. Big-Dye Terminatör Kit PCR koşulları
Sıcaklık Süre Döngü Sayısı Denatürasyon 96 0C 1 dakika 1 Denatürasyon Bağlanma Uzama 96 0C 50 0C 60 0C 10 saniye 5 saniye 25 4 dakika Bekleme 4 0C ∞
İkinci saflaştırma işlemi PCR sonrasında, ortaya çıkan PCR ürününün içerisindeki florasan işaretli ddNTP’leri ve diğer PCR bileşenlerini ortamdan uzaklaştırmak amacıyla uygulanır. Bu işlem için “Zymo Research DNA Sequencing Clean Up Kit“ kullanılmıştı.
38 Dizi analizi örneklerinin yürütülmesi için ABI 3500 cihazı kullanılmıştı.
Sonuçlar analiz edilirken, Sanger dizi analizi için CLC Genomics Workbench programı, YNDA ile yapılan çalışmalar için ise IGV programı kullanıldı.
39 4. BULGULAR
Çalışmamızda kalıtsal trombositopeni ön tanısıyla tarafımıza yönlendirilmiş 36 olgu değerlendirildi. Bu olguların genel özellikleri Tablo 30’da verilmiştir. Toplamda 10 olguda, 5 gende (NBEAL2, MPL, MYH9, GP1BA, WAS), 9 farklı mutasyon saptanmıştır. ACMG 2015 kriterlerine göre bu varyantların 4’ü patojenik, 4’ü muhtemel patojenik ve 1 tanesi önemi bilinmeyen varyant olarak sınıflandırılmıştır. Olgularda saptanan mutasyonlar Tablo 31’de gösterilmiştir. Ayrıca çalışmada klinik olarak önemi bilinmeyen değişiklik olarak sınıfladığımız varyantlar Ek- Tablo 1’de belirtilmiştir.
Tablo 30. Çalışmaya alınan 36 olgunun genel özellikleri
Olgu No Yaş Cinsiyet Trombosit Sayısı (/mm3) Ön Tanı 1* 13 E 90.000 Kalıtsal Trombositopeni 2 2 E 94.000 Kalıtsal Trombositopeni 3* 8 E 102.000 Kalıtsal Trombositopeni 4 11 K 40.000 Makrotrombositopeni 5* 9 E 69.000 Kalıtsal Trombositopeni
6 37 K 122.000 Ailesel Trombosit Bozukluğu ve Myeloid Lösemilere Yatkınlık
7 12 K 3700 Makrotrombositopeni 8 16 E 90.000 Kalıtsal Trombositopeni 9* 4 K 10.000 Amegakaryositik Trombositopeni 10 5 K 41.000 Makrotrombositopeni 11 15 K 125.000 Kalıtsal Trombositopeni 12 4 E 26.000 Kalıtsal Trombositopeni 13 18 E 78000 Kalıtsal Trombositopeni 14 1 K 23.000 Amegakaryositik Trombositopeni 15 5 K 71.000 Makrotrombositopeni 16* 13 E 48.000 Kalıtsal Trombositopeni 17 25 K 82.000 Makrotrombositopeni 18 19 E 75.000 Kalıtsal Trombositopeni
19 21 E 32.000 Ailesel Trombosit Bozukluğu ve Myeloid Lösemilere Yatkınlık
20 14 E 90.000 Kalıtsal Trombositopeni 21 16 E 24.000 Makrotrombositopeni 22 11 K 74.000 Makrotrombositopeni 23 12 E 15.000 Kalıtsal Trombositopeni 24 7 K 56.000 Kalıtsal Trombositopeni 25* 14 K 34.000 Kalıtsal Trombositopeni 26 21 K 102.000 Kalıtsal Trombositopeni 27 10 K 70.000 Kalıtsal Trombositopeni 28* 13 K 70.000 Kalıtsal Trombositopeni 29* 26 E 20.000 Makrotrombositopeni
40 30 7 K 135.000 Bernard-Soulier Sendromu 31 10 E 60.000 Kalıtsal Trombositopeni 32* 3 E 50.000 Makrotrombositopeni 33 13 E 109.000 Kalıtsal Trombositopeni 34* 6 E 7.900 Makrotrombositopeni 35 10 E 95.000 Makrotrombositopeni
36 14 K 112.000 Trombosit Fonksiyon Bozukluğu
*: Mutasyon saptanan olgular
Tablo 31. Çalışmada saptanan mutasyonlar
Gen Transkript Varyant ACMG Sınıflandırması
MYH9 NM_002473.6 c.287C>T (p.S96L) Muhtemel Patojenik
MYH9 NM_002473.6 c.2104C>T (p.R702C) Patojenik
WAS NM_000377.3 c.1453G>A (p.D485N) Patojenik
MPL NM_005373.3 c.212+5G>A Muhtemel Patojenik
MPL NM_005373.3 c.235_236delCT (p.L79Efsx84) Patojenik
NBEAL2 NM_015175.3 c.7878+2T>A Patojenik
NBEAL2 NM_015175.3 c.7559G>T (p.G2520V) Önemi Bilinmeyen varyant
GP1BB NM_000407.5 c.149C>T (p.P50L) Muhtemel Patojenik
41 OLGU 1 (AA)
Aralarında 1. derece kuzen evliliği bulunan 3 çocuklu anne ve babanın ikinci çocuğu olarak, miadında, normal spontan vaginal doğum (NSVD) ile dünyaya gelen 13 yaşındaki erkek olgu bacaklarda kolay morarma, yılda 3-4 kez olan burun kanamaları ve trombositopeni öyküsü ile nedeniyle tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde, trombosit sayısı düşüklüğü bulunan aile bireyi olmadığı öğrenildi. Olgunun tam kan sayımında trombosit sayısı 90.000 /mm3 olarak saptanmış. Agregasyon testlerinde ADP, epinefrin ve ristosetin cevabı düşük olarak bulunmuş. Vitamin B12 değeri ise 1621 pg/ml olarak ölçülmüş. Periferik yaymada ise trombositlerin soluk renkli görüldüğü belirtilmişti.
42 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile NBEAL2 geninde c.7559G>T (p.G2520V) değişikliği homozigot olarak saptanmıştı. Segregasyon çalışmasında anne ve babanın bu genetik değişikliği heterozigot durumda taşıdıkları gösterilmişti. Literatürde ve veri tabanlarında tanımlı olmayan bu varyant ACMG kriterlerine göre önemi bilinmeyen varyant olarak sınıflandırılmaktadır.
Şekil 4. Olgu 1'in Sanger dizi analizi görüntüsü
43 OLGU 3 (AÖ)
Aralarında akrabalık bulunmayan, fakat 400 haneli aynı köylü olan anne-babanın 2. çocuğu olarak, miadında, NSVD ile dünyaya gelen 8 yaşındaki erkek olgu, trombositopeni etyolojisinin aydınlatılması amacıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde trombositopenisi bulunan aile bireyi yoktu. Trombositopenisi ilk kez 18 aylıkken fark edilmiş, 5 yaşında ise aralıklı hematüri sebebiyle kanama diyatezi açısından yapılan tetkikleri normal bulunmuş. Yapılan son tetkiklerinde tam kan sayımında trombosit sayısı 102.000/mm3 ve
hemoglobin değeri 10,2 mg/dl olarak saptanmış. Periferik yaymasında; atipik hücre görülmezken, trombosit sayısının 80.000 olduğu, yer yer trombositlerde 2’li kümelerin olduğu ve eritrositlerin normo-makrositer olduğu gözlenmiş. Agregasyon testlerinde ADP, epinefrin ve ristosetin cevabı düşük olarak bulunmuş. Vitamin B12 değeri ise 663 pg/ml olarak ölçülmüş. Kemik iliği biyopsisi ise, orta derecede retikülin lif artışı, eritroid seride regresyon, hafif hipersellüler kemik iliği şeklinde yorumlanmış. Bu durumun MDS tanı ve yorumunda yeterli olmadığından olgunun takibi önerilmiş.
44 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile NBEAL2 geninde c.7878+2T>A değişikliği homozigot olarak saptanmıştı. Segregasyon çalışması ile ebeveynlerin bu genetik değişikliği heterozigot durumda taşıdıkları gösterilmişti. Literatürde ve veri tabanlarında tanımlı olmayan bu varyant ACMG kriterlerine göre patojenik olarak sınıflandırılmaktadır.
Şekil 7. Olgu 3'ün Sanger dizi analizi görüntüsü
45 Olgu 5 (BY)
Aralarında 1. derece kuzen evliliği bulunan 2 çocuklu anne-babanın ilk çocuğu olarak, miadında, NSVD ile dünyaya gelen 9 yaşındaki erkek olgu, trombositopeni etyolojisinin aydınlatılması amacıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde trombositopeni öyküsü olan aile bireyi yoktu. İlk kez 6 yıl önce pnömoni sırasında yapılan tetkiklerinde trombosit sayısı 69.000/mm3 olarak saptanması üzerine takibe alınmış. Olgunun
kemik iliği aspirasyonunda myeloid seride belirginleşme, lenfoid hücrelerde artış ve megakaryositlerin bir kısmında displastik değişiklikler olduğu raporlanmıştı. Periferik yayması normal olarak değerlendirilen olgunun ayak baş parmağı etrafında ekzama bulunmasından dolayı yapılan WASp protein ekspresyonu sonucu %97,4 olarak sonuçlanmış. Kanama ve immun yetmezlik semptomu bulunmayan olgu, trombositopeni sebebiyle takip altında izlenmiş.
46 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile WAS geninde c.1453G>A (p.D485N) değişikliği hemizigot olarak saptanmıştı. Aileye yapılan segregasyon çalışmasında annede bu değişikliğin heterozigot olarak kalıtıldığı görülmüştü. Bu varyant ACMG kriterlerine göre patojenik olarak sınıflandırılırken, daha önce literatürde X’e bağlı trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 10. Olgu 5'in Sanger dizi analizi görüntüsü
47 OLGU 9- EK
Aralarında akrabalık bulunmayan anne-babanın ilk çocuğu olarak, miadında dünyaya gelen 4 yaşındaki kız olgu trombositopeni etyolojisinin aydınlatılması amacıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde, trombosit sayısı düşüklüğü bulunan aile bireyi olmadığı öğrenildi. Dört aylıkken idrar yolu enfeksiyonu sebebiyle yapılan tetkiklerinde trombosit sayısının 40.000/mm3 gelmesi üzerine takibe alınmış. Son kontrollerinde trombosit değerleri
6500/mm3’e kadar gerileyen olguya yapılan kemik iliği biyopsisinde atipik hücre saptanmadığı, her 3 serinin diferasyon ve maturasyonunun tam olduğu fakat çok nadir megakaryosit gözlendiği raporlanmış. Periferik yaymada ise atipik hücre gözlenmez iken, trombosit sayısı 10.000/mm3 olarak saptanmış.
48 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile MPL geninde c.212+5G>A ve c.235_236delCT değişiklikleri saptanmıştı. Aile segregasyon çalışmasında babada c.212+5G>A annede c.235_236delCT değişikliğinin heterozigot saptanması üzerine olgu bileşik heterozigot olarak değerlendirildi. Bu iki varyant ACMG kriterlerine göre sırasıyla muhtemel patojenik ve patojenik olarak sınıflandırılırken, her 2 varyantın da literatürde konjenital amegakaryositik trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
49 Şekil 14. Olgu 9'un segregasyon çalışması (I)
50 OLGU-16 (FCŞ)
Aralarında 1. derece kuzen evliliği bulunan anne-babanın 3. çocuğu olarak, miadında dünyaya gelen 13 yaşındaki erkek olgu kalıtsal trombositopeni ön tanısıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Olgunun annesinin ITP tanısıyla takipte olması nedeniyle doğumdan sonra tarama amaçlı olgumuza yapılan tam kan sayımında trombosit sayısı 48.000/mm3 olarak
saptanmış. Soygeçmişte, annenin 5 yıl önce splenektomi operasyonu geçirdiği ve hala trombositopeni ve anemi sebebiyle takipte olduğu öğrenildi. Ayrıca annenin de anne-babası arasında 1. derece kuzen evliliği bulunmaktaydı. Olguda bugüne kadar kanama ile ilgili klinik semptomun olmadığı, yıllık düzenli kontroller ile takipte kaldığı ve herhangi bir ilaç kullanmadığı öğrenildi.
51 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile MPL geninde c.212+5G>A değişikliği homozigot olarak saptanmıştı. Segregasyon çalışmasında annesinin bu genetik değişikliği homozigot, babasının ise heterozigot durumda taşıdığı gösterilmişti. Bu varyant ACMG kriterlerine göre muhtemel patojenik olarak sınıflandırılırken, literatürde homozigot durumda konjenital amegakaryositik trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 17. Olgu 16'nın Sanger dizi analizi görüntüsü
52 OLGU-25 (RK)
Aralarında 1. derece kuzen evliliği bulunan 2 çocuklu anne-babanın ilk çocuğu olarak, miadında, NSVD ile dünyaya gelen 14 yaşındaki kız olgu, kalıtsal trombositopeni ön tanısıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişte, anne, baba, 2 teyze ve halasında trombositopeni olduğu öğrenilmiştir. Doğum sonrasında sefal hematom nedeniyle yapılan tetkiklerinde trombosit sayısının düşük olduğu olduğu fark edilmiş. Olgu infant dönemde trombosit süspansiyonları almış, sonrasında ise ITP tanısıyla IVIG verilerek takip edilmiş. Son yapılan tetkiklerinde tam kan sayımında trombosit sayısı 34.000/mm3, periferik yaymada
ise her sahada 8-9 tane olmak üzere tekli, büyük trombositler saptanmış. Klinik olarak Bernard-Solier Sendromu düşünülerek yapılan akım sitometresi sonuçlarında CD42b (GPIb) ve CD61 (GPIIIa) normal saptanmış.
53 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile GP1BA geninde c.449A>G (p.N150S) değişikliği homozigot olarak saptanmıştı. Segregasyon çalışmasında anne ve babanın bu genetik değişikliği heterozigot durumda taşıdıkları gösterilmişti. Bu varyant ACMG kriterlerine göre muhtemel patojenik olarak sınıflandırılırken, literatürde heterozigot durumda makrotrombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 20. Olgu 25'in Sanger dizi analizi görüntüsü
54 Olgu 28 (SD)
Aralarında 2. derece kuzen evliliği bulunan 3 çocuklu anne-babana ilk çocuğu olarak, miadında, NSVD ile dünyaya gelen 13 yaşındaki kız olgu trombositopeni nedeniyle tarafımıza başvurmuş. Soygeçmişinde trombositopenili aile bireyi yoktu. Olgunun 3 yaşında başlayan aralıklı hematüri ve yılda 3-4 kez burun kanaması şikâyeti oluyormuş. Trombosit sayısı ortalama 70.000/mm3 olarak seyreden olgu ITP ön tanısı ile izlenmekteymiş. Periferik
yaymasında trombositlerin iri ve kümelenmiş olduğu, atipik hücrelerin görülmediği raporlanmış. Kemik iliği aspirasyon biyopsisinde ise trombosit kümeleri dışında ek patoloji gözlenmemiş.
55 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile NBEAL2 geninde c.7878+2 G>A değişikliği homozigot olarak saptanmıştı. Segregasyon analizinde ebeveynlerin bu değişikliği heterozigot durumda taşıdığı gösterilmişti. Literatürde ve veri tabanlarında tanımlı olmayan bu varyant ACMG kriterlerine göre patojenik olarak sınıflandırılmaktadır.
Şekil 23. Olgu 28'in Sanger dizi analizi görüntüsü
56 Olgu 29 (ŞA)
Aralarında akrabalık bulunmayan 2 çocuklu anne-babanın ilk çocuğu olarak, miadında dünyaya gelen 26 yaşındaki erkek olgu makrotrombositopeni ön tanısı ile tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde, benzer hastalık öyküsüne sahip birey olmadığı öğrenildi. Üç yaşından itibaren ITP ön tanısıyla takip ediliyormuş. 3 yıl önce splenektomi operasyonu geçirmiş. Böbrek fonksiyon testleri ilk kez 14 yaşında bozulmaya başlayan olgu daha sonrasında fokal segmental glomeruloskleroz tanısıyla takip edilmiş. Son dönem böbrek yetmezliği sebebiyle 2 yıl önce hemodiyaliz başlanmış. Bu dönemde yapılan periferik yaymasında trombosit sayısının 20.000/mm3 ve boyutlarının artmış olduğu görülünce kalıtsal
trombositopeni olarak takiplerine devam edilmiş. 6 yıl önce yapılan işitme testlerinde saptanan %15-20 kadar kaybın çalışma ortamı ile ilgili olduğu düşünülmüş.
57 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile MYH9 geninde c.287C>T (p.S96L) değişikliği heterozigot olarak saptanmıştı. Aile bireylerine ulaşılamadığından segregasyon yapılamamıştı. Saptanan varyant ACMG kriterlerine göre muhtemel patojenik olarak sınıflandırılırken, literatürde heterozigot durumda MYH9 ilişkili trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 26. Olgu 29'un Sanger dizi analizi görüntüsü
58 Olgu 32 (YSÖ)
Aralarında akrabalık bulunmayan anne-babanın ilk çocuğu olarak, miadında, NSVD ile dünyaya gelen 3 yaşındaki erkek olgu makrotrombositopeni etiyolojisinin aydınlatılması amacıyla tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişinde babasının makrotrombositopeni nedeniyle takipli olduğu öğrenildi. Babada işitme ve görme kaybı mevcutken, böbrek fonksiyon testleri normal olarak değerlendirilmiş. Olgunun babaannesinin, işitme kaybı nedeniyle cihaz kullandığı ve son dönem böbrek yetmezliği sebebiyle exitus olduğu öğrenildi. Bir yaşında kafasını sehpaya vurduğu için yapılan testlerinde trombosit sayısının düşük olduğu fark edilmiş. Periferik yaymasında makrotrombositopeni tespit edilen olgunun bugüne kadar kanama bozukları ile ilgili semptomu yoktu.
59 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile MYH9 geninde c.2104C>T (p.R702C) değişikliği heterozigot olarak saptanmıştı. Aileye yapılan segregasyon çalışmasında aynı genetik değişikliğin babada da heterozigot durumda mevcut olduğu görülmüştü. Bu varyant ACMG kriterlerine göre muhtemel patojenik olarak sınıflandırılırken, literatürde heterozigot durumda MYH9 ilişkili trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 29. Olgu 32'nin Sanger dizi analizi görüntüsü
60 Olgu 34 (YDÇ)
Aralarında akrabalık bulunmayan anne babanın ilk çocuğu olarak, miadında dünyaya gelen 6 yaşındaki erkek olgu makrotrombositopeni nedeniyle tarafımıza yönlendirilmiş. Soygeçmişte, annesinin atipik HÜS ön tanısıyla son dönem böbrek yetmezliğine ilerlediği ve 3 yıl önce böbrek transplantasyonu olduğu, işitme ve görme kaybının olduğu öğrenildi. Doğumda tarama amaçlı trombosit sayısı düşük çıkan olgunun, periferik yaymasındaki makrotrombositopenisi dışında olağan dışı laboratuvar sonucu ve klinik semptomu yoktu.
61 Olguya yapılan hedefe yönelik YNDA ile MYH9 geninde c.287C>T (p.S96L) değişikliği heterozigot olarak saptanmıştı. Aileye yapılan segregasyon çalışmasında annenin de bu değişikliği heterozigot durumda taşıdığı tespit edilmişti. Bu varyant ACMG kriterlerine göre muhtemel patojenik olarak sınıflandırılırken, literatürde heterozigot durumda MYH9 ilişkili trombositopeniye sebep olduğu bildirilmiştir.
Şekil 32. Olgu 34'ün Sanger dizi analizi görüntüsü
62 5. TARTIŞMA
Kalıtsal trombositopeniler, trombosit sayısı düşüklüğünün yanında klinik şiddeti değişkenlik gösteren kanama semptomları ile giden heterojen hastalık grubudur. Olguların bir kısmında konjenital anomaliler görülürken, bir kısmında nefropati, sağırlık ya da hematolojik maligniteler ilerleyen yaşlarda ortaya çıkabilir. Bu olgularda genetik etiyolojinin aydınlatılması; kanama için profilaktik tedavisi stratejilerinin geliştirilmesi, uygun olmayan ilaçlarla tedaviden kaçınılması, takip sırasında kullanılacak parametrelerin oluşturulması, prognoz tahmini ve yeni kuşaklarda hastalığın ortaya çıkmasının engellenmesi açısından çok önemlidir. Bu çalışmada kalıtsal trombositopenilerden şüphelenilen 36 olguya yapılan hedeflenmiş yeni nesil dizi analizi sonuçları retrospektif olarak incelenerek, ülkemizdeki genetik etiyoloji sebeplerini ortaya koymak ve genotip-fenotip korelasyonu açısından literatüre katkıda bulunmak amaçlanmıştır.
Bu çalışmadaki 7 olguda saptanan 6 mutasyon (MYH9: c.287C>T, MYH9: c.2104C>T WAS: c.1453G>A, MPL: c.212+5G>A, MPL: c.235_236delCT, GP1BA: c.449A>G) daha önce literatürde bildirilmiştir. Ayrıca NBEAL2 geninde c.7878+2G>A ve c.7559G>T mutasyonları ilk kez bizim çalışmamızda saptanmış olup, 3 olgumuzda klinikle uyumlu olarak değerlendirilmiştir. Toplamda olguların %27,7’sinde (36 olgudan 10 tanesinde) trombositopeninin genetik sebebi ortaya konmuştur.
Bastida ve ark. (143) kendi tasarladıkları hedeflenmiş YNDA uygulanan kalıtsal trombosit bozukluğu ön tanılı, 82 olgudaki toplam genetik tanı başarısını %68 olarak bulmuşlardır. Klinik ve laboratuvar bulgularının bir KT ön tanısı oluşturduğu grupta tanı başarısı %88 (30/34) iken, ön tanı oluşturulamayan grupta tanı başarısını %54 (26/48) olarak bulmuşlardır (143). Leinoe ve ark. (144) 71 KT olgusuna yaptıkları hedeflenmiş YNDA çalışmasında 33 olguda (%46) genetik tanıya ulaşmışlardır. Johnson ve ark. (145) tasarladıkları panel ile 31 olgudan 24’ünde (%77) genetik tanı koyabilmişlerdir. Rabbolini ve ark. (146) çalışmasında ise trombositopenik 28 hastanın %52’sine moleküler genetik tanı konulmuştur. Bizim hastalarımızda tanı oranın literatüre oranla düşük bulunması hasta seçim kriterlerimizin daha esnek olması yanında şu 2 sebeple ilişkili olabilir. Hedeflenmiş YNDA ile genlerdeki delesyon ve duplikasyonların saptanması mümkün olmadığından, Türk toplumunda bu mutasyon tiplerinin görülme oranları daha yüksek olabilir. Ayrıca son 10 yılda KT etiyolojisini açıklayacak çok sayıda yeni gen tanımlanmıştır, bizim olgularımızda şu an için keşfedilmemiş genetik etiyolojiler mevcut olabilir.
Literatürle benzer bir şekilde bizim çalışmamızda da en sık mutasyon saptanan genlerden biri MYH9’dur (143–146). Kas dışı miyozin IIA nın ağır zincirini (NMMHC-IIA)
63 kodlayan MYH9 genindeki mutasyonlar otozomal dominant kalıtılan MYH9 ilişkili trombositopeniye sebep olur.
MYH9 ilişkili trombositopeni olarak tek başlık altında toplanan sendromlardan ilk tanımlanan May-Hegglin anomalisidir. May 1909 yılında geniş trombositlere sahip hafif kanama bulguları olan bir ailenin üyelerini tanımlamıştır (147). Daha sonra Hegglin lökositlerdeki Döhle cisimciklerinin dominant kalıtımlı dev trombosit hastalığında görüldüğünü bildirmiştir (147). May-Hegglin anomalisi ise trombositopeni, dev trombositler ve lökositlerdeki inklüzyon cisimlerinden oluşan triad olarak tanımlanmıştır. Epstein ve ark. (148) 1972 yılında Epstein Sendromunu sağırlık ve nefropatiye eşlik eden dev trombositlerin görüldüğü ilk makrotrombositopeni sendromu olarak tanımlamışlardır. Peterson ve ark. (149) ise 1985 yılında Fechtner Sendromunu interstisyel nefrit, katarakt, sağırlık ve lökosit inklüzyonlarından oluşan yeni bir makrotrombosit sendromu olarak tanımlamışlardır. Fechtner Sendromu o dönemlerde Alport sendromunun bir varyantı olarak kabul görmüştür. Greinacher ve ark. (150) ise 1990 yılında daha küçük lökosit inklüzyon cisimcikleri içeren, makrotrombositopenin hafif bir formu olarak Sebastian sendromunu tanımlamışlardır. Greinacher ve ark. ilk yayınlarında olgularda görme, işitme ve böbrek sorunları tariflemezken, takiplerde olgularda katarak ve işitme kayıpları olduğunu bildirmişlerdir. Toren ve ark. (151) 1999 yılında 22q kromozom bölgesindeki 5.5 megabazlık bölgenin dev trombosit hastalıkları ile ilişkili olduğunu ve bu sendromların aynı genetik defektten kaynaklanabileceğini belirtmiştir. The May-Hegglin/Fechtner Sendromu çalışma grubu (152) ise 2000 yılında bu antitelerin hepsinden MYH9 genindeki farklı genotiplerin sorumlu olduğunu bildirmişlerdir.
MYH9 ilişkili trombositopeni için yapılan bir sıklık çalışması bulunmamasına rağmen, ExAC veri tabanında tanımlanan 6 fonksiyon kaybettirici mutasyon olduğu düşünüldüğünde allel frekansının en az 1/20.000 olduğu söylenebilir (153). Althaus ve ark. (147) Almanya’nın 250.000 nüfuslu Greifswald bölgesinde 5 farklı ailede MYH9 mutasyonu saptadıklarını bildirmişlerdir. Sporadik mutasyon oranında yaklaşık 1/3 olduğu düşünüldüğünde, tahmini sıklığın 1/20-25.000 olduğunu söyleyebiliriz (154).
NMMHC-IIA proteini; N-terminal globüler baş bölgesi (head domain) (HD) (ekzon 2-19), hafif zincir bağlanma boyun bölgesi (light chain binding neck domain) (ND) (ekzon 20), C-terminal bölge (TD) (ekzon 21-41) olmak üzere 3 bölümden oluşur (155). TD ise, uzun alfa helikal çift kıvrımlı kısım ve ekzon 41’in son 37 aminoasitinden oluşan helikal olmayan kuyruk (NHT) kısmı olmak üzere 2 bölümden oluşur (6). Saposnik ve ark. (154) 39 aileden 109 olguyu inceledikleri Fransız popülasyonunu çalışmasında MYH9 genindeki mutasyonların %35,8’inin HD ve %63,3’ünün TD bölümlerinde saptandığını, mutasyonların özellikle 2-17- 27-31-39-41. ekzonlarda görüldüğünü bildirmişlerdir. Pecci ve ark. (6) 121 aileden 255
64 olguyu inceledikleri İtalyan popülasyonu çalışmasında ise mutasyonların %28’inin HD ve %72’sinin ise TD bölümünde saptandığını bildirmişlerdir. Toplam 6 aminoasitteki mutasyonlar (HD bölgesindeki 96. aa serin ve 702. aa arjinin; TD bölgesindeki 1165. aa arjinin, 1424. aa aspartat, 1841. aa glutamin ve 1933. aa arjininin) olguların %70’inden sorumludurlar (78). Bizim olgularımızdaki p.S96L ve p.R702C mutasyonları HD bölgesinde bulunan ve literatürde sık gözlendiği belirtilen mutasyonlardandı.