A cada 6h de exposição às larvas, a temperatura da água de cada poço de infecção foi aferida utilizando um termômetro analógico. Após o término dos estímulos, os caramujos de cada grupo foram lavados com água corrente, retirando possíveis larvas que poderiam estar sobre a concha. Após este procedimento, os moluscos de cada um dos seis grupos experimentais foram distribuídos aleatoriamente grupos de cinco, e colocados em cubas com água (1000ml),
De cada um dos seis grupos experimentais, nos dias 5, 10, 15, 20 e 30 após a exposição, foram sacrificados cinco moluscos, e estes foram processados conforme descrito no item 4.3. Objetivando verificar a taxa de recuperação e o desenvolvimento larvar, após a digestão em pepsina, todas as larvas recuperadas foram quantificadas e classificadas em larva de primeiro estádio (L1) larvas de segundo estádio (L2) e larva de terceiro estádio (L3), observando-se os caracteres morfológicos segundo Guilhon e Cens (1973).
4.4.2 – Estímulo térmico
Para avaliar a influência do estímulo térmico sobre a infecção experimental de B. glabrata por larvas de A. vasorum, 250 moluscos, medindo em média 16,46mm de diâmetro de concha (DP = 1,44mm) foram separados em dois experimentos constituídos por cinco grupos distribuídos aleatoriamente. Cada grupo foi constituído por 25 moluscos que foram colocados individualmente em placas de cultura de células, com seis poços, contendo 3 ml de água desclorada e 400 L1 de A. vasorum. A infecção ocorreu sob diferentes estímulos térmicos, conforme segue:
Grupo 1b – Infecção em temperatura constante de
10°C
; durante 24h;Grupo 2b – Infecção em temperatura constante de 20°C; durante 24h;
Grupo 3b – Infecção em temperatura constante de
25°C
; durante 24h;Grupo 4b – Infecção em temperatura constante de
30°C
; durante 24h;Grupo 5b – Infecção em temperatura constante de
37°C
; durante 24h.A temperatura da estufa tipo “Bio Chemical Oxygen Demand” (BOD) foi monitorada antes da realização dos experimentos para verificar a variação de temperatura em 24 h. Após o término dos estímulos, os caramujos foram lavados com água corrente para retirar as larvas que poderiam estar sobre a concha. Os moluscos de cada um dos cinco grupos experimentais foram colocados em cubas com água (1000ml), sendo alimentados com alface fresca. Os grupos foram mantidos em BOD com temperatura constante de 25°C e fotoperíodo de 12 horas.
De cada um dos seis grupos experimentais, nos dias 5, 10, 15, 20 e 30 após a exposição, foram sacrificados cinco moluscos, e estes foram processados conforme descrito no item 4.3. Para se verificar a taxa de recuperação e o desenvolvimento larvar, após a digestão em pepsina, todas as larvas recuperadas foram quantificadas e classificadas em L1, L2 e L3, através da observação de caracteres morfológicos segundo Guilhon e Cens (1973).
4.4.3 - Meio de infecção
Com o objetivo de avaliar o efeito de diferentes meios na infecção B. glabrata com larvas de A. vasorum foram utilizadas três vias para expor os moluscos ao material infectante:
Grupo A: Dez moluscos, em dois experimentos, foram colocados individualmente em placas para cultura de células com seis poços contendo 3ml de água desclorada e fragmentos de alface com 2 cm de diâmetro, sobre os quais foram colocadas 400 L1.
Grupo S: Dez moluscos, em dois experimentos, foram colocados individualmente em placas para cultura de células com seis poços contendo 400L1 ressuspensas em 3ml de água desclorada.
Grupo F: Dez moluscos, em dois experimentos, foram colocados individualmente em placas para cultura de células com seis poços contendo 400 L1 em fezes de cão diluídas em 3 ml de água desclorada (variação: 250mg, 500mg, 750mg e 1000mg de fezes).
Para os três grupos, independente do substrato utilizado, todas as placas foram colocadas sob foco de luz com lâmpada incandescente de 25 W a uma distância de 50 cm, por 24 h. Após o procedimento de infecção, os caramujos foram lavados em água corrente para retirar larvas que poderiam estar sobre a concha. Os moluscos de cada um dos três grupos experimentais foram colocados em cubas com água (1000ml), sendo alimentados com alface fresca. Os grupos foram mantidos em BOD com temperatura constante de 25°C e fotoperíodo de 12 horas.
Trinta dias após a infecção, os moluscos foram sacrificados e processados conforme descrito no item 4.3. Para verificar a taxa de recuperação e o desenvolvimento larvar, após a digestão em pepsina, todas as larvas recuperadas foram quantificadas e classificadas em L1, L2 e L3, através da observação de caracteres morfológicos segundo Guilhon e Cens (1973).
4.4.4 – Temperatura de manutenção na recuperação de L3 de A. vasorum
Duzentos e cinqüenta exemplares de B. glabrata, medindo em média 15,75mm de diâmetro de concha (DP = 0,91mm), em dois experimentos, foram individualmente colocados em placas de poliestireno para cultura de células com seis poços contendo 3ml de água desclorada e 400 L1 de A. vasorum. As placas foram mantidas em estufa BOD à temperatura constante de 25°C, por 24h, com fotoperíodo de 12h. Após o procedimento de infecção, os moluscos foram lavados com água corrente para retirar as larvas que poderiam estar sobre a concha e aleatoriamente divididos em cinco grupos:
Grupo 1c - 25 caramujos mantidos em estufa BOD à temperatura constante de 10°C;
Grupo 2c - 25 caramujos mantidos em estufa BOD à temperatura constante de 20°C;
Grupo 3c - 25 caramujos mantidos em estufa BOD à temperatura constante de
25°C
;Grupo 4c - 25 caramujos mantidos em estufa BOD à temperatura constante de
30°C
;Grupo 5c - 25 caramujos mantidos em estufa BOD à temperatura constante de 37°C.
Os moluscos de cada um dos cinco grupos experimentais foram colocados em cubas com água (1000ml), sendo alimentados com alface fresca. Para cada um dos grupos experimentais, nos dias 5, 10, 15, 20 e 30 após a exposição, foram sacrificados cinco moluscos, e estes foram processados conforme descrito no item 4.3. Visando verificar a taxa de recuperação e o desenvolvimento larvar, após a digestão em pepsina, todas as larvas recuperadas foram quantificadas e classificadas em L1, L2 e L3, pela da observação de caracteres morfológicos segundo Guilhon e Cens (1973).
4.4.5 – Ovipostua de B. glabratainfectada por A. vasorum
Grupo 1: Dez caramujos, em dois experimentos, com tamanho médio de concha de 15 mm