A avaliação de danos induzidos ao material genético foi realizada com as aplicações da técnica da eletroforese em gel de células individualizadas (SCGE), ensaio cometa.
4.2.1.teste do cometa em células de mucosa bucal
É uma importante ferramenta utilizada nos estudos de biomonitoramento populacional (Collins et al., 2008). As amostras de células esfoliadas de mucosa bucal (Figura 10) de cada paciente foram centrifugadas por 10 minutos (1500 rpm), em três lavagens, com solução salina a 0,9% NaCl. As lâminas foram cobertas por solução de agarose de ponto de fusão normal a 0,75%. Posteriormente, foram mantidas em temperatura ambiente até a solidificação da agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão. Foram retirados 30 µL de células esfoliadas de mucosa bucal suspendidas em PBS e misturadas com 110 µL de agarose low mellting, a 37ºC e colocadas em forma de gotas sobre as lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa temperatura por 30 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no mínimo 24 horas. Ao serem removidas da solução de lise,as lâminas foram colocadas na posição horizontal na cuba de eletroforese e submetidas à corrida de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo, para manter a temperatura da eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba foi, então, preenchida com a solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH > 13) recém-preparada , a um nível superior (0,25cm, em média) às lâminas, ficaram em repouso por 20 min para o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis. A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300 mA, por 15 min. Todos estes passos foram realizados na presença de baixa luminosidade. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As lâminas foram fixadas por 10 minutos em solução fixadora (Ácido tricloroacético
15%; Sulfato de zinco heptahidratado 5% e Glicerol 5%), posteriormente, foi feita a coloração com solução de nitrato de prata. Lavou-se 3x com água destilada, mantendo as lâminas nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada ( ácido acético) nas cubetas deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água destilada e deixada secar em bandejas. Imagens de 100 células foram selecionadas aleatoriamente (50 células de cada uma de duas laminas) por indivíduo.
Figura 10. Esquema do teste de cometa conforme protocolo de (Tice et al., 2000) usado para a avaliação de genotoxicidade em agricultores expostos aos agrotóxicos.
A avaliação visual (Figura 11) dos cometas é um método de avaliação bem validado que tem uma alta correlação com a análise de imagens por computador (Collins et al., 2008). A análise, feita pelo padrão de escores, onde, de acordo com o tamanho e intensidade da cauda do cometa, os mesmos foram divididos em cinco categorias (0-4) de acordo com a percentagem de DNA na cauda do cometa, que indica o grau de lesão sofrido pela célula: 0 = sem danos (<5%); 1 = baixo nível de danos (5-20%); 2 = médio nível de danos (20-40%); 3 = alto nível de danos (40-95%); 4 = dano total (95%). O controle negativo foi processado separado das amostras dos trabalhadores de curtume.
Figura 11. Classes de Danos ao DNA analisados no Teste Cometa. (Adaptado de Villela et al., 2006).
4.2.2.Teste do cometa em linfócitos de sangue periférico
As amostras de sangue de cada indivíduo foram coletadas através de punção venosa, cerca de 5 mL de sangue periférico com seringa estéril e descartável, contendo o anticoagulante heparina sódica 5000 U/ml. Do sangue heparinizado 100 µL foi colocado em 5 mL de meio RPMI 1640 (na concentração final de 9%) , adicionado 13,25% de DMSO. Foram estocadas no freezer a -80º C e antes do processamente foram colocadas no banho- Maria a 37º C. O teste Cometa foi realizado segundo Singh et al. (1988), com modificações de Tice et al. (2000), com adaptações de (Vilella, 2006). As lâminas foram pré-cobertas por solução de agarose de ponto de fusão normal a 0,75%. Posteriormente, foram mantidas em temperatura ambiente até a solidificação da agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão. As amostras foram centrifugadas a 900 rpm, o sobrenadante descartado e 5 µL do centrifugado foi misturado com 95 µL (0,75%) de agarose
C Á Dano 0 1 2 3 4 ID % ∑Danos 1 3 2 4 apoptose 0 1 3 2 4 apoptose
de baixo ponto de fusão ( low mellting), a 37ºC e colocadas em forma de gotas sobre as lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa temperatura por 5 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no mínimo 24 horas. Ao serem removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas na posição horizontal na cuba de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo, para manter a temperatura da eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba foi, então, preenchida com a solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH > 13) recém-preparada, a um nível superior (0,25cm, em média) às lâminas, ficaram em repouso por 20 min para o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis.
A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300 mA, por 15 min. Todos estes passos foram realizados na presença de baixa luminosidade. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As lâminas foram fixadas por 10 mim em solução fixadora (Ácido tricloroacético 15%; Sulfato de zinco heptahidratado 5% e Glicerol 5%), após secagem das lâminas foram coradas com solução de nitrato de prata (0,02%). Lavou-se 3x com água destilada, mantendo as lâminas nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada (ácido acético) nas cubetas deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água destilada e deixada secar em bandejas. Imagens de 100 células foram selecionadas aleatoriamente (50 células de cada uma de duas lâminas) por indivíduo (Figura 12).
Para verificação da ocorrência de cometas em trabalhadores rurais no Estado do Piauí, um total de 15.200 linfócitos foram analisados, a partir da cultura de linfócitos do sangue coletado dos indivíduos pesquisados. Foram contabilizadas 100 células (50 células/lâmina) por indivíduo (ANEXO V).
Figura 12. Esquema do teste de cometa em cultura de linfócitos conforme protocolo de Singh et al (1988) eTice et al.(2008) usado para a avaliação de genotoxicidade em trabalhadores de curtume.